專利名稱：用于細(xì)胞穿透的超荷電蛋白的制作方法
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用于細(xì)胞穿透的超荷電蛋白相關(guān)申請(qǐng)案交叉參考本發(fā)明根據(jù)35 U. S. C. § 119(e)主張2008年4月觀日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng) 案第USSN 61/048, 370號(hào)及2008年10月14日申請(qǐng)的USSN 61/105, 287的優(yōu)先權(quán)；所述每 個(gè)申請(qǐng)案是以引用方式并入本文中。政府支持本發(fā)明是在美國政府的支持下根據(jù)國立衛(wèi)生研究院/NIGMS所簽署的第ROl GM065400號(hào)合同來實(shí)施。美國政府對(duì)本發(fā)明擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
意欲用于治療性診斷性或其它應(yīng)用的藥劑的有效性通常高度依賴于其穿透細(xì)胞 膜或組織來誘導(dǎo)生物活性發(fā)生期望變化的能力。盡管許多治療性藥物、診斷性或其它產(chǎn)品 候選者(不論是蛋白質(zhì)、核酸、有機(jī)小分子、抑或無機(jī)小分子)在體外顯示有希望的生物活 性，但其很多不能到達(dá)或穿透靶細(xì)胞而達(dá)成期望效果，這通常是因?yàn)槠渖砘瘜W(xué)特性導(dǎo)致 體內(nèi)生物分布不足。具體來說，核酸很有可能可用作有效治療劑和研究工具。SiRNA介導(dǎo)的基因調(diào)節(jié) 的普遍性和序列特異性已提高了使用siRNA作為基因特異性治療劑的可能性(波姆羅特 (Bumcrot)等人，2006，自然化學(xué)生物學(xué)(Nat. Chem. Biol), 2 :711-19 ；其是以引用方式并入 本文中)。短干擾RNA(SiRNA)對(duì)基因表達(dá)的抑制也已成為研究基因和蛋白質(zhì)功能的有價(jià) 值的工具(多賽特(Dorsett)等人，2004，自然評(píng)論藥物發(fā)現(xiàn)(Nat. Rev. DrugDiscov.), 3 :318-29 ；戴克斯霍恩(Dykxhoorn)等人，2003，自然評(píng)論分子細(xì)胞生物學(xué)(Nat. Rev. Mol Cell. Biol)，4 :457-67 ；巴希爾(Elbashir)等人，2001，自然(Nature)，411 :494-98 ；上述 各文獻(xiàn)是以引用方式并入本文中)。然而，人們已發(fā)現(xiàn)將諸如siRNA等核酸遞送至細(xì)胞中是 不可預(yù)知的并且通常無效。將核酸有效地送至細(xì)胞的一個(gè)障礙是誘導(dǎo)細(xì)胞吸收核酸。業(yè)內(nèi) 已作出大量工作來鑒別可幫助將核酸遞送至細(xì)胞的藥劑。通常在細(xì)胞培養(yǎng)中使用市售陽離 子脂質(zhì)試劑來轉(zhuǎn)染siRNA。然而，基于陽離子脂質(zhì)的siRNA遞送的有效性在不同細(xì)胞類型 之間差異顯著。同樣，多種細(xì)胞系(包括一些原代神經(jīng)元、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞 系)已顯示對(duì)常用陽離子脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)具有抗性(卡洛蒂(Carlotti)等人，2004，分子療 法(Mol. Ther.) ,9 :209-17 ；馬(Ma)等人，2002，神經(jīng)科學(xué)(Neuroscience), 112 :1_5 ；麥克 馬奈斯(McManus)等人，2002，免疫學(xué)雜志(J. Immunol), 169 :5754-60 ；斯特雷特(Strait) 等人，2007，美國生理學(xué)雜志-腎生理學(xué)(Am. J. Physiol. Renal Physiol), 293 :F601_06 ；上 述各文獻(xiàn)是以引用方式并入本文中)。業(yè)內(nèi)也已使用包括電穿孔(詹奇(Jantsch)等人， 2008，免疫學(xué)方法雜志(J. Immunol. Methods), 331 :11-11 ；其是以引用方式并入本文中)和 病毒介導(dǎo)的siRNA遞送(布魯邁爾卡姆(Brummelkamp)等人，2002，癌細(xì)胞(Cancer Cell), 2 :243-47 ；斯圖爾特(Stewart)等人，2003，RNA, 9 =493-501 ；上述各文獻(xiàn)是以引用方式并 入本文中)在內(nèi)的替代性轉(zhuǎn)染方法；然而，這些方法可能具有細(xì)胞毒性或以不可預(yù)知的方 式干擾細(xì)胞功能，并且用于在個(gè)體中遞送核酸(例如siRNA)治療劑的價(jià)值有限。
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業(yè)內(nèi)近期努力解決核酸遞送問題并已獲得了多個(gè)新核酸遞送平臺(tái)。這些方法包括 類脂質(zhì)(阿肯克(Akinc)等人，2008，自然生物技術(shù)(Nat. Biotechnol)，洸561-69 ；其是 以引用方式并入本文中)、陽離子聚合物(塞古拉(Segura)和哈伯爾(HiAbell)，2007，生 物偶聯(lián)化學(xué)(Bioconjug. Chem.)，18 :736-45 ；其是以引用方式并入本文中)、無機(jī)納米粒子 (索科洛娃(Sokolova)和普爾(Epple)，應(yīng)用化學(xué)國際英文版(Angew Chem. Int. Ed. Engl)， 47 :1382-95 ；其是以引用方式并入本文中)、碳納米管(劉(Liu)等人，2007，應(yīng)用化學(xué)國際 英文版，46 =2023-27 ；其是以引用方式并入本文中)、細(xì)胞穿透肽(德莎耶絲(Deshayes)等 人，2005，細(xì)胞和分子生命科學(xué)(Cell Mol. Life Sci.)，62 1839-49 ；和梅亞德(Meade)與 道迪(Dowdy)，2008，先進(jìn)藥物輸送評(píng)論(Adv. Drug Deliv. Rev. ),60 :530-36 ；所述兩個(gè)文 獻(xiàn)都是以引用方式并入本文中)和經(jīng)化學(xué)修飾的siRNA(克魯茲菲爾德(Krutzfeldt)等 人，2005，自然，438 =685-89 ；其是以引用方式并入本文中)。這些遞送系統(tǒng)中每一者都有益 于特定應(yīng)用；然而，在大多數(shù)情形下，仍然存在關(guān)于細(xì)胞毒性、易制備性、穩(wěn)定性或普遍性的 問題。因此，業(yè)內(nèi)仍特別關(guān)注能將核酸(例如siRNA)有效遞送至多種細(xì)胞系且無顯著細(xì)胞 毒性的易制備試劑?？紤]到目前人們對(duì)RNAi療法和其它核酸基療法的關(guān)注，業(yè)內(nèi)仍然需要可用于將 核酸以及其它藥劑(例如肽、蛋白質(zhì)、小分子)以可預(yù)知方式有效遞送至眾多種細(xì)胞類型的 試劑和系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供新穎系統(tǒng)、組合物、制劑和相關(guān)方法，其用于使用已經(jīng)修飾而使蛋白 質(zhì)上的總表面電荷增加或減少(在下文中稱作“超荷電”)的蛋白質(zhì)來將核酸和其它藥劑 (例如肽、蛋白質(zhì)、小分子)遞送至細(xì)胞中。因此，可在體內(nèi)或在體外使用超荷電來促進(jìn)超 荷電蛋白或與超荷電蛋白締合在一起而形成復(fù)合體的藥劑進(jìn)入細(xì)胞中。所述系統(tǒng)和方法 可包含使用已經(jīng)改造而超荷電的蛋白質(zhì)并且包括所有所述修飾，包括(但不限于)涉及氨 基酸序列變化以及使荷電部分附接至蛋白質(zhì)的修飾。經(jīng)改造超荷電蛋白的實(shí)例闡述于以下 專利中在2007年6月1日申請(qǐng)并且作為WO 2007/143574在2007年12月13日公開的 國際PCT專利申請(qǐng)案PCT/US07/702M;和在2006年6月2日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案 U. S. S. N. 60/810，364和在2006年8月9日申請(qǐng)的U. S. S. N. 60/836，607 ；每個(gè)所述專利標(biāo) 題為“蛋白質(zhì)表面重建(Protein Surface Remodeling) ”并且每個(gè)所述專利是以引用方式 并入本文中。本文還闡述可用于藥物遞送的超荷電蛋白的其它實(shí)例。本發(fā)明也涵蓋天然存 在的超荷電蛋白的用途，其用于增強(qiáng)一起形成復(fù)合體的所締合藥劑的細(xì)胞穿透或用于增強(qiáng) 天然存在的超荷電蛋白自身的細(xì)胞穿透。通常，經(jīng)改造或天然存在的超荷電蛋白具有正電 荷。在某些實(shí)施例中，超荷正電蛋白可通過靜電相互作用與核酸(其通常具有凈負(fù)電荷) 締合，由此幫助將核酸遞送至細(xì)胞中。超荷正電蛋白也可以共價(jià)或非共價(jià)方式與核酸締合 以通過其它方式來遞送。也可使用與欲遞送藥劑共價(jià)鍵結(jié)或以其它方式締合(例如靜電相 互作用)的超荷電蛋白將諸如肽或小分子等其它藥劑遞送至細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中，超 荷電蛋白與第二蛋白質(zhì)序列融合。例如，在某些實(shí)施例中，欲遞送藥劑與超荷正電蛋白以融 合蛋白形式一起在單一多肽鏈中表達(dá)。在某些實(shí)施例中，融合蛋白在超荷電蛋白與其它蛋 白質(zhì)組份之間具有連接體(例如可裂解連接體)。在某些實(shí)施例中，欲遞送藥劑與超荷電蛋白(例如超荷正電蛋白)通過可裂解連接體(例如可通過蛋白酶或酯酶裂解的連接體、 二硫鍵)彼此締合?？捎糜诒景l(fā)明中的超荷電蛋白(例如超荷正電蛋白)通常具有非抗原 性、生物可降解性和/或生物相容性。在某些實(shí)施例中，超荷正電蛋白不具有生物活性或任 何有害生物活性。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白具有突變或其它改變(例如翻譯后修飾，例 如裂解或其它共價(jià)修飾)，其可降低或消除所述蛋白在超荷電之前所表現(xiàn)的生物活性。此 突變或改變?cè)诔呻姷鞍撞⒎且蚱渥陨砩锘钚远且蚱湓趯⑺巹┻f送至細(xì)胞中的用途 而受到關(guān)注時(shí)尤其令人關(guān)注。不期望受限于具體理論，業(yè)內(nèi)認(rèn)為陰離子細(xì)胞表面蛋白聚糖 可作為與其作用負(fù)荷結(jié)合的超荷正電蛋白的肌動(dòng)蛋白依賴性胞吞作用受體。本發(fā)明超荷電 蛋白或使用超荷電(例如超荷正電)蛋白的遞送系統(tǒng)可包括使用其它醫(yī)藥上可接受的賦形 劑，例如聚合物、脂質(zhì)、碳水化合物、小分子、靶向部分、溶內(nèi)體性藥劑、蛋白質(zhì)、肽等。例如， 超荷電蛋白或超荷電蛋白(例如超荷正電蛋白)與欲遞送藥劑的復(fù)合體可含于微粒、納米 粒子、皮米粒子(Picoparticle)、膠束、脂質(zhì)體或其它藥物遞送系統(tǒng)中或與其締合。在其它 實(shí)施例中，僅使用欲遞送藥劑和超荷電蛋白來將所述藥劑遞送至細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中， 選擇超荷電蛋白來將其自身或所締合藥劑遞送至特定細(xì)胞或組織類型中。在某些實(shí)施例 中，將超荷電(例如超荷正電)蛋白或欲遞送藥劑和所述超荷電蛋白與可破壞溶內(nèi)體性囊 泡或增強(qiáng)內(nèi)體降解的藥劑(例如氯喹(chloroquine)、芘丁酸、基因融合肽、聚乙烯亞胺、血 凝素2 (H/^)肽、蜂毒肽)組合。由此促進(jìn)欲遞送藥劑自內(nèi)體向胞質(zhì)溶膠中逸出。
在一些實(shí)施例中，本發(fā)明系統(tǒng)和方法涉及改變蛋白質(zhì)的一級(jí)序列以使所述蛋白 “超荷電”。在其它實(shí)施例中，本發(fā)明系統(tǒng)和方法涉及使荷電部分附接至蛋白質(zhì)以使所述蛋 白“超荷電”。也就是說，經(jīng)修飾蛋白質(zhì)上的總凈電荷與未修飾蛋白相比有所增加(更多正 電荷或更多負(fù)電荷)。在某些實(shí)施例中，使蛋白質(zhì)超荷電(例如超荷正電)以使得可將核酸 或其它藥劑遞送至細(xì)胞中?？墒谷我坏鞍踪|(zhì)“超荷電”。通常，蛋白質(zhì)無免疫原性并且天然地 或在超荷電后具有可將自身或所締合藥劑轉(zhuǎn)染或遞送至細(xì)胞中的能力。在某些實(shí)施例中， 超荷電蛋白的活性與未修飾蛋白大致或?qū)嵸|(zhì)上相同。在其它實(shí)施例中，超荷電蛋白的活性 與未修飾蛋白相比顯著降低。所述活性可能與如本文所述將其自身或所締合藥劑(例如核 酸)遞送至細(xì)胞中無關(guān)。在一些實(shí)施例中，使蛋白質(zhì)超荷電可提高所述蛋白對(duì)聚集的抗性、 溶解度、再折疊能力和/或在眾多種條件下的一般穩(wěn)定性，以及提高所述蛋白將其自身或 所締合藥劑(例如核酸)遞送至細(xì)胞的能力。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白有助于將其自身 或所締合的欲遞送藥劑靶向特定細(xì)胞類型、組織或器官。在某些實(shí)施例中，使蛋白質(zhì)超荷電 包括以下步驟(a)鑒別目標(biāo)蛋白的表面殘基；(b)任選地，鑒別在其它與目標(biāo)蛋白相關(guān)的 蛋白質(zhì)中并非高度保守的特定表面殘基(即確定對(duì)于所述蛋白的活性或功能并非必需的 氨基酸)；(c)確定所鑒別表面殘基的親水性；和(d)用在生理pH下帶電荷的氨基酸來替代 至少一個(gè)或多個(gè)所鑒別的帶電荷或極性溶劑暴露殘基。參見在2007年6月1日申請(qǐng)并作為 W02007/14;3574在2007年12月13日公開的已公開國際PCT專利申請(qǐng)案PCT/US07/70254 ； 和在2006年6月2日申請(qǐng)的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案U. S. S. N. 60/810，364和在2006年8月9 日申請(qǐng)的U. S. S. N. 60/836，607 ；每個(gè)所述專利標(biāo)題為“蛋白質(zhì)表面重建”；并且每個(gè)所述專 利是以引用方式并入本文中。本文中闡述制備超荷電蛋白的實(shí)例性方法和闡釋方法的使用 的實(shí)例性蛋白質(zhì)序列。在某些實(shí)施例中，為制備帶正電的“超荷電”蛋白，使經(jīng)鑒別用于修 飾的殘基突變?yōu)橘嚢彼?Lys)或精氨酸(Arg)殘基(即在生理pH下帶正電的氨基酸)。在
10某些實(shí)施例中，為制備帶負(fù)電的“超荷電”蛋白，使經(jīng)鑒別用于修飾的殘基突變?yōu)樘於彼?(Asp)或谷氨酸(Glu)殘基(即在生理pH下帶負(fù)電的氨基酸)。每一上述步驟都可使用業(yè) 內(nèi)已知的任一技術(shù)、電腦軟件、算法、方法、范例等來實(shí)施。在產(chǎn)生經(jīng)修飾蛋白后，可測試其 活性和/或所尋求的期望特性(例如將核酸或其它藥劑遞送至細(xì)胞中的能力)。在某些實(shí) 施例中，超荷電蛋白對(duì)聚集的易感性較低。在某些實(shí)施例中，帶正電的“超荷電”蛋白(例如 超荷正電綠色熒光蛋白(GFP)，例如+36GFP)可用于將核酸(例如siRNA藥劑)遞送至細(xì)胞 (例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞、人類細(xì)胞)中。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明系統(tǒng)容許將核酸遞送至通常 對(duì)轉(zhuǎn)染具有抗性的細(xì)胞(例如神經(jīng)元細(xì)胞、T細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞)中。在某些實(shí) 施例中，在本發(fā)明藥物遞送系統(tǒng)中鑒別并使用天然存在的超荷電蛋白，而不是改造超荷電 蛋白。天然存在的超荷電蛋白的實(shí)例包括(但不限于)西科龍(cyclon)(識(shí)別號(hào)Q9H6F5)、 PNRCl (識(shí)別號(hào):Q12796)、RNPSl (識(shí)別號(hào):Q15287)、SURF6 (識(shí)別號(hào):075683)、AR6P (識(shí)別 號(hào):Q66PJ3)、NKAP (識(shí)別號(hào):Q8N5F7)、EBP2 (識(shí)別號(hào)Q99848)、LSMll (識(shí)別號(hào)P83369)、 RL4(識(shí)另Ij 號(hào):P36578)、KRRl (識(shí)別號(hào):Q13601)、RY-1 (識(shí)別號(hào):Q8WVK2)、BriX (識(shí)別號(hào) Q8TDN6)、MNDA(識(shí)別號(hào):P41218)、Hlb (識(shí)別號(hào)P16401)、細(xì)胞周期蛋白(識(shí)別號(hào):Q9UK58)、 MDK(識(shí)別號(hào)P21741)、肝素結(jié)合細(xì)胞因子(Midkine)(識(shí)別號(hào)P21741)、PROK(識(shí)別號(hào) Q9HC23)、FGF5 (識(shí)別號(hào)P12034)、SFRS (識(shí)別號(hào)Q8N9Q2)、AKIP (識(shí)別號(hào)Q9NWT8)、CDK (識(shí) 別號(hào):Q8N726)、β -防御素(識(shí)別號(hào)Ρ81534)、防御素3 (識(shí)別號(hào)Ρ81534) ；PAVAC (識(shí)別號(hào) Ρ18509)、PACAP (識(shí)別號(hào)Ρ18509)、嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子-3 (eotaxin-3)(識(shí)別號(hào) Q9Y258)、組蛋白 H2A (識(shí)別號(hào):Q7L7L0)、HMGBl (識(shí)別號(hào)P09429)、C-Jun (識(shí)別號(hào)P05412)、 TERF 1 (識(shí)別號(hào)PM274)、N-DEK (識(shí)別號(hào)P35659)、PIAS 1 (識(shí)別號(hào)075925)、Ku70 (識(shí)別 號(hào)P12956)、HBEGF (識(shí)別號(hào)Q99075)和 HGF (識(shí)別號(hào)P14210)。在某些實(shí)施例中，在已獲得超荷電蛋白后，本發(fā)明系統(tǒng)和方法涉及使一或多種核 酸或其它藥劑與所述超荷電蛋白締合和使所得復(fù)合體與細(xì)胞在適合所述細(xì)胞吸收作用負(fù) 荷的條件下接觸。核酸可為DNA、RNA和/或其雜合體或衍生物。在某些實(shí)施例中，核酸是 RNAi因子、RNAi誘導(dǎo)劑、短干擾RNA(siRNA)、短發(fā)夾RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、反義 RNA、核酶、催化性DNA、誘導(dǎo)三螺旋形成的RNA、適體、載體、質(zhì)粒、病毒基因組、人工染色體 等。在一些實(shí)施例中，核酸是單鏈核酸。在其它實(shí)施例中，核酸是雙鏈核酸。在一些實(shí)施例 中，核酸可包含一或多個(gè)可檢測標(biāo)記(例如熒光標(biāo)簽和/或放射性原子)。在某些實(shí)施例中， 對(duì)核酸進(jìn)行修飾或衍生(例如降低對(duì)降解的易感性，提高轉(zhuǎn)染效率)。在某些實(shí)施例中，修 飾核酸可防止核酸降解。在某些實(shí)施例中，修飾核酸可幫助將核酸遞送至細(xì)胞中?？墒褂?超荷電蛋白遞送的其它藥劑包括小分子、肽和蛋白質(zhì)。然后可使所得復(fù)合體與其它醫(yī)藥上 可接受的賦形劑組合或締合以形成適合于將藥劑遞送至細(xì)胞、組織、器官或個(gè)體的組合物?？墒钩呻姷鞍着c核酸(或其它藥劑)通過非共價(jià)相互作用締合而形成復(fù)合體。 盡管超荷電蛋白與核酸的共價(jià)締合是可能的，但其對(duì)于核酸遞送的達(dá)成通常并不是必需 的。在一些實(shí)施例中，通過靜電相互作用使超荷電蛋白與核酸締合?？赏ㄟ^其它非共價(jià)相互 作用或共價(jià)相互作用使超荷電蛋白與核酸締合。超荷電蛋白可具有至少+5、+10、+15、+20、 +25、+30、+35、+40、或+50的凈正電荷。在一些實(shí)施例中，使超荷正電蛋白與具有總體凈負(fù) 電荷的核酸締合。所得復(fù)合體可具有凈負(fù)電荷或凈正電荷。在某些實(shí)施例中，復(fù)合體具有 凈正電荷。例如，+36GFP可與帶負(fù)電的siRNA締合。
超荷電蛋白可通過非共價(jià)或共價(jià)相互作用與除核酸以外的其它藥劑締合。例如， 帶負(fù)電的蛋白質(zhì)可與超荷正電蛋白通過靜電相互作用締合。對(duì)于不帶電或不具有足量電荷 的藥劑來說，可使所述藥劑與超荷電蛋白共價(jià)締合以實(shí)現(xiàn)將藥劑遞送至細(xì)胞中。例如，可使 肽治療藥物與超荷電蛋白融合以將所述肽治療藥物遞送至細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中，可通 過可裂解連接體接合超荷電蛋白與肽。在另一實(shí)例中，可使小分子偶聯(lián)至超荷電蛋白以遞 送至細(xì)胞中。也可通過非共價(jià)相互作用(例如配體-受體相互作用、偶極-偶極相互作用 等)使藥劑與超荷電蛋白締合。本發(fā)明提供包含超荷電蛋白和一或多個(gè)欲遞送藥劑的分子的復(fù)合體。在一些實(shí)施 例中，所述復(fù)合體中每個(gè)超荷電蛋白分子包含多個(gè)藥劑分子。在一些實(shí)施例中，所述復(fù)合 體中每個(gè)超荷電蛋白分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或更多個(gè)藥劑(例如核酸)分 子。在某些特定實(shí)施例中，復(fù)合體對(duì)應(yīng)于1個(gè)超荷電蛋白分子包含約1-2個(gè)核酸分子(例如 siRNA)。在其它實(shí)施例中，所述復(fù)合體中每個(gè)藥劑分子包含多個(gè)蛋白質(zhì)分子。在一些實(shí)施 例中，所述復(fù)合體中每個(gè)藥劑分子包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、或更多個(gè)蛋白質(zhì)分子。 在某些實(shí)施例中，所述復(fù)合體包含約1個(gè)藥劑分子和約1個(gè)超荷正電蛋白分子。在某些實(shí) 施例中，藥劑/超荷電蛋白復(fù)合體上的總凈電荷為負(fù)。在某些實(shí)施例中，藥劑/超荷電蛋白 復(fù)合體上的總凈電荷為正。在某些實(shí)施例中，藥劑/超荷電蛋白復(fù)合體上的總凈電荷為中 性。在某些特定實(shí)施例中，核酸/超荷電蛋白復(fù)合體上的總凈電荷為正。在另一方面中，本發(fā)明提供醫(yī)藥組合物，其包含a) —或多種超荷電蛋白；b)超荷 電蛋白與欲遞送藥劑的一或多種復(fù)合體；或c)本發(fā)明一或多種a)或一或多種b)與至少一 種醫(yī)藥上可接受的賦形劑。復(fù)合體在組合物中的量可為可用于在細(xì)胞中誘導(dǎo)期望生物反應(yīng) (例如提高或降低特定基因在細(xì)胞中的表達(dá))的量。在某些實(shí)施例中，使復(fù)合體與用于將藥 劑的遞送引導(dǎo)至特定細(xì)胞、細(xì)胞類型、組織或器官的靶向部分(例如小分子、蛋白質(zhì)、肽、碳 水化合物等)締合。在一些實(shí)施例中，超荷電蛋白或包含經(jīng)改造或天然存在的超荷電蛋白與一或多種 核酸(和/或其醫(yī)藥組合物)的復(fù)合體可用作治療劑。在一些實(shí)施例中，核酸和/或超荷電 蛋白可具有治療活性。在某些實(shí)施例中，核酸具有治療活性。例如，一些病況(例如癌癥、 炎癥性疾病)與某些mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)有關(guān)。與靶向所表現(xiàn)mRNA的RNAi因子締 合的超荷電蛋白可用于治療所述病況?；蛘撸恍┎r與某些mRNA和/或蛋白質(zhì)的表達(dá)不 足有關(guān)(例如癌癥、先天性代謝缺陷)。與驅(qū)動(dòng)缺陷型mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)的載體締合 的超荷電蛋白可用于治療所述病況。本發(fā)明也提供試劑盒，其可用于產(chǎn)生本發(fā)明超荷電蛋白或超荷電蛋白/藥劑復(fù)合 體或其組合物，和/或使用所述復(fù)合體來將所述超荷電蛋白或藥劑轉(zhuǎn)染或遞送至細(xì)胞中。 本發(fā)明試劑盒也可包括投與或使用本發(fā)明超荷電蛋白或復(fù)合體或其醫(yī)藥組合物的說明書。 例如，試劑盒可包括向個(gè)體開立醫(yī)藥組合物的說明書。試劑盒可包括足夠材料用于多個(gè)單 位劑量的藥劑。試劑盒可設(shè)計(jì)用于治療性或研究性目的。試劑盒可任選地包括欲遞送藥劑 (例如siRNA、肽、藥物)，或藥劑可由最終使用者來提供。本發(fā)明也提供將超荷電蛋白或與超荷電蛋白締合的藥劑、或二者引入細(xì)胞中的方 法。本發(fā)明方法包含使超荷電蛋白、或超荷電蛋白和與超荷電蛋白締合的藥劑與細(xì)胞在 (例如)足以容許所述超荷電蛋白或與超荷電蛋白締合的藥劑穿透至細(xì)胞中的條件下接觸，由此將超荷電蛋白、或與超荷電蛋白締合的藥劑、或二者引入細(xì)胞中。在某些實(shí)施例中， 足量超荷電蛋白或藥劑進(jìn)入細(xì)胞，從而容許一或多種以下檢測細(xì)胞中的超荷電蛋白或藥 劑；細(xì)胞生物特性的變化，例如細(xì)胞的生長速率、基因表達(dá)模式、或活力；或檢測超荷電蛋 白或藥劑的生物效應(yīng)。在某些實(shí)施例中，接觸是在體外實(shí)施。在某些實(shí)施例中，接觸是在體 內(nèi)實(shí)施，例如在個(gè)體(例如人類或其它動(dòng)物)體內(nèi)。在一體內(nèi)實(shí)施例中，細(xì)胞中存在足量超 荷電蛋白、藥劑、或二者，從而在個(gè)體中產(chǎn)生可檢測效應(yīng)(例如治療效應(yīng))。在一體內(nèi)實(shí)施例 中，在細(xì)胞中存在足量超荷電蛋白、藥劑、或二者，從而使得可對(duì)一或多種經(jīng)穿透細(xì)胞或組 織進(jìn)行成像。.在某些實(shí)施例中，因細(xì)胞穿透而產(chǎn)生所觀察或可檢測效應(yīng)。本發(fā)明也提供評(píng)估超荷電蛋白的細(xì)胞穿透的方法，其包含任選地，選擇超荷電蛋 白；提供所述超荷電蛋白；和使所述超荷電蛋白與細(xì)胞接觸并確定所述超荷電蛋白是否穿 透所述細(xì)胞，由此對(duì)超荷電蛋白的細(xì)胞穿透作出評(píng)估。本發(fā)明也提供評(píng)估超荷電蛋白的細(xì)胞穿透的方法，其包含選擇欲超荷電的蛋白 質(zhì)；獲得一個(gè)含一或多個(gè)欲改變殘基的集合以產(chǎn)生超荷電蛋白，其中所述殘基集合通過本 文所述方法來生成(獲得包括生成所述殘基集合或自另一方接受所述集合中一或多個(gè)成 員的屬性)；提供(例如通過制備或自另一方接受)具有所述變化殘基集合的超荷電蛋白； 和使所述超荷電蛋白與細(xì)胞接觸并測定所述超荷電蛋白是否穿透所述細(xì)胞，由此評(píng)估超荷 電蛋白的細(xì)胞穿透。所述方法可容許一方形成超荷電蛋白或與其它方共同形成。


圖1.超荷電綠色熒光蛋白(GFP)。㈧GFP變體的蛋白質(zhì)序列，其中熒光團(tuán)形成殘 基標(biāo)示為綠色，帶負(fù)電的殘基標(biāo)示為紅色，并且?guī)д姷臍埢鶚?biāo)示為藍(lán)色。(B-D) sfGFP (B)、 GFP (+36) (C)和GFP (-30) (D)的表面靜電勢，顏色自(紅色)變至+2^T/e (藍(lán)色)。圖2. GFP變體的分子內(nèi)特性。(A)純化GFP變體的染色和UV熒光。每個(gè)泳道和管 含有0.2yg蛋白質(zhì)。(B)GFP變體的圓二色譜。(C)GFP變體的熱力學(xué)穩(wěn)定性，其是通過胍 鹽誘導(dǎo)解折疊來測量。圖3.超荷電蛋白的分子間特性。㈧純化GFP變體(“天然的”)的UV照射樣品， 將所述樣品在100°C下加熱1分鐘(“沸騰的”)，并且隨后使所述樣品在25°C下冷卻2小 時(shí)(“冷卻的”)。(B)用40% TFE在25°C下誘導(dǎo)GFP變體聚集并通過直角光散射來監(jiān)測。 (C)超荷電GFP可逆附著至帶相反電荷的高分子上。樣品1 :61186 (+36)，存于3(^1^251111 Tris pH 7.0和IOOmM NaCl中。樣品2:將6yg GFP(-30)添加至樣品1中。樣品3 將 30 yg鮭魚精DNA添加至樣品1中。樣品4 將20 μ g大腸桿菌(E. coli) tRNA添加至樣品 1中。樣品5 將IM NaCl添加至樣品4中。樣品6_8 分別等同與樣品1、2和4，只是使用 sfGFP來代替GFP (+36)。將所有樣品在微量離心機(jī)中短暫旋轉(zhuǎn)并在UV光下可視化。圖4. GFP變體的(A)激發(fā)光譜和(B)發(fā)射光譜。如通過發(fā)色團(tuán)在490nm下的吸光 度所定量，各樣品含有等量蛋白質(zhì)。圖5.超荷電表面主要分子間相互作用。超荷電GFP非特異性地可逆附著至帶相 反電荷的高分子(“蛋白質(zhì)維可牢(Velcro) ”)上。所述相互作用可導(dǎo)致形成沉淀。與變 性蛋白的聚集物不同，所述沉淀含有經(jīng)折疊熒光GFP并且溶于IM鹽中。此處顯示為單獨(dú) 的 +36GFP ；+36GFP 與-30GFP 混合；+36GFP 與 tRNA 混合；+36GFP 與 tRNA 混合在 IMNaCl 中；sfGFP (-7)；和 sfGFP 與-30GFP 混合。圖6.超荷正電GFP結(jié)合siRNA。在瓊脂糖凝膠中GFP_siRNA復(fù)合體不與siRNA共 移動(dòng)-將+36GFP與siRNA —起培育，并且對(duì)所得復(fù)合體實(shí)施瓊脂糖凝膠電泳。在此分析中 測試各種+36GFP siRNA 比率0 1、1 1、1 2、1 3、1 4、1 5 和 1 10。在約 1 3的化學(xué)計(jì)量下，顯示+36GFP與siRNA形成穩(wěn)定復(fù)合體。非超荷正電蛋白顯示不結(jié)合 siRNA。測試50 1比率的sfGFP siRNA，但甚至在如此高的過量水平下，sfGFP也不與 siRNA締合。圖7.超荷正電GFP穿透細(xì)胞。將海拉(HeLa)細(xì)胞與GFP (sf GFP (_7)、-30GFP或 +36GFP) 一起培育，洗滌，固定，并染色。+36GFP而非sfGFP或-30GFP有效穿透海拉細(xì)胞。 左側(cè)對(duì)DNA進(jìn)行DAPI染色以標(biāo)記細(xì)胞。中間進(jìn)行GFP染色以標(biāo)記GFP發(fā)生細(xì)胞攝取的 位置。右側(cè)在+36GFP出現(xiàn)時(shí)顯示其定位的影像。圖8.超荷正電GFP將siRNA遞送至人類細(xì)胞中。顯示+36GFP可將siRNA有效遞 送至海拉細(xì)胞中。左圖陽離子脂質(zhì)體2000和Cy3-siRNA ；右圖+36GFP和Cy3_siRNA。顯 示+36GFP可將siRNA有效遞送至海拉細(xì)胞中。使用霍克斯特(Hoescht)通道(藍(lán)色)來 使DNA可視化，由此標(biāo)記細(xì)胞位置；使用Cy3通道(紅色)來使Cy3標(biāo)記的siRNA可視化； 使用GFP通道(綠色)來使GFP可視化；黃色表示siRNA與GFP之間的共定位位點(diǎn)。圖9.將siRNA遞送至對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染具有抗性的細(xì)胞系中鼠類3T3-Q前脂肪 細(xì)胞(“3T3L細(xì)胞”)。用以下組合中的任一者處理3T3L細(xì)胞陽離子脂質(zhì)體2000和 Cy3-siRNA(左圖)；或+36GFP和Cy3_siRNA(右圖)。陽離子脂質(zhì)體對(duì)3T3L的轉(zhuǎn)染較弱， 但+36GFP可有效轉(zhuǎn)染。使用霍克斯特通道(藍(lán)色)來使DNA可視化，由此標(biāo)記細(xì)胞位置； 使用Cy3通道(紅色)來使Cy3標(biāo)記的siRNA可視化；使用GFP通道(綠色)來使GFP可 視化。黃色表示siRNA與GFP之間的共定位位點(diǎn)。圖10.將siRNA遞送至對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染具有抗性的細(xì)胞系中大鼠IMCD細(xì)胞。用陽離 子脂質(zhì)體2000與Cy3-siRNA(左圖)或+36GFP與Cy3_siRNA(右圖)來處理大鼠IMCD細(xì) 胞。陽離子脂質(zhì)體對(duì)大鼠IMCD細(xì)胞轉(zhuǎn)染較弱，但+36GFP可有效轉(zhuǎn)染。使用霍克斯特通道 (藍(lán)色)來使DNA可視化，由此標(biāo)記細(xì)胞位置；使用Cy3通道(紅色)來使Cy3標(biāo)記的siRNA 可視化；使用GFP通道(綠色)來使GFP可視化。黃色表示siRNA與GFP之間的共定位位 點(diǎn)ο圖11.將siRNA遞送至對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染具有抗性的細(xì)胞系中人類ST14A神經(jīng)元。用 陽離子脂質(zhì)體2000與Cy3-siRNA(左圖)或+36GFP與Cy3_siRNA(右圖)處理人類ST14A 神經(jīng)元。陽離子脂質(zhì)體對(duì)人類ST14A神經(jīng)元的轉(zhuǎn)染較弱，但+36GFP可有效轉(zhuǎn)染。使用DAPI 通道(藍(lán)色)來使DNA可視化，由此標(biāo)記細(xì)胞位置；使用Cy3通道(紅色)來使Cy3標(biāo)記的 siRNA可視化；使用GFP通道(綠色)來使GFP可視化。黃色表示siRNA與GFP之間的共 定位位點(diǎn)。圖12.對(duì)siRNA轉(zhuǎn)染的流式細(xì)胞術(shù)分析。左側(cè)陽離子脂質(zhì)體。每個(gè)柱對(duì)應(yīng)于用 不同轉(zhuǎn)染方法實(shí)施的實(shí)驗(yàn)陽離子脂質(zhì)體(藍(lán)色)；和20nM+36GFP (紅色)。每個(gè)圖表對(duì) 應(yīng)于用不同細(xì)胞類型實(shí)施的實(shí)驗(yàn)=IMCD細(xì)胞、PC 12細(xì)胞、海拉細(xì)胞、3T3L細(xì)胞和尤爾卡特 (Jurkat)細(xì)胞。X軸代表自Cy3通道獲得的測量值，其為siRNA熒光的讀數(shù)。Y軸代表在流 式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞計(jì)數(shù)。流式細(xì)胞術(shù)數(shù)據(jù)表明，使用+36GFP可比使用陽離子脂質(zhì)體更
14有效地以SiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。圖13.用+36GFP遞送的siRNA可誘導(dǎo)基因敲除。使用約2 μ M的陽離子脂質(zhì)體 2000 (黑色柱)或20nM+36GFP (綠色柱)將50nM GAPDH siRNA轉(zhuǎn)染至五種不同細(xì)胞類型 (海拉、IMCD、3T3L、PC 12和尤爾卡特細(xì)胞系)中。Y軸代表GAPDH蛋白水平，以微管蛋白 水平的分?jǐn)?shù)表示。圖14.細(xì)胞穿透的機(jī)械探針。用多種探針中的一種將海拉細(xì)胞處理30分鐘并且 隨后用5nM+36GFP處理。樣品包括(A)無探針；(B)4°C預(yù)培育(抑制能量依賴性過程)； (C)IOOmM蔗糖(抑制網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的胞吞作用)(左圖)和25yg/ml制霉菌素(nystatin) (破壞穴樣內(nèi)陷功能)(右圖)；Φ)25μΜ松胞菌素(cytochalasirOB(抑制巨胞飲作用) (左圖)和5 μ M莫能菌素(monensin)(抑制內(nèi)體受體再循環(huán))(右圖)。圖15.有助于細(xì)胞穿透活性的因素。顯示電荷強(qiáng)度可促進(jìn)細(xì)胞穿透活性。具體來 說，顯示+15GFP或Lys20^50不能穿透細(xì)胞。左圖:20mM+15GFP和50nM siRNA-Cy3 中圖 20nM+36GFP。右圖60nM Lys2(1_5(1和50nM siRNA_Cy3。使用霍克斯特通道(藍(lán)色)來使DNA 可視化，由此標(biāo)記細(xì)胞位置；使用GFP通道(綠色)來使GFP可視化。圖16.超荷電GFP變體和其穿透細(xì)胞的能力。㈧計(jì)算GFP變體的表面靜電勢，顏 色自-25kT/e (深紅色)變至+2^T/e (深藍(lán)色)。(B)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示在用200nM的 各種GFP變體獨(dú)立處理海拉細(xì)胞并用含有肝素的PBS洗滌三次以移除細(xì)胞表面結(jié)合的GFP 之后，內(nèi)化GFP在海拉細(xì)胞中的量。(C)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示與未處理細(xì)胞(黑色)中的背 景熒光相比，內(nèi)化+36GFP (綠色)在海拉、IMCD、3T3-L、PC 12和尤爾卡特細(xì)胞中的量。圖17. (A)在37°C下共培育1小時(shí)后+36GFP在海拉細(xì)胞中的內(nèi)化。(B)在4°C下 培育1小時(shí)后抑制+36GFP在海拉細(xì)胞中的細(xì)胞穿透。僅部分洗滌細(xì)胞以使+36GFP保持部 分結(jié)合在細(xì)胞表面上。(C)和(D)+36GFP在(A)中條件下、且分別在小窩蛋白依賴性胞吞作 用抑制劑非律平(filipin)與制霉菌素的存在下內(nèi)化。(E)+36GFP在(A)中條件下、且在網(wǎng) 格蛋白依賴性胞吞作用抑制劑氯丙嗪(chlorpromazine)的存在下內(nèi)化。(F)在胞吞作用20 分鐘后，阿萊克薩熒光二抗647 (Alexa Fluor 647)標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白(紅色)和+36GFP (綠 色)的細(xì)胞定位。(G)在肌動(dòng)蛋白聚合抑制劑松胞菌素D存在下對(duì)+36GFP在海拉細(xì)胞中的 內(nèi)化的抑制。(H)用SOmM氯酸鈉處理對(duì)+36GFP在海拉細(xì)胞中的內(nèi)化的抑制。(I)在37°C 下培育1小時(shí)后，+36GFP在CHO細(xì)胞中的內(nèi)化。(J)在PDG-CHO細(xì)胞中缺少+36GFP內(nèi)化。 在⑴和(J)中細(xì)胞核經(jīng)DAPI (藍(lán)色)染色。圖18. (A)凝膠遷移分析顯示通過溴化乙錠染色的未結(jié)合siRNA(3 ，以測定超荷 正電GFP siRNA結(jié)合的化學(xué)計(jì)量。在25°C下將10皮摩爾siRNA以不同摩爾比與各種GFP 混合10分鐘，然后通過非變性PAGE進(jìn)行分析。每行中的最右側(cè)泳道顯示sfGFP與siRNA 的100 1混合物。(B)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示在用50nM Cy3_siRNA與200nM的+15、+25或 +36GFP的混合物處理海拉細(xì)胞，之后用肝素洗滌三次以移除未內(nèi)化蛋白(參見圖2 后， 內(nèi)化siRNA在海拉細(xì)胞中的水平。來自經(jīng)siRNA而非轉(zhuǎn)染試劑處理的海拉細(xì)胞的數(shù)據(jù)顯示 為黑色。(C)流式細(xì)胞術(shù)分析顯示與經(jīng)siRNA而非轉(zhuǎn)染試劑處理的細(xì)胞(黑色)相比，在 與50nM Cy3-siRNA與200nM+36GFP (綠色)或約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000 (藍(lán)色)的混合 物一起培育后，遞送至海拉、IMCD、3T3-L、PC12和尤爾卡特細(xì)胞中的Cy3標(biāo)記的siRNA的水 平。如上所述在進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)之前洗滌細(xì)胞。(D)在用200nM+36GFP和50nM Cy3-siRNA處理4小時(shí)后M小時(shí)，穩(wěn)定附著細(xì)胞系(海拉、IMCD和3T3-L)的熒光顯微圖像。每一圖 像是三個(gè)通道的疊加藍(lán)色(DAPI染色)、紅色(Cy3-siRNA)和綠色(+36GFP)；黃色表示紅 色與綠色的共定位。所有三個(gè)圖像的放大倍數(shù)都是40x。圖19. siRNA遞送對(duì)GAPDH的mRNA和蛋白水平的抑制。(A)在用50nM siRNA和 約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000或用50nM siRNA和200nM+36GFP處理后48,72或96小時(shí)，如 通過RT-QPCR所測量，GAPDH的mRNA水平在海拉細(xì)胞中的抑制。將所顯示抑制水平標(biāo)準(zhǔn)化 為β -肌動(dòng)蛋白mRNA水平；將0%抑制定義為經(jīng)約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000和50ηΜ雜亂 陰性對(duì)照siRNA處理的細(xì)胞中的mRNA水平。(B)在用siRNA和約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000 或用siRNA和200nM+36GFP處理后48、72和96小時(shí)，GAPDH蛋白水平在海拉細(xì)胞中的抑制。 (C)在用 50nM siRNA 和約 2 μ M 陽離子脂質(zhì)體 2000、200nM+36GFP、或 200nM+36GFP_HA2 處 理后96小時(shí)，GAPDH蛋白水平在海拉、IMCD、3T3-L、PC12和尤爾卡特細(xì)胞中的抑制。在⑶ 和(C)中，所顯示抑制水平是通過蛋白質(zhì)印跡(Western blot)來測量并且標(biāo)準(zhǔn)化為β-微 管蛋白水平；0%抑制定義為在經(jīng)約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000和雜亂陰性對(duì)照siRNA處理的 細(xì)胞中的蛋白水平。數(shù)值和誤差柱代表(A)和(B)中三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)以及(C)中五次獨(dú)立實(shí) 驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。圖20.與+15和+36GFP相比，各種陽離子合成肽的siRNA轉(zhuǎn)染活性。在用 50nMCy3-siRNA與200nM或2 μ M所示肽或蛋白質(zhì)的混合物處理4小時(shí)后，使用流式細(xì)胞術(shù) 來測量內(nèi)化Cy3-siRNA在海拉細(xì)胞中的水平。圖21.通過陽離子脂質(zhì)體2000、+36GFP或+36GFP-HA2將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染至海拉、 IMCD、3T3-L、PC 12和尤爾卡特細(xì)胞中。用800ng pSV-β -半乳糖苷酶質(zhì)粒和200nM或 2 μ M+36GFP或+36GFP-HA2將細(xì)胞處理4小時(shí)。在M小時(shí)后，使用β -熒光二抗試劑盒(諾 維根(Novagen))來測量半乳糖苷酶活性。數(shù)值和誤差柱代表三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 和標(biāo)準(zhǔn)誤差。圖22.用于移除細(xì)胞表面結(jié)合的超荷電GFP的洗滌方案的有效性。在4°C下用 200nM+36GFP將海拉細(xì)胞處理(為阻斷GFP的細(xì)胞攝取，參見正文)1小時(shí)。然后用4°C PBS 或用存于PBS中的4°C 20U/mL硫酸肝素將細(xì)胞洗滌三次(每次洗滌1分鐘)，然后通過流式 細(xì)胞術(shù)來分析。用PBS洗滌的細(xì)胞顯示據(jù)推測源自細(xì)胞表面結(jié)合的GFP的顯著GFP熒光。 相反，用20U/mL存于PBS中的肝素洗滌的細(xì)胞所表現(xiàn)的GFP熒光水平等效于未處理細(xì)胞。圖23.+36GFP在海拉細(xì)胞中的細(xì)胞穿透的濃度依賴性。在無血清培養(yǎng)基中用 +36GFP將海拉細(xì)胞處理4小時(shí)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理并在存于DMEM中的10% FBS 中將其再次平鋪于涂布有基質(zhì)膠(Matrigel) (BD生物科學(xué)(BD Biosciences))的載玻片 上。在37°C下保持M小時(shí)后，用存于PBS中的4%甲醛固定細(xì)胞，用DAPI染色，并使用萊 卡(Leica)DMRB倒置顯微鏡進(jìn)行成像。所有圖像的放大倍數(shù)都是20x。圖24.熒光顯微術(shù)揭示，在使用福金6 (Fugene 6)(羅氏(Roche))轉(zhuǎn)染劑的IMCD 和3T3-L細(xì)胞中無內(nèi)化Cy3-siRNA。按照制造商方案在無血清培養(yǎng)基中用福金6將細(xì)胞處 理4小時(shí)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理并沉淀。通過抽吸移除含胰蛋白酶培養(yǎng)基并使細(xì)胞再 懸浮于存于DMEM中的10% FBS中，然后平鋪在預(yù)涂布有基質(zhì)膠 的載玻片上。使細(xì)胞附 著M小時(shí)，用存于PBS中的4%甲醛固定，用DAPI染色，并使用萊卡DMRB倒置顯微鏡成像。 所有圖像的放大倍數(shù)都是20x。未觀察到Cy3熒光(與圖18D相比)。
圖 25. (A)在用 50nM siRNA 和約 2 μ M 陽離子脂質(zhì)體 2000、+36GFP 或 +36GFP-HA2 處理后，對(duì)五種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性分析。在處理后M小時(shí)獲取數(shù)據(jù)。數(shù)值 和誤差柱反映三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。用+36GFP或+36GFP-HA2但不用MTT試 劑處理的細(xì)胞在所述條件下不表現(xiàn)顯著吸光度。(B)在用50nM siRNA和200nM或2 μ M陽 離子聚合物處理后，對(duì)海拉細(xì)胞進(jìn)行MTT細(xì)胞毒性分析。用氯喹或芘丁酸處理顯示細(xì)胞毒 性(分別為泳道9和10)。圖26.凝膠遷移分析顯示未結(jié)合線性化pSV-β-半乳糖苷酶質(zhì)粒DNA (普洛麥格 (Promega))以測定+36GFP 質(zhì)粒DNA結(jié)合的化學(xué)計(jì)量。在每個(gè)泳道中，將22fmol通過EcoRI 消化線性化的pSV-β -半乳糖苷酶與不同摩爾比的+36GFP合并并在25°C下培育10分鐘。 在140V下在含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠上經(jīng)50分鐘通過電泳來分析樣品。圖27.對(duì)此工作中所用純化GFP變體的SDS-PAGE分析。通過用考馬斯藍(lán) (Coomassie Blue)染色來使蛋白質(zhì)可視化。分子量標(biāo)記物的移動(dòng)點(diǎn)列示于左側(cè)。應(yīng)注意， 超荷電GFP在SDS-PAGE期間以部分取決于理論凈電荷強(qiáng)度而不是僅取決于實(shí)際分子量的 方式移動(dòng)。圖28.此研究中所用所有GFP類似物的熒光光譜(每種蛋白ΙΟηΜ，在488nm下激 發(fā))。圖29. (A)在用約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000和50ηΜ陰性對(duì)照siRNA處理后4天的 代表性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。(B)在用200nM+36GFP和50nM陰性對(duì)照siRNA處理后4天的代表 性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。(C)代表性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)顯示在用50nM GAPDHsiRNA和約2μ M陽離 子脂質(zhì)體2000或200nM+36GFP處理后48、72和96小時(shí)的GAPDH和β-微管蛋白水平。(D) 在用約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000和50nM GAPDHsiRNA處理后4天的代表性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。 (E)在用200nM+36GFP和50nMGAPDH siRNA處理后4天的代表性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。(F)在 用200nM+36GFP-HA2和50nM GAPDH siRNA處理后4天的代表性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。(G)在 用約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000和50ηΜ陰性對(duì)照siRNA、約2 μ M陽離子脂質(zhì)體2000和50ηΜ β -肌動(dòng)蛋白靶向siRNA、200nM+36GFP和50ηΜ β -肌動(dòng)蛋白靶向siRNA、或200nM+36GFP 和50nM陰性對(duì)照siRNA處理后4天自海拉細(xì)胞獲得的代表性蛋白質(zhì)印跡數(shù)據(jù)。圖30.熒光顯微術(shù)揭示，在4°C下處理的海拉細(xì)胞中或在經(jīng)松胞菌素D (10 μ g/mL) 預(yù)處理的海拉細(xì)胞中，無內(nèi)化Cy3-siRNA或GFP。圖像是在用含有200nM+36GFP和50nM siRNA的溶液處理后1小時(shí)的細(xì)胞。用配備有濾光片的反向轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡獲取圖像以 檢測GFP發(fā)射。為促進(jìn)可視化，用存于PBS中的20U/mL肝素將細(xì)胞洗滌兩次(每次1分 鐘)以移除大部分(但并非所有)表面結(jié)合GFP-siRNA。 圖31. (A)動(dòng)態(tài)光散射(DLS)數(shù)據(jù)顯示通過混合20 μ M+36GFP與5 μ M雙鏈RNA20 聚體形成的粒子的流體動(dòng)力學(xué)半徑(Hr)。(B)上述樣品的熒光顯微圖像。所示圖像是亮視 野與GFP通道圖像的疊加；應(yīng)注意，較大特征是在樣品干燥時(shí)締合在一起的實(shí)際上較小的 粒子。比例尺=10 μ m。 圖32. (A)通過蛋白水解酶K消化+36GFP和牛血清白蛋白。在37°C下用0.6單 位蛋白水解酶K處理100pmol+36GFP或牛血清白蛋白(BSA)。將樣品與SDS蛋白質(zhì)加樣緩 沖液混合，加熱至90°C并保持10分鐘，并在經(jīng)考馬斯藍(lán)染色的4-12%丙烯酰胺凝膠上通過 SDS-PAGE進(jìn)行分析。(B)+36GFP和BSA在鼠類血清中的穩(wěn)定性。將存于PBS中的IOOpmol的每種蛋白與5 μ L鼠類血清混合至總體積為10 μ L并在37°C下培育。將樣品與SDS蛋白質(zhì) 加樣緩沖液混合并在90°C下加熱10分鐘。通過SDS-PAGE在4-12%丙烯酰胺凝膠上分析所 得混合物，并且通過蛋白質(zhì)印跡來揭示+36GFP和BSA蛋白區(qū)帶。下部圖像是+36GFP_siRNA 復(fù)合體的5 μ L樣品(論述于C中)并通過蛋白質(zhì)印跡分析其GFP。(C)與+36GFP在鼠類 血清中復(fù)合的 siRNA 的穩(wěn)定性。將 SiRNA(IOpmol)與 sfGFPQOpmol)或+36GFPQOpmol) 混合，并在25°C下于4μ LPBS中培育10分鐘。將所得溶液添加至四體積的小鼠血清中 (總計(jì)20μ L)并在37°C下培育所示時(shí)間，用乙醇沉淀，并通過凝膠電泳在15%丙烯酰胺凝 膠上進(jìn)行分析。(D)與+36GFP或sfGFP在鼠類血清中復(fù)合的質(zhì)粒DNA的穩(wěn)定性。將質(zhì)粒 DNA (0. 026pmol)與12. 8pmol的+36GFP或sfGFP在4 μ LPBS中混合10分鐘。向此溶液中 添加16yL小鼠血清(總計(jì)20yL)。在37°C下將樣品培育所示時(shí)間。通過用酚-氯仿萃 取并用乙醇沉淀來分離DNA，然后通過凝膠電泳在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析。圖 33.使用(DmCherry-TAT ； (2) HiCherry-Arg9 ；和( mCherry-ALAL_+36GFP 在 海拉、PC12和IMCD細(xì)胞系中內(nèi)化mCherry。圖34.在用50nM mCherry-ALAL_+36GFP處理后4小時(shí)海拉、PC12和IMCD細(xì)胞的 熒光顯微圖像。每個(gè)圖像是三種通道的疊加藍(lán)色(DNA的DAPI染色)、紅色(mCherry)和 綠色(+36GFP)。黃色表示紅色與綠色的共定位。圖35.人類蛋白質(zhì)將siRNA遞送至海拉細(xì)胞中。(A)以提高的質(zhì)量比將人類蛋白質(zhì) 與siRNA混合并通過PAGE和溴化乙錠染色來分析未結(jié)合siRNA。區(qū)帶強(qiáng)度降低表明siRNA 與人類蛋白質(zhì)結(jié)合。(B)將人類蛋白質(zhì)與Cy3標(biāo)記的siRNA混合并經(jīng)4小時(shí)將其施加至海 拉細(xì)胞。然后洗滌細(xì)胞并通過流式細(xì)胞術(shù)分析Cy3熒光。峰向右側(cè)遷移表明siRNA發(fā)生內(nèi) 化。(C)使用人類蛋白質(zhì)以siRNA轉(zhuǎn)染海拉細(xì)胞，培育3天，并分析所靶向mRNA的降解。比 較所靶向GAPDH的mRNA水平與β -肌動(dòng)蛋白mRNA水平?！皩?duì)照”表示使用非靶向siRNA。 使用陽離子脂質(zhì)體2000作為陽性對(duì)照。
具體實(shí)施例方式定義欲遞送藥劑本文所用短語“欲遞送藥劑”是指可遞送至個(gè)體、器官、組織、細(xì)胞、亞 細(xì)胞位點(diǎn)和/或細(xì)胞外基質(zhì)位點(diǎn)的任一物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，欲遞送藥劑是生物活性藥 劑，即其在生物系統(tǒng)和/或有機(jī)體中具有活性。例如，在投與有機(jī)體時(shí)對(duì)所述有機(jī)體具有生 物效應(yīng)的物質(zhì)可視為具有生物活性。在特定實(shí)施例中，倘若欲遞送藥劑是生物活性藥劑，則 所述藥劑中分享整體藥劑的至少一種生物活性的部分通常稱作“生物活性”部分。在一些 實(shí)施例中，欲遞送藥劑是治療劑。本文所用術(shù)語“治療劑”是指在投與個(gè)體時(shí)具有有益效應(yīng) 的任一藥劑。術(shù)語“治療劑”是指在投與個(gè)體時(shí)具有治療性、診斷性和/或預(yù)防性效應(yīng)和/ 或引發(fā)期望生物學(xué)和/或藥理學(xué)效應(yīng)的任一藥劑。本文所用術(shù)語“治療劑”可為通過與超 荷電蛋白締合來遞送至細(xì)胞中的核酸。在某些實(shí)施例中，欲遞送藥劑是核酸。在某些實(shí)施 例中，欲遞送藥劑是DNA。在某些實(shí)施例中，欲遞送藥劑是RNA。在某些實(shí)施例中，欲遞送藥 劑是肽或蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，欲遞送藥劑是小分子。在一些實(shí)施例中，欲遞送藥劑可 用作體內(nèi)或體外成像劑。在一些所述實(shí)施例中，欲遞送藥劑具有生物活性，并且在其它所述 實(shí)施例中不具有生物活性。
動(dòng)物本文所用術(shù)語“動(dòng)物”是指動(dòng)物界的任一成員。在一些實(shí)施例中，“動(dòng)物”是 指任一發(fā)育階段的人類。在一些實(shí)施例中，“動(dòng)物”是指任一發(fā)育階段的非人動(dòng)物。在某些 實(shí)施例中，非人動(dòng)物是哺乳動(dòng)物(例如，嚙齒動(dòng)物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、貓、綿羊、牛、靈長 類動(dòng)物或豬)。在一些實(shí)施例中，動(dòng)物包括(但不限于)哺乳動(dòng)物、鳥、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、 魚和蟲。在一些實(shí)施例中，動(dòng)物是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、遺傳改造動(dòng)物、或克隆。大約本文所用術(shù)語“大約”或“約”在用于一或多個(gè)目標(biāo)數(shù)值時(shí)是指類似于所述參 照數(shù)值的數(shù)值。在某些實(shí)施例中，除非另外說明或上下文中有其它證據(jù)(除了所述數(shù)字會(huì) 超過可能數(shù)值的100%以外)，否則術(shù)語“大約”或“約”是指與所述參照數(shù)值在任一方向上 (大于或小于)相差 25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、 9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、或更小的數(shù)值范圍。與……締合本文所用術(shù)語“與……締合”、“偶聯(lián)”、“連接”、“附接”和“栓接”在用
于兩個(gè)或更多個(gè)部分時(shí)意指所述部分在物理上直接地或通過一或多個(gè)用作連接劑的部分 彼此締合或連接，從而形成足夠穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而使得所述部分在所述結(jié)構(gòu)的使用條件(例 如生理?xiàng)l件)下可保持物理締合。超荷電蛋白通常通過涉及非共價(jià)結(jié)合(例如靜電相互作 用)的機(jī)制與核酸締合。在某些實(shí)施例中，帶正電的超荷電蛋白通過靜電相互作用與核酸 締合而形成復(fù)合體。在一些實(shí)施例中，足夠數(shù)量的較弱相互作用可為欲在各種不同條件下 保持物理締合的部分提供充分穩(wěn)定性。在某些實(shí)施例中，欲遞送藥劑與超荷電蛋白共價(jià)鍵 結(jié)。生物相容性本文所用術(shù)語“生物相容性”是指對(duì)細(xì)胞無毒性的物質(zhì)。在一些實(shí)施 例中，若在體內(nèi)將物質(zhì)添加至細(xì)胞中不會(huì)誘導(dǎo)炎癥和/或其它體內(nèi)不良效應(yīng)，則可將所述 物質(zhì)視為“生物相容性”。在一些實(shí)施例中，若在體外或在體內(nèi)將物質(zhì)添加至細(xì)胞中會(huì)引起 少于或等于約50%、約45%、約40%、約；35%、約30%、約25%、約20%、約15%、約10%、 約5%、或少于約5%的細(xì)胞死亡，則可將所述物質(zhì)視為“生物相容性”。生物可降解性本文所用術(shù)語“生物可降解性”是指在生理?xiàng)l件下降解的物質(zhì)。在 一些實(shí)施例中，生物可降解性物質(zhì)是通過細(xì)胞機(jī)構(gòu)裂解的物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，生物可降 解性物質(zhì)是通過化學(xué)過程裂解的物質(zhì)。生物活性本文所用短語“生物活性”是指在生物系統(tǒng)和/或有機(jī)體中具有活性的 任一物質(zhì)的特征。例如，在投與有機(jī)體時(shí)對(duì)所述有機(jī)體具有生物效應(yīng)的物質(zhì)可視為具有生 物活性。在特定實(shí)施例中，倘若核酸具有生物活性，則所述核酸中分享整體核酸的至少一種 生物活性的部分通常稱作“生物活性”部分。碳水化合物術(shù)語“碳水化合物”是指糖或糖聚合物。術(shù)語“糖”、“多糖”、“碳水化
合物”和“寡糖”可互換使用。大多數(shù)碳水化合物是具有多個(gè)羥基的醛或酮，通常所述分子 中每個(gè)碳原子上有一個(gè)羥基。碳水化合物一般具有分子式CnH2n0n。碳水化合物可為單糖、二 糖、三糖、寡糖或多糖。大多數(shù)基礎(chǔ)碳水化合物是單糖，例如葡萄糖、蔗糖、半乳糖、甘露糖、 核糖、阿拉伯糖、木糖和果糖。二糖是兩個(gè)接合單糖。實(shí)例性二糖包括蔗糖、麥芽糖、纖維二 糖和乳糖。通常，寡糖包括三至六個(gè)單糖單元(例如棉籽糖、水蘇糖)，并且多糖包括六個(gè)或 更多個(gè)單糖單元。實(shí)例性多糖包括淀粉、糖原和纖維素。碳水化合物可含有經(jīng)修飾糖單元， 例如2’-脫氧核糖，其中移除羥基；2’-氟代核糖，其中用氟替代羥基；或N-乙?；咸烟?胺，其為葡萄糖的含氮形式(例如2’-氟代核糖、脫氧核糖和己糖)。碳水化合物可以多種
19不同形式存在，例如構(gòu)象異構(gòu)體、環(huán)狀形式、非環(huán)狀形式、立體異構(gòu)體、互變異構(gòu)體、端基異 構(gòu)體和同分異構(gòu)體。特征性部分本文所用術(shù)語物質(zhì)的“特征性部分”就最廣泛含義來說是與相關(guān)完整 物質(zhì)分享一定序列和/或結(jié)構(gòu)一致性和/或至少一種功能性特征的部分。例如，蛋白質(zhì)或 多肽的“特征性部分”是含有共同構(gòu)成蛋白質(zhì)或多肽的特征的氨基酸連續(xù)區(qū)段、或多個(gè)氨基 酸連續(xù)區(qū)段的部分。在一些實(shí)施例中，每個(gè)所述連續(xù)區(qū)段一般可含有至少2個(gè)、至少5個(gè)、 至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、至少50個(gè)、或更多個(gè)氨基酸。核酸的“特征性部分”是含 有共同構(gòu)成核酸的特征的核苷酸連續(xù)區(qū)段、或多個(gè)核苷酸連續(xù)區(qū)段的部分。在一些實(shí)施例 中，每一所述連續(xù)區(qū)段一般可含有至少2個(gè)、至少5個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、 至少50個(gè)、或更多個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施例中，特征性部分具有生物活性。保守的本文所用術(shù)語“保守的”分別是指多核苷酸序列或氨基酸序列中的核苷 酸或氨基酸殘基在所比較的兩個(gè)或更多個(gè)相關(guān)序列的相同位置中以未改變形式存在。相對(duì) 保守的核苷酸或氨基酸是與序列中其它位置出現(xiàn)的核苷酸或氨基酸相比在較相關(guān)序列中 保守的核苷酸或氨基酸。在一些實(shí)施例中，若兩個(gè)或更多個(gè)序列彼此100% —致，則可將其 稱作“完全保守的”。在一些實(shí)施例中，若兩個(gè)或更多個(gè)序列彼此至少70%—致、至少80% 一致、至少90%—致、或至少95%—致，則可將其稱作“高度保守的”。在一些實(shí)施例中，若 兩個(gè)或更多個(gè)序列彼此約70 % 一致、約80 % 一致、約90 % 一致、約95 %、約98 %、或約99 % 一致，則可將其稱作“高度保守的”。在一些實(shí)施例中，若兩個(gè)或更多個(gè)序列彼此至少30% 一致、至少40%—致、至少50%—致、至少60%—致、至少70%—致、至少80%—致、至少 90%—致、或至少95%—致，則可將其稱作“保守的”。在一些實(shí)施例中，若兩個(gè)或更多個(gè)序 列彼此約30%—致、約40%—致、約50%—致、約60%—致、約70%—致、約80%—致、約 90%—致、約95%—致、約98%—致、或約99%—致，則可將其稱作“保守的”。表達(dá)本文所用核酸序列的“表達(dá)”是指以下事件中的一或多者(1)自DNA序列 (例如通過轉(zhuǎn)錄)產(chǎn)生RNA模板；(2)處理RNA轉(zhuǎn)錄物(例如剪接、編輯、5’帽形成和/或 3’末端處理)；(3)將RNA翻譯為多肽或蛋白質(zhì)；和(4)多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾。功能性本文所用“功能性”生物分子是呈表現(xiàn)特征性特性和/或活性的形式的生 物分子。融合蛋白本文所用“融合蛋白”包括第一蛋白部分(例如超荷電蛋白)，其與第二 蛋白部分之間具有肽鍵。在某些實(shí)施例中，融合蛋白是由單一融合基因來編碼?；虮疚乃眯g(shù)語“基因”具有其業(yè)內(nèi)所理解的含義。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解， 術(shù)語“基因”可包括基因調(diào)節(jié)序列(例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)和/或內(nèi)含子序列。另外應(yīng)了 解，基因的定義包括不編碼蛋白質(zhì)而是編碼諸如RNAi因子、核酶、tRNA等功能性RNA分子 的核酸的含義。出于清晰性目的，應(yīng)注意，本申請(qǐng)案中所用術(shù)語“基因”一般是指編碼蛋白 質(zhì)的核酸部分；所述術(shù)語可任選地涵蓋調(diào)節(jié)序列，如根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)背景所 了解。此定義并不意欲排除術(shù)語“基因”對(duì)于非蛋白質(zhì)編碼性表達(dá)單元的應(yīng)用，而是意欲澄 清，在大多數(shù)情形下，本文獻(xiàn)中所用此術(shù)語是指編碼蛋白質(zhì)的核酸?；虍a(chǎn)物或表達(dá)產(chǎn)物本文所用術(shù)語“基因產(chǎn)物”或“表達(dá)產(chǎn)物”一般是指自基因 轉(zhuǎn)錄的RNA(前-和/或后處理)或自所述基因轉(zhuǎn)錄的RNA編碼的多肽(前-和/或后修 飾)。
綠色熒光蛋白本文所用術(shù)語“綠色熒光蛋白”(GFP)是指最初自水母維多利亞多 管發(fā)光水母(Aequorea victoria)分離的暴露于藍(lán)光下時(shí)發(fā)出綠色熒光的蛋白質(zhì)或此一蛋 白質(zhì)的衍生物(例如蛋白質(zhì)的超荷電形式)。野生型GFP的氨基酸序列如下所述MSKGEELFTG VVPILVELDG DVNGHKFSVS GEGEGDATYGKLTLKFICTT GKLPVPffPTL VTTFSYGVQC FSRYPDHMKQHDFFKSAMPE GYVQERTIFF KDDGNYKTRA EVKFEGDTLVNRIELKGIDF KEDGNILGHK LEYNYNSHNV YIMADKQKNGIKVNFKIRHN IEDGSVQLAD HYQQNTPIGD GPVLLPDNHYLSTQSALSKD PNEKRDHMVL LEFVTAAGIT HGMDELI (SEQIDNO。XX).至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %、或至 少99 %同源的蛋白質(zhì)也可視作綠色熒光蛋白。在某些實(shí)施例中，綠色熒光蛋白是超荷電蛋 白。在某些實(shí)施例中，綠色熒光蛋白是超荷正電蛋白(例如+15GFP、+25GFP和+36GFP，如 本文所述)。在某些實(shí)施例中，GFP可經(jīng)修飾而包括多組氨酸標(biāo)簽以便于純化蛋白質(zhì)。在某 些實(shí)施例中，GFP可與另一蛋白質(zhì)或肽(例如血凝素2(HA2)肽)融合。在某些實(shí)施例中， GFP可以生物或化學(xué)方式進(jìn)一步修飾(例如翻譯后修飾、蛋白酶解等)。同源性本文所用術(shù)語“同源性”是指聚合分子之間(例如核酸分子(例如DNA分 子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間)的總體相關(guān)性。在一些實(shí)施例中，若聚合 分子的序列至少25 %、至少30 %、至少35 %、至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少55 %、至 少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、或至 少99% —致，則可將其視作彼此“同源”。在一些實(shí)施例中，若聚合分子的序列至少25%、至 少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少 70 %、至少75 %、至少80 %、至少85 %、至少90 %、至少95 %、或至少99 %類似，則可將其視 作彼此“同源”。術(shù)語“同源”必然是指至少兩個(gè)序列(核苷酸序列或氨基酸序列)之間的比 較。根據(jù)本發(fā)明，若兩個(gè)核苷酸序列所編碼多肽中有至少一個(gè)至少約20個(gè)氨基酸的區(qū)段至 少約50%—致、至少約60%—致、至少約70%—致、至少約80%—致、或至少約90%—致， 則可將其視作同源。在一些實(shí)施例中，同源核苷酸序列的特征在于能編碼具有至少4-5個(gè) 特別指定氨基酸的區(qū)段。對(duì)于欲確定同源性的核苷酸序列來說，一定要考慮這些氨基酸相 對(duì)于彼此的一致性和近似間隔二者。對(duì)于長度少于60個(gè)核苷酸的核苷酸序列，通過編碼具 有至少4-5個(gè)特別指定氨基酸的區(qū)段的能力來確定同源性。根據(jù)本發(fā)明，若兩個(gè)蛋白質(zhì)序 列中有至少一個(gè)至少約20個(gè)氨基酸的區(qū)段至少約50%—致、至少約60%—致、至少約70% 一致、至少約80%—致、或至少約90% —致，則可將所述蛋白質(zhì)視作同源。親水性本文所用“親水性”物質(zhì)是可溶于極性分散介質(zhì)中的物質(zhì)。在一些實(shí)施例 中，親水性物質(zhì)可與極性分散介質(zhì)瞬時(shí)結(jié)合。在一些實(shí)施例中，親水性物質(zhì)通過氫鍵與極性 分散介質(zhì)瞬時(shí)結(jié)合。在一些實(shí)施例中，極性分散介質(zhì)是水。在一些實(shí)施例中，親水性物質(zhì)可 為粒子型。在一些實(shí)施例中，親水性物質(zhì)可為非離子型。在一些實(shí)施例中，物質(zhì)相對(duì)于另一 種物質(zhì)具有親水性，這是因?yàn)槠湓谒?、極性分散介質(zhì)、或親水性分散介質(zhì)中的溶解度高于所 述另一物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，物質(zhì)相對(duì)于另一種物質(zhì)具有親水性，這是因?yàn)槠湓谟?、非極 性分散介質(zhì)、或疏水性分散介質(zhì)中的溶解度低于所述另一物質(zhì)。疏水性本文所用“疏水性”物質(zhì)是可溶于非極性分散介質(zhì)中的物質(zhì)。在一些實(shí)施 例中，疏水性物質(zhì)受極性分散介質(zhì)排斥。在一些實(shí)施例中，極性分散介質(zhì)是水。在一些實(shí)施 例中，疏水性物質(zhì)是非極性的。在一些實(shí)施例中，物質(zhì)相對(duì)于另一種物質(zhì)具有疏水性，這是因?yàn)槠湓谟?、非極性分散介質(zhì)、或疏水性分散介質(zhì)中的溶解度高于所述另一物質(zhì)。在一些實(shí) 施例中，物質(zhì)相對(duì)于另一種物質(zhì)具有疏水性，這是因?yàn)槠湓谒?、極性分散介質(zhì)、或親水性分 散介質(zhì)中的溶解度低于所述另一物質(zhì)?！滦员疚乃眯g(shù)語“一致性”是指聚合分子之間(例如核酸分子(例如DNA 分子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間)的總體相關(guān)性。例如，出于優(yōu)化對(duì)比目 的，可通過比對(duì)兩個(gè)核酸序列來實(shí)施兩個(gè)序列的一致性百分比的計(jì)算(例如可將間隙引入 第一和第二核酸序列中的一者或二者中以供優(yōu)化比對(duì)，并且出于對(duì)比目的可忽視不一致序 列)。在某些實(shí)施例中，出于比較目的，所比對(duì)序列的長度為參照序列長度的至少30 %、至 少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%、或100%。然 后比較對(duì)應(yīng)核苷酸位置處的核苷酸。若第一序列中的位置與第二序列中的對(duì)應(yīng)位置由相同 核苷酸占據(jù)，則所述分子在所述位置一致。兩個(gè)序列之間的一致性百分比是所述序列共有 的一致性位置數(shù)量的函數(shù)，其中考慮為優(yōu)化比對(duì)兩個(gè)序列而需要引入的間隙數(shù)量和各間隙 的長度。序列的比較和兩個(gè)序列之間一致性百分比的確定可使用數(shù)學(xué)算法來完成。例如， 兩個(gè)核苷酸序列之間的一致性百分比可使用諸如以下等闡述于以下文獻(xiàn)中的方法來測定 計(jì)算分子生物學(xué)(ComputationalMolecular Biology)，來斯科 A. M. (Lesk, A.M.)編輯，牛 津大學(xué)出版社，紐約，1988 ；生物計(jì)算信息學(xué)和基因組項(xiàng)目(Biocomputing =Informatics and Genome Pro jects)，史密斯D. W. (Smith，D. W.)編輯，學(xué)術(shù)出版社，紐約，1993 ；分子生物
I^WMfr (Sequence Analysis in Molecular Biology), ^^0 ) G. (von Heinje, G.)，學(xué)術(shù)出版社，1987 ；序列數(shù)據(jù)的電腦分析(Computer Analysis ofSequence Data)，部 分I，格里芬Α. Μ. (Griffin, Α. Μ.)和格里芬H. G.編輯，休馬納出版社(Humana Press)，新 澤西，1994 ；和序列分析引物(Sequence Analysis Primer)，格里布斯考 Μ· (Gribskov, Μ.) 和德弗魯J. (Devereux, J.)編輯，M斯托克頓出版社(M Stockton Press)，紐約，1991 ；上 述各文獻(xiàn)是以引用方式并入本文中。例如，兩個(gè)核苷酸序列之間的一致性百分比可使用邁 爾斯(Meyers)和米勒(Miller) (CABI0S，1989，4 :11-17)的算法來確定，此算法已納入比對(duì) 程序(2. O版)中，其使用PAM120加權(quán)殘數(shù)表，間隙長度罰分為12并且間隙罰分為4。或 者，兩個(gè)核苷酸序列之間的一致性百分比可使用GCG軟件包中的間隙程序使用NWSgapdna. CMP矩陣來確定。常用于確定不同序列之間的一致性百分比的方法包括(但不限于)以下 文獻(xiàn)中揭示的方法卡里略H. (Carillo, H.)和利普曼D. (Lipman, D.), SIAM應(yīng)用數(shù)學(xué)雜 志(SIAM J Applied Math)，48 1073 (1988)；其是以引用方式并入本文中?！ご_定一致性 的技術(shù)編纂在公眾可獲取的電腦程序中。確定兩個(gè)序列之間的同源性的實(shí)例性電腦程序包 括(但不限于)GCG程序包(德弗魯J.等人，核酸研究(NucleicAcids Research), 12 (1) 387 (1984))、BLASTP、BLASTN 和 FASTA (奧特斯楚 S. F. (Altschul，S. F.)等人，分子生物學(xué) 雜志(J. Molec. Biol.) ,215 :403-410 (1990))。抑制基因的表達(dá)本文所用短語“抑制基因的表達(dá)”意指引起基因的表達(dá)產(chǎn)物的量 降低。表達(dá)產(chǎn)物可為自基因轉(zhuǎn)錄的RNA(例如mRNA)或自基因所轉(zhuǎn)錄mRNA翻譯的多肽。通 常mRNA水平的降低會(huì)導(dǎo)致自其所翻譯的多肽的水平降低。表達(dá)水平可使用用于測量mRNA 或蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定。在體外本文所用術(shù)語“在體外”是指發(fā)生在人工環(huán)境中(例如在試管或反應(yīng)器 中、在細(xì)胞培養(yǎng)中、在皮氏培養(yǎng)皿(Petri dish)中等)，而不是發(fā)生在有機(jī)體(例如動(dòng)物、植
22物或微生物)內(nèi)的事件。在體內(nèi)本文所用術(shù)語“在體內(nèi)”是指發(fā)生在有機(jī)體(例如動(dòng)物、植物或微生物) 內(nèi)的事件。經(jīng)分離本文所用術(shù)語“經(jīng)分離”是指已發(fā)生以下事件的物質(zhì)或?qū)嶓w⑴與至少 一些在最初產(chǎn)生時(shí)其所締合的組份分離(在自然界或在實(shí)驗(yàn)環(huán)境中)，和/或( 由人工產(chǎn) 生、制備和/或制造。經(jīng)分離物質(zhì)和/或?qū)嶓w可與至少約10%、約20%、約30%、約40%、 約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或更多其最初所締合的其它組份分離。在一些 實(shí)施例中，經(jīng)分離藥劑的純度大于約80 %、約85 %、約90 %、約91 %、約92 %、約93 %、約 94 %、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %、約99 %、或大于約99 %。若本文所用物質(zhì)實(shí)質(zhì)上 不含其它組份，則其是“純凈的”。微小RNA (miRNA)本文所用術(shù)語“微小RNA”或“miRNA”是指長約21個(gè)核苷酸(nt) 至23nt的RNAi因子。miRNA的長度可介于18nt46nt之間。通常，miRNA是單鏈的。然 而，在一些實(shí)施例中，miRNA可為至少部分雙鏈。在某些實(shí)施例中，miRNA可包含RNA雙螺 旋(在本文中稱作“雙螺旋區(qū)”)并且可任選地另外包含一至三個(gè)單鏈懸突。在一些實(shí)施例 中，RNAi因子包含長度介于15bp至^bp的雙螺旋區(qū)并且任選地另外包含一個(gè)或兩個(gè)單鏈 懸突。miRNA可自兩個(gè)雜交在一起的RNA分子來形成，或可替代地自包括自雜交部分的單 一 RNA分子來生成。一般來說，miRNA分子的游離5’末端具有磷酸基，并且游離3’末端具 有羥基。miRNA的雙螺旋部分通常(但不一定)包含一或多個(gè)由一或多個(gè)不成對(duì)核苷酸組 成的凸起。miRNA中的一條鏈包括與靶RNA雜交的部分。在某些實(shí)施例中，miRNA中的一條 鏈并非與靶RNA中的區(qū)域精確互補(bǔ)，其意指miRNA與靶RNA的雜交具有一或多處失配。在 一些實(shí)施例中，miRNA中的一條鏈與靶RNA中的區(qū)域精確互補(bǔ)，其意指miRNA與靶RNA的雜 交沒有失配。通常，人們認(rèn)為miRNA可通過抑制靶轉(zhuǎn)錄物的翻譯來介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制。 然而，在一些實(shí)施例中，miRNA可通過引起靶轉(zhuǎn)錄物的降解來介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制。核酸本文所用術(shù)語“核酸”就其最廣泛含義來說是指被納入或可納入寡核苷酸鏈 中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，核酸是通過磷酸二酯鍵被納入或可納入寡 核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，“核酸”是指個(gè)別核酸殘基(例如核苷 酸和/或核苷)。在一些實(shí)施例中，“核酸”是指包含個(gè)別核酸殘基的寡核苷酸鏈。本文所 用術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”可互換使用，其是指核苷酸聚合物(例如至少兩個(gè)核苷 酸的鏈)。在一些實(shí)施例中，“核酸”涵蓋RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或cDNA。此外， 術(shù)語“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或類似術(shù)語包括核酸類似物，即具有非磷酸二酯骨架的類 似物。例如，可認(rèn)為業(yè)內(nèi)已知的在骨架中具有肽鍵來代替磷酸二酯鍵的所謂“肽核酸”在本 發(fā)明范圍內(nèi)。術(shù)語“編碼氨基酸序列的核苷酸序列”包括所有互為簡并形式和/或編碼相 同氨基酸序列的核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和/或RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含子。核酸可 自天然來源來純化，可使用重組表達(dá)系統(tǒng)來產(chǎn)生并任選地加以純化，可以化學(xué)方式合成等。 若適宜(例如在化學(xué)合成分子情形下)，核酸可包含核苷類似物，例如具有經(jīng)化學(xué)修飾堿基 或糖、骨架修飾等的類似物。除非另外說明，否則以5’至3’方向來表示核酸序列。本文所 用術(shù)語“核酸片段”是指作為較長核酸序列中的一部分的核酸序列。在多個(gè)實(shí)施例中，核酸 片段包含至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10 個(gè)、或更多個(gè)殘基。在一些實(shí)施例中，核酸是或包含天然核苷(例如腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷)；核苷類似物(例如2-氨基腺苷、2-硫 代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿 苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脫氮 腺苷、7-脫氮鳥苷、8-側(cè)氧基腺苷、8-側(cè)氧基鳥苷、0(6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞苷)；經(jīng) 化學(xué)修飾的堿基；生物修飾的堿基(例如甲基化堿基)；嵌入堿基；經(jīng)修飾糖(例如2’ -氟 代核糖、核糖、2’_脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或經(jīng)修飾磷酸基(例如硫代磷酸基和 5’ -N-亞磷酰胺鍵)。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明具體來說涉及“未修飾核酸”，其意指未經(jīng)化 學(xué)修飾從而可促進(jìn)或達(dá)成遞送的核酸(例如多核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核苷)。聚合物本文所用術(shù)語“聚合物”是指包含至少兩個(gè)彼此締合的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元(即 “單體”)的任一物質(zhì)。在一些實(shí)施例中，單體彼此共價(jià)締合。在一些實(shí)施例中，單體彼此非 共價(jià)締合。聚合物可為均聚物或包含兩種或更多種單體的共聚物。在序列方面，共聚物可 為無規(guī)共聚物、嵌段共聚物、接枝共聚物，或包含無規(guī)序列、嵌段序列和/或接枝序列的組 合。在一些實(shí)施例中，嵌段共聚物是二嵌段共聚物。在一些實(shí)施例中，嵌段共聚物是三嵌段 共聚物。在一些實(shí)施例中，聚合物可為直鏈或具支鏈聚合物。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明聚合 物包含本文所述任一聚合物的摻和物、混合物和/或加合物。通常，本發(fā)明聚合物是有機(jī)聚 合物。在一些實(shí)施例中，聚合物具有親水性。在一些實(shí)施例中，聚合物具有疏水性。在一些 實(shí)施例中，聚合物經(jīng)一或多個(gè)部分和/或官能團(tuán)修飾。蛋白質(zhì)本文所用術(shù)語“蛋白質(zhì)”是指多肽(即至少兩個(gè)通過肽鍵彼此連接的氨基 酸的鏈)。蛋白質(zhì)可包括非氨基酸部分(例如可為糖蛋白)和/或可以其它方式經(jīng)處理或 修飾。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，“蛋白質(zhì)”可為細(xì)胞產(chǎn)生的完整多肽鏈(具有或不具有信 號(hào)序列)，或可為其功能性部分。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員另外可了解，蛋白質(zhì)有時(shí)可包括不止一 條(例如)通過一或多個(gè)二硫鍵連接或通過其它方式締合的多肽鏈。多肽可含有L-氨基 酸、D-氨基酸、或二者，并且可含有業(yè)內(nèi)已知多種氨基酸修飾或類似物中的任一者?？捎眯?飾包括(例如)添加化學(xué)實(shí)體，例如碳水化合物基團(tuán)、磷酸基、法尼基、異法尼基、脂肪酸基、 酰胺基、末端乙?；⑴悸?lián)用連接體；官能化；或其它修飾(例如α酰胺化)等。在一優(yōu)選 實(shí)施例中，修飾肽來獲得更穩(wěn)定的肽(例如體內(nèi)半衰期更長)。這些修飾可包括肽的環(huán)化、 納入D-氨基酸等。所述修飾應(yīng)該都不顯著干擾所述肽的期望生物活性。在某些實(shí)施例中， 修飾肽以獲得生物活性更強(qiáng)的肽。在一些實(shí)施例中，多肽可包含天然氨基酸、非天然氨基 酸、合成氨基酸、氨基酸類似物和其組合。術(shù)語“肽”通常用于表示長度小于約100個(gè)氨基 酸的多肽。RNA干擾(RNAi)本文所用術(shù)語“RNA干擾”或“RNAi”是指由RNA介導(dǎo)的對(duì)基因 表達(dá)的序列特異性抑制和/或靶RNA水平的降低，所述RNA包含與靶RNA實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的部 分。通常，實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)部分中至少一部分在RNA的雙鏈區(qū)域內(nèi)。在一些實(shí)施例中，RNAi可 通過選擇性細(xì)胞內(nèi)降解RNA來進(jìn)行。在一些實(shí)施例中，RNAi可通過翻譯阻遏來進(jìn)行。RNAi因子本文所用術(shù)語“RNAi因子”或“RNAi”是指任選地包括一或多個(gè)核苷酸 類似物或修飾的RNA，其具有可通過RNAi機(jī)制介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制的分子結(jié)構(gòu)特征。在 一些實(shí)施例中，RNAi因子通過使轉(zhuǎn)錄物降解來介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制。在一些實(shí)施例中， RNAi因子通過抑制靶轉(zhuǎn)錄物的翻譯來介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制。一般來說，RNAi因子包括與 靶RNA實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)的部分。在一些實(shí)施例中，RNAi因子至少部分為雙鏈。在一些實(shí)施例中，RNAi因子為單鏈。在一些實(shí)施例中，實(shí)例性RNAi因子可包括siRNA、shRNA和/或miRNA。 在一些實(shí)施例中，RNAi因子可全部由天然RNA核苷酸(即腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶和尿嘧 啶)組成。在一些實(shí)施例中，RNAi因子可包括一或多種非天然RNA核苷酸(例如核苷酸類 似物、DNA核苷酸等)?？赏ㄟ^引入非天然RNA核酸殘基來使RNAi因子對(duì)細(xì)胞降解的抗性 強(qiáng)于RNA。在一些實(shí)施例中，術(shù)語“RNAi因子”可指可誘導(dǎo)RNAi效應(yīng)(例如降解靶RNA和 /或抑制翻譯)的任一 RNA、RNA衍生物和/或編碼RNA的核酸。在一些實(shí)施例中，RNAi因 子可包含可用作戴斯酶(Dicer)底物的鈍頭末端(即無懸突)dsRNA。例如，此一 RNAi因子 可包含長度> 25個(gè)堿基對(duì)的鈍頭末端dsRNA，其可任選地經(jīng)化學(xué)修飾以消除免疫應(yīng)答。RNAi誘導(dǎo)劑本文所用術(shù)語“RNAi誘導(dǎo)劑”涵蓋可遞送RNAi因子、調(diào)節(jié)和/或修 飾RNAi因子活性的任一實(shí)體。在一些實(shí)施例中，RNAi誘導(dǎo)劑可包括載體(但不包括未經(jīng) 人工修飾的天然存在的分子)，其在細(xì)胞內(nèi)的存在可產(chǎn)生RNAi并使RNAi誘導(dǎo)劑所靶向轉(zhuǎn) 錄物的表達(dá)降低。在一些實(shí)施例中，RNAi誘導(dǎo)劑是RNAi誘導(dǎo)載體。在一些實(shí)施例中，RNAi 誘導(dǎo)劑是包含RNAi因子和一或多種醫(yī)藥上可接受的賦形劑和/或載劑的組合物。在一些 實(shí)施例中，RNAi誘導(dǎo)劑是“RNAi誘導(dǎo)載體”，其是指在細(xì)胞內(nèi)的存在可導(dǎo)致產(chǎn)生一或多種自 雜交或彼此雜交而形成RNAi因子的RNA (例如siRNA、shRNA和/或miRNA)的載體。在各 實(shí)施例中，此術(shù)語涵蓋質(zhì)粒(例如DNA載體(其序列可包含源自病毒的序列元件))、或病 毒(但不包括未經(jīng)人工修飾的天然存在的病毒或質(zhì)粒)，其在細(xì)胞內(nèi)的存在可導(dǎo)致產(chǎn)生一 或多種自雜交或彼此雜交而形成RNAi因子的RNA。一般來說，載體包含可操作連接至表達(dá) 信號(hào)的核酸，從而使得可在細(xì)胞中存在所述載體時(shí)轉(zhuǎn)錄一或多種雜交或自雜交而形成RNAi 因子的RNA。因此，載體為細(xì)胞內(nèi)合成一或多種RNA或其前體提供模板。出于誘導(dǎo)RNAi的 目的，可認(rèn)為病毒基因組在細(xì)胞中的存在(例如在病毒包膜與細(xì)胞膜融合后)足以表明所 述病毒在所述細(xì)胞中的存在。另外，出于誘導(dǎo)RNAi的目的，若載體是被引入細(xì)胞中、進(jìn)入細(xì) 胞中、或自親代細(xì)胞繼承，則不論其隨后在細(xì)胞內(nèi)是否經(jīng)修飾或處理都可認(rèn)為所述載體存 在于細(xì)胞內(nèi)。若RNAi誘導(dǎo)載體在細(xì)胞內(nèi)的存在可導(dǎo)致產(chǎn)生一或多種彼此雜交或自雜交而 形成靶向轉(zhuǎn)錄物的RNAi因子的RNA，即若所述載體在細(xì)胞內(nèi)的存在導(dǎo)致產(chǎn)生一或多種靶向 轉(zhuǎn)錄物的RNAi因子，則可認(rèn)為所述載體靶向轉(zhuǎn)錄物。短干擾RNA(SiRNA)本文所用術(shù)語“短干擾RNA”或“siRNA”是指包含長約19個(gè) 堿基對(duì)(bp)并且任選地另外包含一至三個(gè)單鏈懸突的RNA雙螺旋(在本文中稱作“雙螺旋 區(qū)”)的RNAi因子。在一些實(shí)施例中，RNAi因子包含長度介于15bp至^bp范圍內(nèi)并且任 選地另外包含一個(gè)或兩個(gè)單鏈懸突的雙螺旋區(qū)。siRNA可自兩個(gè)雜交在一起的RNA分子來 形成，或可替代地自包括自雜交部分的單一 RNA分子來生成。一般來說，siRNA分子的游離 5’末端具有磷酸基，并且游離3’末端具有羥基。siRNA的雙螺旋部分可(但通常并不)包 含一或多個(gè)由一或多個(gè)不成對(duì)核苷酸組成的凸起。siRNA中的一條鏈包括與靶轉(zhuǎn)錄物雜交 的部分。在某些實(shí)施例中，siRNA中的一條鏈與靶轉(zhuǎn)錄物中的區(qū)域精確互補(bǔ)，其意指siRNA 與靶轉(zhuǎn)錄物的雜交無單一失配。在一些實(shí)施例中，siRNA與靶轉(zhuǎn)錄物的靶向部分之間可存 在一或多處失配。在未達(dá)成完全互補(bǔ)的一些實(shí)施例中，任一失配一般定位于siRNA末端或 附近。在一些實(shí)施例中，siRNA通過引發(fā)靶轉(zhuǎn)錄物的降解來介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制。 短發(fā)夾RNA (shRNA)本文所用術(shù)語“短發(fā)夾RNA”或“shRNA”是指包含RNA的RNAi 因子，所述RNA具有至少兩個(gè)互補(bǔ)部分，其經(jīng)雜交或能雜交而形成長至足以介導(dǎo)RNAi (通常至少長約19bp)的雙鏈(雙螺旋)結(jié)構(gòu)；和至少一個(gè)單鏈部分，其長度通常介于約1個(gè)核苷 酸(nt)與約IOnt范圍內(nèi)并形成環(huán)。在一些實(shí)施例中，shRNA包含長度介于15bp至^bp 范圍內(nèi)的雙螺旋部分和至少一個(gè)長度通常介于Int與約IOnt范圍內(nèi)并形成環(huán)的單鏈部分。 雙螺旋部分可(但通常并不)包含一或多個(gè)由一或多個(gè)不成對(duì)核苷酸組成的凸起。在一些 實(shí)施例中，siRNA通過引發(fā)靶轉(zhuǎn)錄物的降解來介導(dǎo)對(duì)基因表達(dá)的抑制。人們認(rèn)為可通過保 守的細(xì)胞RNAi機(jī)構(gòu)將shRNA處理為siRNA。因此，shRNA可為siRNA的前體。無論如何，與 siRNA類似，siRNA 一般能抑制靶RNA的表達(dá)。小分子一般來說，“小分子”是指在實(shí)驗(yàn)室中制備的或在自然界中發(fā)現(xiàn)的實(shí)質(zhì)上 非肽的非寡聚有機(jī)化合物。本文所用小分子可指“類天然產(chǎn)物”化合物，然而，術(shù)語“小分子” 并不限于“類天然產(chǎn)物”化合物。相反，小分子的特征通常在于其含有若干個(gè)碳-碳鍵，并 且分子量小于 1500g/mol、小于 1250g/mol、小于 1000g/mol、小于 750g/mol、小于 500g/mol、 或小于250g/mol，但出于本發(fā)明目的，此特征并不欲具有限制性。在某些其它實(shí)施例中，采 用類天然產(chǎn)物小分子。相似性本文所用術(shù)語“相似性”是指聚合分子之間(例如核酸分子(例如DNA分 子和/或RNA分子)之間和/或多肽分子之間)的總體相關(guān)性。聚合分子彼此的相似性百 分比的計(jì)算可以與一致性百分比相同的方式來實(shí)施，只是如業(yè)內(nèi)所理解，相似性百分比的 計(jì)算要考慮到保守取代。穩(wěn)定的本文所用術(shù)語“穩(wěn)定的”在用于蛋白質(zhì)時(shí)是指蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的任一方面。 穩(wěn)定的修飾蛋白與初始未修飾蛋白相比具有以下特征中的任何一或多者溶解度更高、對(duì) 聚集的抗性更強(qiáng)、對(duì)變性的抗性更強(qiáng)、對(duì)解折疊的抗性更強(qiáng)、對(duì)不正確或不期望折疊的抗性 更強(qiáng)、復(fù)性能力更強(qiáng)、熱穩(wěn)定性更高、在各種環(huán)境下(例如PH、鹽濃度、存在去污劑、存在變 性劑等)的穩(wěn)定性更高和在非水性環(huán)境下的穩(wěn)定性更高。在某些實(shí)施例中，穩(wěn)定的修飾蛋 白表現(xiàn)上述特征中的至少二者。在某些實(shí)施例中，穩(wěn)定的修飾蛋白表現(xiàn)上述特征中的至少 三者。所述特征可容許活性蛋白以較高水平產(chǎn)生。例如，與蛋白的未修飾形式相比，經(jīng)修飾 蛋白可以較高水平過表達(dá)而不聚集。所述特征亦可容許蛋白質(zhì)用作治療劑或研究工具。個(gè)體本文所用術(shù)語“個(gè)體”或“患者”是指可出于(例如)實(shí)驗(yàn)性、診斷性、預(yù)防性 和/或治療性目的投與本發(fā)明組合物的任一有機(jī)體。典型個(gè)體包括動(dòng)物(例如哺乳動(dòng)物， 例如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動(dòng)物和人類)和/或植物。實(shí)質(zhì)上本文所用術(shù)語“實(shí)質(zhì)上”是指定性地表示完全或接近完全的范圍或程度的 目標(biāo)特征或特性的狀況。生物領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，生物和化學(xué)現(xiàn)象很少(如果有)完成 和/或進(jìn)行至完全或達(dá)成或避免絕對(duì)性結(jié)果。因此，本文所用術(shù)語“實(shí)質(zhì)上”涵蓋許多生物 和化學(xué)現(xiàn)象中固有的缺少完全性的潛在含義。患有“患有”疾病、病癥和/或病況的個(gè)體已診斷出具有或表現(xiàn)出疾病、病癥和/ 或病況的一或多個(gè)癥狀。超荷電本文所用術(shù)語“超荷電”是指導(dǎo)致蛋白質(zhì)中總凈電荷增加或減少的任一蛋 白質(zhì)修飾。修飾包括(但不限于)改變氨基酸序列或添加荷電部分(例如羧酸基團(tuán)、磷酸 基、硫酸基、氨基)。超荷電也是指藥劑與天然存在的或經(jīng)修飾荷電蛋白締合而形成電荷相 對(duì)于所述單獨(dú)藥劑增加或減少的復(fù)合體。超荷電復(fù)合體本文所定義“超荷電復(fù)合體”是指一或多種與經(jīng)改造或天然存在的超荷電蛋白締合的藥劑組合其共同具有相對(duì)于所述單獨(dú)藥劑增加或減少的電荷。對(duì)……易感“對(duì)疾病、病癥和/或病況易感”的個(gè)體尚未診斷出具有和/或可不 表現(xiàn)疾病、病癥和/或病況的癥狀。在一些實(shí)施例中，對(duì)疾病、病癥和/或病況(例如癌癥) 易感的個(gè)體可具有以下特征中的一或多者(1)與疾病、病癥和/或病況的出現(xiàn)相關(guān)的遺傳 突變；(2)與疾病、病癥和/或病況的出現(xiàn)相關(guān)的遺傳多態(tài)性；C3)與疾病、病癥和/或病況 相關(guān)的蛋白質(zhì)和/或核酸的表達(dá)和/或活性提高和/或降低；(4)與疾病、病癥和/或病況 的出現(xiàn)相關(guān)的習(xí)慣和/或生活方式；( 疾病、病癥和/或病況的家族史；和(6)暴露于與 疾病、病癥和/或病況相關(guān)的微生物和/或經(jīng)其感染。在一些實(shí)施例中，對(duì)疾病、病癥和/ 或病況易感的個(gè)體可出現(xiàn)疾病、病癥和/或病況。在一些實(shí)施例中，對(duì)疾病、病癥和/或病 況易感的個(gè)體不會(huì)出現(xiàn)疾病、病癥和/或病況。靶向劑或靶向部分本文所用術(shù)語“靶向劑”或“靶向部分”是指與細(xì)胞、組織和/ 或器官的相關(guān)組份結(jié)合的任一物質(zhì)。此一組份稱作“靶”或“標(biāo)記物”。靶向劑或靶向部分 可為多肽、糖蛋白、核酸、小分子、碳水化合物、脂質(zhì)等。在一些實(shí)施例中，靶向劑或靶向部分 是抗體或其特征性部分。在一些實(shí)施例中，靶向劑或靶向部分是受體或其特征性部分。在 一些實(shí)施例中，靶向劑或靶向部分是配體或其特征性部分。在一些實(shí)施例中，靶向劑或靶向 部分是與細(xì)胞類型特異性標(biāo)記物結(jié)合的核酸靶向劑(例如適體)。在一些實(shí)施例中，靶向劑 或靶向部分是有機(jī)小分子。在一些實(shí)施例中，靶向劑或靶向部分是無機(jī)小分子。靶基因本文所用術(shù)語“靶基因”是指表達(dá)可由RNAi或其它藥劑改變的任一基因。靶轉(zhuǎn)錄物本文所用術(shù)語“靶轉(zhuǎn)錄物”是指自靶基因轉(zhuǎn)錄的任一 mRNA。治療有效量本文所用術(shù)語“治療有效量”意指欲遞送藥劑(例如核酸、藥物、治療 劑、診斷性藥劑、預(yù)防性藥劑等)在投與患有疾病、病癥和/或病況或?qū)ζ湟赘械膫€(gè)體時(shí)足 以治療所述疾病、病癥和/或病況、改良其癥狀、對(duì)其進(jìn)行診斷、對(duì)其進(jìn)行預(yù)防和/或延遲其 發(fā)作的量。治療本文所用術(shù)語“治療”是指部分或完全緩和、改善、改良、減輕特定疾病、病癥 和/或病況的一或多種癥狀或特征、延遲其發(fā)作、抑制其進(jìn)展、降低其嚴(yán)重性和/或降低其 發(fā)病率。例如，“治療”癌癥可意指抑制腫瘤的存活、生長和/或擴(kuò)散。出于降低出現(xiàn)疾病、 病癥和/或病況相關(guān)病狀的風(fēng)險(xiǎn)的目的，可對(duì)不表現(xiàn)所述疾病、病癥和/或病況的體征的個(gè) 體和/或?qū)H表現(xiàn)所述疾病、病癥和/或病況的早期體征的個(gè)體實(shí)施治療。在一些實(shí)施例 中，治療包含將與治療活性核酸締合的超荷電蛋白遞送至有需要的個(gè)體。未修飾的本文所用“未修飾的”是指在超荷電或在復(fù)合體中與經(jīng)改造或天然存在 的超荷電蛋白締合之前的蛋白質(zhì)或藥劑。載體本文所用“載體”是指可運(yùn)輸其已連接核酸的另一核酸分子。在一些實(shí)施例 中，載體可在宿主細(xì)胞(例如真核和/或原核細(xì)胞)中使其所連接核酸達(dá)成染色體外復(fù)制 和/或表達(dá)。能引導(dǎo)可操作連接的基因表達(dá)的載體在本文中稱作“表達(dá)載體”。本發(fā)明提供通過使蛋白質(zhì)自身超荷電或通過締合蛋白質(zhì)或其它藥劑(例如肽、蛋 白質(zhì)、小分子)與超荷電蛋白來促進(jìn)將蛋白質(zhì)或其它藥劑遞送至細(xì)胞的組合物、制劑、系統(tǒng) 和相關(guān)方法。所述系統(tǒng)和方法一般包含使用超荷電蛋白。在一些實(shí)施例中，將超荷電蛋白 自身遞送至細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)部以(例如)引起對(duì)其所穿透細(xì)胞的生物效應(yīng)而獲得治療益處。也 可使用超荷電蛋白質(zhì)來遞送其它藥劑。例如，可使超荷正電蛋白與具有負(fù)電荷的藥劑(例如核酸(其通常具有凈負(fù)電荷)或帶負(fù)電的肽或蛋白質(zhì))通過靜電相互作用締合而形成復(fù) 合體。可使超荷負(fù)電蛋白與具有正電荷的藥劑締合。也可使欲遞送藥劑與超荷電蛋白通過 共價(jià)鍵或其它非共價(jià)相互作用締合。在一些實(shí)施例中，所述組合物、制劑、系統(tǒng)和方法涉及 改變蛋白質(zhì)的一級(jí)序列以使所述蛋白質(zhì)“超荷電”(例如生成超荷正電蛋白)。在某些實(shí)施 例中，本發(fā)明系統(tǒng)使用天然存在的蛋白質(zhì)來形成復(fù)合體。在某些實(shí)施例中，本發(fā)明復(fù)合體包 含超荷電蛋白和一或多種欲遞送藥劑(例如核酸、蛋白質(zhì)、肽、小分子)。在細(xì)胞攝取的一個(gè) 實(shí)例中，已發(fā)現(xiàn)超荷電蛋白可被細(xì)胞胞吞。將超荷電蛋白或與欲遞送藥劑混合形成蛋白質(zhì)/ 藥劑復(fù)合體的超荷電蛋白有效轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。機(jī)制研究表明，這些復(fù)合體的胞吞作用涉及 硫酸化細(xì)胞表面蛋白聚糖但不涉及網(wǎng)格蛋白或小窩蛋白。在一些實(shí)施例中，超荷電蛋白或 包含超荷電蛋白和一或多種欲遞送藥劑的復(fù)合體可用作治療劑、診斷性藥劑、或研究工具。 在一些實(shí)施例中，藥劑和/或超荷電蛋白可具有治療活性。在一些實(shí)施例中，使用超荷電蛋 白或復(fù)合體來調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因的表達(dá)。在一些實(shí)施例中，使用超荷電蛋白或復(fù)合體來調(diào)節(jié) 細(xì)胞中的生物途徑(例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、代謝途徑)。在一些實(shí)施例中，使用超荷電蛋白或 復(fù)合體來抑制細(xì)胞中酶的活性。在一些實(shí)施例中，將本發(fā)明超荷電蛋白或復(fù)合體和/或其 醫(yī)藥組合物投與有需要的個(gè)體。在一些實(shí)施例中，在可將藥劑有效轉(zhuǎn)染至細(xì)胞(例如人類 細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、T細(xì)胞、神經(jīng)元、干細(xì)胞、祖細(xì)胞、血細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等)中 的條件下使本發(fā)明超荷電蛋白或復(fù)合體和/或其組合物與細(xì)胞接觸。在一些實(shí)施例中，將 超荷電蛋白或復(fù)合體遞送至細(xì)胞涉及將超荷電蛋白或包含與治療劑締合的超荷電蛋白的 復(fù)合體投與有需要的個(gè)體。超荷電蛋白超荷電蛋白可通過將蛋白質(zhì)表面上的非保守氨基酸改變?yōu)闃O性更強(qiáng)或帶有更多 電荷的氨基酸殘基來產(chǎn)生。欲改變的氨基酸殘基可為疏水性殘基、親水性殘基、帶電荷殘 基、或其組合。超荷電蛋白也可通過使荷電部分附接至蛋白質(zhì)上以使所述蛋白質(zhì)超荷電來 產(chǎn)生。超荷電蛋白通常對(duì)聚集具有抗性，再折疊能力提高，可抵抗錯(cuò)誤折疊，溶解度提高，并 且一般在眾多種條件下(包括變性條件，例如加熱或存在去污劑)更穩(wěn)定?？墒褂帽景l(fā)明系統(tǒng)修飾任一蛋白質(zhì)來產(chǎn)生超荷電蛋白?？尚揎椞烊灰约胺翘烊坏?白質(zhì)(例如改造蛋白質(zhì))?？尚揎椀鞍踪|(zhì)的實(shí)例包括受體、膜結(jié)合蛋白、跨膜蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄 因子、細(xì)胞外蛋白、治療性蛋白、細(xì)胞因子、信使蛋白、DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn) 導(dǎo)中所涉及蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、細(xì)胞質(zhì)蛋白、核蛋白、疏水性蛋白、親水性蛋白等。欲修飾蛋白 可源自任一種植物、動(dòng)物和/或微生物。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是哺乳動(dòng)物蛋白。在某些 實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是人類蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)源自研究中常用的有機(jī)體。例如， 欲修飾蛋白可來自靈長類動(dòng)物(例如猿、猴子)、嚙齒動(dòng)物(例如兔、倉鼠、沙鼠)、豬、狗、 貓、魚(例如斑馬魚(Danio rerio))、線蟲(例如秀麗隱桿線蟲(C. elegans))、酵母(例如 釀酒酵母(Saccharomyces cervisiae))、或細(xì)菌(例如大腸桿菌)。在某些實(shí)施例中，蛋白 質(zhì)無免疫原性。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)無抗原性。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)不具有固有生 物活性或已經(jīng)修飾而不具有生物活性。在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是基于其靶向能力來選擇。 在某些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)是綠色熒光蛋白。在一些實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)已通過(例如)NMR或X射線晶體學(xué)進(jìn)行表 征的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是結(jié)構(gòu)與生化活性(例如酶促活性、蛋白質(zhì)間相互作用等)有關(guān)和/或相關(guān)的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，所述信息引導(dǎo)對(duì)欲修飾或不修 飾氨基酸殘基的選擇(例如，從而可維持生物功能或可降低或消除生物活性)。在某些實(shí)施 例中，降低或消除蛋白質(zhì)的固有生物活性以降低有害和/或不期望效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。在一些實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是可用于將核酸或其它藥劑遞送至細(xì)胞的蛋白 質(zhì)。在一些實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是成像劑、標(biāo)記劑、診斷劑、預(yù)防劑、或治療劑。在一些 實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是可用于將藥劑(例如核酸)遞送至特定細(xì)胞的蛋白質(zhì)。在一些 實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是具有期望生物活性的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，欲修飾蛋白質(zhì)是 具有期望靶向活性的蛋白質(zhì)。在一些實(shí)施例中，鑒別目標(biāo)蛋白的非保守表面殘基并且用在 生理pH下是親水性、極性和/或帶電荷的殘基替代至少一些所述殘基。在一些實(shí)施例中， 鑒別目標(biāo)蛋白的非保守表面殘基并且用在生理PH下帶正電的殘基來替代至少一些所述殘 基。使用業(yè)內(nèi)已知的任何方法來鑒別欲修飾蛋白質(zhì)的表面殘基。在某些實(shí)施例中，通 過對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電腦建模來鑒別表面殘基。在某些實(shí)施例中，已知和/或已確定蛋白質(zhì)的 三維結(jié)構(gòu)，并且通過使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可視化來鑒別表面殘基。在一些實(shí)施例中，使用電腦軟 件來預(yù)測表面殘基。在某些特定實(shí)施例中，使用每個(gè)側(cè)鏈原子的平均相鄰原子數(shù)(Average Neighbor Atoms per Sidechain Atom) (AvNAPSA)值來預(yù)測表面暴露。AvNAPSA 是表面暴 露的自動(dòng)化量度，其已作為電腦程序來實(shí)踐。低AvNAPSA數(shù)值表示表面暴露殘基，而高數(shù)值 表示位于蛋白質(zhì)內(nèi)部的殘基。在某些實(shí)施例中，使用軟件來預(yù)測蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和/或 三級(jí)結(jié)構(gòu)，并且基于此預(yù)測來鑒別表面殘基。在一些實(shí)施例中，對(duì)表面殘基的預(yù)測是基于殘 基的疏水性和親水性以及其在蛋白質(zhì)一級(jí)序列中的聚簇。除了基于電腦的方法，蛋白質(zhì)的 表面殘基也可使用各種生化技術(shù)來鑒別，例如蛋白酶裂解、表面修飾等。任選地，隨后確定表面殘基中的保守殘基或?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能具有重要意義的殘 基。在不需要保留蛋白質(zhì)的潛在生物活性時(shí)，確定保守殘基的步驟是可選的。對(duì)保守殘基 的鑒別可使用業(yè)內(nèi)已知的任一方法來確定。在某些實(shí)施例中，保守殘基是通過比對(duì)目標(biāo)蛋 白與相關(guān)蛋白的一級(jí)序列來鑒別的。所述相關(guān)蛋白可來自相同蛋白質(zhì)家族。例如，若蛋白 質(zhì)是免疫球蛋白，則可使用其它免疫球蛋白序列。相關(guān)蛋白也可為來自不同物種的相同蛋 白。例如，保守殘基可通過比對(duì)來自不同物種的相同蛋白的序列來鑒別。在另一實(shí)例中，可 比對(duì)具有類似功能或生物活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，使用2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)不同序 列來確定蛋白質(zhì)中的保守氨基酸。在某些實(shí)施例中，若超過50%、超過60%、超過70%、超 過75 %、超過80 %、超過90 %、或超過95 %的序列在特定位置具有相同氨基酸，則可將所述 殘基視為保守殘基。在其它實(shí)施例中，若超過50%、超過60%、超過70%、超過75%、超過 80%、超過90%、或超過95%的序列在特定位置具有相同或相似氨基酸(例如纈氨酸、亮氨 酸和異亮氨酸；甘氨酸和丙氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；或天冬氨酸和谷氨酸)，則可將所 述殘基視作保守殘基。許多軟件包可用于比對(duì)和比較本文所述蛋白質(zhì)序列。如所屬領(lǐng)域技 術(shù)人員可了解，可首先確定保守殘基或可首先確定表面殘基。順序沒有影響。在某些實(shí)施 例中，電腦軟件包可同時(shí)確定表面殘基和保守殘基。也可通過誘變蛋白質(zhì)來鑒別蛋白質(zhì)中 的重要?dú)埢?。例如，可使用蛋白質(zhì)的丙氨酸掃描來確定蛋白質(zhì)中的重要氨基酸殘基。在一 些實(shí)施例中，可使用定點(diǎn)誘變。在某些實(shí)施例中，保留蛋白質(zhì)的原始生物活性并不重要，并 且因此不實(shí)施鑒別保守殘基并在超荷電蛋白保留其的步驟。
將每個(gè)表面殘基鑒別為疏水性或親水性。在某些實(shí)施例中，評(píng)定殘基的疏水性分 數(shù)。例如，可評(píng)定每個(gè)表面殘基的辛醇/水IogP值。還可使用其它疏水性參數(shù)。氨基酸的 所述量表已論述于以下文獻(xiàn)中扎尼(Janin)，1979，自然，277 :491 ；沃爾芬登(Wolfenden) 等人，1981，生物化學(xué)(Biochemistry)，20 :849 ；凱特(Kyte)等人，1982，分子生物學(xué)雜志， 157 :105;羅斯(Rose)等人，1985，科學(xué)，2 :8；34 ；科尼特(Cornette)等人，1987，分子生 物學(xué)雜志，195 659 ；查頓(Charton)和查頓，1982，理論生物學(xué)雜志(J. Theor. Biol)，99 629 ；每篇所述文獻(xiàn)都是以引用方式并入。本發(fā)明方法中可使用這些疏水性參數(shù)中的任一者 來確定欲修飾殘基。在某些實(shí)施例中，鑒別親水性或帶電荷殘基進(jìn)行修飾。然后選擇至少一個(gè)所鑒別表面殘基進(jìn)行修飾。在某些實(shí)施例中，選擇疏水性殘基 進(jìn)行修飾。在其它實(shí)施例中，選擇親水性和/或帶電荷殘基進(jìn)行修飾。在某些實(shí)施例中，選 擇不止一個(gè)殘基進(jìn)行修飾。在某些實(shí)施例中，選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個(gè)所鑒別殘基 進(jìn)行修飾。在某些實(shí)施例中，選擇超過10個(gè)、超過15個(gè)、超過20個(gè)、或超過25個(gè)殘基進(jìn)行 修飾。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，蛋白質(zhì)越大，需要修飾的殘基越多。同樣，蛋白質(zhì)疏水 性越強(qiáng)或越容易聚集或沉淀，需要修飾的殘基越多。在某些實(shí)施例中，產(chǎn)生并測試多個(gè)蛋白 質(zhì)變體(各自具有不同修飾)以確定在將核酸遞送至細(xì)胞、穩(wěn)定性、生物相容性和/或生物 活性方面最佳的變體。在某些實(shí)施例中，使所選擇進(jìn)行修飾的殘基突變?yōu)橛H水性更強(qiáng)的殘基(包括帶電 荷殘基)。通常，使殘基突變?yōu)橛H水性更強(qiáng)的天然氨基酸。在某些實(shí)施例中，使殘基突變?yōu)?在生理PH下帶電荷的氨基酸。例如，可使殘基變?yōu)榫彼?、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸或賴 氨酸。在某些實(shí)施例中，使所有欲修飾殘基都變?yōu)橄嗤牟煌瑲埢?。例如，使所有所選擇 殘基都變?yōu)橘嚢彼釟埢?。在其它?shí)施例中，使所選擇殘基變?yōu)椴煌瑲埢?；然而，所有最終殘 基在生理PH下都可帶正電或帶負(fù)電。在某些實(shí)施例中，為產(chǎn)生帶負(fù)電的蛋白質(zhì)，使所有欲 突變殘基都轉(zhuǎn)化為谷氨酸和/或天冬氨酸殘基。在某些實(shí)施例中，為產(chǎn)生帶正電的蛋白質(zhì)， 使所有欲突變殘基都轉(zhuǎn)化為賴氨酸殘基。例如，所有所選擇欲修飾殘基為天冬酰胺、谷氨酰 胺、賴氨酸和/或精氨酸，并且使所述殘基突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼釟埢Ｔ诹硪粚?shí)例中， 所有所選擇欲修飾殘基為天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺，且使所述殘基突變 為賴氨酸。此方法使得可最大程度地改變蛋白質(zhì)上的凈電荷。在一些實(shí)施例中，對(duì)蛋白質(zhì)的修飾可使經(jīng)修飾蛋白質(zhì)上的凈電荷與未修飾蛋白保 持相同。在一些實(shí)施例中，可修飾蛋白質(zhì)以減少蛋白質(zhì)上的總凈電荷同時(shí)增加表面上的帶 電荷殘基總數(shù)。在某些實(shí)施例中，使理論凈電荷增加至少+1、至少+2、至少+3、至少+4、至 少+5、至少+10、至少+15、至少+20、至少+25、至少+30、至少+35、或至少+40。在某些實(shí)施 例中，使理論凈電荷減少至少-1、至少-2、至少-3、至少-4、至少-5、至少-10、至少-15、至 少-20、至少-25、至少-30、至少-35、或至少-40。在某些實(shí)施例中，使所選氨基酸變?yōu)榉请x 子型極性殘基(例如半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺)。在某些實(shí)施例中，使突變?yōu)閹щ姾砂被釟埢陌被釟埢舜讼喔糁辽?個(gè)、 至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10 個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、或至少25個(gè)氨基酸殘基。在某些實(shí)施例中，使突變?yōu)閹д姷?氨基酸殘基(例如賴氨酸)的氨基酸殘基彼此相隔至少1個(gè)、至少2個(gè)、至少3個(gè)、至少4 個(gè)、至少5個(gè)、至少6個(gè)、至少7個(gè)、至少8個(gè)、至少9個(gè)、至少10個(gè)、至少15個(gè)、至少20個(gè)、或至少25個(gè)氨基酸殘基。通常，這些插入序列是基于所超荷電蛋白質(zhì)的原始氨基酸。在某 些實(shí)施例中，在超荷電蛋白的一行中僅容許有兩個(gè)帶電荷氨基酸。在某些實(shí)施例中，在超荷 電蛋白的一行中僅容許有三個(gè)或更少帶電荷氨基酸。在某些實(shí)施例中，在超荷電蛋白的一 行中僅容許有四個(gè)或更少帶電荷氨基酸。在某些實(shí)施例中，在超荷電蛋白的一行中僅容許 有五個(gè)或更少帶電荷氨基酸。在某些實(shí)施例中，表面暴露的環(huán)、螺旋、轉(zhuǎn)角或其它二級(jí)結(jié)構(gòu)可僅含有1、2、3、4、5、 6、7、8、9、或10個(gè)帶電荷殘基。通常認(rèn)為使帶電荷殘基分布遍及蛋白質(zhì)可使蛋白質(zhì)更穩(wěn)定。 在某些實(shí)施例中，在一級(jí)序列中每15-20個(gè)氨基酸僅有1、2、3、4或5個(gè)殘基突變?yōu)閹щ姾?氨基酸(例如賴氨酸)。在某些實(shí)施例中，在一級(jí)序列中每10個(gè)氨基酸平均僅有1、2、3、4 或5個(gè)殘基突變?yōu)閹щ姾砂被?例如賴氨酸)。在某些實(shí)施例中，在一級(jí)序列中每15個(gè) 氨基酸平均僅有1、2、3、4或5個(gè)殘基突變?yōu)閹щ姾砂被?例如賴氨酸)。在某些實(shí)施例 中，在一級(jí)序列中每20個(gè)氨基酸平均僅有1、2、3、4或5個(gè)殘基突變?yōu)閹щ姾砂被?例如 賴氨酸)。在某些實(shí)施例中，在一級(jí)序列中每25個(gè)氨基酸平均僅有1、2、3、4或5個(gè)殘基突 變?yōu)閹щ姾砂被?例如賴氨酸)。在某些實(shí)施例中，在一級(jí)序列中每30個(gè)氨基酸平均僅 有1、2、3、4或5個(gè)殘基突變?yōu)閹щ姾砂被?例如賴氨酸)。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白中至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或 至少90 %的突變帶電荷氨基酸殘基是溶劑暴露的。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白中至少 50 %、至少60 %、至少70 %、至少80 %、或至少90 %的突變帶電荷氨基酸殘基位于蛋白質(zhì)表 面上。在某些實(shí)施例中，少于5%、少于10%、少于20%、少于30%、少于40%、少于50%的 突變帶電荷氨基酸殘基不是溶劑暴露的。在某些實(shí)施例中，少于5 %、少于10 %、少于20 %、 少于30 %、少于40 %、少于50 %的突變帶電荷氨基酸殘基是內(nèi)部氨基酸殘基。在一些實(shí)施例中，使用一或多種預(yù)定標(biāo)準(zhǔn)來選擇進(jìn)行修飾的氨基酸。例如，為生成 超荷正電蛋白，可使用AvNAPSA值來鑒別AVNAPSA值低于某一閾值的天冬氨酸、谷氨酸、天 冬酰胺和/或谷氨酰胺殘基，并且所述殘基中的一或多者(例如所有)可變?yōu)橘嚢彼?。?一些實(shí)施例中，為生成超荷正電蛋白，使用AvNAPSA來鑒別AVNAPSA低于某一閾值的天冬氨 酸、谷氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺殘基，并且所述殘基中的一或多者(例如所有)變?yōu)?精氨酸。在一些實(shí)施例中，為生成超荷負(fù)電蛋白，使用AvNAPSA來鑒別AVNAPSA值低于某 一閾值的天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸和/或精氨酸殘基，并且所述殘基中的一或多者(例 如所有)變?yōu)樘於彼釟埢?。在一些?shí)施例中，為生成超荷負(fù)電蛋白，使用AvNAPSA來鑒 別AvNAPSA值低于某一閾值的天冬酰胺、谷氨酰胺、賴氨酸和/或精氨酸殘基，并且所述殘 基中的一或多者(例如所有)變?yōu)楣劝彼釟埢?。在一些?shí)施例中，某一閾值為40或更低。 在一些實(shí)施例中，某一閾值為35或更低。在一些實(shí)施例中，某一閾值為30或更低。在一些 實(shí)施例中，某一閾值為25或更低。在一些實(shí)施例中，某一閾值為20或更低。在一些實(shí)施例 中，某一閾值為19或更低、18或更低、17或更低、16或更低、15或更低、14或更低、13或更 低、12或更低、11或更低、10或更低、9或更低、8或更低、7或更低、6或更低、5或更低、4或 更低、3或更低、2或更低、或1或更低。在一些實(shí)施例中，某一閾值為0。在一些實(shí)施例中，通過相鄰殘基數(shù)來鑒別溶劑暴露殘基。一般來說，相鄰殘基較 多的殘基的溶劑暴露性低于相鄰殘基較少的殘基。在一些實(shí)施例中，溶劑暴露殘基是通 過半球暴露來鑒別，其考慮氨基酸側(cè)鏈的方向(哈默爾瑞克(Hamelryck)，2005，蛋白質(zhì)
31(Proteins), 59 :8-48 ；其是以引用方式并入本文中)。在一些實(shí)施例中，溶劑暴露殘基是通 過計(jì)算各殘基的溶劑暴露的表面面積、可及表面面積和/或溶劑排斥表面來鑒別。例如，參 見李(Lee)等人，分子生物學(xué)雜志.55 C3) :379-400,1971 ；理查德(Richmond)，分子生物學(xué) 雜志.178 :63-89,1984 ；上述各文獻(xiàn)是以引用方式并入本文中。蛋白質(zhì)中的期望修飾或突變可使用任一業(yè)內(nèi)已知技術(shù)來完成。用于將所述改變 引入蛋白質(zhì)序列中的重組DNA技術(shù)為業(yè)內(nèi)所熟知。在某些實(shí)施例中，通過定點(diǎn)誘變編碼 蛋白質(zhì)的多核苷酸來達(dá)成修飾。引入突變的其它技術(shù)論述于以下文獻(xiàn)中分子克隆實(shí)驗(yàn) 室手冊(cè)(Molecular Cloning :A Laboratory Manual)，第 2 版，桑布魯克(Sambrook)、弗 里奇(Fritsch)和曼尼阿迪斯(Maniatis)編輯(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社1989)；論文酶 學(xué)方法(Methods in Enzymology)(學(xué)術(shù)出版社公司，紐約)；奧蘇伯爾(Ausubel)等人， 當(dāng)前分子生物學(xué)方案(Current Protocols in Molecular Biology)(約翰威利父子公司 (JohnWiley&Sons，hc.)，紐約，1999)；上述各文獻(xiàn)是以引用方式并入本文中。表達(dá)并測試 經(jīng)修飾蛋白。在某些實(shí)施例中，制備一系列變體，并測試每個(gè)變體來確定其生物活性和其穩(wěn) 定性。所選擇用于后續(xù)應(yīng)用的變體可為最穩(wěn)定者、活性最強(qiáng)者、或具有活性與穩(wěn)定性的最大 總體組合者。在制備第一組變體后，可根據(jù)自第一組變體了解到的信息制備另一組變體。通 常使用業(yè)內(nèi)已知的重組技術(shù)來產(chǎn)生并過表達(dá)變體?？蛇M(jìn)一步修飾超荷電蛋白?？墒褂盟鶎兕I(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來修飾包括超荷 電蛋白在內(nèi)的蛋白質(zhì)。例如，可以化學(xué)方式或生物方式來修飾超荷電蛋白?？稍谝患?jí)序列 中添加、刪除或改變一或多個(gè)氨基酸。例如，可將多組氨酸標(biāo)簽或其它標(biāo)簽添加至超荷電蛋 白以幫助蛋白質(zhì)純化?？蓪⑵渌幕虻鞍踪|(zhì)添加至超荷電蛋白上以改變蛋白質(zhì)的生物、生 化和/或生物物理特性。例如，可將溶內(nèi)體性肽添加至超荷電蛋白的一級(jí)序列中，或可將靶 向肽添加至超荷電蛋白的一級(jí)序列中。超荷電蛋白的其它修飾包括(但不限于)翻譯后修 飾(例如糖基化、磷酸化、?；⒅|(zhì)化、法尼基化、乙?；?、蛋白酶解等)。在某些實(shí)施例 中，可修飾超荷電蛋白以降低其免疫原性。在某些實(shí)施例中，可修飾超荷電蛋白以增強(qiáng)其將 核酸遞送至細(xì)胞中的能力。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白可與聚合物偶聯(lián)。例如，可通過將 蛋白質(zhì)偶聯(lián)至聚乙二醇(PEG)聚合物來使蛋白質(zhì)聚乙二醇化。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可設(shè)想多 種修飾超荷電蛋白而不背離本發(fā)明范圍的方式。本文所述方法容許通過在欲超荷電的蛋白 質(zhì)的蛋白質(zhì)序列中作出改變來使蛋白質(zhì)超荷電?？墒褂闷渌椒▉懋a(chǎn)生超荷電蛋白而不修 飾蛋白質(zhì)序列。例如，可將改變電荷的部分附接至蛋白質(zhì)(例如通過化學(xué)或酶促反應(yīng))以提 供表面電荷從而達(dá)成超荷電。在某些實(shí)施例中，使用肖(Siaw)等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science) 17 :1446,2008中所述修飾蛋白質(zhì)的方法來使蛋白質(zhì)超荷電。國際PCT專利申請(qǐng)案(PCT/US07/70254，在2007年6月1日申請(qǐng)并且作為 W02007/143574在2007年12月13日公開，標(biāo)題為“蛋白質(zhì)表面重建”；其是以引用方式并 入本文中)和美國臨時(shí)專利申請(qǐng)案(在2006年6月2日申請(qǐng)的U. S. S. N. 60/810, 364和在 2006年8月9日申請(qǐng)的U. S. S. N. 60/836，607 ；兩個(gè)申請(qǐng)案的標(biāo)題都是“蛋白質(zhì)表面重建”； 并且所述兩個(gè)文獻(xiàn)都是以引用方式并入本文中)闡述若干種不同蛋白質(zhì)的變體的設(shè)計(jì)和 產(chǎn)生。已顯示這些變體更穩(wěn)定并且可保留其熒光性。例如，來自維多利亞多管發(fā)光水母的 綠色熒光蛋白(GFP)闡述于基因庫(GenBank)中(登錄號(hào)P42212)，其是以引用方式并入本 文中。此野生型GFP的氨基酸序列如下所述
MSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTFSYGVQ CFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYN SHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEF VTAAGITHGMDELYK(SEQ IDNO 1)野生型GFP的理論凈電荷為_7。已產(chǎn)生理論凈電荷為-29、-30、-25、+15、+25、 +36、+48和+49的變體。甚至在將+36GFP加熱至95 °C后，變體蛋白仍然100%可溶并且所 述蛋白的熒光性保持> 70%。已發(fā)現(xiàn)+15、+25和+36GFP尤其可用于將核酸轉(zhuǎn)染至細(xì)胞 中。具體來說，已發(fā)現(xiàn)+36GFP具有高細(xì)胞穿透性并且能將核酸有效遞送至多種哺乳動(dòng)物細(xì) 胞中，包括對(duì)使用其它轉(zhuǎn)染方法具有抗性的細(xì)胞系。因此，人們認(rèn)為GFP或其它凈電荷為至 少+25、至少+30、至少+35、或至少+40的蛋白質(zhì)尤其可用于將核酸轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中。已產(chǎn)生GFP變體的氨基酸序列包括GFP-NEG7MGHHHHHHGGASKGEELFTGWPILVELDGDVNGHKFSVRGEGE ⑶ ATNGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNI LGHKLEYNFNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNE KRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO 2)GFP-NEG25MGHHHHHHGGASKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNI LGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDDHYLSTESALSKDPNE DRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO 3)GFP-NEG29MGHHHHHHGGASKGEELFDGEVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPffPT LVTTLTYGVQCFSRYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNI LGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDDHYLSTESALSKDPNE DRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO :4)GFP-NEG30MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELDGDVNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPT LVTTLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNI LGHKLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDDHYLSTESALSKDPNE DRDHMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK(SEQ ID NO :5)GFP-POS15MGHHHHHHGGASKGERLFTGWPILVELDGDVNGHKFSVRGEGE ⑶ ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPEGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIELKGRDFKEKGNI LGHKLEYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKE KRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO :6)GFP-P0S25MGHHHHHHGGASKGERLFTGWPILVELDGDVNGHKFSVRGKGK ⑶ ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGTYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGHKLRYNFNSHNVYITADKRKNGIKANFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSALSKDPKE KRDHMVLLEFVTAAGITHGMDELYK(SEQ ID NO =XXGFP-P0S36MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGK⑶ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNI LGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKE KRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQ ID NO 7)GFP-P0S42MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGK⑶ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNI LGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKE KRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQ ID NO 8)GFP-P0S48MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGK⑶ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNI LGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKE KRDHMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQ ID NO :9)GFP-P0S49MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLKGDVNGHKFSVRGKGK⑶ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNI LGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKE KRDHMVLKEFVTAAGIKIGRKERYK(SEQ ID NO :10)為促進(jìn)超荷電蛋白或所遞送藥劑(例如核酸)自內(nèi)體逸出，可使超荷電蛋白與已 知可增強(qiáng)內(nèi)體降解或內(nèi)體溶解的蛋白質(zhì)、肽或其它實(shí)體融合或締合。在某些實(shí)施例中，所述 肽是血凝素2(H/^)肽，已知其可增強(qiáng)內(nèi)體降解。在某些特定實(shí)施例中，使HA2肽與超荷電 GFP(例如+36GFP)融合。在某些特定實(shí)施例中，所融合蛋白具有以下序列+36GFP-HA2MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGK⑶ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPT LVTTLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNI LGHKLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKE KRDHMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ IDNO :XX)在某些實(shí)施例中，溶內(nèi)體性肽是蜂毒肽(GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ，SEQ ID Ν0:ΧΧ)(邁爾(Meyer)等人，JACS 130(11) :3272_3273，2008 ；其是以引用方式并入本文 中)。在某些實(shí)施例中，通過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸的取代、缺失和/或添加 來修飾蜂毒肽。在某些實(shí)施例中，蜂毒肽具有以下序列CIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ(SEQ ID NO :ΧΧ)。在某些特定實(shí)施例中，使蜂毒肽與超荷電GFP (例如+36GFP)融合。在某些實(shí)施例中，溶內(nèi)體性肽是穿透肽(RQIKIWFQNRRMKWKK-酰胺，SEQ IDNO XX)、牛 PrP (1-30)肽(MVKSKIGSWILVLFVAMWSDVGLCKKRPKP-酰胺，SEQID NO :XX)、MPG Δ NLs 肽(其由于K- > S取代而缺少功能性核定位序列)(GALFLGWLGAAGSTMGAPKSKRKV，SEQID NO :XX)、TP-10 肽(AGYLLGKINLKALAALAKKIL-酰胺，SEQ ID NO :XX)和 / 或 EBl 肽 (LIRLWSHLIHIWFQNRRLKWKKK-酰胺，SEQ ID NO :XX)(倫德伯格(Lundberg)等人，2007，美國 實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)雜志(FASEB J.)21 :2664;其是以引用方式并入本文中)。在某些 實(shí)施例中，通過一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)氨基酸取代、缺失和/或添加來修飾穿透肽、 PrP (1-30)、MPG、TP-10 和 / 或 EBl 肽。在某些特定實(shí)施例中，使 PrP (1-30)、MPG、TP-10 和 /或EBl肽與超荷電GFP (例如+36GFP)融合。也可使其它肽或蛋白質(zhì)與超荷電蛋白融合。例如，可使靶向肽與超荷電蛋白融合 以選擇性地將超荷電蛋白或締合藥劑(例如核酸)遞送至特定細(xì)胞類型中。也可使用增強(qiáng) 核酸轉(zhuǎn)染的肽或蛋白質(zhì)。在某些實(shí)施例中，與超荷電蛋白融合的肽是肽類激素。在某些實(shí) 施例中，與超荷電蛋白融合的肽是肽類配體。如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員可了解，也可認(rèn)為本發(fā)明范圍包括同源蛋白。例如，根據(jù)本發(fā) 明可采用包括如下區(qū)段的任一蛋白質(zhì)其具有約20個(gè)、約30個(gè)、約40個(gè)、約50個(gè)、或約100 個(gè)氨基酸并且與上述任一序列約40 %、約50 %、約60 %、約70 %、約80 %、約90 %、約95 %、 或約100%—致?；蛘呋蛄硗猓鶕?jù)本發(fā)明可采用添加和缺失變體。在某些實(shí)施例中，根據(jù) 本發(fā)明可采用具有如上述任一序列中所示突變殘基的任一GFP。在某些實(shí)施例中，欲根據(jù)本 發(fā)明采用的蛋白質(zhì)序列包括2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、或更多個(gè)如上 述任一序列中所示的突變。可超荷電并且可用于(例如)遞送藥劑(例如核酸)的其它蛋白質(zhì)包括其它GFP 型熒光蛋白。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白是藍(lán)色熒光蛋白的超荷電形式。在某些實(shí)施例 中，超荷電蛋白是青色熒光蛋白的超荷電形式。在某些實(shí)施例中，超荷電蛋白是黃色熒光蛋 白的超荷電形式。實(shí)例性熒光蛋白包括(但不限于)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EGFP)、AcGFP、 TurboGFP> Emerald、Azami Green、ZsGreen、EBFP> Sapphire、T-Sapphire、ECFP> mCFP、 Ceru 1 ean,CyPet,AmCyan 1,Midori-Ishi CyarumTFPl (Teal)、增強(qiáng)型黃色熒光蛋白(EYFP)、 Topaz、Venus、mCitrine、YPet> PhiYFP> ZsYellowl、mBanana、Kusabira Orange、mOrange、 dTomato、dTomato-Tandem、DsRecU DsRed2、DsRed-Express (Tl)、DsRed-單體、mTangerine、 mStrawberry、AsRed2、mRFPl、JRecU mCherry、HcRedl、mRaspberry、HcRedl、HcRed-Tandem、 mPlum 禾口 AQ 143?？沙呻姴⑶铱捎糜?例如)遞送藥劑(例如核酸)的其它蛋白質(zhì)包括組蛋白組 份或組蛋白樣蛋白。在某些實(shí)施例中，組蛋白組份是組蛋白連接體HI。在某些實(shí)施例中，組 蛋白組份是核心組蛋白H2A。在某些實(shí)施例中，組蛋白組份是核心組蛋白H2B。在某些實(shí)施 例中，組蛋白組份是核心組蛋白H3。在某些實(shí)施例中，組蛋白組份是核心組蛋白H4。在某 些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是古細(xì)菌組蛋白樣蛋白HPhA。在某些實(shí)施例中，所述蛋白是細(xì)菌組 蛋白樣蛋白TmHU?？沙呻姴⑶铱捎糜?例如)遞送藥劑(例如核酸)的其它蛋白質(zhì)包括高遷移率 蛋白(HMG)。在某些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是HMG1。在某些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是HMG17。 在某些實(shí)施例中，所述蛋白質(zhì)是HMG1-2?？沙呻姴⑶铱捎糜?例如)遞送藥劑(例如核酸)的其它蛋白質(zhì)包括抗癌藥， 例如抗細(xì)胞凋亡劑、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑等?？沙呻姴⑶铱捎糜?例如)遞送藥劑(例如核酸)的其它蛋白質(zhì)是酶，包括(但不限于)淀粉酶、果膠酶、水解酶、蛋白酶、葡萄糖異構(gòu)酶、脂肪酶、植酸酶等。在一些實(shí)施例 中，可超荷電并且可用于(例如)遞送藥劑(例如核酸)的蛋白質(zhì)是溶酶體酶，包括(但不 限于)阿糖腦苷酶、伊米苷酶(imiglucerase)、阿加糖酶β (agalsidasebeta)、α-1-艾杜 糖醛酸酶、酸性α -葡萄糖苷酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶 等(王(Wang)等人，2008，NBT J6 :901-08 ；其是以引用方式并入本文中)?？沙呻姴⑶铱捎糜?例如)遞送藥劑(例如核酸)的其它蛋白質(zhì)展示于表1中。 表1中所列示的一些蛋白質(zhì)包括一系列可經(jīng)修飾以使所述蛋白質(zhì)超荷電的殘基。所述殘基 的一致性是通過下載目標(biāo)蛋白的PDB文檔以計(jì)算方式來確定。通過追溯avNapsa值來對(duì) Pdb文檔中的殘基進(jìn)行分類，并且建議使前15個(gè)ASP、GLU、ASN或GLN殘基突變?yōu)長YS。按照慣例，PDB文檔根據(jù)氨基酸在野生型蛋白質(zhì)中的順序?qū)ζ溥M(jìn)行編號(hào)。然而，PDB 文檔不能含有全長野生型蛋白質(zhì)。輸入蛋白質(zhì)序列是PDB中所包括的氨基酸序列。建議突 變提供氨基酸在全長野生型蛋白質(zhì)中的編號(hào)以及在輸入蛋白質(zhì)序列中的編號(hào)。建議突變是 以以下模式來提供野生型殘基鏈殘基在野生型蛋白質(zhì)鏈中的編號(hào)(殘基在輸入鏈中的 編號(hào))建議殘基。野生型殘基是指野生型蛋白質(zhì)中的氨基酸屬性。鏈?zhǔn)侵妇哂兄付ㄍ蛔兊?肽鏈的名稱。殘基在野生型蛋白質(zhì)中的編號(hào)是指氨基酸在全長野生型蛋白質(zhì)中的具有指定 突變的指定蛋白質(zhì)鏈中的編號(hào)。殘基在輸入鏈中的編號(hào)是指氨基酸在所分析PDB包括的指 定蛋白質(zhì)鏈中的編號(hào)。表1.可超荷電的實(shí)例性蛋白質(zhì)
權(quán)利要求
1.一種超荷電蛋白制劑，其中所述超荷電蛋白的總體凈負(fù)電荷或凈正電荷大于其相應(yīng) 未修飾蛋白且數(shù)量充足，并且所述超荷電蛋白經(jīng)調(diào)配用于穿透至細(xì)胞中。
2.如權(quán)利要求1所述的制劑，其中所述制劑是醫(yī)藥上可接受的制劑。
3.一種將超荷電蛋白、或與超荷電蛋白締合的藥劑、或二者引入細(xì)胞中的方法，其包含使所述超荷電蛋白、或超荷電蛋白和與所述超荷電蛋白締合的藥劑與所述細(xì)胞在足以 容許所述超荷電蛋白、或所述與超荷電蛋白締合的藥劑穿透至所述細(xì)胞中的條件下接觸， 由此將超荷電蛋白、或與超荷電蛋白締合的藥劑、或二者引入細(xì)胞中。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其進(jìn)一步通過以下方式中的一或多者來確認(rèn)所述超荷電 蛋白或與所述超荷電蛋白締合的藥劑已經(jīng)穿透所述細(xì)胞檢測標(biāo)記、檢測所述細(xì)胞中的生 物學(xué)變化、或在投與所述超荷電蛋白、或與超荷電蛋白締合的藥劑的個(gè)體中檢測諸如病癥 治療等反應(yīng)。
5.一種復(fù)合體，其包含超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白的總凈電荷大于其相應(yīng)未修飾蛋白；和一或多種核因子。
6.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白具有總體凈正電荷。
7.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+5。
8.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+10。
9.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+15。
10.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+20。
11.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+25。
12.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+30。
13.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+35。
14.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述總體凈正電荷為約+40。
15.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述目標(biāo)超荷電蛋白在生理pH下所帶正電荷多 于其相應(yīng)未修飾蛋白。
16.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述目標(biāo)超荷電蛋白在生理pH下所帶正電荷比 其相應(yīng)未修飾蛋白多至少+5。
17.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述目標(biāo)超荷電蛋白在生理pH下所帶正電荷比 其相應(yīng)未修飾蛋白多至少+10。
18.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述目標(biāo)超荷電蛋白在生理pH下所帶正電荷比 其相應(yīng)未修飾蛋白多至少+5。
19.如權(quán)利要求6所述的復(fù)合體，其中所述目標(biāo)超荷電蛋白在生理pH下所帶正電荷比 其相應(yīng)未修飾蛋白多至少+5。
20.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白是熒光蛋白。
21.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白是綠色熒光蛋白(GFP)。
22.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白是超荷正電GFP。
23.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白是具有以下序列的超荷正電 GFP(+36GFP)MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK(SEQ ID NO :XX)。
24.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含如SEQID NO :7中所示的 氨基酸序列。
25.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含所述如SEQID NO :7中所 示氨基酸序列中約20個(gè)氨基酸的區(qū)段。
26.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含所述如SEQID NO :7中所 示氨基酸序列中約30個(gè)氨基酸的區(qū)段。
27.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含所述如SEQID NO :7中所 示氨基酸序列中約40個(gè)氨基酸的區(qū)段。
28.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含所述如SEQID NO :7中所 示氨基酸序列中約50個(gè)氨基酸的區(qū)段。
29.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含所述如SEQID NO :7中所 示氨基酸序列中約100個(gè)氨基酸的區(qū)段。
30.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID N0:7中所 示氨基酸序列約40%—致的氨基酸序列。
31.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID N0:7中所 示氨基酸序列約50%—致的氨基酸序列。
32.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID NO :7中所 示氨基酸序列約60%—致的氨基酸序列。
33.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID NO :7中所 示氨基酸序列約70%—致的氨基酸序列。
34.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID NO :7中所 示氨基酸序列約80%—致的氨基酸序列。
35.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID NO :7中所 示氨基酸序列約90%—致的氨基酸序列。
36.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白包含與所述SEQID NO :7中所 示氨基酸序列約95%—致的氨基酸序列。
37.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白是綠色熒光蛋白與血凝素 2(HA2)肽的融合蛋白。
38.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白是綠色熒光蛋白與血凝素 2(HA2)肽的融合蛋白，其具有以下序列MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELKGDVNGHKFSVRGKGK⑶ATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRDERYKGSAGSAAGSGEFGLFGAIAGFIENGWEGMIDG(SEQ ID NO :XX)。
39.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酸包含RNA。
40.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酸包含DNA。
41.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酸包含RNAi因子。
42.如權(quán)利要求41所述的復(fù)合體，其中所述RNAi因子選自由以下組成的群組短干擾RNA、短發(fā)夾RNA、微小RNA和其組合。
43.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含RNAi誘導(dǎo)實(shí)體。
44.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含反義RNA。
45.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含核酶或脫氧核酶。
46.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含誘導(dǎo)三螺旋形成的RNA。
47.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含RNA適體。
48.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含載體。
49.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含驅(qū)動(dòng)mRNA表達(dá)的載體。
50.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述核酉髮包含驅(qū)動(dòng)蛋白質(zhì)表達(dá)的載體。
51.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中超荷電蛋白與核酸的比率為約1 1。
52.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白與核酸的比率為約1 2。
53.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白與核酸的比率為約1 3。
54.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白與核酸的比率為約1 4。
55.如權(quán)利要求5所述的復(fù)合體，其中所述超荷電蛋白與核酸的比率為約1 5。
56.一種復(fù)合體，其包含超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白的總凈電荷大于其相應(yīng)未修飾蛋白；和一或多種肽 或蛋白。
57.一種復(fù)合體，其包含超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白的總凈電荷大于其相應(yīng)未修飾蛋白；和一或多種小分子。
58.一種復(fù)合體，其包含選自由以下組成的群組的蛋白質(zhì)西科龍(cyclon)(識(shí)別號(hào)Q9H6F5)、PNRCl (識(shí)別 號(hào):Q12796)、RNPSl (識(shí)別號(hào):Q15287)、SURF6(識(shí)別號(hào)075683)、AR6P(識(shí)別號(hào)Q66PJ3)、 NKAP (識(shí)別號(hào):Q8N5F7)、EBP2(識(shí)別號(hào):Q99848)、LSMll (識(shí)別號(hào)P83369)、RL4(識(shí)別號(hào) P36578) ,KRRl (識(shí)別號(hào)Q13601) ,RY-I (識(shí)別號(hào):Q8WVK2)、BriX (識(shí)別號(hào):Q8TDN6)、MNDA (識(shí) 別號(hào)P41218)、Hlb (識(shí)別號(hào):P16401)、細(xì)胞周期蛋白(識(shí)別號(hào)Q9UK58)、MDK(識(shí)別號(hào) P21741)、PR0K (識(shí)別號(hào)Q9HC23)、FGF5(識(shí)別號(hào)P12034)、SFRS (識(shí)別號(hào)Q8N9Q2)、AKIP (識(shí) 別號(hào):Q9NWT8)、CDK (識(shí)別號(hào):Q8N726)、β -防御素(識(shí)別號(hào)P81534)、PAVAC (識(shí)別號(hào) Ρ18509)、嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子-3(識(shí)別號(hào)Q9Y258)、組蛋白H2A(識(shí)別號(hào)Q7L7L0) 和HMGBl (識(shí)別號(hào)P09429)；和一或多種多核苷酸。
59.一種復(fù)合體，其包含選自由以下組成的群組的蛋白質(zhì)西科龍(識(shí)別號(hào)Q9H6F5)、PNRCl (識(shí)別號(hào) Q12796)、RNPSl (識(shí)別號(hào):Q15287)、SURF6 (識(shí)別號(hào):075683)、AR6P(識(shí)別號(hào)Q66PJ3)、 NKAP (識(shí)別號(hào):Q8N5F7)、EBP2(識(shí)別號(hào):Q99848)、LSMll (識(shí)別號(hào)P83369)、RL4(識(shí)別號(hào) P36578) ,KRRl (識(shí)別號(hào)Q13601) ,RY-I (識(shí)別號(hào):Q8WVK2)、BriX (識(shí)別號(hào):Q8TDN6)、MNDA (識(shí) 別號(hào)P41218)、Hlb (識(shí)別號(hào):P16401)、細(xì)胞周期蛋白(識(shí)別號(hào)Q9UK58)、MDK(識(shí)別號(hào)P21741)、PR0K (識(shí)別號(hào)Q9HC23)、FGF5(識(shí)別號(hào)P12034)、SFRS (識(shí)別號(hào)Q8N9Q2)、AKIP (識(shí) 別號(hào):Q9NWT8)、CDK (識(shí)別號(hào):Q8N726)、β -防御素(識(shí)別號(hào)P81534)、PAVAC (識(shí)別號(hào) Ρ18509)、嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子-3(識(shí)別號(hào)Q9Y258)、組蛋白H2A(識(shí)別號(hào)Q7L7L0) 和HMGBl (識(shí)別號(hào)P09429)；和一或多種肽或蛋白質(zhì)。
60.一種復(fù)合體，其包含選自由以下組成的群組的蛋白質(zhì)西科龍(識(shí)別號(hào)Q9H6F5)、PNRC1 (識(shí)別號(hào) Q12796)、RNPSl (識(shí)別號(hào):Q15287)、SURF6 (識(shí)別號(hào):075683)、AR6P(識(shí)別號(hào)Q66PJ3)、 NKAP (識(shí)別號(hào):Q8N5F7)、EBP2(識(shí)別號(hào):Q99848)、LSMll (識(shí)別號(hào)P83369)、RL4(識(shí)別號(hào) P36578) ,KRRl (識(shí)別號(hào)Q13601) ,RY-I (識(shí)別號(hào):Q8WVK2)、BriX (識(shí)別號(hào):Q8TDN6)、MNDA (識(shí) 別號(hào)P41218)、Hlb (識(shí)別號(hào):P16401)、細(xì)胞周期蛋白(識(shí)別號(hào)Q9UK58)、MDK(識(shí)別號(hào) P21741)、PR0K (識(shí)別號(hào):Q9HC23)、FGF5 (識(shí)別號(hào):P12034)、SFRS (識(shí)別號(hào):Q8N9Q2)、AKIP (識(shí) 別號(hào):Q9NWT8)、CDK (識(shí)別號(hào):Q8N726)、β -防御素(識(shí)別號(hào)P81534)、PAVAC (識(shí)別號(hào) Ρ18509)、嗜酸性粒細(xì)胞活化趨化因子-3(識(shí)別號(hào)Q9Y258)、組蛋白H2A(識(shí)別號(hào)Q7L7L0) 和HMGBl (識(shí)別號(hào)P09429)；和一或多種小分子。
61.一種超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白的總凈電荷大于其相應(yīng)未修飾蛋白，其中所 述超荷電蛋白包含至少5個(gè)帶正電但在所述相應(yīng)未修飾蛋白中不帶正電的氨基酸殘基，并 且其中所述帶正電的氨基酸殘基的每一者之間間隔至少1個(gè)氨基酸殘基。
62.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白包含至少10個(gè)帶正電但在 所述相應(yīng)未修飾蛋白中不帶正電的氨基酸殘基。
63.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白包含至少15個(gè)帶正電但在 所述相應(yīng)未修飾蛋白中不帶正電的氨基酸殘基。
64.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白包含至少20個(gè)帶正電但在 所述相應(yīng)未修飾蛋白中不帶正電的氨基酸殘基。
65.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白包含至少25個(gè)帶正電但在 所述相應(yīng)未修飾蛋白中不帶正電的氨基酸殘基。
66.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述帶正電的氨基酸殘基的每一者之間間 隔至少2個(gè)氨基酸殘基。
67.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述帶正電的氨基酸殘基的每一者之間間 隔至少3個(gè)氨基酸殘基。
68.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述帶正電的氨基酸殘基的每一者之間間 隔至少5個(gè)氨基酸殘基。
69.如權(quán)利要求61所述的超荷電蛋白，其中所述帶正電的氨基酸殘基的每一者之間間 隔至少10個(gè)氨基酸殘基。
70.一種超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白的總凈電荷大于其相應(yīng)未修飾蛋白，其中所 述超荷電蛋白包含至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基 與存于所述相應(yīng)未修飾蛋白中的相應(yīng)氨基酸殘基不同，并且其中所述帶正電的氨基酸殘基 的每一者之間間隔至少1個(gè)氨基酸殘基。
71.如權(quán)利要求61或70所述的超荷電蛋白，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基的 最遠(yuǎn)氨基末端與最遠(yuǎn)羧基末端之間的距離為約10個(gè)氨基酸。
72.一種超荷電蛋白，其中所述超荷電蛋白的總凈電荷大于其相應(yīng)未修飾蛋白，其中所 述超荷電蛋白包含至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基 與存于所述相應(yīng)未修飾蛋白中的相應(yīng)氨基酸殘基不同，并且其中所述至少5個(gè)帶正電的氨 基酸殘基中的至少60%定位于所述蛋白質(zhì)的表面。
73.如權(quán)利要求72所述的超荷電蛋白，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基中的至 少70%定位于所述蛋白質(zhì)的表面。
74.如權(quán)利要求72所述的超荷電蛋白，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基中的至 少80%定位于所述蛋白質(zhì)的表面。
75.如權(quán)利要求72所述的超荷電蛋白，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基中的至 少90%定位于所述蛋白質(zhì)的表面。
76.如權(quán)利要求72所述的超荷電蛋白，其中所述至少5個(gè)帶正電的氨基酸殘基中的至 少95%定位于所述蛋白質(zhì)的表面。
77.一種超荷電蛋白，其中至少5個(gè)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸殘 基與所述相應(yīng)未修飾蛋白中的相應(yīng)氨基酸殘基不同，其中所述相應(yīng)未修飾蛋白中具有最高 AvNAPSA分?jǐn)?shù)的所述至少5個(gè)天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺氨基酸殘基突變?yōu)橘?氨酸，并且其中所述至少5個(gè)氨基酸殘基帶正電荷。
78.一種醫(yī)藥組合物，其包含如權(quán)利要求5至60中任一權(quán)利要求所述的復(fù)合體；和醫(yī)藥上可接受的賦形劑。
79.一種方法，其包含以下步驟提供易患、患有或表現(xiàn)一或多種疾病、病癥或病況癥狀的個(gè)體；將如權(quán)利要求1至77中任一權(quán)利要求所述的超荷電蛋白或復(fù)合體或如權(quán)利要求78所 述的醫(yī)藥組合物投與所述個(gè)體，從而改良至少一種癥狀。
80.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述投與步驟是在足以使所述超荷電蛋白或復(fù)合 體穿透所述個(gè)體的細(xì)胞的條件下實(shí)施。
81.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述疾病、病癥或病況與mRNA、蛋白質(zhì)或其組合的 異常升高水平有關(guān)。
82.如權(quán)利要求81所述的方法，其中所述復(fù)合體包含可降低所述mRNA或蛋白質(zhì)的異常 升高水平的核酸。
83.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述疾病、病癥或病況與mRNA、蛋白質(zhì)或其組合的表達(dá)有關(guān)。
84.如權(quán)利要求83所述的方法，其中所述復(fù)合體包含可降低所述mRNA或蛋白質(zhì)的表達(dá) 水平的核酸。
85.如權(quán)利要求84所述的方法，其中所述核酸選自由以下組成的群組RNAi因子、RNAi 誘導(dǎo)實(shí)體、反義RNA、核酶和其組合。
86.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述疾病、病癥或病況與mRNA或蛋白質(zhì)的異常低 水平有關(guān)。
87.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述復(fù)合體包含可提高所述mRNA或蛋白質(zhì)的異常 升高水平的核酸。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中所述核酸包含表達(dá)載體。
89.如權(quán)利要求79所述的方法，其中所述投與步驟包含選自由以下組成的群組的投與 路徑經(jīng)口、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、皮下、心室內(nèi)、局部、吸入和經(jīng)粘膜遞送。
90.一種試劑盒，其用于實(shí)施如權(quán)利要求79至89中任一權(quán)利要求所述的方法。
91.一種試劑盒，其包含如權(quán)利要求5至60中任一權(quán)利要求所述的復(fù)合體或如權(quán)利要 求78所述的醫(yī)藥組合物。
92.一種評(píng)估超荷電蛋白的細(xì)胞穿透的方法，其包含 任選地選擇超荷電蛋白；提供所述超荷電蛋白； 使所述超荷電蛋白與細(xì)胞接觸；和測定所述超荷電蛋白是否穿透所述細(xì)胞，由此評(píng)估超荷電蛋白的細(xì)胞穿透。
93.一種評(píng)估超荷電蛋白的細(xì)胞穿透的方法，其包含 選擇欲超荷電的蛋白質(zhì)；獲得一個(gè)含一個(gè)或多個(gè)欲改變殘基的集合以產(chǎn)生超荷電蛋白； 提供具有所述經(jīng)改變殘基集合的超荷電蛋白； 使所述超荷電蛋白與細(xì)胞接觸；和測定所述超荷電蛋白是否穿透所述細(xì)胞，由此評(píng)估超荷電蛋白的細(xì)胞穿透。
全文摘要
本發(fā)明揭示用于將超荷電蛋白或超荷電蛋白與治療劑(例如核酸、肽、小分子)的復(fù)合體遞送至細(xì)胞的組合物、系統(tǒng)和相關(guān)方法。超荷正電蛋白可通過靜電相互作用與核酸(通常具有凈負(fù)電荷)締合。所述系統(tǒng)和方法可涉及改變蛋白質(zhì)的一級(jí)序列以使蛋白質(zhì)“超荷電”(例如生成超荷正電蛋白)。所述組合物可用于治療增生性疾病、傳染病、心血管疾病、先天性代謝缺陷、遺傳性疾病等。
文檔編號(hào)A61K47/42GK102066405SQ200980123772
公開日2011年5月18日 申請(qǐng)日期2009年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月28日
發(fā)明者大衛(wèi)·R·劉, 布賴恩·R·麥克諾頓, 戴維·B·湯普森, 詹姆斯·約瑟夫·克羅尼坎 申請(qǐng)人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會(huì)