專利名稱：帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，同時提供了構(gòu)建該哺乳動物細胞系的方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
干擾素是一類在同種細胞上具有廣譜抗病毒活性和免疫調(diào)節(jié)功能的糖蛋白，在機體抗病毒天然免疫中發(fā)揮重要作用。研究表明，I型干擾素是最早誘導表達的基因，主要通過JAK-STAT信號轉(zhuǎn)導途徑激活一系列級聯(lián)反應(yīng)。一方面誘導抗病毒蛋白(如ISG蛋白、Mxl蛋白、2-5’寡聚腺苷合成酶、一氧化氮合成酶等)的表達量升高，發(fā)揮抗病毒作用，另一方面作用于受感染的細胞，激活相關(guān)基因的表達，使機體迅速處于抗病毒的防御狀態(tài)，建立廣泛的抗病毒防御系統(tǒng)。目前在基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用中，豬干擾素α的產(chǎn)生多采用大腸桿菌表達系統(tǒng)或酵母表達系統(tǒng)。采用大腸桿菌表達的信號肽序列缺失的重組干擾素_α，未經(jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體的加工，缺少天然的IFN-α活性，需要進行復性處理；酵母表達系統(tǒng)存在分泌能力低，背景雜蛋白含量高導致難以純化，以及過度糖基化等問題。哺乳動物細胞表達系統(tǒng)表達產(chǎn)物在分子結(jié)構(gòu)、生物學功能方面最接近于天然的蛋白質(zhì)，但表達水平較低。本發(fā)明選擇 pcDNA3.0作為載體在豬Η(15細胞中表達豬α干擾素以克服原核表達和酵母表達系統(tǒng)的不足，獲得具有接近天然干擾素蛋白活性的基因工程干擾素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，使豬干擾素在哺乳動物細胞中得到了表達，提供了上述哺乳動物細胞系的建立方法，能夠建立帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，提供了穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，是一種帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系。本發(fā)明的技術(shù)方案是帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，所述豬干擾素α基因具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列。所述豬干擾素α基因的擴增引物具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列。帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系的制備方法，它的步驟如下
(1)利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法從豬外周血白細胞中擴增豬干擾素α基因；
(2)豬干擾素α基因插入真核表達載體的多克隆位點上，得到重組表達載體
pcDNA-poIFNa ；
(3)將重組真核表達載體pcDNA-poIFNa轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的細胞系。具體步驟如下
真核表達載體的構(gòu)建參照GenBank上已發(fā)表的豬α干擾素基因序列Μ28623和)(57191,利用引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5. 0設(shè)計真核表達引物P3和P4，P3引物帶有EcoR I酶切位點，下游引物 P4帶有BioI酶切位點，上、下游引物之間所擴增片段長570bp，同時用DNAstar等軟件評價所設(shè)計的引物。上游弓丨物P3 5，TCTAGAATTCATGGCCCCAACCTCAG 3， 下游引物 P4:5，TACACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG 3，
PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用EcoR I /XhoI雙酶切，純化后與pcDNA3. O載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5ci感受態(tài)細胞，涂布于含Amp的瓊脂平板上進行抗性篩選，挑取多個單菌落搖菌進行PCR鑒定，堿裂解法小量提取陽性質(zhì)粒并酶切鑒定，測序正確后，構(gòu)建成功的真核表達質(zhì)粒命名為pcDNA-poIFN_a。穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的H(15細胞系的構(gòu)建
采用基因工程的方法，將豬IFN-α基因插入到真核細胞表達載體多克隆位點處，得到重組表達載體。通過脂質(zhì)體LipOfeCtamineTM2000介導的細胞轉(zhuǎn)染以及抗生素篩選技術(shù)，篩選出可以表達豬IFN-a基因的細胞系。本發(fā)明的積極效果在于將構(gòu)建的pcDNA-poIFN-a大量純化無菌提取后，利用 Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染H(15細胞，經(jīng)G418篩選15天后，獲得抗性細胞。采用一系列方法對獲得的細胞在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯表達水平進行鑒定，獲得穩(wěn)定表達豬干擾素 α基因的Η(15細胞，采用反轉(zhuǎn)錄PCR、實時定量PCR以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)細胞方法在Η(15細胞中檢測到豬干擾素α mRNA和蛋白的表達。


圖1為豬α干擾素基因PCR擴增結(jié)果，其中，Ml :DL2000Marker, 1 豬α干擾素 RT-PCR 產(chǎn)物。圖2為pTG19-T-poIFN-a重組質(zhì)粒擴增和酶切鑒定結(jié)果，其中，Ml DL15000Marker, 1 =BamH I重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果，2:豬α干擾素RT-PCR產(chǎn)物，Μ2 DL2000Markero圖3為豬α干擾素進化樹分析結(jié)果。圖4為豬α干擾素真核表達重組質(zhì)粒PCR擴增及酶切鑒定結(jié)果，其中，Ml =DL 15000 Marker，1 豬α干擾素真核表達質(zhì)粒酶切產(chǎn)物，2 豬α干擾素真核表達RT-PCR產(chǎn)物，Μ2 =DL 2000 Marker。圖5為豬α干擾素ELISA檢測繪制的標準曲線。圖6為熒光定量PCR方法檢測豬α干擾素mRNA轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果。圖7為重組poIFN- α在ΡΚ-15細胞中穩(wěn)定表達。
具體實施例方式帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，所述豬干擾素α基因具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列。所述豬干擾素α基因的擴增引物具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系的制備方法，它的步驟如下
(1)利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法從豬外周血白細胞中擴增豬干擾素α基因；
(2)豬干擾素α基因插入真核表達載體的多克隆位點上，得到重組表達載體
pcDNA-poIFNa ；
(3)將重組真核表達載體pcDNA-poIFNa轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的細胞系。豬α干擾素氨基酸序列 MAPTSAFLTALVLLSCNAIYSLGCDLPQTYSLAHTRALRPLAQMRRISPFSCLDYRRDFGFPQEALGGNQVQ
KAQAMALVHEMLQQTSQLFSTEGSAAAWDDSLLHQFCTGLDQQLRDLEACVMQEAGLEGTPLLEEDSILAVRKYFHR LTLYLQEKSYSPCAWEIVRAEVMRAFSSSTNLQDRLRKKE
質(zhì)粒pcDNA3. O-poIFN-α的核苷酸序列，其中944-1513位是poIFN-α基因序列 GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTCGACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAA GCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAA GGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATA TACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGG AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATA ATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAACTGC CCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCT GGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACC ATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCC CATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCAT TGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACT GCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTA ACGGCCGCCAGTGTGCTG^ TTCA TGGCCCCAACCTCAGCCTTCCTCACGGCCCTGGTGCTACTCAGCTGCAA TGC CATCTACTCTCTGGGCTGTGACCTGCCTCAGACCTACAGCCTGGCTCACACCAGGGCCCTGAGGCCCCTGGCACAAA TGAGGAGAATCTCTCCCTTCTCCTGCCTGGACTACAGAAGGGACTTTGGATTCCCCCAAGAGGCCTTGGGGGGCAAC CAGGTCCAGAAGGCTCAAGCCA TGGCTCTGGTGCA TGAGA TGCTCCAGCAGACCTCCCAGCTCTTCAGCACAGAGGG CTCAGCTGCTGCCTGGGATGACAGCCTCCTGCACCAGTTCTGCACTGGACTGGATCAGCAGCTCAGGGACCTGGAAG CCTGTGTCA TGCAGGAGGCGGGGCTGGAAGGGACCCCCCTGCTGGAGGAGGACTCCA TCCTGGCTGTGAGGAAA TAC TTCCACAGACTCACCCTCTA TCTGCAAGAGAAGAGCTACAGCCCCTGTGCCTGGGAGA TCGTCAGGGCAGAAGTCA T GAGAGCCTTCTCTTCCTCCACAAACCTGCAAGACAGACTCAGGAAGAAGGAGTGACTCGAGCATGCATCTAGAGGGC CCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGT TGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAA TTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGG GAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAG GGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACAC TTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAA GCTCTAAATCGGGGCATCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGG TGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGGGG ATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAG TTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCA GGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTC CCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTT TTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCC TAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTT CGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGC ACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGA CCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCT TGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCT CCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATC CGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTC GATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCC CGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTG GATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAA GAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTT CTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCC ATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGA TGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTAC AAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACT CATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTC CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCC TAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCT GCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACT CGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCA GGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGC GTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAG GACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGA TACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTA GGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATC GTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGG TATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTG CGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCG GTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACG GGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTA GATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAAT GCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAG ATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCC AGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCT ACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTAC ATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAG TGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACT GGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGA TAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGA TCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACC AGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAAT ACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAAT GTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGT SEQ ID No. 1 <110>河南農(nóng)業(yè)大學
<120>帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系及其制備方法 <160> 2 <170> PatentIn Version 3.3 <210> 1 <211> 570 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (1)... (570) <400> 1
atggccccaacctcagccttcctcacggccctggtgctactcagctgcaatgccatctac60tctctgggctgtgacctgcctcagacctacagcctggctcacaccagggccctgaggccc120ctggcacaaatgaggagaatctctcccttctcctgcctggactacagaagggactttgga180ttcccccaagaggccttggggggcaaccaggtccagaaggctcaagccatggctctggtg240catgagatgctccagcagacctcccagctcttcagcacagagggctcagctgctgcctgg300gatgacagcctcctgcaccagttctgcactggactggatcagcagctcagggacctggaa360gcctgtgtcatgcaggaggcggggctggaagggacccccctgctggaggaggactccatc420ctggctgtgaggaaatacttccacagactcaccctctatctgcaagagaagagctacagc480ccctgtgcctgggagatcgtcagggcagaagtcatgagagccttctcttcctccacaaac540ctgcaagacagactcaggaagaaggagtga570
SEQ ID No. 2 <110>河南農(nóng)業(yè)大學
<120>帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系及其制備方法 <160> 2
<170> PatentIn Version 3.3
7<210> 2 <211> 185 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221> misc_feature <222> (1)... (185) <400> 2 Met Ala Pro Thr Ser Ala 5
Asn Ala lie Tyr Ser Leu 20
Ala His Thr Arg Ala Leu 35
Pro Phe Ser Cys Leu Asp 5055
Leu Gly Gly Asn Gln
Phe Gly
Leu Thr 10
Cys Asp
Ala
65
His
Ala
Asp
Leu
Tyr
Ala
Glu Met Leu
85
Ala Ala Trp Asp 100
Gln Gln Leu Arg
Asn 70 Gln Gln
Asp Asp
115 Glu Gly 130
Phe His
Trp Glu
165 Leu Gln
Thr Pro
Arg Leu
150 lie Val
Asp Arg
Leu 135 Thr Leu
Arg Ala
170 Leu Arg
25 Arg Pro 40
Tyr Arg
Val Gln
Thr Ser
Ser Leu
105 Leu Glu 120 Leu Glu
Leu Arg Lys
Ala Leu Ala
Leu
Pro
Gln 45 Phe
Asp 60 Ala Gln
75 Gln Leu
90
Leu
Ala Glu
His Cys
Phe Gln Val
Val
Gln 30
Met
Gly Ala Ser
Leu
15
Thr
Arg
Phe
Met
Thr 95 Cys
Tyr Leu
155 Glu Val
Lys Lys
Asp
140 Gln Glu
Met Arg 175
Glu
Phe 110 Met Gln 125
Ser lie Leu
Leu
Tyr
Arg
Pro
Ala 80 Glu
Thr
Glu
Ser Ser lie Gln Leu Gly Gly Ala
Lys Ser 160 Ala Phe
Ala Val
145 Tyr Ser
Ser Ser
Cys Leu Ser Glu Val Ser Leu Gly
Arg Lys Pro Cys Ser Thr
Asn.
180185
1材料與方法 1. 1質(zhì)粒、菌株和細胞株
PK-15細胞由河南農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)微生物實驗室保存，于含有5%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。宿主菌DH-5 α、真核表達載體pcDNA3. 0載體，PRRSV HeN-2株，均由本實驗室保存。
1. 2試劑與儀器
RPMI 1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基購自GIBCO公司，pTG19_T載體購自上海捷瑞公司，限制性內(nèi)切酶EcoR I、XhoI、Taq聚合酶、T4 DNA Ligase均為TaKafci公司產(chǎn)品。DNA快速膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 Reagent購自hvitrogen公司，G418、胰蛋白酶購自Sigma公司，新生牛血清購自杭州四季青生物公司，豬α干擾素Elisa試劑盒購自R&D公司。ΕΡΧ-800酶標檢測儀購自Thermo公司；S2-93自動雙重純水蒸餾器為上海亞榮公司產(chǎn)品；ABI熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)板購自美國康寧公司。1.3 引物設(shè)計參照GenBank上已發(fā)表的豬α干擾素基因序列Μ28623和 )(57191，利用引物設(shè)計軟件I^rimer Premier 5. 0設(shè)計包括豬α干擾素完整開放閱讀框的上、下游引物Pl和Ρ2，擴增片段為660bp，引物如下上游引物Pl :5’ CTCAGCCAGGACAGAAGC 3’，下游引物P2 :5’ GGAAGAATGGGCTTGTTAG 3’ ；設(shè)計真核表達引物擴增片段長570bp，上游引物 P3 :5’ TCTAGAATTCATGGCCCCAACCTCAG 3’，帶有 EcoR I 酶切位點(下劃線部分)，ATG 為起始密碼子，下游引物P4 :5，TACACTCGAGTCACTCCTTCTTCCTG 3，，帶有XhoI酶切位點(下劃線部分)，TCA反向互補序列TGA為終止密碼子。同時用DNAstar等軟件評價所設(shè)計的引物。豬α干擾素和β-actin持家基因熒光定量PCR引物序列如下豬α干擾素上游Ρ5 5，-GGATCAGCAGCTCAGGG-3，，豬 α 干擾素下游Ρ6 :5，-GAGGGTGAGTCTGTGGAAGTA _3，，產(chǎn)物長度為 121 bp, β -actin 上游 Bl 5' - CGGGACATCAAGGAGAAGC- 3，，β -actin 下游 B2 5'-CTCGTTGCCGATGGTGATG- 3，，產(chǎn)物長度為 132 bp。1.4 目的基因IFN-α的擴增、克隆和序列測定采集豬外周血，分離淋巴細胞，采用Trizol法提取白細胞RNA，將提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系20 μ L，RNA模板 11 μ L,dNTP (10 mmol/L)混合物 1 μ L，5X Buffer 緩沖液4 μ L，M_MuLV 反轉(zhuǎn)錄酶(200 U/ UL) lyL，RNase抑制劑(40 U/μ L) lyL，反轉(zhuǎn)錄引物Ρ2 1 μ L，混合體系在42°C下反應(yīng) lh。取反轉(zhuǎn)錄cDNA進行PCR，PCR擴增體系25μ L，其中iTaq DNA聚合酶8 μ L，ddH2013 μ L， Ρ1、Ρ2引物各lyL，模板3yL。PCR反應(yīng)條件為:95°C預變性5min，95°C變性30s，55°C退火40s，72°C延伸45s，31個循環(huán)后，72°C延伸lOmin。目的片段PCR產(chǎn)物回收后純化，克隆至PTG19-T Vector，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)大腸桿菌，經(jīng)藍白斑篩選出陽性重組質(zhì)粒，送上海生工公司進行序列測定。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pTG19-T_poIFN-a。1.5 真核表達載體pcDNA3. O-poIFN-α的構(gòu)建
用引物P3、P4從重組質(zhì)粒pTG19-T-poIFN-a上擴增目的基因，PCR反應(yīng)條件同上，PCR 產(chǎn)物回收純化。將pcDNA3. O空載體和目的片段用EcoR I和BioI雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定并膠回收，回收產(chǎn)物用T4連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pcDNA3. 0-poIFN- a。1. 6 PK-15細胞的復蘇
超凈臺紫外燈照射30min，從液氮灌中取出PK-15細胞凍存管，迅速放入37°C水浴鍋中使其盡快解凍，超凈臺中倒出凍存管細胞懸液入提前準備好的細胞瓶中，補加10mll0%的細胞生長液，37°C 5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。1.7 G418篩選濃度的確定
待細胞瓶中的細胞長成致密單層時，棄去廢舊培養(yǎng)液，用0. 25%的胰酶消化，加入含 10%新生牛血清的DMEM營養(yǎng)液約15mL，反復吹打細胞呈單個懸浮。以2X 105個的細胞密度接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞長至單層達70 80%，更換新鮮培養(yǎng)液并分別加入終濃度為 200 μ g/ml,300 μ g/ml,400 μ g/ml,500 μ g/ml 和 600 μ g/ml 的 G418，并設(shè)置空白對照，37°C 5% C02條件下培養(yǎng)，每2 3d換液一次，選擇出在10 14d內(nèi)PK-15細胞全部死亡的最低G418濃度為最適工作濃度。1.8 重組質(zhì)粒 pcDNA3. O-poIFN-α 轉(zhuǎn)染 PK-15 細胞
將純度OD26W為1. 85-1. 95的大量提純質(zhì)粒在脂質(zhì)體作用下傳染冊-15細胞。將生長狀態(tài)良好的細胞接種6孔板，待細胞密度達60%-80%，按照Lipofectamine 2000 Reagent脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體系說明書，每孔加入質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine Reagent以1 2.5(質(zhì)量體積)的比例混合轉(zhuǎn)染。染中的細胞在標準生長條件下(37°C、5%C02)培養(yǎng)4 6h后除去培養(yǎng)液與DNA沉淀，每孔加入新鮮的預熱的DMEM生長培養(yǎng)基^iI,置37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)36 48h，后用G418進行篩選。同時設(shè)空質(zhì)粒對照組和空白細胞對照組。1.9干擾素α在H(-15細胞中的表達及檢測
1. 9. 1重組質(zhì)粒pcDNA3. Ο-poIFN α轉(zhuǎn)染ΡΚ-15細胞mRNA的提取重組質(zhì)粒pcDNA3. 0-poIFN α轉(zhuǎn)染冊-15細胞，擴大培養(yǎng)后，經(jīng)胰酶消化收集冊_15細胞于離心管中，2000rpm lOmin，用PBS液懸浮，按TRIZOL法提取細胞總RNA，提取豬α干擾素mRNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，根據(jù)本實驗室建立的豬α干擾素熒光定量PCR方法，對Η(-15 細胞上穩(wěn)定表達的豬α干擾素mRNA水平進行檢測，具體操作步驟對豬α干擾素表達產(chǎn)物進行總RNA提取，用下游引物進行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系如下總RNA 11 μΙ,ΙΟπΜ dNTPs 2μ1，下游引物1 μ1，65 溫浴5min，然后置于冰上急冷，加5XM-MLV RT Buffer 4 μ ,M-MLV 1 μ ，Rnase Inhibitor (40υ/μ1) 1 μ ，總體積共 20 μ ，將上述混合物混勻后， 420C 60min ；70°C lOmin，進行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)結(jié)束后可以立即進行PCR反應(yīng)或_20°C保存?zhèn)溆?。按常?guī)PCR擴增體系進行，反應(yīng)程序為94°C預變性5min，PCR循環(huán)為94°C變性45s， 56. 2°C ( β-actin :55. 2)退火 40s, 72°C 延伸 40s，34 個循環(huán)后，72°C延伸 IOmin0 程序運行結(jié)束后，取6μ1 PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。同時real-time PCR 反應(yīng)程序為95°C 30s，PCR 循環(huán) 95°C 10s, 60°C 34s，40 個循環(huán)。1.9.2 ELISA檢測豬干擾素α表達 1.9. 2. 1試劑的準備
(1)收集重組質(zhì)粒pcDNA3.0-poIFN α轉(zhuǎn)染Η(-15細胞的上清液，IOOOrpm離心lOmin， 去除細胞殘渣
(2)標準品的準備標準品稀釋前將標準品振蕩混勻，稀釋比例按表1進行
表1豬α干擾素ELISA試劑盒標準品的稀釋
1600pg/ml6號標準品原倍濃度不用稀釋直接加入50ul800pg/ml5號標準品IOOul的原倍標準品加入IOOul的標準品稀釋液400pg/ml4號標準品IOOul的5號標準品加入IOOul的標準品稀釋液200pg/ml3號標準品IOOul的4號標準品加入IOOul的標準品稀釋液100pg/ml2號標準品IOOul的3號標準品加入IOOul的標準品稀釋液50pg/ml1號標準品IOOul的2號標準品加入IOOul的標準品稀釋液Opg/ml空白對照原始濃度不用稀釋直接加入50ul
(3)洗滌緩沖液用滅菌蒸餾水50倍稀釋 1. 9. 2. 2操作步驟
(1)使用前，將所有試劑充分混勻，不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。 (2)根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標準品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)，每個標準品和空白孔建議做復孔，每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復孔的盡量做復孔，標本用標本稀釋液1 1稀釋后加入50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。(3)加入稀釋好的標準品50ul于反應(yīng)孔中，加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)，立即加入50ul生物素標記的抗體，蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37°C溫育lh。(4)甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復此操作3次。(5)每孔加入60ul的親和鏈霉素-HRP，輕輕振蕩混勻，37°C溫育30min。(6)甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30s，甩去洗滌液，用吸水紙拍干，重復此操作3次。(7)每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37°C溫育lOmin，避免光照。(8)取出酶標板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。(9)在450nm波長處測定各孔的OD值。2結(jié)果與分析
2.1豬α干擾素基因的PCR擴增
從分離的豬外周血白細胞中提取豬α干擾素基因總RNA，通過RT-PCR方法擴出一條 660bp大小的目的片段，與預期片段一致(如圖1)，豬α干擾素的完整開放閱讀框為570bp， 編碼166個成熟氨基酸。2. 2重組質(zhì)粒的鑒定
將純化回收的DNA片段連接到pTG19-T載體后，轉(zhuǎn)化和篩選白斑提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定，獲得陽性pTG19-T-poIFN-a重組質(zhì)粒，用BamH
I單酶切，得到了與預期目標相符大小的片段，結(jié)果表明，目的DNA片段連接、轉(zhuǎn)化正確(如圖2)。2.3目的基因的序列測定
將鑒定為陽性的重組質(zhì)粒送往大連寶生物工程公司測序，獲得豬α干擾素的完整開放閱讀框，通過Blast和DNAstar軟件分析，并與GenBank上下載序列AY776246、 M28623, X57191和NM214393進行比對，核苷酸同源性都在95%以上，其中與序列AY435969 和匪214393的同源性達到為97. 4%，運用ClustralX 1. 81和MEG4軟件繪制豬α干擾素系統(tǒng)發(fā)育進化樹(如圖3)，確定豬α干擾素測序結(jié)果正確， 2.4真核表達重組質(zhì)粒的鑒定
利用真核表達引物Ρ3和Ρ4擴增出目的片段，并克隆到pcDNA3. O真核表達載體中，經(jīng) EcoR I和B10I雙酶切鑒定，酶切片段大小與預期結(jié)果一致，送上海博尚測序分析，結(jié)果表明目的基因插入的位置、大小均正確。PCR擴增及酶切鑒定結(jié)果(如圖4)。2. 5豬α干擾素轉(zhuǎn)染ΡΚ-15細胞mRNA的提取
將重組質(zhì)粒pcDNA-poIFN- α轉(zhuǎn)染ΡΚ-15細胞后進行擴大培養(yǎng)，收集細胞，放入離心管中3000rmp離心lOmin，棄上清，用PBS液懸浮細胞，按照實驗一的方法提取總RNA，結(jié)果出現(xiàn)與預期一致的目的片段。2. 6豬α干擾素ELISA試劑盒檢測
以標準品濃度為橫坐標，所測的OD值為縱坐標，繪制豬α干擾素標準曲線，以標準值為橫坐標，所測的OD值為縱坐標，繪制標準曲線(圖5)，根據(jù)公式y(tǒng)=0. 0016x+0. 1937，R2=0. 9895，換算出pcDNA-poIFN-α轉(zhuǎn)染H(-15細胞的表達蛋白量標準值為883. 94pg/ml。2. 7豬α干擾素mRNA水平的檢測
繪制溶解曲線，表明擴增產(chǎn)物形成單一的特異性溶解峰，溶解溫度介于85°C 90°C之間。以β-actin為內(nèi)參基因，應(yīng)用相對熒光定量PCR檢測豬α干擾素在冊_15細胞上的表達量，結(jié)果與PCDNA3.0空載體對照組相比，豬α干擾素mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)(如圖6)。2.8豬α干擾素穩(wěn)定表達的冊_15細胞系的建立
真核表達質(zhì)粒pcDNA-IFN-a轉(zhuǎn)染H(-15細胞24h后，用500 μ g/mL G418進行篩選培養(yǎng)，6孔板長滿后，轉(zhuǎn)入細胞培養(yǎng)瓶中進行擴大培養(yǎng)，收集轉(zhuǎn)染后的H(-15細胞，提取 PoIFNa的mRNA，經(jīng)過PCR檢測獲得預期的目的片段；應(yīng)用豬α干擾素ELISA試劑盒對豬α干擾素的表達蛋白進行檢測，繪制標準曲線，獲得豬α干擾素表達蛋白的表達量為 883. 94pg/ml ；通過建立豬α干擾素熒光定量方法，檢測豬α干擾素mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果與空載體的對照組相比，豬α干擾素mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)；建立了豬α干擾素穩(wěn)定表達的H(-15細胞系(圖7)。
權(quán)利要求
1.帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，其特征在于所述豬干擾素α 基因具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系，其特征在于所述豬干擾素α基因的擴增引物具有SEQ ID No. 2的氨基酸序列。
3.如權(quán)利要求1所述的帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系的制備方法， 其特征在于它的步驟如下(1)利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法從豬外周血白細胞中擴增豬干擾素α基因；(2)豬干擾素α基因插入真核表達載體的多克隆位點上，得到重組表達載體pcDNA-poIFNa ；(3)將重組真核表達載體pcDNA-poIFNa轉(zhuǎn)染并篩選出穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的細胞系。
全文摘要
本發(fā)明公開了帶有穩(wěn)定表達豬干擾素α基因的哺乳動物細胞系及其制備方法，建立一種完整豬α干擾素基因的克隆、重組真核表達載體的構(gòu)建以及穩(wěn)定表達豬α干擾素的真核細胞系，將克隆的豬α干擾素cDNA基因插入到pcDNA3.0載體中構(gòu)建真核表達載體pcDNA-poIFNα，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染豬PK15細胞，經(jīng)G418篩選后用熒光定量PCR和ELISA方法分別檢測豬α干擾素mRNA及蛋白的表達水平，構(gòu)建了穩(wěn)定表達豬α干擾素的PK15細胞系。采用一系列方法對獲得的細胞在基因水平、轉(zhuǎn)錄水平和翻譯表達水平進行鑒定。
文檔編號C12N15/21GK102533662SQ20121000574
公開日2012年7月4日 申請日期2012年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月10日
發(fā)明者盧曉艷, 夏平安, 崔保安, 慕春龍 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學