帶電荷營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供帶電荷營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在pH7下具有水溶解度為至少12.5g/L。在一些實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在pH7下具有水溶解度為至少50g/L。在一些實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在pH7下具有水溶解度為至少100g/L。在一些實(shí)施方案中，所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含一定水平的以下至少一者：a)所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)中存在的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于基準(zhǔn)蛋白質(zhì)中存在的支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率；b)所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)中存在的亮氨酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于基準(zhǔn)蛋白質(zhì)中存在的亮氨酸殘基與總氨基酸殘基的比率；和c)所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)中存在的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率等于或大于基準(zhǔn)蛋白質(zhì)中存在的必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率。也尤其提供編碼所述蛋白質(zhì)的核酸、制備所述蛋白質(zhì)的重組微生物、使用重組微生物制備所述蛋白質(zhì)的方法、包含所述蛋白質(zhì)的組合物和使用所述蛋白質(zhì)的方法。
【專利說(shuō)明】帶電荷營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)和方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的引用：
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年3月26日提交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/615, 816的優(yōu)先權(quán)， 所述專利申請(qǐng)據(jù)此以引用的方式整體并入本文。
[0003] 序列表：
[0004] 本申請(qǐng)含有已通過(guò)EFS-Web以ASCII格式提交且據(jù)此以引用的方式整體并入本文 的序列表。2013年3月12日創(chuàng)建的所述ASCII拷貝名為1005. 004-PCT_SL. txt且大小為 1，194, 666 字節(jié)。
[0005] 引言：
[0006] 膳食蛋白質(zhì)是為人類健康和生長(zhǎng)所必需之營(yíng)養(yǎng)物。世界衛(wèi)生組織推薦當(dāng)處于能量 平衡和重量穩(wěn)定時(shí)，膳食蛋白質(zhì)應(yīng)占能量攝取量的約10至15%。各個(gè)國(guó)家的平均每日蛋白 質(zhì)攝取量指示這些推薦與全世界消耗的蛋白質(zhì)的量一致。當(dāng)以能量平衡消耗時(shí)，平均20至 30 %的能量來(lái)自蛋白質(zhì)的餐食代表高蛋白質(zhì)膳食。
[0007] 身體不能合成為健康和生長(zhǎng)所必需的某些氨基酸，且代之以必須自食物獲得它 們。稱為"必需氨基酸"的這些氨基酸是組氨酸（H)、異亮氨酸（I)、亮氨酸（L)、賴氨酸（K)、 甲硫氨酸（M)、苯丙氨酸（F)、蘇氨酸（T)、色氨酸（W)和纈氨酸（V)。提供所有必需氨基酸 的膳食蛋白質(zhì)稱為"高品質(zhì)"蛋白質(zhì)。如肉、魚(yú)、家禽、蛋和乳制品的動(dòng)物性食物通常被認(rèn)為 是提供必需氨基酸的良好平衡的高品質(zhì)蛋白質(zhì)來(lái)源。酪蛋白（一種通常見(jiàn)于哺乳動(dòng)物奶 中，占牛奶中的蛋白質(zhì)的80%的蛋白質(zhì)）和乳清（在奶已凝固和應(yīng)變之后剩余的呈液體狀 態(tài)的蛋白質(zhì)）是高品質(zhì)膳食蛋白質(zhì)的主要來(lái)源。不提供必需氨基酸的良好平衡的食物稱為 "低品質(zhì)"蛋白質(zhì)。大多數(shù)水果和蔬菜是蛋白質(zhì)的不良來(lái)源。包括菜豆、豌豆、小扁豆、堅(jiān)果 和谷粒（如小麥）的一些植物性食物是蛋白質(zhì)的較好來(lái)源。大豆，作為一種由黃豆制得的 植物性蛋白質(zhì)，被一些人視為商品質(zhì)蛋白質(zhì)。
[0008] 對(duì)消耗大量蛋白質(zhì)在人中的急性效應(yīng)的研究已顯示在膳食中包括以及在一些情 況下增加蛋白質(zhì)含量可具有有益作用。舉例來(lái)說(shuō)，研究已顯示攝取蛋白質(zhì)可在人受試者中 誘導(dǎo)餐后飽腹感（包括通過(guò)抑制饑餓感），誘導(dǎo)產(chǎn)熱以及降低血糖反應(yīng)。
[0009] 對(duì)1?蛋白質(zhì)勝食有關(guān)重量減輕的研究已顯不蛋白質(zhì)正面影響能量消耗和瘦體重。 進(jìn)一步研究已顯示就含有的能量的至少5%來(lái)自蛋白質(zhì)的膳食而言，過(guò)度進(jìn)食會(huì)產(chǎn)生顯著 較小重量增加，且高蛋白質(zhì)膳食降低能量攝取。
[0010] 臨床研究提供證據(jù)表明蛋白質(zhì)阻止歸因于衰老或臥床休息的肌肉損失。具體來(lái) 說(shuō)，研究已顯示補(bǔ)充蛋白質(zhì)增加長(zhǎng)期臥床休息期間的肌肉分?jǐn)?shù)合成率（FSR)，維持長(zhǎng)期臥床 休息期間的腿部質(zhì)量和強(qiáng)度，增加瘦體重，改進(jìn)步態(tài)和平衡的功能性量度，且可充當(dāng)用于由 于不活動(dòng)或長(zhǎng)期臥床休息而處于肌肉減少癥的風(fēng)險(xiǎn)下的個(gè)體的可行性介入手段。
[0011] 在運(yùn)動(dòng)員中進(jìn)行的關(guān)于增加肌肉蛋白質(zhì)合成代謝的研究已顯示在運(yùn)動(dòng)之后提供 的蛋白質(zhì)促進(jìn)肌肉肥大的程度大于由單獨(dú)運(yùn)動(dòng)達(dá)成的肌肉肥大。也已顯示在運(yùn)動(dòng)之后提供 的蛋白質(zhì)支持蛋白質(zhì)合成而不使蛋白質(zhì)分解有任何增加，從而導(dǎo)致凈正性蛋白質(zhì)平衡和肌 肉質(zhì)量增大。盡管肌肉蛋白質(zhì)合成似乎以劑量-反應(yīng)方式對(duì)補(bǔ)充必需氨基酸起反應(yīng)，但并 非所有蛋白質(zhì)在構(gòu)建肌肉方面都等同。舉例來(lái)說(shuō)，在用阻力訓(xùn)練支持肌肉質(zhì)量增大方面，奶 蛋白似乎優(yōu)于大豆，而兩者均優(yōu)于單獨(dú)碳水化合物。氨基酸亮氨酸是刺激肌肉蛋白質(zhì)合成 的重要因素。
[0012] 通常見(jiàn)于食物中的全部蛋白質(zhì)未必以高效方式提供滿足如人的哺乳動(dòng)物的氨基 酸需求的氨基酸組成。結(jié)果是為達(dá)到各必需氨基酸的最小需求，在膳食中消耗的總蛋白質(zhì) 的量必須大于如果膳食蛋白質(zhì)的品質(zhì)較高所將需要的量。通過(guò)增加膳食中的蛋白質(zhì)品質(zhì)， 有可能相較于包括品質(zhì)較低的蛋白質(zhì)的膳食，降低必須消耗的蛋白質(zhì)總量。
[0013] 一般來(lái)說(shuō)，在哺乳動(dòng)物膳食中，具有較高蛋白質(zhì)品質(zhì)的蛋白質(zhì)被視為比不具有較 高蛋白質(zhì)品質(zhì)的其它蛋白質(zhì)更有益。所述蛋白質(zhì)例如適用作哺乳動(dòng)物膳食的組分。在某些 情況下，所述蛋白質(zhì)尤其促進(jìn)維持肌肉質(zhì)量、健康身體質(zhì)量指數(shù)和血糖平衡。因此，對(duì)具有 商蛋白質(zhì)品質(zhì)的蛋白質(zhì)的來(lái)源存在需要。
[0014] 在傳統(tǒng)上，氨基酸的合乎需要混合物（如包含必需氨基酸的混合物）已通過(guò)水解 必需氨基酸的水平相對(duì)較高的蛋白質(zhì)（如乳清蛋白質(zhì)）和/或通過(guò)在任選也包括如乳清的 水解蛋白質(zhì)的混合物中組合游離氨基酸來(lái)提供。這個(gè)類型的混合物可具有苦味且可被視為 不適合某些用途或不合乎某些用途需要。因此，所述混合物有時(shí)包括調(diào)味劑來(lái)掩蔽游離氨 基酸和/或水解蛋白質(zhì)的味道。在一些情況下，發(fā)現(xiàn)其中一定比例的氨基酸內(nèi)含物是由多 肽或蛋白質(zhì)提供的組合物具有的味道好于較高比例的總氨基酸是以游離氨基酸和/或某 些水解蛋白質(zhì)形式提供的組合物。然而，所述組合物的可用性已受到限制，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)性制劑 在傳統(tǒng)上已由自天然食物產(chǎn)品分離的蛋白質(zhì)（如自奶分離的乳清或自大豆分離的大豆蛋 白質(zhì)）制得。那些蛋白質(zhì)的氨基酸分布未必滿足哺乳動(dòng)物的氨基酸需求。此外，商品蛋白 質(zhì)通常由蛋白質(zhì)和/或蛋白質(zhì)水解物的混合物組成，所述混合物在它們的蛋白質(zhì)組成方面 可變化，由此導(dǎo)致關(guān)于它們的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的不可預(yù)測(cè)性。此外，所述高品質(zhì)蛋白質(zhì)的來(lái)源的數(shù) 目有限已意味著僅某些氨基酸組合可以蛋白質(zhì)形式以大規(guī)模用于攝取。
[0015] 為供應(yīng)如釀蛋白和乳清、蛋及肉的商品質(zhì)動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源、以及如大?的植物蛋 白質(zhì)所需的農(nóng)業(yè)方法也需要大量能量輸入且具有潛在有害環(huán)境影響。因此，將在某些情況 下適用的是具有供應(yīng)供哺乳動(dòng)物消耗的蛋白質(zhì)的替代性來(lái)源和方法。
[0016] 在理論上，可在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下設(shè)計(jì)和產(chǎn)生包含所需氨基酸混合物的合成多肽序 列。然而，這個(gè)方法可產(chǎn)生各種顧慮，且因此并非始終適用。首先，熟練技術(shù)人員了解的是 獲得所述合成序列的高產(chǎn)生水平可極具挑戰(zhàn)性。其次，即使所述合成蛋白質(zhì)被合成，它用于 營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)品中的適合性也將是不確定的。舉例來(lái)說(shuō)，所述非天然存在的多肽可為過(guò)敏原或 毒素。因此，在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)提供天然蛋白質(zhì)或多肽序列或其變體。
[0017] 可增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的效用的一個(gè)特征是它的溶解度。溶解度較高的營(yíng)養(yǎng)性蛋白 質(zhì)可展現(xiàn)合乎需要的特征，如增加的穩(wěn)定性、抗聚集性和合乎需要的味道分布。舉例來(lái)說(shuō)， 展現(xiàn)溶解度增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)可被配制成呈相對(duì)較低體積的溶液形式的包括高濃度營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)的飲料或液體制劑，由此遞送每單位體積較大劑量的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物?？扇苄誀I(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)可適用于其中使用者（例如，運(yùn)動(dòng)員）想要在身體活動(dòng)之前、期間或之后攝取營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)的運(yùn)動(dòng)飲料或恢復(fù)飲料中。展現(xiàn)溶解度增強(qiáng)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)也可特別適用于其 中受試者（例如，患者或年長(zhǎng)人士）需要蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物，但不能消耗固體食物或大體積的液 體的臨床環(huán)境中。
[0018] 本公開(kāi)提供主要由不僅僅依賴于傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)來(lái)產(chǎn)生的氨基酸的適用組合組成的蛋 白質(zhì)。舉例來(lái)說(shuō)，
【發(fā)明者】已發(fā)現(xiàn)且本公開(kāi)提供主要由氨基酸的組合組成的天然存在的多肽 序列，其含有適用水平的以下至少一者：支鏈氨基酸與總氨基酸的比率、氨基酸亮氨酸與總 氨基酸的比率、和必需氨基酸與總氨基酸的比率。本公開(kāi)也提供包含多肽序列的營(yíng)養(yǎng)性蛋 白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含以下至少一者：支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘 基的比率為至少24% ;Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至少11% ;和必需氨基酸殘基與 總氨基酸殘基的比率為至少49%。
[0019] 本公開(kāi)也尤其提供編碼蛋白質(zhì)的核酸、制備蛋白質(zhì)的重組微生物、使用重組微生 物制備蛋白質(zhì)的方法、包含蛋白質(zhì)的組合物和使用蛋白質(zhì)的方法。
[0020] 概述：
[0021] 在第一方面，本公開(kāi)提供包含第一多肽序列的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第 一多肽序列在PH 7下具有水溶解度為至少12. 5g/L。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列在 pH 7下具有水溶解度為至少50g/L。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列在pH 7下具有水 溶解度為至少l〇〇g/L。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含：a.支鏈氨基酸殘基與總氨 基酸殘基的比率為至少8% ;b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至少4% ;和c.必需氨 基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少19%。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列進(jìn)一步包 含各必需氨基酸的至少一者。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含以下至少一者：a.支 鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少24% ;b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至 少11%;和c.必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少49%。在一些實(shí)施方案中， 第一多肽序列包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至少70%同源性。在 一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至 少95%同源性。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至 少70%同源性。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少 95%同源性。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列由天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)組成。在一些實(shí)施 方案中，第一多肽序列不是天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。
[0023] 在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列不是過(guò)敏原。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列 與已知過(guò)敏原具有小于50%整體同源性。
[0024] 在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列不是毒素。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列與 已知毒素具有小于50%整體同源性。
[0025] 在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列具有模擬胃消化半衰期為小于60分鐘。在一些 實(shí)施方案中，第一多肽序列具有模擬胃消化半衰期為小于30分鐘。在一些實(shí)施方案中，第 一多肽序列具有模擬胃消化半衰期為小于10分鐘。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列在模 擬胃液中完全消化。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含至少一個(gè)選自胃蛋白酶識(shí)別位 點(diǎn)、胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)和胰凝乳蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。在一些實(shí)施方案中，第 一多肽序列不包含半胱氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列不包含二硫鍵。在一 些實(shí)施方案中，第一多肽序列不包含N連接的糖基化。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列不 包含〇連接的糖基化。
[0026] 在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列對(duì)聚集具有抗性。在一些實(shí)施方案中，第一多 肽序列在pH 7下是陰離子型的。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列具有計(jì)算溶合計(jì)分 (calculated solvation score)為-20或更低。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列具有計(jì) 算溶合計(jì)分為-30或更低。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列具有計(jì)算聚集計(jì)分為0. 75或 更低。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列具有計(jì)算聚集計(jì)分0.5或更低。在一些實(shí)施方案 中，第一多肽序列具有計(jì)算聚集計(jì)分0. 3或更低。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列包含 選自以下的氨基酸序列：i.選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列；ii.選自 SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的修飾的衍生物；和iii.選自SEQ ID NO: 1 至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的突變蛋白。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列由選自以 下的氨基酸序列組成：i.選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:490的氨基酸序列，ii.選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的修飾的衍生物，和iii.選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的突變蛋白。在一些實(shí)施方案中，第一多肽序列與至少一個(gè)選自 SEQ ID N0:1 至 SEQ ID N0:490 的參照氨基酸序列至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、 70 %,75 %,80 %,85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%或 99. 5% 同源。
[0027] 在另一方面，本公開(kāi)提供包含第一多肽序列的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分 離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在PH 7下具有水溶解度為至少12. 5g/L。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)在pH 7下具有水溶解度為至少50g/L。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白 質(zhì)在pH 7下具有水溶解度為至少100g/L。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含： a. 支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少8% ;b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率 為至少4%;和c.必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少19%。在一些實(shí)施方案 中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含各必需氨基酸的至少一者。在一些實(shí)施方案中，分離的 營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含以下至少一者：a.支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少24% ; b. Leu殘基與總氣基酸殘基的比率為至少11 %;和c.必需氣基酸殘基與總氣基酸殘基的比 率為至少49%。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì) 的至少50個(gè)氨基酸的至少70%同源性。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含與天 然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至少95%同源性。在一些實(shí)施方案中，分離的 營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少70%同源性。在一些實(shí)施方案中，分 離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少95%同源性。
[0028] 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)由天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)組成。在一 些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不是天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。
[0029] 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不是過(guò)敏原。在一些實(shí)施方案中，分離的 營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)與已知過(guò)敏原具有小于50%整體同源性。
[0030] 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不是毒素。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)與已知毒素具有小于50%整體同源性。
[0031] 在一些實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有模擬胃消化半衰期為小于60分鐘。在一些 實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有模擬胃消化半衰期為小于30分鐘。在一些實(shí)施方案中，分 離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有模擬胃消化半衰期為小于10分鐘。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng) 性蛋白質(zhì)在模擬胃液中完全消化。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含至少一個(gè) 選自胃蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)、胰蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)和胰凝乳蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不包含半胱氨酸殘基。在一些實(shí)施方案中，分離的 營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不包含二硫鍵。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不包含N連接的糖 基化。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)不包含O連接的糖基化。
[0032] 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)對(duì)聚集具有抗性。在一些實(shí)施方案中，分 離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在PH 7下是陰離子型的。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有 計(jì)算溶合計(jì)分為-20或更低。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì)算溶合計(jì)分 為-30或更低。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì)算聚集計(jì)分為0. 75或更低。 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì)算聚集計(jì)分為〇. 5或更低。在一些實(shí)施方 案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì)算聚集計(jì)分為〇. 3或更低。
[0033] 在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含選自以下的氨基酸序列：i.選自 SEQ ID NO: 1 至SEQ ID NO:490 的氨基酸序列；ii.選自 SEQ ID NO: 1 至SEQ ID NO:490 的氨 基酸序列的修飾的衍生物；和iii.選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的突 變蛋白。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)由選自以下的氨基酸序列組成：i.選自 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO:490 的氨基酸序列，ii.選自 SEQ ID NO: 1 至 SEQ ID NO:490 的 氨基酸序列的修飾的衍生物，和iii.選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的 突變蛋白。在一些實(shí)施方案中，分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)與至少一個(gè)選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID N0:490 的參照氨基酸序列至少 40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、 86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 99. 5% 同源。
[0034] 在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含用于親和純化的多 肽標(biāo)簽。在一些實(shí)施方案中，用于親和純化的標(biāo)簽是聚組氨酸標(biāo)簽。
[0035] 在另一方面，本公開(kāi)提供包含編碼本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的核酸序列的分離的核 酸。在一些實(shí)施方案中，分離的核酸選自基因組DNA、cDNA、正義RNA和反義RNA。在一些實(shí) 施方案中，分離的核酸是基因組DNA。在一些實(shí)施方案中，分離的核酸是cDNA。在一些實(shí)施 方案中，分離的核酸進(jìn)一步包含可操作地連接于編碼營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的核酸序列的表達(dá)控制 序列。在一些實(shí)施方案中，提供載體
[0036] 在另一方面，本公開(kāi)提供一種包含編碼本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的核酸序列的載 體。在一些實(shí)施方案中，載體進(jìn)一步包含可操作地連接于編碼營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的核酸序列的 表達(dá)控制序列。
[0037] 在另一方面，本公開(kāi)提供包含本公開(kāi)的核酸和本公開(kāi)的載體的至少一者的重組微 生物。在一些實(shí)施方案中，重組微生物是原核生物。在一些實(shí)施方案中，原核生物是異養(yǎng)性 的。在一些實(shí)施方案中，原核生物是自養(yǎng)性的。在一些實(shí)施方案中，原核生物是細(xì)菌。
[0038] 在另一方面，本公開(kāi)提供制備本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括在足 以由重組微生物產(chǎn)生所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的條件下培養(yǎng)本公開(kāi)的重組微生物。在一些實(shí)施方 案中，方法進(jìn)一步包括自培養(yǎng)物分離營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。
[0039] 在另一方面，本公開(kāi)提供包含本公開(kāi)的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)和至少一種第二組分 的營(yíng)養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分選自蛋白質(zhì)、多肽、肽、游離氨基 酸、碳水化合物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)或礦物質(zhì)來(lái)源、維生素、補(bǔ)充劑、生物體、醫(yī)藥和賦形劑。在一 些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是營(yíng)養(yǎng) 性蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是選自必需氨基酸、非必需氨基酸、支鏈 氨基酸、非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和修飾的氨基酸的游離氨基酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組 分是選自必需氨基酸的游離氨基酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是選自支鏈氨 基酸的游離氨基酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是Leu。在一些實(shí)施方案中，至 少一種第二組分是脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，脂質(zhì)選自脂肪、油、甘油三酯、膽固醇、磷脂和 脂肪酸。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分選自礦物質(zhì)和維生素。在一些實(shí)施方案中， 至少一種第二組分是補(bǔ)充劑。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是生物體。在一些實(shí) 施方案中，至少一種第二組分是醫(yī)藥。在一些實(shí)施方案中，至少一種第二組分是賦形劑。在 一些實(shí)施方案中，至少一種賦形劑選自緩沖劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、壓實(shí)劑、潤(rùn)滑劑、分 散增強(qiáng)劑、崩解劑、調(diào)味劑、甜味劑、著色劑。在一些實(shí)施方案中，將營(yíng)養(yǎng)性組合物配制成液 體溶液、漿液、混懸液、凝膠劑、糊劑、粉末或固體。
[0040] 在另一方面，本公開(kāi)提供制備本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物的方法，其包括提供本公開(kāi) 的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)以及組合所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)與至少一種第二組分。
[0041] 在另一方面，本公開(kāi)提供維持或增加受試者的肌肉質(zhì)量、肌肉強(qiáng)度和功能性表現(xiàn) 的至少一者的方法，所述方法包括向所述受試者提供足量的本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公 開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，受試者 處于以下至少一種狀態(tài)下：年長(zhǎng)、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、以及罹患蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良 癥。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方 法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者與進(jìn)行運(yùn)動(dòng)配合加以消耗。在一些實(shí)施方案中，受試者 是肥胖的。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公 開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者通過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加以消耗。
[0042] 在另一方面，本公開(kāi)提供維持或達(dá)成受試者的合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)的方法， 所述方法包括向所述受試者提供足量的本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或 通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，受試者處于以下至少一種狀 態(tài)下：年長(zhǎng)、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、以及罹患蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良癥。在一些實(shí)施方案中， 本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物 是由受試者與進(jìn)行運(yùn)動(dòng)配合加以消耗。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖的。在一些實(shí)施 方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng) 性組合物是由受試者通過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加以消耗。
[0043] 在另一方面，本公開(kāi)提供向患有蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良癥的受試者提供蛋白質(zhì)的 方法，所述方法包括向所述受試者提供足量的本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組 合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白 質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者與進(jìn)行運(yùn) 動(dòng)配合加以消耗。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖的。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng) 性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者通 過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加以消耗。
[0044] 在另一方面，本公開(kāi)提供增加受試者的產(chǎn)熱的方法，所述方法包括向所述受試者 提供足量的本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng) 養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖的。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋 白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者與進(jìn)行 運(yùn)動(dòng)配合加以消耗。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖的。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者 通過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加以消耗。
[0045] 在另一方面，本公開(kāi)提供誘導(dǎo)受試者的飽足反應(yīng)和飽腹感反應(yīng)的至少一者的方 法，所述方法包括向所述受試者提供足量的本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合 物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖的。在一 些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備 的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者與進(jìn)行運(yùn)動(dòng)配合加以消耗。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖 的。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方 法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者通過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加以消耗。
[0046] 在另一方面，本公開(kāi)提供治療受試者的惡病質(zhì)、肌肉減少癥和虛弱的至少一者的 方法，所述方法包括向所述受試者提供足量的本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組 合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。在一些實(shí)施方案中，受試者是肥胖的。在 一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、本公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)本公開(kāi)的方法制 備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由受試者通過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加以消耗。
[0047] 附圖簡(jiǎn)述：
[0048] 圖1顯示二維直方圖，其指示隨溶合計(jì)分（y軸）和聚集計(jì)分（X軸）而變的蛋白 質(zhì)在大腸桿菌表達(dá)篩選中表達(dá)的相對(duì)可能性（在對(duì)數(shù)尺度上）。
[0049] 圖2顯示二維直方圖，其指示隨溶合計(jì)分（y軸）和聚集計(jì)分（X軸）而變的蛋白 質(zhì)在大腸桿菌表達(dá)篩選中可溶性表達(dá)的相對(duì)可能性（在對(duì)數(shù)尺度上）。
[0050] 詳述：
[0051] 除非本文另外定義，否則與本公開(kāi)關(guān)聯(lián)使用的科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)將具有由本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員通常所理解的含義。此外，除非另外為上下文所需，否則單數(shù)術(shù)語(yǔ)將包括復(fù)數(shù)且 復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)將包括單數(shù)。通常，與本文所述的生物化學(xué)、酶學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、 遺傳學(xué)、及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、以及雜交關(guān)聯(lián)使用的命名法以及本文所述的生物化學(xué)、酶 學(xué)、分子和細(xì)胞生物學(xué)、微生物學(xué)、遺傳學(xué)、及蛋白質(zhì)和核酸化學(xué)、以及雜交的技術(shù)是本領(lǐng)域 中熟知且通常使用的命名法以及技術(shù)。本文引用的某些參考文獻(xiàn)和其它文件以引用的方式 明確并入本文。另外，本文引用的所有UniProt/SwissProt記錄都據(jù)此以引用的方式并入 本文。在起沖突的情況下，以包括定義的本說(shuō)明書為準(zhǔn)。材料、方法和實(shí)施例僅具有說(shuō)明性 而非意圖具有限制性。
[0052] 除非另外指示，否則本公開(kāi)的方法和技術(shù)通常是根據(jù)本領(lǐng)域中熟知及如本說(shuō)明 書整篇引用和論述的各種一般性和更特定參考文獻(xiàn)中所述的常規(guī)方法來(lái)執(zhí)行。參見(jiàn)例如 Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (2001) ；Ausubel 等,Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates (1992 及截至 2002 的補(bǔ)編）； Taylor 和 Drickamer, Introduction to Glycobiology, Oxford Univ.Press (2003)； Worthington Enzyme Manual,Worthington Biochemical Corp., Freehold, N. J.； Handbook of Biochemistry: Section A Proteins,第 I 卷,CRC Press (1976)； Handbook of Biochemistry: Section A Proteins,第 II 卷,CRC Press (1976)； Essentials of Glycobiology, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999)?？蛇m 用于藍(lán)細(xì)菌的許多分子生物學(xué)和遺傳技術(shù)描述于Heidorn等，"Synthetic Biology in Cyanobacteria:Engineering and Analyzing Novel Functions, "Methods in Enzymology,第497卷，第24章（2011)中，其據(jù)此以引用的方式并入本文。
[0053] 本公開(kāi)涉及在因特網(wǎng)上公開(kāi)的針對(duì)某些蛋白質(zhì)和基因序列的序列數(shù)據(jù)庫(kù)條目 (例如，UniProt/SwissProt記錄）以及因特網(wǎng)上的其它信息。熟練技術(shù)人員了解的是因特 網(wǎng)上的信息（包括序列數(shù)據(jù)庫(kù)條目）時(shí)時(shí)更新，且例如用于指代特定序列的參考編號(hào)可變 化。當(dāng)提及序列信息的公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)或因特網(wǎng)上的其它信息時(shí)，應(yīng)了解的是可發(fā)生所述變化 且因特網(wǎng)上的信息的特定實(shí)施方案可時(shí)有時(shí)無(wú)。因?yàn)槭炀毤夹g(shù)人員可通過(guò)在因特網(wǎng)上搜索 來(lái)得到等效信息，所以提及因特網(wǎng)網(wǎng)頁(yè)地址或序列數(shù)據(jù)庫(kù)條目證實(shí)所論述信息的可用性和 公開(kāi)傳播性。
[0054] 在公開(kāi)和描述本發(fā)明蛋白質(zhì)、組合物、方法和其它實(shí)施方案之前，應(yīng)了解的是本文 使用的術(shù)語(yǔ)是僅出于描述特定實(shí)施方案的目的且不意圖具有限制性。必須注意的是，除非 上下文另外明確規(guī)定，否則如說(shuō)明書和隨附權(quán)利要求中所用，單數(shù)形式"一"和"所述"包括 復(fù)數(shù)個(gè)指示物。
[0055] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"包含"與"包括"或"含有"同義，且是包括性的或開(kāi)放的，且不 排除其它未敘述成員、要素或方法步驟。
[0056] 本公開(kāi)提及氨基酸。氨基酸的全稱可與各自的標(biāo)準(zhǔn)三字母和單字母縮寫互換使 用。為避免疑問(wèn)，這些氨基酸是：丙氨酸（Ala、A)、精氨酸（Arg、R)、天冬酰胺（Asn、N)、天冬 氨酸仏鄧、0)、半胱氨酸化5^、〇、谷氨酸（6111、幻、谷氨酰胺（6111、0)、甘氨酸（61 7、6)、組 氨酸（His、H)、異亮氨酸（lie、I)、亮氨酸（Leu、L)、賴氨酸（Lys、K)、甲硫氨酸（Met、M)、苯 丙氨酸（Phe、F)、脯氨酸（Pro、P)、絲氨酸（Ser、S)、蘇氨酸（Thr、T)、色氨酸（Trp、W)、酪氨 酸（Tyr、Y)、纟顏氨酸（Val、V)。
[0057] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"體外"是指事件發(fā)生在人工環(huán)境中，例如在試管或反應(yīng)容器中、 在細(xì)胞培養(yǎng)物中、在皮氏培養(yǎng)皿（Petri dish)中等，而非在生物體（例如，動(dòng)物、植物或微 生物）內(nèi)。
[0058] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"體內(nèi)"是指事件發(fā)生在生物體（例如，動(dòng)物、植物或微生物）內(nèi)。
[0059] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"分離的"是指物質(zhì)或?qū)嶓w已（1)與它在最初產(chǎn)生時(shí)（無(wú)論在自 然界中或在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中）與之相伴的至少一些組分分離，和/或（2)通過(guò)人手產(chǎn)生、制備和 /或制造。分離的物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約 60%、約70%、約80%、約90%、或更多它們最初與之相伴的其它組分分離。在一些實(shí)施方 案中，分離的試劑的純度大于約80 %、約85 %、約90 %、約91 %、約92 %、約93 %、約94%、 約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %或大于約99 %。如本文所用，如果物質(zhì)大致上不 含其它組分，那么它是"純的"。
[0060] 如本文所用，"支鏈氨基酸"是選自亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的氨基酸。
[0061] 如本文所用，"必需氨基酸"是選自組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、 苯丙氨酸、蘇氨酸、色氨酸和纈氨酸的氨基酸。
[0062] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"肽"是指短多肽，例如通常含有小于約50個(gè)氨基酸且更通常 小于約30個(gè)氨基酸的多肽。如本文所用的所述術(shù)語(yǔ)涵蓋模擬結(jié)構(gòu)功能以及因此生物功能 的類似物和模擬物。
[0063] 術(shù)語(yǔ)"多肽"涵蓋天然存在的蛋白質(zhì)與非天然存在的蛋白質(zhì)兩者及其片段、突變 體、衍生物和類似物。多肽可為單體或聚合物。此外，多肽可包含各自具有一種或多種不同 活性的許多不同結(jié)構(gòu)域。為避免疑問(wèn)，"多肽"可具有大于兩個(gè)氨基酸的任何長(zhǎng)度。
[0064] 術(shù)語(yǔ)"分離的蛋白質(zhì)"或"分離的多肽"是就它的起源或來(lái)源而言，（1)不與在它的 天然狀態(tài)下伴隨它的天然相伴組分相伴，（2)以不見(jiàn)于自然界中的純度存在，其中純度可關(guān) 于其它細(xì)胞物質(zhì)的存在加以斷定（例如，不含來(lái)自相同物種的其它蛋白質(zhì)），（3)由來(lái)自不 同物種的細(xì)胞表達(dá)，或（4)不存在于自然界中（例如，它是見(jiàn)于自然界中的多肽的片段或它 包括不見(jiàn)于自然界中的氨基酸類似物或衍生物或除標(biāo)準(zhǔn)肽鍵以外的鍵聯(lián)）的蛋白質(zhì)或多 肽。因此，化學(xué)合成或在不同于它所天然源于的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中合成的多肽將與它的天 然相伴組分"分離"。也可通過(guò)使用本領(lǐng)域中熟知的蛋白質(zhì)純化技術(shù)進(jìn)行分離來(lái)致使多肽或 蛋白質(zhì)大致上不含天然相伴組分。如因此所定義，"分離"未必需要如此描述的蛋白質(zhì)、多 肽、肽或寡肽已自于其中合成它的細(xì)胞物理移除。
[0065] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"多肽片段"是指相較于全長(zhǎng)多肽（如天然存在的蛋白質(zhì)），具 有缺失（例如氨基末端和/或羧基末端缺失）的多肽。在一實(shí)施方案中，多肽片段是連續(xù) 序列，其中所述片段的氨基酸序列與天然存在的序列中的相應(yīng)位置一致。片段的長(zhǎng)度通常 是至少5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸、或至少12、14、16或18個(gè)氨基酸、或至少20個(gè)氨基酸、 或至少25、30、35、40或45個(gè)氨基酸、或至少50或60個(gè)氨基酸、或至少70個(gè)氨基酸、或至 少100個(gè)氨基酸。
[0066] 術(shù)語(yǔ)"融合蛋白"是指包含偶聯(lián)于異源氨基酸序列的多肽或片段的多肽。融合蛋白 是適用的，因?yàn)樗鼈兛杀粯?gòu)建來(lái)含有兩個(gè)或更多個(gè)可來(lái)自兩種或更多種不同蛋白質(zhì)的所需 功能性元件。融合蛋白包含至少10個(gè)來(lái)自目標(biāo)多肽的連續(xù)氨基酸、或至少20或30個(gè)氨基 酸、或至少40、50或60個(gè)氨基酸、或至少75、100或125個(gè)氨基酸。融合蛋白內(nèi)包括的異源 多肽的長(zhǎng)度通常是至少6個(gè)氨基酸、或至少8個(gè)氨基酸、或至少15、20或25個(gè)氨基酸。包 括較大多肽（如IgG Fc區(qū)域）以及甚至整個(gè)蛋白質(zhì)（如含有綠色熒光蛋白（"GFP"）發(fā)色 團(tuán)的蛋白質(zhì)）的融合物具有特定效用。融合蛋白可通過(guò)與編碼不同蛋白質(zhì)或肽的核酸序列 同框構(gòu)建編碼多肽或其片段的核酸序列，且接著表達(dá)融合蛋白來(lái)重組產(chǎn)生?；蛘?，可通過(guò)使 多肽或其片段交聯(lián)于另一蛋白質(zhì)來(lái)化學(xué)產(chǎn)生融合蛋白。
[0067] 如本文所用，如果編碼蛋白質(zhì)的核酸序列與編碼第二蛋白質(zhì)的核酸序列具有類似 序列，那么所述蛋白質(zhì)與所述第二蛋白質(zhì)具有"同源性"或與所述第二蛋白質(zhì)"同源"?；蛘?， 如果兩個(gè)蛋白質(zhì)具有類似氨基酸序列，那么某一蛋白質(zhì)與第二蛋白質(zhì)具有同源性。（因此， 術(shù)語(yǔ)"同源蛋白質(zhì)"被定義來(lái)指兩個(gè)蛋白質(zhì)具有類似氨基酸序列。）如本文所用，氨基酸序 列的兩個(gè)區(qū)域之間的同源性（尤其關(guān)于預(yù)測(cè)的結(jié)構(gòu)類似性）解釋為暗示在功能方面的類似 性。
[0068] 當(dāng)"同源"關(guān)于蛋白質(zhì)或肽使用時(shí)，應(yīng)認(rèn)識(shí)到不相同的殘基位置常因保守性氨基酸 取代而不同。"保守性氨基酸取代"是其中某一氨基酸殘基被具有類似化學(xué)性質(zhì)（例如，電 荷或疏水性）側(cè)鏈（R基團(tuán)）的另一氨基酸殘基取代的取代。一般來(lái)說(shuō)，保守性氨基酸取代 將不實(shí)質(zhì)上改變蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)。在兩個(gè)或更多個(gè)氨基酸序列因保守性取代而不同于 彼此的情況下，序列同一性百分比或同源性程度可向上調(diào)整以校正取代的保守性性質(zhì)。用 于進(jìn)行這個(gè)調(diào)整的手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。參見(jiàn)例如Pearson, 1994, Methods Mol. Biol. 24:307-31 和 25:365-89。
[0069] 以下六組各自含有是彼此的保守性取代的氨基酸：1)絲氨酸、蘇氨酸；2)天冬氨 酸、谷氨酸；3)天冬酰胺、谷氨酰胺；4)精氨酸、賴氨酸；5)異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、丙 氨酸、纈氨酸；和6)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸。
[0070] 也稱為序列同一性百分比的多肽的序列同源性通常是使用序列分析軟件測(cè) 量。參見(jiàn)例如威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心的遺傳學(xué)計(jì)算機(jī)組（GCG)的序列分析軟件包 (910University Avenue, Madison, Wis. 53705)。蛋白質(zhì)分析軟件使用對(duì)各種取代、缺失和 其它修飾（包括保守性氨基酸取代）指定的同源性量度匹配類似序列。舉例來(lái)說(shuō)，GCG含 有可以缺省參數(shù)用于確定密切相關(guān)多肽（如來(lái)自生物體的不同物種的同源多肽）之間或野 生型蛋白質(zhì)與其突變蛋白之間的序列同源性或序列同一性的程序，如"Gap"和"Bestfit"。 參見(jiàn)例如GCG6. 1版。
[0071] 當(dāng)將特定多肽序列與含有來(lái)自不同生物體的許多序列的數(shù)據(jù)庫(kù)比較時(shí)，一示 例性算法是計(jì)算機(jī)程序 BLAST(Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) ;Gish 和 States, Nature Genet. 3:266-272 (1993) ;Madden 等，Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997) ;Zhang 和 Madden, Genome Res.7:649-656 (1997)),尤其 blastp 或 tblastn(Altschul 等，Nucleic Acids Res.25:3389-3402(1997))。
[0072] 用于BLASTp的示例性參數(shù)是：期望值：10(缺省值）；過(guò)濾：seg(缺省值）；打開(kāi) 缺口的代價(jià)：11 (缺省值）；延伸缺口的代價(jià)：1 (缺省值）；最大比對(duì)：100 (缺省值）；字長(zhǎng)： 11(缺省值）；描述數(shù)目：100(缺省值）；罰分矩陣：BL0WSUM62。針對(duì)同源性比較的多肽序 列的長(zhǎng)度將通常是至少約16個(gè)氨基酸殘基、或至少約20個(gè)殘基、或至少約24個(gè)殘基、或 至少約28個(gè)殘基、或大于約35個(gè)殘基。當(dāng)搜索含有來(lái)自許多不同生物體的序列的數(shù)據(jù)庫(kù) 時(shí)，可適用的是比較氨基酸序列。使用氨基酸序列進(jìn)行的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索可通過(guò)本領(lǐng)域中已知 的除blastp以外的算法來(lái)測(cè)量。舉例來(lái)說(shuō)，可使用GCG 6. 1版中的程序FASTA比較多肽序 列。FASTA提供在查詢序列與搜索序列之間最佳重疊的區(qū)域的比對(duì)和序列同一性百分比。 Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98(1990)。舉例來(lái)說(shuō)，如以引用的方式并入本文的GCG 6. 1版中所提供，可使用FASTA以它的缺省參數(shù)（字長(zhǎng)2和PAM250計(jì)分矩陣）確定氨基酸 序列之間的序列同一性百分比。
[0073] 在一些實(shí)施方案中，如果聚合分子（例如多肽序列或核酸序列）的序列至少25%、 至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、 至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%同一，那么它 們被視為彼此"同源"。在一些實(shí)施方案中，如果聚合分子的序列至少25%、至少30%、至 少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少 75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %或至少99 %類似，那么它們被視為彼此"同 源"。術(shù)語(yǔ)"同源"必須是指至少兩個(gè)序列（核苷酸序列或氨基酸序列）之間的比較。在一 些實(shí)施方案中，如果兩個(gè)核苷酸序列編碼的多肽就至少一個(gè)具有至少約20個(gè)氨基酸的鏈 段而言是至少約50%同一、至少約60%同一、至少約70%同一、至少約80%同一或至少約 90%同一，那么所述兩個(gè)核苷酸序列被視為同源。在一些實(shí)施方案中，同源核苷酸序列的特 征在于能夠編碼具有至少4-5個(gè)獨(dú)特指定的氨基酸的鏈段。這些氨基酸相對(duì)于彼此的同一 性與大致間隔兩者均必須為將核苷酸序列考慮為同源時(shí)所考慮。在長(zhǎng)度小于60個(gè)核苷酸 的核苷酸序列的一些實(shí)施方案中，同源性通過(guò)能夠編碼具有至少4-5個(gè)獨(dú)特指定的氨基酸 的鏈段來(lái)確定。在一些實(shí)施方案中，如果蛋白質(zhì)就至少一個(gè)具有至少約20個(gè)氨基酸的鏈 段而言是至少約50%同一、至少約60%同一、至少約70%同一、至少約80%同一或至少約 90%同一，那么兩個(gè)蛋白質(zhì)序列被視為同源。
[0074] 如本文所用，"修飾的衍生物"是指在一級(jí)結(jié)構(gòu)序列方面與參照多肽序列大致上 同源，但包括例如體內(nèi)或體外化學(xué)和生物化學(xué)修飾或并有不見(jiàn)于參照多肽中的氨基酸的 多肽或其片段。所述修飾包括例如乙?；?、羧化、磷酸化、糖基化、泛素化、標(biāo)記（例如用 放射性核素標(biāo)記）和各種酶修飾，如將易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。多種用于標(biāo)記多 肽的方法和適用于所述目的的取代基或標(biāo)記在本領(lǐng)域中是熟知的，且包括放射性同位素 (如 125I、32P、35S和3H)、結(jié)合標(biāo)記的抗配體（例如，抗體）的配體、熒光團(tuán)、化學(xué)發(fā)光劑、酶 和可充當(dāng)標(biāo)記的配體的特異性結(jié)合對(duì)成員的抗配體。對(duì)標(biāo)記的選擇取決于所需靈敏性、與 引物綴合的簡(jiǎn)易性、穩(wěn)定性要求和可用儀器。用于標(biāo)記多肽的方法在本領(lǐng)域中是熟知的。 參見(jiàn)例如 Ausubel 等，Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992 及截至 2002 的補(bǔ)編）。
[0075] 如本文所用，"多肽突變體"或"突變蛋白"是指相較于參照蛋白質(zhì)或多肽（如天然 或野生型蛋白質(zhì)）的氨基酸序列，序列含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、重復(fù)、缺失、重排或 取代的多肽。突變蛋白可具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸點(diǎn)取代，其中在某一位置處的單一氨基酸 已變?yōu)榱硪话被?；一個(gè)或多個(gè)插入和/或缺失，其中一個(gè)或多個(gè)氨基酸分別被插入在參 照蛋白質(zhì)的序列中或在參照蛋白質(zhì)的序列中缺失；和/或氨基酸序列在氨基或羧基末端的 任一者或兩者處的截短。突變蛋白相較于參照蛋白質(zhì)可具有相同或不同生物活性。
[0076] 在一些實(shí)施方案中，突變蛋白與它的對(duì)應(yīng)參照蛋白質(zhì)具有例如至少85%總體序列 同源性。在一些實(shí)施方案中，突變蛋白與野生型蛋白質(zhì)具有至少90%總體序列同源性。在 其它實(shí)施方案中，突變蛋白展現(xiàn)至少95 %序列同一性、或98 %或99 %或99. 5 %或99. 9 %總 體序列同一性。
[0077] 如本文所用，"用于親和純化的多肽標(biāo)簽"是具有可用于分離或純化融合于第一 "標(biāo)簽"多肽的目標(biāo)第二蛋白質(zhì)或多肽序列的結(jié)合配偶體的任何多肽。若干實(shí)例在本領(lǐng)域中 是熟知的且包括His-6標(biāo)簽、FLAG表位、c-myc表位、Str印-TAGII、生物素標(biāo)簽、谷胱甘肽 5_轉(zhuǎn)移酶（GST)、幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白（CBP)、麥芽糖結(jié)合蛋白（MBP)或金屬親和標(biāo)簽。
[0078] 如本文所用，"重組"是指例如基因或蛋白質(zhì)的生物分子（1)已自它的天然存在的 環(huán)境移除，（2)不與在自然界中發(fā)現(xiàn)所述基因所處的多核苷酸的全部或一部分相伴，（3)可 操作地連接于它在自然界中不與之連接的多核苷酸，或（4)不存在于自然界中。術(shù)語(yǔ)"重 組"可關(guān)于克隆的DNA分離物、化學(xué)合成的多核苷酸類似物或由異源系統(tǒng)生物合成的多核苷 酸類似物、以及由所述核酸編碼的蛋白質(zhì)和/或mRNA加以使用。因此，舉例來(lái)說(shuō)，例如如果 由微生物合成的蛋白質(zhì)是自由細(xì)胞中存在的重組基因合成的mRNA合成，那么它是重組的。
[0079] 術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"、"核酸分子"、"核酸"或"核酸序列"是指長(zhǎng)度是至少10個(gè)堿基 的聚合形式的核苷酸。所述術(shù)語(yǔ)包括DNA分子（例如，cDNA或基因組或合成DNA)和RNA 分子（例如，mRNA或合成RNA)、以及DNA或RNA的含有非天然核苷酸類似物、非天然核苷 間鍵或兩者的類似物。核酸可呈任何拓?fù)錁?gòu)象。舉例來(lái)說(shuō)，核酸可為單鏈、雙鏈、三鏈、四鏈 體、部分雙鏈、分支式、發(fā)夾式、環(huán)狀或呈掛鎖（padlocked)構(gòu)象。核酸（也稱為多核苷酸） 可包括RNA、cDNA、基因組DNA以及以上各者的合成形式和混合聚合物的正義鏈與反義鏈兩 者。它們可被化學(xué)或生物化學(xué)修飾或可含有非天然或衍生核苷酸堿基，如將易于為本領(lǐng)域 技術(shù)人員所了解。所述修飾包括例如標(biāo)記、甲基化、用類似物取代一個(gè)或多個(gè)天然存在的核 苷酸、核苷酸間修飾（如不帶電荷鍵聯(lián)（例如甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸 酯等）、帶電荷鍵聯(lián)（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等））、懸垂部分（例如，多肽）、嵌入劑 (例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素（psoralen)等）、螯合劑、烷基化劑和修飾的鍵聯(lián)（例如，α端基異 構(gòu)核酸等）。也包括在合成分子能夠通過(guò)氫鍵結(jié)和其它化學(xué)相互作用結(jié)合指定序列方面模 擬多核苷酸的所述合成分子。所述分子在本領(lǐng)域中是已知的且包括例如在分子骨架中，肽 鍵被替代成磷酸酯鍵聯(lián)的分子。其它修飾可包括例如核糖環(huán)含有橋接部分或其它結(jié)構(gòu)（如 見(jiàn)于"鎖定"核酸中的修飾）的類似物。
[0080] "合成" RNA、DNA或混合聚合物是在細(xì)胞外部產(chǎn)生的RNA、DNA或混合聚合物，例如 化學(xué)合成的RNA、DNA或混合聚合物。
[0081] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"核酸片段"是指相較于全長(zhǎng)參照核苷酸序列，具有缺失（例如 5'末端或3'末端缺失）的核酸序列。在一實(shí)施方案中，核酸片段是連續(xù)序列，其中所述片 段的核苷酸序列與天然存在的序列中的相應(yīng)位置一致。在一些實(shí)施方案中，片段的長(zhǎng)度是 至少 10、15、20 或 25 個(gè)核苷酸、或至少 20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140 或150個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，核酸序列的片段是開(kāi)放閱讀框序列的片段。在一些 實(shí)施方案中，所述片段編碼由開(kāi)放閱讀框核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)的多肽片段（如本文所 定義）。
[0082] 如本文所用，如果鄰近于生物體的基因組中的內(nèi)源性核酸序列（或那個(gè)序列編碼 的蛋白質(zhì)產(chǎn)物）放置異源序列，以使這個(gè)內(nèi)源性核酸序列的表達(dá)被改變，那么所述內(nèi)源性 核酸序列在本文中被視為"重組的"。在這個(gè)情形下，異源序列是不天然鄰近于內(nèi)源性核酸 序列的序列，無(wú)論所述異源序列是否本身是內(nèi)源性的（源于相同宿主細(xì)胞或其子代）或外 源性的（源于不同宿主細(xì)胞或其子代）。舉例來(lái)說(shuō)，啟動(dòng)子序列可取代（例如，通過(guò)同源重 組）宿主細(xì)胞的基因組中的基因的天然啟動(dòng)子，以使這個(gè)基因具有改變的表達(dá)樣式。這個(gè) 基因現(xiàn)將變?yōu)?重組的"，因?yàn)樗c天然側(cè)接它的至少一些序列分離。
[0083] 如果核酸含有不天然存在于基因組中的相應(yīng)核酸中的任何修飾，那么它也被視為 "重組的"。舉例來(lái)說(shuō)，如果內(nèi)源性編碼序列含有例如通過(guò)人為干預(yù)來(lái)人工引入的插入、缺失 或點(diǎn)突變，那么它被視為"重組的"。"重組核酸"也包括在異源位點(diǎn)處整合至宿主細(xì)胞染色 體中的核酸和以游離體形式存在的核酸構(gòu)建體。
[0084] 如本文所用，短語(yǔ)參照核酸序列的"簡(jiǎn)并變體"涵蓋可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)遺傳密碼翻譯以提 供與自所述參照核酸序列翻譯的氨基酸序列一致的氨基酸序列的核酸序列。術(shù)語(yǔ)"簡(jiǎn)并寡 核苷酸"或"簡(jiǎn)并引物"用于表示能夠與在序列方面未必一致，但在一個(gè)或多個(gè)特定區(qū)段內(nèi) 彼此同源的靶標(biāo)核酸序列雜交的寡核苷酸。
[0085] 術(shù)語(yǔ)"序列同一性百分比"或"同一"在核酸序列的情形下是指當(dāng)比對(duì)以達(dá)成最 大對(duì)應(yīng)時(shí)，兩個(gè)序列中的殘基是相同的。序列同一性比較的長(zhǎng)度可為歷經(jīng)至少約9個(gè)核苷 酸、通常至少約20個(gè)核苷酸、更通常至少約24個(gè)核苷酸、通常至少約28個(gè)核苷酸、更通常 至少約32個(gè)、且甚至更通常至少約36個(gè)或更多個(gè)核苷酸的鏈段。存在本領(lǐng)域中已知的 可用于測(cè)量核苷酸序列同一性的許多不同算法。舉例來(lái)說(shuō)，可使用威斯康星程序包10.0 版（Genetics Computer Group (GCG) ,Madison, Wis)中的程序 FASTA、Gap 或 Bestfit 比 較多核苷酸序列。FASTA提供在查詢序列與搜索序列之間最佳重疊的區(qū)域的比對(duì)和序列 同一性百分比。Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990)。舉例來(lái)說(shuō)，如以引用的方 式并入本文的GCG 6. 1版中所提供，可使用FASTA以它的缺省參數(shù)（字長(zhǎng)6和用于計(jì)分矩 陣的NOPAM因子）或使用Gap以它的缺省參數(shù)確定核酸序列之間的序列同一性百分比。 或者，可使用計(jì)算機(jī)程序 BLAST (Altschul 等，J. Mol. Biol. 215:403-410(1990) ;Gish 和 States, Nature Genet. 3:266-272 (1993) ;Madden 等，Meth. Enzymol. 266:131-141 (1996); Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997) ;Zhang 和 Madden, Genome Res.7:649-656 (1997)),尤其 blastp 或 tblastn(Altschul 等，Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997))比較序列。
[0086] 術(shù)語(yǔ)"實(shí)質(zhì)性同源性"或"實(shí)質(zhì)性類似性"在關(guān)于核酸或其片段時(shí)指示當(dāng)在適當(dāng)核 苷酸插入或缺失下與另一核酸（或它的互補(bǔ)鏈）最優(yōu)比對(duì)時(shí)，在至少約76%、80%、85%、或 至少約90 %、或至少約95 %、96 %、97 %、98 %或99 %的核苷酸堿基中存在核苷酸序列同一 性，如通過(guò)序列同一性的任何熟知算法，如如上所論述的FASTA、BLAST或Gap所測(cè)量。
[0087] 或者，當(dāng)核酸或其片段與另一核酸、另一核酸的一條鏈、或其互補(bǔ)鏈在嚴(yán)格雜交條 件下雜交時(shí)，存在實(shí)質(zhì)性同源性或類似性。"嚴(yán)格雜交條件"和"嚴(yán)格洗滌條件"在核酸雜交 實(shí)驗(yàn)的情形下取決于許多不同物理參數(shù)。核酸雜交將受如以下的條件影響：鹽濃度、溫度、 溶劑、雜交物質(zhì)的堿基組成、互補(bǔ)區(qū)域的長(zhǎng)度和雜交核酸之間的核苷酸堿基錯(cuò)配數(shù)目，如將 易于為本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解如何改變這些參數(shù)來(lái)達(dá)成特定雜 交嚴(yán)格性。
[0088] 一般來(lái)說(shuō)，特定DNA雜交物的"嚴(yán)格雜交"是在約25°C下在低于熱熔點(diǎn)（Tm)下在 一組特定條件下進(jìn)行。特定DNA雜交物的"嚴(yán)格洗滌"是在溫度約5°C下在低于Tm下在一 組特定條件下進(jìn)行。Tm是50%靶標(biāo)序列與完全匹配探針雜交所處的溫度。參見(jiàn)Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)，第9. 51頁(yè)。出于本文目的，溶液相雜交的"嚴(yán)格 條件"被定義為在65°C下在6xSSC(其中20xSSC含有3. OM NaCl和0. 3M檸檬酸鈉）、1 % SDS中進(jìn)行水性雜交（即不含甲酰胺）8-12小時(shí)，隨后在65°C下在0. 2xSSC、0. 1%SDS中進(jìn) 行2次20分鐘洗滌。熟練工作者應(yīng)了解的是在65°C下雜交將取決于許多因素而在不同速 率下發(fā)生，所述因素包括雜交的序列的長(zhǎng)度和同一性百分比。
[0089] 如本文所用，"表達(dá)控制序列"是指為實(shí)現(xiàn)它們所可操作地連接的編碼序列的表達(dá) 所必需的多核苷酸序列。表達(dá)控制序列是控制核酸序列的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后事件和翻譯的序列。 表達(dá)控制序列包括適當(dāng)轉(zhuǎn)錄啟始、終止、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列；高效RNA加工信號(hào)，如剪接 和聚腺苷酸化信號(hào)；使細(xì)胞質(zhì)mRNA穩(wěn)定的序列；增強(qiáng)翻譯效率的序列（例如，核糖體結(jié)合 位點(diǎn)）；增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的序列；和當(dāng)需要時(shí)，增強(qiáng)蛋白質(zhì)分泌的序列。所述控制序列的 性質(zhì)視宿主生物體而不同；在原核生物中，所述控制序列通常包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn) 和轉(zhuǎn)錄終止序列。術(shù)語(yǔ)"控制序列"意圖至少涵蓋其存在為表達(dá)所必需的任何組分，且也可 涵蓋其存在是有利的其它組分，例如前導(dǎo)序列和融合配偶體序列。
[0090] 如本文所用，"可操作地連接的"表達(dá)控制序列是指以下連接：表達(dá)控制序列與目 標(biāo)基因鄰接以控制所述目標(biāo)基因，以及表達(dá)控制序列反式作用或在一定距離下控制所述目 標(biāo)基因的作用。
[0091] 如本文所用，"載體"意圖指代能夠轉(zhuǎn)運(yùn)它已連接的另一核酸的核酸分子。一種載 體類型是"質(zhì)粒"，其通常是指可向其中連接其它DNA區(qū)段的環(huán)狀雙鏈DNA環(huán)，但也包括線性 雙鏈分子，如通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)由擴(kuò)增或由用限制酶處理環(huán)狀質(zhì)粒產(chǎn)生的線性雙 鏈分子。其它載體包括粘粒、細(xì)菌人工染色體（BAC)和酵母人工染色體（YAC)。另一載體類 型是病毒載體，其中可將其它DNA區(qū)段連接至病毒基因組中（以下更詳細(xì)論述）。某些載體 能夠在它們所引入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制（例如，具有在宿主細(xì)胞中起作用的復(fù)制起點(diǎn)的 載體）。其它載體可在引入宿主細(xì)胞中后整合至所述宿主細(xì)胞的基因組中，且由此與宿主基 因組一起復(fù)制。此外，某些載體能夠指導(dǎo)它們所可操作地連接的基因的表達(dá)。所述載體在 本文中稱為"重組表達(dá)載體"（或簡(jiǎn)稱為"表達(dá)載體"）。
[0092] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"（或簡(jiǎn)稱為"重組細(xì)胞"或"宿主細(xì)胞"）意圖 指代已引入有如重組載體的重組核酸的細(xì)胞。在一些情況下，用詞"細(xì)胞"由指定細(xì)胞類型 的名稱替代。舉例來(lái)說(shuō)，"重組微生物"是為微生物宿主細(xì)胞的重組宿主細(xì)胞。應(yīng)了解的是 所述術(shù)語(yǔ)意圖不僅指代特定受試細(xì)胞，而且指代所述細(xì)胞的子代。因?yàn)槟承┬揎椏捎捎谕?變或環(huán)境影響而發(fā)生在繼代中，所以所述子代可能實(shí)際上不與親本細(xì)胞一致，但仍然包括 在如本文所用的術(shù)語(yǔ)"重組宿主細(xì)胞"、"重組細(xì)胞"和"宿主細(xì)胞"的范圍內(nèi)。重組宿主細(xì) 胞可為生長(zhǎng)在培養(yǎng)物中的分離的細(xì)胞或細(xì)胞系或可為存在于活組織或生物體中的細(xì)胞。 [0093] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"異養(yǎng)性"是指生物體不能固定碳且使用有機(jī)碳來(lái)生長(zhǎng)。
[0094] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"自養(yǎng)性"是指生物體使用來(lái)自光（通過(guò)光合作用）或無(wú)機(jī)化學(xué) 反應(yīng)（化學(xué)合成）的能量自簡(jiǎn)單無(wú)機(jī)分子產(chǎn)生復(fù)雜有機(jī)化合物（如碳水化合物、脂肪和蛋 白質(zhì)）。
[0095] 如本文所用，"肌肉質(zhì)量"是指受試者的身體中的肌肉重量。肌肉質(zhì)量包括骨骼肌、 平滑?。ㄈ缧呐K和消化道肌肉）和這些肌肉中含有的水。特定肌肉的肌肉質(zhì)量可使用雙能 X射線吸光測(cè)定法（DEXA) (Padden-Jones等，2004)來(lái)測(cè)定?？偸蒹w重（減去脂肪）、總身 體質(zhì)量和骨礦物質(zhì)含量也可通過(guò)DEXA來(lái)測(cè)量。在一些實(shí)施方案中，受試者的特定肌肉的肌 肉質(zhì)量的變化是例如通過(guò)DEXA來(lái)測(cè)定，且所述變化用作所述受試者的肌肉質(zhì)量的總變化 的代表。因此，舉例來(lái)說(shuō)，如果受試者消耗如本文公開(kāi)的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)且歷經(jīng)一段時(shí)期經(jīng)歷 特定肌肉或肌肉群中的肌肉質(zhì)量增加，那么可推斷所述受試者已經(jīng)歷肌肉質(zhì)量增加。
[0096] 如本文所用，"肌肉強(qiáng)度"是指在單次最大出力下，肌肉可產(chǎn)生的力的量。存在兩種 類型的肌肉強(qiáng)度，即靜態(tài)強(qiáng)度和動(dòng)態(tài)強(qiáng)度。靜態(tài)強(qiáng)度是指肌肉的等長(zhǎng)收縮，其中肌肉產(chǎn)生力 量，而肌肉長(zhǎng)度保持恒定和/或此時(shí)不存在關(guān)節(jié)運(yùn)動(dòng)。實(shí)例包括固持或攜帶物件或相對(duì)于 墻壁推進(jìn)。動(dòng)態(tài)強(qiáng)度是指肌肉產(chǎn)生導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)的力量。動(dòng)態(tài)強(qiáng)度可為等張收縮，其中肌肉在 恒定負(fù)荷或等動(dòng)力收縮下縮短，其中肌肉在恒定速度下收縮且縮短。動(dòng)態(tài)強(qiáng)度也可包括等 慣性強(qiáng)度。
[0097] 除非指定，否則"肌肉強(qiáng)度"是指最大動(dòng)態(tài)肌肉強(qiáng)度。最大強(qiáng)度稱為"最大重復(fù)一 次"（IRM)。這是可在不失敗或損傷下完全移動(dòng)（提升、推進(jìn)或牽拉）最大負(fù)荷（以千克 計(jì)）一次的測(cè)量結(jié)果。這個(gè)值可直接測(cè)量，但這樣做需要增加重量直至受試者未能將活動(dòng) 進(jìn)行完畢。或者，IRM是通過(guò)使用小于受試者可移動(dòng)的最大量的負(fù)荷，對(duì)受試者可達(dá)成的最 大運(yùn)動(dòng)重復(fù)次數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)估計(jì)。常在臨床試驗(yàn)中測(cè)量腿部伸展和腿部彎曲（Borsheim 等，"Effect of amino acid supplementation on muscle mass, strength and physical function in elderly，" Clin Nutr 2008;27:189-195 ;Paddon_Jones，等，"Essential amino acid and carbohydrate supplementation ameliorates muscle protein loss in humans during 28days bed rest，"J Clin Endocrinol Metab 2004;89:4351-4358)。
[0098] 如本文所用，"功能性表現(xiàn)"是指模擬每日活動(dòng)的功能性測(cè)試。"功能性表現(xiàn)"是 通過(guò)任何適合接受測(cè)試來(lái)測(cè)量，所述測(cè)試包括定時(shí)舉步測(cè)試（自4英寸臺(tái)階盡可能快地 上下舉步5次）、定時(shí)平臺(tái)傳送測(cè)試（在平臺(tái)上盡可能快地自立位變?yōu)檠雠P位且此后再次 向上變?yōu)榱⑽唬貜?fù)一次）、和身體表現(xiàn)連串測(cè)試（靜態(tài)平衡測(cè)試、坐椅測(cè)試和行走測(cè)試） (Borsheim等，"Effect of amino acid supplementation on muscle mass, strength and physical function in elderly， "Clin Nutr 2008;27:189-195)。
[0099] 如本文所用，"身體質(zhì)量指數(shù)"或"BMI"或"克托萊指數(shù)（Quetelet index)"是以 千克計(jì)的受試者的重量除以以米計(jì)的受試者的身高的平方（kg/m2)。
[0100] 對(duì)于成人，常使用BMI來(lái)評(píng)估個(gè)體的體重偏離具有他的或她的身高的人士的正常 或合乎需要體重的程度。重量過(guò)度或不足可部分地用身體脂肪來(lái)解釋，但如肌肉發(fā)達(dá)性的 其它因素也顯著影響B(tài)MI。世界衛(wèi)生組織將BMI小于18. 5視為重量不足且可指示營(yíng)養(yǎng)不良、 飲食病癥或其它健康問(wèn)題，而B(niǎo)MI大于25被視為超重且高于30被視為肥胖。（世界衛(wèi)生組 織。BMI 分類。2012 年 3 月 19 日訪問(wèn) http://apps.who. int/bmi/index.jsp ? introPage =intro_3.html.)如本文所用，"合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)"是身體質(zhì)量指數(shù)自約18.5至 約25。因此，如果受試者的BMI低于約18. 5,那么所述受試者的BMI增加是所述受試者的 BMI的合乎需要增加。如果相反，受試者的BMI高于約25,那么所述受試者的BMI降低是所 述受試者的BMI的合乎需要增加。
[0101] 如本文所用，"年長(zhǎng)"哺乳動(dòng)物是經(jīng)歷身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量的至少一者的年齡 相關(guān)變化（例如，年齡相關(guān)肌肉減少癥）的哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，"年長(zhǎng)"人是至少 50歲、至少60歲、至少65歲、至少70歲、至少75歲、至少80歲、至少85歲、至少90歲、至 少95歲或至少100歲。在一些實(shí)施方案中，年長(zhǎng)動(dòng)物、哺乳動(dòng)物或人是已經(jīng)歷肌肉質(zhì)量自 峰值壽命肌肉質(zhì)量損失至少5 %、至少10 %、至少15 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %、至 少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %或至少60 %的人。因?yàn)橐阎眢w質(zhì)量 指數(shù)和肌肉質(zhì)量的至少一者的年齡相關(guān)變化與年齡增加相關(guān)，所以在一些實(shí)施方案中，僅 基于年齡鑒定或確定年長(zhǎng)哺乳動(dòng)物。因此，在一些實(shí)施方案中，"年長(zhǎng)"人是通過(guò)他們的年 齡是至少60歲、至少65歲、至少70歲、至少75歲、至少80歲、至少85歲、至少90歲、至少 95歲或至少100歲的事實(shí)，而不依靠身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量的至少一者的測(cè)量結(jié)果來(lái)簡(jiǎn) 單地鑒定或確定。
[0102] 如本文所用，如果患者由于醫(yī)學(xué)疾病而經(jīng)歷身體質(zhì)量指數(shù)和肌肉質(zhì)量的至少一者 的變化（例如，肌肉減少癥），那么所述患者患有"醫(yī)學(xué)上危急疾病"。在一些實(shí)施方案中，患 者持續(xù)他們醒來(lái)時(shí)間的至少25%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、 至少95%或100%被限制臥床。在一些實(shí)施方案中，患者是無(wú)意識(shí)的。在一些實(shí)施方案中， 患者已如這個(gè)段落中所述被限制臥床至少1天、2天、3天、4天、5天、10天、2周、3周、4周、 5周、10周或更長(zhǎng)。
[0103] 如本文所用，"蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良癥"是指一種形式的營(yíng)養(yǎng)不良，其中存在蛋白 質(zhì)攝取不充分。類型包括夸休可爾癥（Kwashiorkor)(突出性蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良）、消瘦（缺 乏卡路里與蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物兩者）和消瘦性夸休可爾癥（存在顯著蛋白質(zhì)缺乏和顯著卡路里 不足征象，有時(shí)稱為最重度形式的營(yíng)養(yǎng)不良）。
[0104] 如本文所用，"惡病質(zhì)"是指導(dǎo)致?lián)p耗和重量減輕的多層面臨床綜合征。它是一種 復(fù)雜病狀，其中蛋白質(zhì)分解代謝超過(guò)蛋白質(zhì)合成代謝，此使得肌肉損耗成為所述病狀的主 要特征。除蛋白質(zhì)代謝的代謝紊亂之外，它的特征也在于厭食和發(fā)炎。這些紊亂加上蛋白 質(zhì)代謝受損在不同程度上對(duì)營(yíng)養(yǎng)物療法起反應(yīng)。
[0105] 如本文所用，"產(chǎn)熱"是哺乳動(dòng)物中的熱產(chǎn)生過(guò)程。產(chǎn)熱伴隨有能量消耗增加。產(chǎn) 熱具體來(lái)說(shuō)是在食物組分（如蛋白質(zhì)）代謝之后燃燒能量。這也可稱為食物的熱效應(yīng)。由 個(gè)體消耗的總能量等于靜息能量消耗（在空腹?fàn)顟B(tài)下在靜息時(shí)消耗來(lái)支撐基礎(chǔ)代謝的能 量）、食物的熱效應(yīng)和與身體活動(dòng)相關(guān)的能量消耗的總和。靜息能量消耗占人中總能量消 耗的約65-75%。肌肉質(zhì)量的量和活性是靜息能量消耗的一種影響因素。足以支撐肌肉的 蛋白質(zhì)消耗也影響靜息能量消耗。蛋白質(zhì)的攝取傾向于增加餐后能量消耗；這是食物的熱 效應(yīng)。食物的熱效應(yīng)占人中總能量消耗的約10%。盡管這是總能量消耗的較小比例，但這 個(gè)值的較小增加可影響體重。蛋白質(zhì)具有的熱效應(yīng)高于脂肪或碳水化合物；這個(gè)效應(yīng)連同 蛋白質(zhì)的其它代謝影響一起使得蛋白質(zhì)成為適用于重量控制、糖尿病管理和其它情況的基 質(zhì)。
[0106] 如本文所用，"飽足"是當(dāng)進(jìn)食時(shí)變飽或?qū)M(jìn)食的需求降低的行為。這會(huì)停止或減 少進(jìn)食。
[0107] 如本文所用，"飽腹感"是餐后保持飽滿的行為，其表示為餐后不進(jìn)食的時(shí)期。
[0108] 如本文所用，最廣泛而言，"運(yùn)動(dòng)"是增強(qiáng)或維持身體康健以及總體健康和安康的 任何身體活動(dòng)。運(yùn)動(dòng)是出于各種原因來(lái)進(jìn)行，包括強(qiáng)化肌肉和心血管系統(tǒng)、磨練運(yùn)動(dòng)技能、 減輕或維持重量以及出于享樂(lè)的目的。
[0109] 如本文所用，"足量"是本文公開(kāi)的蛋白質(zhì)或多肽足以產(chǎn)生所需作用的量。舉例來(lái) 說(shuō)，如果需要肌肉質(zhì)量增加，那么足量是歷經(jīng)一段時(shí)期導(dǎo)致肌肉質(zhì)量增加的量。足量蛋白質(zhì) 或多肽片段可直接（即通過(guò)向受試者施用所述蛋白質(zhì)或多肽片段）提供，或它可作為包含 所述蛋白質(zhì)或多肽片段的組合物的一部分提供。在本文中其它地方論述施用模式。
[0110] 如本文所用，術(shù)語(yǔ)"哺乳動(dòng)物"是指分類類別哺乳綱的任何成員，包括胎盤哺乳動(dòng) 物和有袋哺乳動(dòng)物。因此，"哺乳動(dòng)物"包括人、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、家畜和實(shí)驗(yàn)室哺乳動(dòng)物。示例 性哺乳動(dòng)物包括嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、兔、狗、貓、綿羊、馬、山羊、美洲駝、牛、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、 豬和任何其它哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物、遺傳工程化哺乳 動(dòng)物和克隆哺乳動(dòng)物中的至少一者。
[0111] A.營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)
[0112] 出于本公開(kāi)的目的，"營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)"是含有合乎需要量的必需氨基酸的蛋白質(zhì)。 在一些實(shí)施方案中，以重量計(jì)，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含至少30%必需氨基酸。在一些實(shí)施方案 中，以重量計(jì)，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含至少40%必需氨基酸。在一些實(shí)施方案中，以重量計(jì)，營(yíng)養(yǎng) 性蛋白質(zhì)包含至少50%必需氨基酸。在一些實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含以下或由以下 組成：天然存在于可食用物質(zhì)中的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段。"可食用物質(zhì)"以它的最廣泛意 義涵蓋已知由至少一種類型的哺乳動(dòng)物進(jìn)食而無(wú)有害作用的任何物質(zhì)。有害作用包括有毒 作用和毒性作用。在一些實(shí)施方案中，可食用物質(zhì)是已知由人進(jìn)食而無(wú)有害作用的物質(zhì)。一 些可食用物質(zhì)是處于有限地理位置的僅一小組某一類型的哺乳動(dòng)物的膳食的不常見(jiàn)但已 知的組分，而其它可食用物質(zhì)是遍及世界上大部分區(qū)域的膳食主要成分。在其它實(shí)施方案 中，可食用物質(zhì)是不知先前由任何哺乳動(dòng)物進(jìn)食，但在測(cè)試后被證明可食用的物質(zhì)?？墒秤?物質(zhì)包括但不限于特倫納棉（Gossypium turneri)、白黃側(cè)耳（Pleurotus cornucopiae)、 大豆（Glycine max)、水稻（Oryza sativa)、大眼金槍魚(yú)（Thunnus obesus)、荀片冷杉 (Abies bracteata)、紅腹刺鼠 （Acomys ignitus)、葉軸香豌豆（Lathyrus aphaca)、印度野 牛（Bos gaurus)、黑耳巖玲（Raphicerus melanotis)、格陵蘭海豹（Phoca groenlandica)、中華舞（Acipenser sinensis)、馬來(lái)靈貓（Viverra tangalunga)、漏斗狀 側(cè)耳（Pleurotus sajor-caju)、苦養(yǎng)麥（Fagopyrum tataricum)、美國(guó)五針?biāo)桑≒inus strobus)、大花牽牛（Ipomoea nil)、東北紅豆杉（Taxus cuspidata)、械葉小牽牛 (Ipomoea wrightii)、砂海螂（Mya arenaria)、美味稱猴桃（Actinidia deliciosa)、戈氏 瞪玲（Gazella granti)、歐洲山楊（Populus tremula)、西洋李（Prunus domestica)、銀區(qū)鳥(niǎo) (Larus argentatus)、毛野豌豆（Vicia villosa)、乳斑棘鱗魚(yú)（Sargocentron punctatissimum)、叉枝妮子草（Silene Iatifolia)、霍氏海豚（Lagenodelphis hosei)、大 西洋浪始（Spisula solidissima)、暗長(zhǎng)毛朦（Crossarchus obscurus)、赤豆（Phaseolus angularis) Λ Lathyrus vestitus、細(xì)鱗大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus gorbuscha)、密西西t匕短 吻鱷（Alligator mississippiensis)、哈列朋松（Pinus halepensis)、海區(qū)鳥(niǎo)（Larus canus)、憲菁甘藍(lán)（Brassica napus)、麥瓶草（Silene cucubalus)、帶紋海豹（Phoca fasciata)、印度瞪玲（Gazella bennettii)、火炬松（Pinus taeda)、加拿大紅豆杉（Taxus canadensis)、鱗批澤米（Zamia furfuracea)、云南松（Pinus yunnanensis)、喬松（Pinus wallichiana)、石習(xí)桕（Asparagus officinalis)、風(fēng)鈴辣椒（Capsicum baccatum)、大盆地 刺果松（Pinus longaeva)、菜果紫杉（Taxus baccata)、西伯利亞紅松（Pinus sibirica)、 甜禮（Citrus sinensis)、條紋金鱗魚(yú)（Sargocentron xantherythrum)、美洲野牛（Bison bison)、湯姆森瞪玲（Gazella thomsonii)、救荒野豌豆（Vicia sativa)、加拿大黑雁 (Branta canadensis)、序菜(Apium graveolens)、檢皮械(Acer campestre)、完宴 (Coriandrum sativum)、圓維麥瓶草（Silene conica)、萵苣（Lactuca sativa)、黃燈籠辣 椒（Capsicum chinense)、白檜（Abies veitchii)、家山羊（Capra hircus)、斯氏瞪玲 (Gazella spekei)、大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus keta)、小心葉薯（Ipomoea obscura)、菜瓜 (Cucumis melo var.conomon)、環(huán)斑海豹（Phoca hispida)、火狐（Vulpes vulpes)、羽葉鳥(niǎo) 蘿（Ipomoea quamoclit)、多毛番煎（Solanum habrochaites)、楊屬的種（Populus sp·)、 剛松（Pinus rigida)、提琴葉櫟（Quercus lyrata)、多花菜豆（Phaseolus coccineus)、紅 嘴區(qū)鳥(niǎo)（Larus ridibundus)、尖吻棘鱗魚(yú)（Sargocentron spiniferum)、金槍魚(yú)（Thunnus thynnus)、北極狐（Vulpes lagopus)、大額印度野牛（Bos gaurus frontalis)、意大利槭 (Acer opalus)、雞爪械（Acer palmatum)、石櫟（Quercus ilex)、中歐山松（Pinus mugo)、 赤頸鶴（Grus antigone)、山地松（Pinus uncinata)、烏梅（Prunus mume)、大鱗大馬哈魚(yú) (Oncorhynchus tschawytscha)、鵝喉玲（Gazella subgutturosa)、耳廓狐（Vulpes zerda)、大果松（Pinus coulteri)、海島棉（Gossypium barbadense)、歐亞械（Acer pseudoplatanus)、紅大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus nerka)、須野豬（Sus barbatus)、養(yǎng)麥袓先 亞種（Fagopyrum esculentum subsp.Ancestrale)、朿丨描菜薊（Cynara cardunculus)、綠豆 (Phaseolus aureus)、黑楊（Populus nigra)、施溫迪茫棉（Gossypium schwendimanii)、野 生馬鈴薯（Solanum chacoense)、赤櫟（Quercus rubra)、黃瓜（Cucumis sativus)、普通斑 馬（Equus burchelli)、銀士麻哈魚(yú)（Oncorhynchus kisutch)、福射松（Pinus radiata)、 港海豹（Phoca vitulina richardsi)、黑頸鶴（Grus nigricollis)、大冷杉（Abies grandis)、孟蘇大麻哈魚(yú)（Oncorhynchus masou)、菠菜（Spinacia oleracea)、智利番煎 (Solanum chilense)、旋角玲（Addax nasomaculatus)、甘薯（Ipomoea batatas)、格列威斑 馬（Equus grevyi)、庫(kù)頁(yè)冷杉（Abies sachalinensis)、意大利石松（Pinus pinea)、康氏 蹄幅（Hipposideros commersoni)、走莖番紅花（Crocus nudiflorus)、柚（Citrus maxima)、美洲舞（Acipenser transmontanus)、擬似棉（Gossypium gossypioides)、廣香貓 (Viverra zibetha)、西里櫟（Quercus cerris)、斑頭雁（Anser indicus)、狐尾松（Pinus balfouriana)、黃雪輪（Silene otites)、大麻哈魚(yú)屬的種（Oncorhynchus sp.)、大斑靈貓 (Viverra megaspila)、野耗牛（Bos mutus grunniens)、濕地松（Pinus elliottii)、土庫(kù) 曼野馬戶（Equus hemionus kulan)、羱羊（Capra ibex ibex)、大蒜（Allium sativum)、蘿卜 (Raphanus sativus)、萌芽松（Pinus echinata)、野黑樓（Prunus serotina)、白紋觸 (Sargocentron diadema)、匙葉麥瓶草（Silene gallica)、甘藍(lán)（Brassica oleracea)、古月 蘿卜（Daucus carota)、蟲(chóng)工蹲（Oncorhynchus mykiss)、芥藍(lán)（Brassica oleracea var. alboglabra)、陸地棉（Gossypium hirsutum)、歐洲冷杉（Abies alba)、柑桔（Citrus reticulata)、菊苣（Cichorium intybus)、柬埔寨野牛（Bos sauveli)、馬馬它（Lama glama)、玉米（Zea mays)、石菖?。ˋcorus gramineus)、赤狐（Vulpes macrotis)、盤羊蒙 古亞種（Ovis ammon darwini)、沙氏石玲（Raphicerus sharpei)、扭葉松（Pinus contorta)、瘤牛（Bos indicus)、西伯利亞北山羊（Capra sibirica)、西黃松（Pinus ponderosa)、苦杏仁（Prunus dulcis)、馬鈴薯（Solanum sogarandinum)、蕹菜（Ipomoea aquatica)、白 _ 斑紋海豚（Lagenorhynchus albirostris)、加拿大盤羊（Ovis canadensis)、歐洲甜樓桃（Prunus avium)、鹿瞪玲（Gazella dama)、長(zhǎng)鰭金槍魚(yú)（Thunnus alalunga)、白花妮子草（Silene pratensis)、瑞士松（Pinus cembra)、番紅花（Crocus sativus)、西瓜（Citrullus lanatus)、紅額瞪玲（Gazella rufifrons)、亞洲芥（Brassica tournefortii)、擒角山羊（Capra falconeri)、民都洛水牛（Bubalus mindorensis)、長(zhǎng)葉 松（Pinus palustris)、月桂樓（Prunus laurocerasus)、白枕鶴（Grus vipio)、牽?；?(Ipomoea purpurea)、平滑葉松（Pinus leiophylla)、暗色斑紋海豚（Lagenorhynchus obscurus)、小巖玲(Raphicerus campestris)、大白菜(Brassica rapa subsp. Pekinensis)、Acmella radicans、三裂葉薯（Ipomoea triloba)、展葉松（Pinus patula)、 舌甘瓜（Cucumis melo)、矮松(Pinus virginiana)、番煎（Solanum lycopersicum)、赤松 (Pinus densiflora)、大葉松（Pinus engelmannii)、歐洲白櫟（Quercus robur)、刺毛月光 花（Ipomoea setosa)、紅平燕（Pleurotus djamor)、晃蹄幅（Hipposideros diadema)、綿 羊（Ovis aries)、長(zhǎng)棘鱗魚(yú)（Sargocentron microstoma)、花莖甘藍(lán)（Brassica oleracea var.italica)、東高力卩索羱羊（Capra cylindricornis)、雜交白楊（Populus kitakamiensis)、編織蔥(Allium textile)、香豆(Vicia faba)、養(yǎng)麥(Fagopyrum esculentum)、草原野牛(Bison priscus)、栓皮櫟(Quercus suber)、Lagophylla ramosissima、馬達(dá)力口斯力口地結(jié)(Acrantophis madagascariensis)、西伯利亞魚(yú)尋（Acipenser baerii)、樓桃辣椒（Capsicum annuum)、小麥（Triticum aestivum)、爪蟾（Xenopus Iaevis)、西伯利亞海豹（Phoca sibirica)、納氏舞（Acipenser naccarii)、中華稱猴桃 (Actinidia chinensis)、白大角羊（Ovis dalli)、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、菲律賓水 牛（Bubalus carabanensis)、粗梓樣（Citrus jambhiri)、歐洲野牛（Bison bonasus)、非 洲野驢（Equus asinus)、低地倭水牛（Bubalus depressicornis)、刺序側(cè)耳（Pleurotus eryngii)、矮煎（Solanum demissum)、赤羊（Ovis vignei)、野生玉米（Zea mays subsp. Parviglumis)、丹吉爾山黧豆（Lathyrus tingitanus)、百歲蘭（Welwitschia mirabilis)、 澳洲鶴（Grus rubicunda)、禮紅鳥(niǎo)蘿（Ipomoea coccinea)、洋蔥（Allium cepa)、索曼莫格 齊瞪玲（Gazella soe_erringii)、憲菁（Brassica rapa)、痩馬它（Lama vicugna)、秘魯番 煎（Solanum peruvianum)、北歐爪蟾（Xenopus borealis)、高加索山羊（Capra caucasica)、黃鰭鮪(Thunnus albacares)、山斑馬(Equus zebra)、原雞(Gallus gal Ius)、野生墨西哥土豆（Solanum bulbocastanum)、臺(tái)灣葉鼻幅（Hipposideros terasensis)、白腰斑紋海豚（Lagenorhynchus acutus)、河馬（Hippopotamus amphibius)、 紅松（Pinus koraiensis)、蒙皮利埃械（Acer monspessulanum)、三角葉楊（Populus deltoides)、毛果楊（Populus trichocarpa)、俄羅斯舞（Acipenser guldenstadti)、黑松 (Pinus thunbergii)、結(jié)球甘藍(lán)（Brassica oleracea var.capitata)、柯氏淵杜父魚(yú) (Abyssocottus korotneffi)、居維葉瞪玲（Gazella cuvieri)、日光冷杉（Abies homolepis)、遼東冷杉（Abies holophylla)、山瞪玲（Gazella gazella)、五針?biāo)桑≒inus parviflora)、習(xí)習(xí)衣甘藍(lán)（Brassica oleracea var. acephala)、西葫蘆（Cucurbita pepo)、 華山松（Pinus armandii)、大白葉冷杉（Abies mariesii)、太平洋黑鮪（Thunnus thynnus orientalis)、溫州蜜柑（Citrus unshiu)、契斯曼尼番煎（Solanum cheesmanii)、太平洋短 吻海豚（Lagenorhynchus obiiquidens)、挪威械（Acer platanoides)、梓樣（Citrus limon)、杜氏納（Acrantophis dumerili)、科民煎(Solanum commersonii)、木本棉 (Gossypium arboreum)、桃（Primus persica)、糖皮側(cè)耳（Pleurotus ostreatus)、日本冷 杉（Abies firma)、細(xì)角玲（Gazella Ieptoceros)、鹽湖鮭魚(yú)（Salmo salar)、美洲海螯蟲(chóng)下 (Homarus americanus)、紫果冷杉（Abies magnifica)、爪卩圭野牛（Bos javanicus)、環(huán)斑海 豹（Phoca Iargha)、卷毛野豬（Sus cebifrons)、煎子（Solanum melongena)、海豹（Phoca vitulina)、歐洲赤松（Pinus sylvestris)、佛州澤米（Zamia floridana)、沙狐（Vulpes corsac)、MM· (Allium porrum)、里海海豹（Phoca caspica)、南非狐（Vulpes chama)、中 國(guó)紅豆杉（Taxus chinensis)、花椰菜（Brassica oleracea var. botrytis)、灰雁（Anser anser anser)、金甲豆（Phaseolus Iunatus)、油菜（Brassica campestris)、糖械（Acer saccharum)、偃松（Pinus pumi la)、潘那利番煎（Solanum pennel Ii i)、可食松（Pinus edulis)、南方牽牛（Ipomoea cordatotriloba)、銀白楊（Populus alba)、克拉克大麻哈魚(yú) (Oncorhynchus clarki)、無(wú)?；担≦uercus petraea)、多撫野豬（Sus verrucosus)、野生 蒙古野馬（Equus caballus przewalskii)、胡楊（Populus euphratica)、熱帶爪蟾 (Xenopus tropicalis)、短葉紫杉（Taxus 13代￥丨：[>011&)、原5它（1^111& guanicoe)、北美短葉 松（Pinus banksiana)、龍葵（Solanum nigrum)、印尼野豬（Sus celebensis)、芥菜 (Brassica juncea)、大西洋斑紋海豚（Lagenorhynchus cruciger)、顫楊（Populus tremuloides)、刺針?biāo)桑≒inus pungens)、西里伯斯野水牛（Bubalus quarlesi)、Quercus gamelliflora、歐洲盤羊（Ovis orientalis musimon)、印度水牛（Bubalus bubalis)、琉球 松（Pinus Iuchuensis)、菲律賓野豬（Sus philippensis)、菜豆（Phaseolus vulgaris)、 海蹲（Salmo trutta)、波斯舞（Acipenser persicus)、野生種馬鈴薯（Solanum brevidens)、多脂松（Pinus resinosa)、黑馬玲（Hippotragus niger)、努比亞羱羊（Capra nubiana)、Asparagus scaber、方寵轉(zhuǎn)牽牛（Ipomoea platensis)、野豬（Sus scrofa)、野山羊 (Capra aegagrus)、山黧豆（Lathyrus sativus)、赤鰭棘鱗魚(yú)（Sargocentron tiere)、大西 洋庸蝶（Hippoglossus hippoglossus)、美國(guó)菖蒲(Acorus americanus)、馬(Equus caballus)、歐洲牛（Bos taurus)、山芥（Barbarea vulgaris)、小羊馬它（Lama guanicoe pacos)、海岸松（Pinus pinaster)、普通章魚(yú)（Octopus vulgaris)、星花煎（Solanum crispum)、褐馬玲（Hippotragus equinus)、普通斑馬達(dá)馬亞種（Equus burchellii antiquorum)、亞氏長(zhǎng)毛朦（Crossarchus alexandri)、月光花（Ipomoea alba)、一粒小麥 (Triticum monococcum)、長(zhǎng)葉楊(Populus jackii)、皮氏斑紋海豚（Lagenorhynchus australis)、多卡瞪玲（Gazella dorcas)、胭脂蟲(chóng)櫟（Quercus coccifera)、雪雁（Anser caerulescens)、白菖蒲（Acorus calamus)、西藏長(zhǎng)葉松（Pinus roxburghii)、油松（Pinus tabuliformis)、費(fèi)切爾澤米（Zamia fischeri)、肉垂鶴（Grus carunculatus)、棘小鼠 (Acomys cahirinus)、網(wǎng)紋甜瓜（Cucumis melo var.reticulatus)、錫蘭野雞（Gallus lafayettei)、豌豆（Pisum sativum)、狹松（Pinus attenuata)、美國(guó)沙松（Pinus clausa)、沙特瞪玲（Gazella saudiya)、羱羊（Capra ibex)、三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida)、繁茂大當(dāng)草（Zea luxurians)、越南松（Pinus krempfii)、威氏刺毛鼠 （Acomys wilsoni)、繪葉石蛇床（Petroselinum crispum)、針櫟（Quercus palustris)、提莫菲維小 麥（Triticum timopheevi)、火雞（Meleagris gallopavo)、甘藍(lán)（Brassica oleracea)、甘 藍(lán)（Brassica oleracea)、舌甘菜（Beta vulgaris)、番煎（Solanum lycopersicum)、菜豆 (Phaseolus vulgaris)、劍魚(yú)（Xiphias gladius)、美洲條紋狼魚(yú)盧（Morone saxatilis)、大 口 黑魚(yú)盧（Micropterus salmoides)、巨扇貝（Placopecten magellanicus)、黍鯡（Sprattus sprattus)、大西洋鯡（Clupea harengus)、歐洲銳（Engraulis encrasicolus)、輿瓜 (Cucurbita maxima)、雙抱子蘑 ? (Agaricus bisporus)、香蕉(Musa acuminata x balbisiana)、蘋果（Malus domestica)、鷹嘴豆（Cicer arietinum)、綠頭鴨（Anas platyrhynchos)、大果酸果蔓（Vaccinium macrocarpum)、北美紅木莓（Rubus idaeus x strigosus)、矮叢藍(lán)莓（Vaccinium angustifolium)、草莓（Fragaria ananassa)、歐洲黑莓 (Rubus fruticosus)、舌甘瓜（Cucumis melo)、菠蘿（Ananas comosus)、西葫蘆（Cucurbita pepo)、南瓜(Cucurbita moschata)、家豬(Sus scrofa domesticus)、羅勒(Ocimum basilicum)、迷迭香（Rosmarinus officinalis)、茴香（Foeniculum vulgare)、波葉大黃 (Rheum rhabarbarum)、番木瓜（Carica papaya)、芒果（Mangifera indica)、美味稱猴桃 (Actinidia deliciosa)、杏（Prunus armeniaca)、歐洲甜樓桃（Prunus avium)、椰子 (Cocos nucifera)、油撤攬（Olea europaea)、西洋梨（Pyrus communis)、無(wú)花果（Ficus carica)、雞蛋果（Passiflora edulis)、水稻亞種粳稻（Oryza sativa subsp.Japonica)、 秈稻（Oryza sativa subsp. Indica)、鶴 _ (Coturnix coturnix)、釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0
[0113] 在一些實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)包含以下或由以下組成：天然存在于可食用物 質(zhì)中的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)的片段的衍生物或突變蛋白。所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)可稱為"工程化營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)"。在所述實(shí)施方案中，天然蛋白質(zhì)或其片段是"參照"蛋白質(zhì)或多肽且工程化營(yíng) 養(yǎng)性蛋白質(zhì)或其第一多肽序列相對(duì)于所述參照蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸序列包含至少一個(gè) 序列修飾。舉例來(lái)說(shuō)，在一些實(shí)施方案中，工程化營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)或其第一多肽序列與至少一 個(gè)參照營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)氨基酸序列至少40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 99. 5%同源。通常，工程化營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)或其第一多肽序列中存在的支鏈氨基酸殘基與總 氨基酸殘基的比率、必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率、以及亮氨酸殘基與總氨基酸 殘基的比率的至少一者大于參照營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)或多肽序列中存在的支鏈氨基酸殘基與總 氨基酸殘基的相應(yīng)比率、必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的相應(yīng)比率、以及亮氨酸殘基與 總氨基酸殘基的相應(yīng)比率的至少一者。
[0114] 在一些實(shí)施方案中，營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)是食物中的豐富蛋白質(zhì)或其衍生物或突變蛋 白，或是食物中的豐富蛋白質(zhì)或其衍生物或突變蛋白的片段。豐富蛋白質(zhì)是相對(duì)于食物中 存在的其它蛋白質(zhì)，以較高濃度存在于所述食物中的蛋白質(zhì)。食物可為處于有限地理位置 的僅一小組某一類型的哺乳動(dòng)物的膳食的已知組分，或?yàn)楸榧笆澜缟洗蟛糠謪^(qū)域的膳食主 要成分。在一些實(shí)施方案中，食物中的豐富蛋白質(zhì)選自雞蛋蛋白質(zhì)，如卵清蛋白、卵鐵傳遞 蛋白和卵類粘蛋白；肉蛋白質(zhì)，如肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、原肌凝蛋白、I父原蛋白和肌f丐蛋白； 谷類蛋白質(zhì)，如酪蛋白、a 1酪蛋白、α 2酪蛋白、β酪蛋白、K酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳 白蛋白、大豆球蛋白、β -伴大豆球蛋白、谷蛋白、谷醇溶蛋白、麥醇溶蛋白、麥谷蛋白、白蛋 白、球蛋白；雞肌肉蛋白質(zhì)，如白蛋白、烯醇酶、肌酸激酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸丙糖異 構(gòu)酶、載脂蛋白、卵鐵傳遞蛋白、葡糖磷酸變位酶、磷酸甘油酸激酶、甘油-3-磷酸脫氫酶、 3_磷酸甘油醛脫氫酶、血紅素、絲切蛋白、糖原磷酸化酶、果糖-1，6-二磷酸酶、肌動(dòng)蛋白、 肌球蛋白、原肌球蛋白a鏈、酪蛋白激酶、糖原磷酸化酶、果糖-1，6-二磷酸酶、醛縮酶、微 管蛋白、波形蛋白、內(nèi)質(zhì)蛋白（endoplasmin)、乳酸脫氫酶、肌動(dòng)蛋白解聚因子（destrin)、 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白、雙磷酸果糖醛縮酶、碳酸酐酶、醛脫氫酶、膜聯(lián)蛋白、腺苷高半胱氨酸酶 (adenosyl homocysteinase);豬肉肌肉蛋白質(zhì)，如肌動(dòng)蛋白、肌球蛋白、烯醇酶、肌聯(lián)蛋白 (titin)、絲切蛋白、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸脫氫酶、糖原磷酸化酶、磷酸丙糖異構(gòu) 酶、肌激酶；和魚(yú)蛋白質(zhì)，如小白蛋白、丙酮酸脫氫酶、肌間線蛋白（desmin)和磷酸丙糖異 構(gòu)酶。
[0115] 通常被認(rèn)為是高品質(zhì)氨基酸的良好來(lái)源的三種蛋白質(zhì)天然來(lái)源是乳清蛋白質(zhì)、蛋 蛋白質(zhì)和大豆蛋白質(zhì)。各來(lái)源包含多種蛋白質(zhì)。表1呈現(xiàn)各氨基酸在蛋白質(zhì)來(lái)源中的表示 為百分比的重量比例表示（g AA/g蛋白質(zhì)）。
[0116] 表 1
[0117]
【權(quán)利要求】
1. 一種包含第一多膚序列的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列在抑7下 具有水溶解度為至少12. 5g/L。
2. 如權(quán)利要求1所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列在抑7下具有水 溶解度為至少50g/L。
3. 如權(quán)利要求1所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列在抑7下具有水 溶解度為至少lOOg/L。
4. 如權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列包 含： a. 支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少8% ; b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至少4% ;和 C.必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少19%。
5. 如權(quán)利要求4所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列進(jìn)一步包含各必 需氨基酸的至少一者。
6. 如權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列包 含W下至少一者： a. 支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少24% ; b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至少11% ;和 C.必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少49%。
7. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列包 含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至少70%同源性。
8. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列包 含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至少95%同源性。
9. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列包 含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少70%同源性。
10. 如權(quán)利要求1至6中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列包 含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少95%同源性。
11. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 由天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)組成。
12. 如權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不是天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。
13. 如權(quán)利要求1至12中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不是過(guò)敏原。
14. 如權(quán)利要求13所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列與已知過(guò)敏原 具有小于50%整體同源性。
15. 如權(quán)利要求1至14中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不是毒素。
16. 如權(quán)利要求15所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列與已知毒素具 有小于50 %整體同源性。
17. 如權(quán)利要求1至16中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 具有模擬胃消化半衰期為小于60分鐘。
18. 如權(quán)利要求17所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列具有模擬胃消 化半衰期為小于30分鐘。
19. 如權(quán)利要求18所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列具有模擬胃消 化半衰期為小于10分鐘。
20. 如權(quán)利要求1至19中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 在模擬胃液中完全消化。
21. 如權(quán)利要求1至20中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 包含至少一個(gè)選自胃蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)、膜蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)和膜凝乳蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)的蛋白 酶識(shí)別位點(diǎn)。
22. 如權(quán)利要求1至21中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不包含半脫氨酸殘基。
23. 如權(quán)利要求1至22中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不包含二硫鍵。
24. 如權(quán)利要求1至23中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不包含N連接的糖基化。
25. 如權(quán)利要求1至24中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 不包含0連接的糖基化。
26. 如權(quán)利要求1至25中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 對(duì)聚集具有抗性。
27. 如權(quán)利要求1至26中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 在抑7下是陰離子型的。
28. 如權(quán)利要求1至27中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 具有計(jì)算溶合計(jì)分為-20或更低。
29. 如權(quán)利要求28所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列具有計(jì)算溶合 計(jì)分為-30或更低。
30. 如權(quán)利要求1至29中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 具有計(jì)算聚集計(jì)分為0. 75或更低。
31. 如權(quán)利要求30所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列具有計(jì)算聚集 計(jì)分為0.5或更低。
32. 如權(quán)利要求31所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列具有計(jì)算聚集 計(jì)分為0.3或更低。
33. 如權(quán)利要求1至32中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 包含選自W下的氨基酸序列： i. 選自SEQ ID NO:l至SEQ ID N0:490的氨基酸序列； ii. 選自SEQ ID NO:l至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的修飾的衍生物；和 iii. 選自SEQ ID NO:l至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的突變蛋白。
34. 如權(quán)利要求1至33中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 由選自W下的氨基酸序列組成： i. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列， ii. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的修飾的衍生物，和 iii. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的突變蛋白。
35. 如權(quán)利要求1至34中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述第一多膚序列 與至少一個(gè)選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的參照氨基酸序列至少40%、45%、50%、 55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 99. 5% 同源。
36. -種包含第一多膚序列的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在 pH 7下具有水溶解度為至少12. 5g/L。
37. 如權(quán)利要求36所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在抑7 下具有水溶解度為至少50g/L。
38. 如權(quán)利要求37所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)在抑7 下具有水溶解度為至少lOOg/L。
39. 如權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含： a. 支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少8% ; b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至少4% ;和 C.必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少19%。
40. 如權(quán)利要求39所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)進(jìn)一步 包含各必需氨基酸的至少一者。
41. 如權(quán)利要求36至40中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含W下至少一者： a. 支鏈氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少24% ; b. Leu殘基與總氨基酸殘基的比率為至少11% ;和 C.必需氨基酸殘基與總氨基酸殘基的比率為至少49%。
42. 如權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至少70%同源性。
43. 如權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少50個(gè)氨基酸的至少95%同源性。
44. 如權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少70%同源性。
45. 如權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含與天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的至少95%同源性。
46. 如權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)由天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)組成。
47. 如權(quán)利要求36至41中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不是天然存在的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。
48. 如權(quán)利要求36至47中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不是過(guò)敏原。
49. 如權(quán)利要求48所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)與已知 過(guò)敏原具有小于50%整體同源性。
50. 如權(quán)利要求36至49中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不是毒素。
51. 如權(quán)利要求50所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)與已知 毒素具有小于50%整體同源性。
52. 如權(quán)利要求36至51中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì) 具有模擬胃消化半衰期為小于60分鐘。
53. 如權(quán)利要求52所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有模擬胃消 化半衰期為小于30分鐘。
54. 如權(quán)利要求53所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有模 擬胃消化半衰期為小于10分鐘。
55. 如權(quán)利要求36至54中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)在模擬胃液中完全消化。
56. 如權(quán)利要求36至55中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含至少一個(gè)選自胃蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)、膜蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)和膜凝乳蛋白酶識(shí)別位點(diǎn) 的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)。
57. 如權(quán)利要求36至56中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不包含半脫氨酸殘基。
58. 如權(quán)利要求36至57中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不包含-硫鍵。
59. 如權(quán)利要求36至58中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不包含N連接的糖基化。
60. 如權(quán)利要求36至59中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)不包含0連接的糖基化。
61. 如權(quán)利要求36至60中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)對(duì)聚集具有抗性。
62. 如權(quán)利要求36至61中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)在抑7下是陰離子型的。
63. 如權(quán)利要求36至62中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)具有計(jì)算溶合計(jì)分為-20或更低。
64. 如權(quán)利要求63所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì) 算溶合計(jì)分為-30或更低。
65. 如權(quán)利要求36至64中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)具有計(jì)算聚集計(jì)分為0. 75或更低。
66. 如權(quán)利要求65所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì) 算聚集計(jì)分為0.5或更低。
67. 如權(quán)利要求66所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)具有計(jì) 算聚集計(jì)分為0.3或更低。
68. 如權(quán)利要求36至67中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)包含選自W下的氨基酸序列： i. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列； ii. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的修飾的衍生物；和 iii. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的突變蛋白。
69. 如權(quán)利要求36至68中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)由選自W下的氨基酸序列組成： i. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列， ii. 選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的氨基酸序列的修飾的衍生物，和 iii. 選自SEQ ID NO: 1至SEQ ID NO:490的氨基酸序列的突變蛋白。
70. 如權(quán)利要求36至69中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性 蛋白質(zhì)與至少一個(gè)選自SEQ ID N0:1至SEQ ID N0:490的參照氨基酸序列至少40%、45%、 50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或99.5%同源。
71. 如權(quán)利要求1至10、12至33、35至45、47至68和70中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng) 性蛋白質(zhì)，其中所述分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)進(jìn)一步包含用于親和純化的多膚標(biāo)簽。
72. 如權(quán)利要求71所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)，其中用于親和純化的所述標(biāo)簽是聚組 氨酸標(biāo)簽。
73. -種分離的核酸，其包含編碼如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的 核酸序列。
74. 如權(quán)利要求73所述的分離的核酸，其中所述分離的核酸選自基因組DNA、cDNA、正 義RNA和反義RNA。
75. 如權(quán)利要求74所述的分離的核酸，其中所述分離的核酸是基因組DNA。
76. 如權(quán)利要求74所述的分離的核酸，其中所述分離的核酸是cDNA。
77. 如權(quán)利要求73至76中任一項(xiàng)所述的分離的核酸，其進(jìn)一步包含可操作地連接于編 碼所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的所述核酸序列的表達(dá)控制序列。
78. -種載體，其包含編碼如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的核酸序 列。
79. 如權(quán)利要求78所述的載體，其進(jìn)一步包含可操作地連接于編碼所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì) 的所述核酸序列的表達(dá)控制序列。
80. -種重組微生物，其包含如權(quán)利要求73至77中任一項(xiàng)所述的核酸和如權(quán)利要求 78和79中任一項(xiàng)所述的載體的至少一者。
81. 如權(quán)利要求80所述的重組微生物，其中所述重組微生物是原核生物。
82. 如權(quán)利要求81所述的重組原核生物，其中所述原核生物是異養(yǎng)性的。
83. 如權(quán)利要求81所述的重組原核生物，其中所述原核生物是自養(yǎng)性的。
84. 如權(quán)利要求81所述的重組原核生物，其中所述原核生物是細(xì)菌。
85. -種制備如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括 在足W由如權(quán)利要求80至84中任一項(xiàng)所述的重組微生物產(chǎn)生所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)的條件下 培養(yǎng)所述重組微生物。
86. 如權(quán)利要求85所述的方法，其進(jìn)一步包括自所述培養(yǎng)物分離所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)。
87. -種營(yíng)養(yǎng)性組合物，其包含如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的分離的營(yíng)養(yǎng)性蛋白 質(zhì)和至少一種第二組分。
88. 如權(quán)利要求87所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分選自蛋白質(zhì)、多 膚、膚、游離氨基酸、碳水化合物、脂質(zhì)、礦物質(zhì)或礦物質(zhì)來(lái)源、維生素、補(bǔ)充劑、生物體、醫(yī)藥 和賦形劑。
89. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是蛋白質(zhì)。
90. 如權(quán)利要求89所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是營(yíng)養(yǎng)性蛋白 質(zhì)。
91. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是選自必需氨基 酸、非必需氨基酸、支鏈氨基酸、非標(biāo)準(zhǔn)氨基酸和修飾的氨基酸的游離氨基酸。
92. 如權(quán)利要求91所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是選自必需氨基 酸的游離氨基酸。
93. 如權(quán)利要求91所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是選自支鏈氨基 酸的游離氨基酸。
94. 如權(quán)利要求91所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是Leu。
95. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是脂質(zhì)。
96. 如權(quán)利要求95所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述脂質(zhì)選自脂肪、油、甘油H醋、膽固 醇、磯脂和脂肪酸。
97. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分選自礦物質(zhì)和維 生素。
98. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是補(bǔ)充劑。
99. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是生物體。
100. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是醫(yī)藥。
101. 如權(quán)利要求88所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種第二組分是賦形劑。
102. 如權(quán)利要求101所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述至少一種賦形劑選自緩沖劑、防 腐劑、穩(wěn)定劑、粘合劑、壓實(shí)劑、潤(rùn)滑劑、分散增強(qiáng)劑、崩解劑、調(diào)味劑、甜味劑、著色劑。
103. 如權(quán)利要求87至102中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物，其中所述營(yíng)養(yǎng)性組合物被配 制成液體溶液、漿液、混息液、凝膠劑、糊劑、粉末或固體。
104. -種制備如權(quán)利要求87至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物的方法，其包括提供 如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)W及組合所述營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)與所述至少 一種第二組分。
105. -種維持或增加受試者的肌肉質(zhì)量、肌肉強(qiáng)度和功能性表現(xiàn)的至少一者的方法， 所述方法包括向所述受試者提供足量的如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、 如權(quán)利要求87至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求104所述的方法制 備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。
106. -種維持或達(dá)成受試者的合乎需要的身體質(zhì)量指數(shù)的方法，所述方法包括向所述 受試者提供足量的如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87至103 中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。
107. 如權(quán)利要求105或106所述的方法，其中所述受試者處于W下至少一種狀態(tài)下： 年長(zhǎng)、患有醫(yī)學(xué)上危急疾病、W及罹患蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良癥。
108. -種向患有蛋白質(zhì)-能量營(yíng)養(yǎng)不良癥的受試者提供蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括 向所述受試者提供足量的如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87 至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合 物。
109. -種增加受試者的產(chǎn)熱的方法，所述方法包括向所述受試者提供足量的如權(quán)利要 求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組 合物或通過(guò)如權(quán)利要求104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物。
110. -種誘導(dǎo)受試者的飽足反應(yīng)和飽腹感反應(yīng)的至少一者的方法，所述方法包括向所 述受試者提供足量的如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87至 103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合 物。
111. 如權(quán)利要求109或110所述的方法，其中所述受試者是服胖的。
112. 如權(quán)利要求105至111中任一項(xiàng)所述的方法，其中如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所 述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求 104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由所述受試者與進(jìn)行運(yùn)動(dòng)配合加W消耗。
113. -種治療受試者的惡病質(zhì)、肌肉減少癥和虛弱的至少一者的方法，所述方法包括 向所述受試者提供足量的如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87 至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合 物。
114. 如權(quán)利要求105至113中任一項(xiàng)所述的方法，其中如權(quán)利要求1至72中任一項(xiàng)所 述的營(yíng)養(yǎng)性蛋白質(zhì)、如權(quán)利要求87至103中任一項(xiàng)所述的營(yíng)養(yǎng)性組合物或通過(guò)如權(quán)利要求 104所述的方法制備的營(yíng)養(yǎng)性組合物是由所述受試者通過(guò)經(jīng)口、腸或胃腸外途徑加W消耗。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK104470946SQ201380027476
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2013年3月15日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月26日
【發(fā)明者】D·A·貝利, B·A·伯希吉安, N·W·希爾弗, G·馮馬爾特扎恩, R·奇拉庫(kù)魯, M·J·哈米爾 申請(qǐng)人:普羅努塔利亞公司