專利名稱：Hiv感染的肽衍生物融合抑制劑的制作方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及人類免疫缺陷病毒(以下稱“HIV”)gp41 C-末端肽衍生物，這些肽衍生物是病毒感染的抑制劑和/或顯示抗融合特性。尤其是，本發(fā)明涉及具有對(duì)HIV和猿猴免疫缺陷病毒(以下稱“SIV”)的抑制活性，溶解度提高和作用持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)的肽衍生物，可用于治療相應(yīng)的病毒感染。
相關(guān)技術(shù)綜述膜融合是正常細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程的普遍事件，而且膜融合也參與各種疾病狀態(tài)，包括，例如包膜病毒進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。一些包膜病毒可以通過(guò)病毒包膜蛋白與細(xì)胞表面蛋白之間的特異性結(jié)合反應(yīng)而與靶細(xì)胞融合，該反應(yīng)可以引發(fā)相關(guān)病毒蛋白的構(gòu)象改變，然后促使病毒包膜與細(xì)胞膜的融合。
HIV是一種包膜病毒，為逆轉(zhuǎn)錄病毒慢病毒家族的成員之一，HIV有兩種主要類型，HIV-1和HIV-2，已經(jīng)鑒定了每個(gè)類型的各種菌株。HIV與其宿主細(xì)胞的融合是通過(guò)病毒包膜蛋白gp120和gp41與細(xì)胞表面上的CD4糖蛋白和趨化因子共同受體的結(jié)合所介導(dǎo)的。gp120與T細(xì)胞表面上CD4以及與共同受體(如CCR5或CXCR4)結(jié)合后，gp41插入到靶細(xì)胞膜中；接著gp41 N-末端部分的螺旋與相同蛋白的C-末端的螺旋形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)，使得病毒與細(xì)胞接近而融合(Malashkevich，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1998 Aug 4；95(16)9134-9)。
已知肽可以抑制或以其它方式破壞膜融合相關(guān)事件，包括，例如抑制反轉(zhuǎn)錄病毒傳播到未感染細(xì)胞。來(lái)自HIV包膜蛋白gp41第二個(gè)七殘基重復(fù)區(qū)域的肽，包括T20(DP178)和C34，在體外顯示出有效抗HIV的抗病毒活性(見(jiàn)Wild，et al.，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，919770-4；Chan，et al.，1998，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，9515613-15617)。已證實(shí)的抗病毒活性包括抑制游離病毒對(duì)CD4+細(xì)胞的感染和/或抑制HIV誘導(dǎo)的感染和未感染CD4+細(xì)胞之間合胞體的形成。這種抑制可能是通過(guò)這些肽與gp41中第一個(gè)七殘基重復(fù)區(qū)域的結(jié)合，因此阻止了第一個(gè)與第二個(gè)七殘基重復(fù)區(qū)域形成融合性發(fā)夾結(jié)構(gòu)而發(fā)生的。
盡管本領(lǐng)域描述的很多抗病毒或抗融合肽在體外顯示出有效的抗病毒和/或抗融合活性，但是它們?cè)隗w內(nèi)半衰期短，主要由于快速血清清除和肽酶和蛋白酶活性。這又大大降低它們的有效抗病毒活性。因此需要一種延長(zhǎng)肽在體內(nèi)的半衰期，而基本上不影響抗融合活性的方法。
美國(guó)專利5,612,034公開(kāi)了一個(gè)延長(zhǎng)肽的半衰期的方法，它描述了將治療性肽與在血流中找到的天然蛋白共價(jià)結(jié)合的方法。這個(gè)肽被化學(xué)反應(yīng)性部分所修飾，該部分能夠與血流中蛋白上存在的功能團(tuán)反應(yīng)。將該修飾肽注射到血流后，它與長(zhǎng)期存活的血液成分連接形成肽的長(zhǎng)期存活庫(kù)。然而，因?yàn)檠髦械鞍椎姆肿恿吭?0-600kD的范圍，所以要考慮到這種大得多的蛋白的空間障礙可能危害這種連接肽的生物活性。
在ConjuChem，Inc的國(guó)際專利出版物WO 00/69902(以下稱“902出版物”)中公開(kāi)了延長(zhǎng)已知的抗融合肽半衰期的嘗試。在這個(gè)出版物中，DP178被這樣修飾將3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸通過(guò)酰胺鍵連接到賴氨酸的ε氨基上，然后這個(gè)賴氨酸通過(guò)肽鍵與DP178的C-末端苯丙氨酸連接。“902出版物”還提出了該修飾的DP178的類似物，它們是DP178的截短物或來(lái)自其它HIV病毒分離株的gp41的相應(yīng)片段?！?02出版物”沒(méi)有提示抗融合肽的任何其它設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)。
因此，仍然需要延長(zhǎng)肽在體內(nèi)的半衰期而基本上不影響抗融合活性的方法。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及具有抗病毒、抑制病毒和/或抗融合活性的HIV gp41肽衍生物，包括但不限于表1，2，3和

圖1中的修飾肽，及其修飾和衍生形式(以下統(tǒng)稱“gp41變體肽”)。這些gp41變體肽使得體內(nèi)穩(wěn)定性增加和對(duì)肽酶或蛋白酶降解的易感性降低。結(jié)果，gp41變體肽與未修飾的HIVgp41肽預(yù)期的相比，將更頻繁或甚至持續(xù)給藥的需要減至最小。本發(fā)明的肽衍生物，和使用本發(fā)明方法由其他病毒的gp41樣序列制備的衍生物，可以用作例如很多病毒，包括但不限于HIV和SIV的感染的預(yù)防劑和/或治療劑。
根據(jù)本發(fā)明，提供了與HIV gp41的相應(yīng)未修飾肽序列相比具有增加的溶解度和抗病毒活性的肽衍生物。更具體一些，本發(fā)明涉及以下表1、2和3和圖1中所示式子的化合物，它們包括在體內(nèi)或離體能夠與血液成分上的硫醇基發(fā)生反應(yīng)形成穩(wěn)定共價(jià)鍵的肽衍生物。
表1 gp41肽片斷和修飾的類似物Ac-SLEQIWNNMT WEEWDREINN YTELIHELIE ESQNQQEKNE QELL-NH2 (SEQ ID NO1)FB005Ac-WEEWDREINN YTKLIHELIE ESQNQQEKNE QELL-NH2 (SEQ ID NO2)FB006Ac-WEEWDREINN YTKLIHELIE ESQNQQEENE QELL-NH2 (SEQ ID NO7)FB066Ac-WQE WEQKITALLE QAQIQQEKNE YELQKLDKWA SLWEWF-NH2 (SEQ ID NO3)T-1249Ac-YTSLIHSLIE ESQNQQEKNE QELLELDKWA SLWNWF-NH2 (SEQ ID NO4)T-20Ac-WMEWDREINN YTSLIHSLIE ESQNQQEKNE QELL-NH2 (SEQ ID NO5)C-34表2馬來(lái)酰亞胺修飾的肽

本發(fā)明提供了一些新的組合物，含有相對(duì)于天然肽具有預(yù)定殘基的修飾(即點(diǎn)突變)的肽，它們導(dǎo)入后提高了活性和溶解度。該預(yù)定殘基由表3中找到的肽序列的帶下劃線氨基酸殘基組成。帶有修飾殘基的肽包括但不限于置換的氨基酸殘基，其中具有親水性或疏水性增加的性能的氨基酸殘基置換了天然氨基酸殘基。也可以用有高α螺旋形成傾向性的氨基酸殘基置換gp41變體肽?？晒┻x擇地，帶有修飾殘基的肽包括但不限于衍生的氨基酸殘基，其中偶聯(lián)基團(tuán)與預(yù)定氨基酸殘基綴合，由此允許衍生肽與血液成分的共價(jià)鍵合。
另一方面，本發(fā)明提供了包含上述結(jié)構(gòu)式的衍生物與藥物可接受載體的藥物組合物。這些藥物組合物可用于抑制HIV(包括HIV-1、HIV-2及其所有血清型)和SIV的活性。
在本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方案中，提供了抑制HIV或SIV感染的方法。該方法包括將抑制病毒有效量的一個(gè)或多個(gè)gp41變體肽，單獨(dú)或聯(lián)合藥物可接受載體，或聯(lián)合其它抗病毒劑(包括其它gp41變體肽)給予受試者，優(yōu)選哺乳動(dòng)物，最優(yōu)選人。在本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，至少一個(gè)gp41變體肽，單獨(dú)或聯(lián)合藥物載體，或聯(lián)合其它抗病毒劑(包括其它gp41變體肽)可以以抑制病毒量給予受試者。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了包含與血液成分共價(jià)鍵合的至少一個(gè)gp41變體肽的綴合物(conjugate)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，與本發(fā)明化合物反應(yīng)的優(yōu)選血液成分包括蛋白，例如免疫球蛋白，包括IgG和IgM，血清白蛋白、鐵蛋白、類固醇結(jié)合蛋白、運(yùn)鐵蛋白、甲狀腺素結(jié)合蛋白、α-2-巨球蛋白等，血清白蛋白和IgG是更優(yōu)選的實(shí)施方案，而血清白蛋白是本發(fā)明最優(yōu)選的實(shí)施方案。
本發(fā)明的進(jìn)一步方面，提供了延長(zhǎng)受試者中g(shù)p41變體肽的體內(nèi)半衰期的方法，該方法包括將一個(gè)或多個(gè)gp41變體肽與血液成分共價(jià)鍵合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了設(shè)計(jì)、合成和測(cè)試具有對(duì)抗各種病毒的抗病毒、抑制病毒或抗融合活性的新肽的方法。該方法包括篩選參與進(jìn)入細(xì)胞的病毒蛋白以鑒定其中具有α螺旋形成傾向的肽序列，和根據(jù)這些肽設(shè)計(jì)可以用于治療相同病毒引起疾病的組合物。該方法還包括在體外測(cè)試這些肽組合物以證實(shí)抗病毒、抑制病毒或抗融合活性。
附圖簡(jiǎn)述圖1-圖1顯示了本發(fā)明中公開(kāi)的各種肽的比對(duì)序列。
發(fā)明詳述這里使用的“衍生”是指將偶聯(lián)基團(tuán)添加到肽序列上。下面更詳細(xì)提供了代表性的偶聯(lián)基團(tuán)。
這里使用的“修飾”是指天然肽序列中的第一氨基酸被第二氨基酸置換。第二氨基酸可以選自非限制性組親水性氨基酸、疏水性氨基酸、具有螺旋傾向的氨基酸、非天然存在的氨基酸和天然存在的L-氨基酸的D-異構(gòu)體。
HIV-1以及相關(guān)慢病毒與靶細(xì)胞的融合可以被實(shí)現(xiàn)融合的天然病毒包膜蛋白質(zhì)的肽片斷所抑制。這些肽片斷可以與包膜蛋白結(jié)合并阻斷病毒包膜蛋白的遠(yuǎn)端部分的結(jié)合，由此抑制對(duì)實(shí)現(xiàn)HIV-1與靶細(xì)胞融合很重要的天然蛋白的構(gòu)象改變。這些肽通過(guò)阻斷病毒與細(xì)胞的融合，中斷了疾病發(fā)展所必需的感染過(guò)程。
本發(fā)明改善了現(xiàn)有抗病毒和抗融合肽的性質(zhì)，并提供了有效治療HIV和SIV的新肽組合物。用本發(fā)明肽可以抑制的病毒包括但不限于人逆轉(zhuǎn)錄病毒HIV(包括HIV-1和HIV-2，及其所有其它血清型)和SIV。
修飾的肽可以根據(jù)本發(fā)明制備具有對(duì)慢病毒的抗融合活性的修飾、衍生肽的方法。這些抗融合肽是基于天然gp41蛋白序列的形成螺旋的肽，它們通過(guò)改變?cè)撾牡乃x擇的氨基酸而被修飾。選擇修飾的氨基酸以避免破壞有助于與病毒包膜蛋白gp41形成卷曲螺旋復(fù)合物的相互作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，選擇用來(lái)修飾的氨基酸殘基是其側(cè)鏈遠(yuǎn)離卷曲螺旋界面的殘基。用將增加該肽的疏水或親水特性的可替換殘基置換這些殘基，或可替換地衍化這些殘基而提供能夠使該肽與循環(huán)血液蛋白共價(jià)鍵合的反應(yīng)性部分。親水殘基導(dǎo)入肽序列將增加肽的溶解度。疏水殘基導(dǎo)入肽序列將降低肽的溶解度。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的肽包括稱做FB005，F(xiàn)B006和FB066的肽，特別是帶有馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)部分或其它等同偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的這些肽的衍生物，如3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸通過(guò)[2-(2-氨基-乙氧基)乙氧基]乙酸與賴氨酸結(jié)合。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用具有形成α螺旋傾向性的氨基酸置換肽序列中的氨基酸。
可供選擇地，化學(xué)基團(tuán)可以被添加在它們的氨基和/或羧基末端，使得例如增加肽的穩(wěn)定性、反應(yīng)性和/或溶解度。例如，疏水基團(tuán)如芐氧羰基、丹?；?dansyl)、乙?；蚴宥』豸驶梢蕴砑拥诫牡陌被┒?。同樣，乙?；?-芴基甲氧基-羰基可以置于肽的氨基末端。另外，疏水基團(tuán)，叔丁基氧羰基，或酰氨基可以添加在肽的羧基末端。類似地，對(duì)-硝基芐基酯基團(tuán)可以置于肽的羧基末端。引入這種修飾的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。
可以合成肽使得它們的空間構(gòu)型改變。例如，可以使用肽的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的D-異構(gòu)體，而不是常見(jiàn)的L-異構(gòu)體。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)或多個(gè)氨基酸置換包括天然存在的L氨基酸的D-異構(gòu)體。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，用相同氨基酸的D-異構(gòu)體置換完整肽序列中的每個(gè)天然存在的L氨基酸。本發(fā)明也包括可以用熟知的非天然存在的氨基酸殘基之一置換gp41變體肽中的至少一個(gè)氨基酸殘基。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，可以對(duì)gp41變體肽進(jìn)行天然存在的L氨基酸的D-異構(gòu)體、或非天然存在的氨基酸的置換的任何組合。改變(例如這些改變)可以用于增加gp41變體肽的穩(wěn)定性、蛋白酶抗性、活性、反應(yīng)性和/或溶解度。
本領(lǐng)域熟知非天然存在的氨基酸。此外，本領(lǐng)域也熟知合成具有天然存在L氨基酸的D-異構(gòu)體或非天然存在的氨基酸的肽的方法(見(jiàn)例如美國(guó)專利5,840,697和6,268,479，以及Biochemistry(Chap.4)，D.Voetand J.G.Voet，Wiley & Sons(1990)的公開(kāi)內(nèi)容，它們并入這里作為參考)，并且這些方法也在本發(fā)明的范圍中。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，修飾的肽包括記做FB005，F(xiàn)B006和FB066的肽，特別是帶有馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)部分或其它等同偶聯(lián)結(jié)構(gòu)的這些肽的衍生物，如3-馬來(lái)酰亞胺丙酸通過(guò)[2-(2-氨基-乙氧基)乙氧基]乙酸與賴氨酸偶聯(lián)。
本發(fā)明進(jìn)一步包括gp41變體肽，其中其氨基酸殘基被親水或疏水殘基置換，因此改變了該肽的水中性狀(aqueous traits)。可供選擇地，gp41變體肽的其它氨基酸殘基可以用馬來(lái)酰亞胺連接部分衍生化。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，用親水或疏水殘基置換或可供選擇地用馬來(lái)酰亞胺連接部分衍生化下列g(shù)p41變體肽(表3提供)的帶下劃線氨基酸殘基。具有C-末端賴氨酸殘基的本發(fā)明所包括的任何其它肽也可以用親水殘基置換該C-末端賴氨酸殘基，或可供選擇地用馬來(lái)酰亞胺連接部分衍生化表3YTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLELDKWASLWNWF (SEQ ID NO4)WQEWEQKITALLEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO3)WMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELL(SEQ ID NO5)WQEWERKVDFLEENITALLEEAQIQQEKNMYELQ(SEQ ID NO6)SLEQIWNNMTWEEWDREINNYTELIHELIEESQNQQEKNEQELL(SEQ ID NO1)WEEWDREINNYTKLIHELIEESQNQQEKNEQELL(SEQ ID NO2)WEEWDREINNYTKLIHELIEESQNQQEENEQELL(SEQ ID NO7)
SLEQIWNNMTWEEWDREINNYTXLIHELIEESQNQQEKNEQELL(SEQ ID NO8)SLEQIWNNMTWEEWDREINNYTELIHELIEESQNQQEKNEQELLX (SEQ ID NO9)WEEWDREINNYTXLIHELIEESQNQQEKNEWELL(SEQ ID NO10)WEEWDREINNYTELIHELIEESQNQQEKNEQELLX (SEQ ID NO11)WQEWEQKITALLXQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWF (SEQ ID NO12)WQEWEQKITALIEQAQIQQEKNEYELQKLDKWASLWEWFX (SEQ ID NO13)可以置換任何帶下劃線氨基酸的親水氨基酸包括表4中列出的那些氨基酸。
可以置換任何帶下劃線氨基酸的疏水氨基酸包括表5中列出的那些氨基酸。
另外，表3中提供的任何帶下劃線氨基酸殘基可以用馬來(lái)酰亞胺連接部分衍生化，因此使得帶有該氨基酸殘基的gp41變體肽可以與血液成分上存在的可利用巰基共價(jià)鍵合。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，賴氨酸用馬來(lái)酰亞胺連接部分衍生。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，用馬來(lái)酰亞胺連接部分衍生化的賴氨酸與血液成分上存在的巰基基團(tuán)共價(jià)鍵合。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，表3中提供的任何下劃線氨基酸殘基可以被具有高螺旋傾向性的氨基酸置換(見(jiàn)Creamer，T.，et al.，Alpha-helix-forming propensities in peptides and proteins.Proteins，Jun；19(2)85-97(1994))。表6中以α螺旋傾向性降序列舉了具有高螺旋傾向性的氨基酸。因?yàn)閾?jù)信當(dāng)這些肽結(jié)合病毒靶g(shù)p41時(shí)，它們的活性構(gòu)象是α螺旋，所以增加形成螺旋的趨勢(shì)可以潛在地增加抗病毒活性。
表4-親水性氨基酸
表5-疏水性氨基酸
表6-具有高螺旋傾向性的氨基酸1
一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的肽是包含卷曲螺旋蛋白復(fù)合物一個(gè)α-螺旋的五個(gè)七殘基區(qū)(heptads)的C-34類似物，優(yōu)選類似物具有馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)基團(tuán)和在第一個(gè)七殘基區(qū)的7個(gè)殘基的第2個(gè)，第二個(gè)七殘基區(qū)的7個(gè)殘基的第6個(gè)，第三個(gè)七殘基區(qū)的7個(gè)殘基的第3個(gè)，和/或第四個(gè)七殘基區(qū)的7個(gè)殘基的第7個(gè)處置換的比親本序列極性更強(qiáng)的殘基。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的肽包括上述的這些肽，但是進(jìn)一步還包括在C-34肽N末端引入的gp41的另外10個(gè)殘基。
FB006肽基于C-34肽，第二和第十七位殘基突變?yōu)楣劝彼?，第十三位殘基突變?yōu)橘嚢彼??；贜36/C34復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)選擇這些突變位1文獻(xiàn)T.E.Creighton，ProteinsStructure and Molecular Properties(2ndEd.)，W.H.Freeman and Co.，1993.置。選擇標(biāo)準(zhǔn)是這些殘基不參與與N36螺旋的結(jié)合。改變?yōu)楣劝彼岷唾嚢彼嶂荚诟纳迫芙庑院吐菪齼A向性，即在含水溶液中形成螺旋的趨勢(shì)。因?yàn)橄嘈臗34的活性構(gòu)象與在N36/C34晶體結(jié)構(gòu)中一樣是螺旋，所以增強(qiáng)螺旋傾向性應(yīng)該提高生物學(xué)活性。FB005，F(xiàn)B006，F(xiàn)B066，F(xiàn)B005M，F(xiàn)B005CM，F(xiàn)B006M和FB007M肽也含有這些置換。
gp41變體肽包括表1、2、3和圖1中列出的肽序列，及其修飾和衍生形式。肽FB005基于FB006肽，但是相對(duì)于其它gp41變體肽，在N末端具有另外10個(gè)氨基酸殘基。
FB066肽基于FB006。它不同于FB006，因?yàn)樗鼛в袉我话被嶂脫Q，第28位由賴氨酸變成谷氨酸。這個(gè)改變使得第13個(gè)氨基酸殘基成為唯一充當(dāng)綴合位點(diǎn)的賴氨酸殘基。這個(gè)改變顯著簡(jiǎn)化了帶有馬來(lái)酰亞胺修飾的類似物的合成。
本發(fā)明還提供了基于FB005，F(xiàn)B006和T-1249(見(jiàn)WO 01/03723)的衍生物，它們可與血清白蛋白綴合變成長(zhǎng)效抑制劑。肽FB005M和FB005CM基于FB005序列；肽FB006M和FB007M基于FB006序列；肽FB010M和FB010KM基于T-1249序列。
選擇使得肽能夠連接血液蛋白載體的肽上連接位點(diǎn)的方法也是新的。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)gp41變體肽通過(guò)肽的內(nèi)部賴氨酸殘基與白蛋白連接產(chǎn)生了效力超過(guò)C末端連接物(linkage)的綴合物。FB006，F(xiàn)B006M和FB007M的IC502分別是1.4，3.9和9.1nM。FB006是天然肽，F(xiàn)B006M是在第13個(gè)殘基帶有馬來(lái)酰亞胺連接物的修飾的肽復(fù)合體，而FB007M在C末端連接。當(dāng)FB006M與血清白蛋白連接后，抗病毒作用所需的量增加了2.8倍，而通過(guò)FB007M的C末端連接物而連接白蛋白引起IC50值增加了6.5倍。盡管預(yù)期與載體分子連接可延長(zhǎng)肽的半衰期，但是理論上與白蛋白(66kDa蛋白)綴合預(yù)期也通過(guò)提供空間位阻而阻斷肽的生物活性。然而出乎意料的是，當(dāng)發(fā)明人制備FB006M肽并把它與白蛋白綴合時(shí)，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合體的抗病毒活性并沒(méi)有受到明顯的損害(僅增加2.8倍)。
本發(fā)明的偶聯(lián)基團(tuán)是能夠與血液成分上存在的功能團(tuán)2IC50值是達(dá)到50％病毒抑制的藥物濃度，而TC50值是達(dá)到50％細(xì)胞毒性的藥物濃度。(functionality)形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)。偶聯(lián)基團(tuán)一般在含水環(huán)境下保持穩(wěn)定。血液成分上可利用的與偶聯(lián)基團(tuán)形成共價(jià)鍵的反應(yīng)性功能團(tuán)主要是氨基，羧基，和巰基。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，偶聯(lián)基團(tuán)包括但不限于，反應(yīng)性雙鍵、羧基、磷酰基或方便的?；鳛轷セ蚧旌汪?，或imidate，由此能夠與移動(dòng)蛋白(尤其是血液蛋白)上靶部位的功能團(tuán)，如氨基、羥基或巰基形成共價(jià)鍵。反應(yīng)性酯偶聯(lián)基團(tuán)由酚類化合物，硫醇酯、烷基酯、磷酸酯或類似基團(tuán)組成。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實(shí)施方案中，偶聯(lián)基團(tuán)由琥珀酰亞胺基或馬來(lái)酰亞胺基組成。
本發(fā)明的焦點(diǎn)是修飾gp41肽序列，給肽提供更高的生物利用度、延長(zhǎng)的半衰期和更好的分布(通過(guò)肽選擇性連接到蛋白載體上)，而基本上不改變肽的抗病毒、抑制病毒或抗融合性能。這里闡述的gp41變體肽的衍生允許該衍生肽與血液成分上的基團(tuán)(特別是可利用的巰基)反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。優(yōu)選的gp41變體肽衍生物被設(shè)計(jì)為特異性地與流動(dòng)血液蛋白上的巰基反應(yīng)。這種反應(yīng)通過(guò)帶有馬來(lái)酰亞胺連接物的肽與流動(dòng)血液蛋白，如血清白蛋白或IgG上的巰基的共價(jià)鍵合而建立。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案包括與血液蛋白共價(jià)連接的修飾肽，血液蛋白包括流動(dòng)血液蛋白。本發(fā)明特別優(yōu)選的實(shí)施方案包括修飾的肽與血清白蛋白的共價(jià)鍵合。
與gp41變體肽的本發(fā)明衍生物共價(jià)鍵合的血液成分可以是固定的或移動(dòng)的。固定的血液成分是非流動(dòng)的血液成分，包括組織、膜受體、間質(zhì)蛋白、纖維蛋白、膠原、血小板、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞以及它們相關(guān)的膜及膜受體，軀體的體細(xì)胞、骨骼和平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)成分、骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞以及所有的身體組織特別是與循環(huán)和淋巴系統(tǒng)相關(guān)的那些。流動(dòng)血液組分是在一段時(shí)間內(nèi)，通常不超過(guò)5分鐘，和更經(jīng)常只有1分鐘沒(méi)有固定位置的血液成分。這些血液成分與膜不相關(guān)，它們以至少0.1μg/ml的濃度長(zhǎng)時(shí)間存在于血液中。流動(dòng)血液成分包括血清白質(zhì)白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、鐵蛋白和免疫球蛋白如IgM和IgG。這些流動(dòng)血液成分的半衰期至少大約12小時(shí)。本發(fā)明精選的載體是通過(guò)其游離巰基綴合的白蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案提供了產(chǎn)生具有抗病毒、抑制病毒或抗融合活性的肽融合抑制劑預(yù)防或治療包括逆轉(zhuǎn)錄病毒在內(nèi)的病毒感染的方法。根據(jù)該方法，鑒定參與病毒進(jìn)入細(xì)胞和/或具有融合活性的病毒蛋白。接著篩選所述病毒蛋白的氨基酸序列，篩選據(jù)信參與蛋白-蛋白締合的α螺旋形成區(qū)域。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用基于計(jì)算機(jī)的算法來(lái)篩選蛋白序列的α螺旋形成區(qū)域?？捎糜阼b定α螺旋形成區(qū)域的基于計(jì)算機(jī)的算法包括但不限于螺旋偏好的Garnier-Robson和Chou-Fasman指數(shù)，可在如DNASTAR等程序包中獲得。
通過(guò)用增加肽序列的親水性、疏水性或α螺旋形成趨勢(shì)的氨基酸殘基置換預(yù)定的氨基酸殘基，可以根據(jù)前面討論的本發(fā)明的方法設(shè)計(jì)來(lái)源于病毒蛋白中α螺旋形成區(qū)域的肽?？晒┻x擇地，可以用天然存在的L-氨基酸的D-異構(gòu)體或非天然存在的氨基酸對(duì)本發(fā)明的肽進(jìn)行置換。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，至少兩個(gè)或多個(gè)氨基酸置換包括天然存在L-氨基酸的D-異構(gòu)體。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，完整肽序列包括天然存在的L氨基酸的D-異構(gòu)體。改變(例如這些改變)可以用來(lái)增加本發(fā)明肽的穩(wěn)定性、蛋白酶抗性、活性、反應(yīng)性和/或溶解度。
這些衍生形式的肽一旦與血液成分例如血清白蛋白綴合，可用作具有延長(zhǎng)半衰期的治療劑。預(yù)計(jì)包括天然存在L-氨基酸的D-異構(gòu)體的肽序列對(duì)蛋白酶活性抗性增加，增加模式與肽序列中天然存在L-氨基酸的D-異構(gòu)體的數(shù)量成比例，而不依賴于這些肽是否與血液成分綴合。
本發(fā)明的這個(gè)方法進(jìn)一步考慮了體外檢測(cè)肽組合物以證實(shí)抗病毒、抑制病毒或抗融合活性。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變本文實(shí)施例9的指導(dǎo)而類似地建立篩選抗病毒活性的試驗(yàn)。作為非限制性例子，為了確定IC50和TC50值，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用或改變實(shí)施例9的指導(dǎo)來(lái)檢測(cè)在具有細(xì)胞類型(例如PBMCs)特異性的病毒存在下抗病毒肽的作用。在肽抑制劑存在和缺乏下(具有適當(dāng)對(duì)照)細(xì)胞類型的感染后，孵育所述細(xì)胞，確定病毒滴度和確定IC50和TC50值。
本發(fā)明方法適用的病毒包括但不限于，人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括HIV-1和HIV-2，人類T-淋巴細(xì)胞病毒(HTLV-I和HTLV-II)，和非人類逆轉(zhuǎn)錄病毒，包括牛造白細(xì)胞組織增生病毒，貓肉瘤病毒，貓白血病病毒，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，猿肉瘤病毒，猿白血病，和綿羊進(jìn)行性肺炎病毒。非逆轉(zhuǎn)錄病毒也可被抗病毒、抑制病毒或抗融合的肽所抑制，包括但不限于人呼吸道合胞病毒(RSV)，犬瘟病毒，新城疫病毒，人副流感病毒(HPV)，流感病毒，麻疹病毒，Epstein-Barr病毒，乙型肝炎病毒和猿Mason-Pfizer病毒。無(wú)包膜病毒也可以被本發(fā)明的肽所抑制，包括但不限于小核糖核酸病毒如脊髓灰質(zhì)炎病毒，甲型肝炎病毒，腸道病毒，?？刹《?，柯薩奇病毒，乳頭多瘤空泡病毒如乳頭瘤病毒，細(xì)小病毒，腺病毒和呼腸孤病毒。
肽的合成可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的固相肽化學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)方法合成衍生的gp41變體肽。例如，用固相化學(xué)合成技術(shù)，依照Steward等的《固相肽合成》，第二版，Pierce Chemical Company，Rockford，Ill.，(1984)所述步驟使用Rainin PTI Sympphony合成儀合成肽?？晒┻x擇地，可以合成肽片段，隨后在溶液中組合或連接在一起形成gp41肽序列(片斷縮合法，例如美國(guó)專利6,281,331所述(兩個(gè)出版物都并入這里作為參考))。
對(duì)于固相肽合成，在Stewart等的“Solid Phase Peptide Synthesis”，W.H.Freeman Co.(San Francisco)，1963和Meienhofer，HormonalProteins and Peptides，1973，246中可以找到許多技術(shù)的概述。對(duì)于經(jīng)典的液相合成法，見(jiàn)例如Schroder等的“The Peptides”，1卷，AcacemicPress(New York)。通常，這種方法包括向在聚合物上正在生長(zhǎng)的的肽鏈上順序添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸或適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)氨基酸。正常情況下，第一個(gè)氨基酸的氨基或羧基被適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)性基團(tuán)保護(hù)起來(lái)。接著這個(gè)被保護(hù)的和/或衍生的氨基酸連接到惰性固體載體上，或者在溶液中使用，在適合形成酰胺鍵的條件下，添加具有適當(dāng)保護(hù)的(氨基或羧基)基團(tuán)的序列中的下一個(gè)氨基酸。接著從這個(gè)新近添加氨基酸殘基上除去保護(hù)性基團(tuán)，添加下一個(gè)氨基酸(適當(dāng)保護(hù))，等等。
所有需要的氨基酸以正確順序連接之后，順序或同時(shí)切割任何剩余保護(hù)性基團(tuán)(以及任何固相載體)得到最終的肽。通過(guò)對(duì)這種常用方法的簡(jiǎn)單改變，可能給正在生長(zhǎng)的鏈一次添加一個(gè)以上氨基酸，例如通過(guò)與適當(dāng)保護(hù)的二肽(在不消旋手性中心的條件下)偶聯(lián)保護(hù)的三肽，去保護(hù)后形成五肽。在本發(fā)明肽衍生物的合成過(guò)程中可能需要保護(hù)性基團(tuán)。這些保護(hù)性基團(tuán)是肽合成領(lǐng)域中常規(guī)的，并且通常它們可以描述為能夠保護(hù)肽衍生物不與其它功能基團(tuán)反應(yīng)的化學(xué)部分。各種保護(hù)性基團(tuán)可以從市場(chǎng)上購(gòu)買到，在美國(guó)專利5,493,007中可以找到其實(shí)例，該專利并入這里作為參考。典型的合適保護(hù)性基團(tuán)實(shí)例包括乙?；④袒籽豸驶?FMOC)、叔丁基氧羰基(BOC)、芐氧羰基(CBZ)等。另外，表7提供了天然存在氨基酸的三字母和單字母縮寫(xiě)。
表7天然存在的氨基酸及它們的縮寫(xiě)
制備gp41變體肽的特別優(yōu)選方法包括固相肽合成法，其中氨基酸的α-N末端被酸性或堿性敏感基團(tuán)保護(hù)起來(lái)。這些保護(hù)性基團(tuán)應(yīng)該具有對(duì)肽鍵形成條件穩(wěn)定的性質(zhì)，同時(shí)易于脫去而不破壞正在生長(zhǎng)的肽鏈或使其中含有的任何手性中心消旋。N-保護(hù)性基團(tuán)和羧基保護(hù)性基團(tuán)的實(shí)例在Greene的″Protective Groups In Organic Synthesis，″(John Wiley &Sons，New York pp.152-186(1981))中公開(kāi)，該文獻(xiàn)并入這里作為參考。N-保護(hù)性基團(tuán)的實(shí)例包括但不限于，低級(jí)烷?；缂柞；⒁阴；?Ac)、丙?；?、三甲基乙酰，叔丁基乙酰及相似的基團(tuán)；其它的?；€包括2-氯乙酰、2-溴乙酰、三氟乙酰、三氨乙酰、鄰苯二酰，鄰硝基苯氧乙酰、-氯丁酰，苯甲酰，4-氯苯甲酰、4-溴苯甲酰、4-硝基苯甲酰及類似基團(tuán)；磺?；鶊F(tuán)如苯磺?；?duì)甲苯磺?；?、鄰硝基苯磺?；?，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰基(pmc)及類似基團(tuán)；氨基甲酸酯形成性基團(tuán)如t-戊基氧羰基，芐氧羰基、對(duì)氯芐氧羰基、對(duì)甲氧芐氧羰基、對(duì)硝基芐氧羰基、2-硝基芐氧羰基、對(duì)溴芐氧羰基、3，4-二甲氧芐氧羰基、3，5-二甲氧基芐氧羰基、2，4-二甲氧基芐氧羰基、4-乙氧基芐氧羰基、2-硝基-4，5-二甲氧基芐氧羰基、3，4，5-三甲氧芐氧羰基、1-(對(duì)聯(lián)苯基)-1-甲基乙氧羰基、α，α-二甲基-3，5-二甲氧基芐氧羰基、二苯甲氧羰基，t-丁基氧羰基(Boc)、二異丙基甲氧羰基、異丙氧羰基、乙氧羰基、甲氧羰基、烯丙基氧羰基(Aloc)、2，2，2，-三氯乙氧羰基、苯氧羰基，4-硝基苯氧羰基，芴基-9-甲氧羰基，異冰片基氧羰基，環(huán)戊基氧羰基，adamantyloxycarbonyl，環(huán)己基氧羰基，苯硫羰基等等；芳基烷基如苯甲基、聯(lián)苯基異丙氧基羰基、三苯甲基、芐氧甲基、9-芴基甲基氧羰基(Fmoc)等等和甲硅烷基類如三甲基甲硅烷基等等。優(yōu)選的α-N-保護(hù)性基團(tuán)是鄰硝基苯亞磺酰基(O-nitrophenylsulfenyl)、9-芴基甲基氧羰基、t-丁基氧羰基(boc)、異冰片基氧羰基、3，5-二甲氧芐氧羰基、t-戊基氧羰基；2-氰基-t-丁基氧羰基等等。9-芴基甲基氧羰基更優(yōu)選，而優(yōu)選側(cè)鏈N-保護(hù)性基團(tuán)包括用于如賴氨酸、精氨酸等的側(cè)鏈氨基的2，2，5，7，8-五甲基苯并二氫吡喃-6-磺酰(pmc)，硝基，p-甲苯磺酰，4-甲氧基苯-磺酰，Cbz，Boc，和金剛烷基氧羰基；用于賴氨酸的Aloc；酪氨酸用的苯甲基，o-溴苯甲基氧羰基，2，6-二氯苯甲基，異丙基，t-丁基(t-Bu)，環(huán)己基，環(huán)戊基和乙?；?Ac)；絲氨酸用的t-丁基，苯甲基和四氫吡喃基；組氨酸用的三苯甲基，苯甲基，Cbz，p-甲苯磺酰和2，4-二硝基苯基；色氨酸用的甲?；?；谷氨酸和天冬氨酸用的芐基和t-丁基；半胱氨酸用的三苯甲基。
羧基保護(hù)性基團(tuán)通常是指羧酸保護(hù)性酯或酰胺基。這些羧基保護(hù)性基團(tuán)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，已經(jīng)廣泛用于青霉素和頭孢菌素領(lǐng)域的羧基基團(tuán)保護(hù)中，如美國(guó)專利3,840,556和美國(guó)專利3,719,667所述，這些公開(kāi)物并入這里作為參考。
代表性的羧基保護(hù)性基團(tuán)包括但不限于C1-C8的低級(jí)烷基、芳基烷基如苯乙基或芐基及其取代的衍生物如烷氧基苯甲基或硝基苯甲基；芳基鏈烯基如苯基乙烯基；芳基及其取代的衍生物如5-茚滿基；二烷基氨基烷基如二甲基氨乙基；烷酰氧基烷基如乙酸基甲基，丁酰氧基甲基，戊酰氧基甲基，異丁酰氧基甲基，異戊酰氧基甲基，1-(丙酸基)-1-乙基，1-(新戊酰氧基)-1-乙基，1-甲基-1-(丙酸基)-1-乙基，新戊酰氧基甲基，丙酸基甲基；環(huán)烷酰氧基烷基如環(huán)丙基羰基氧甲基，環(huán)丁基羰基氧甲基，環(huán)戊基羰基氧甲基，環(huán)己基羰基氧甲基；芳酰氧基烷基如苯甲酰氧甲基，苯甲酰氧乙基；芳基烷基羰基氧基烷基如苯甲基羰氧甲基，2-苯甲基羰氧乙基；烷氧基羰基烷基或環(huán)烷基氧基羰基烷基如甲酯基甲基，環(huán)己基氧羰基甲基，1-甲酯基-1-乙基；烷氧基羰基氧基烷基或環(huán)烷氧基羰氧烷基如甲酯基氧甲基，t-丁基氧羰基-氧甲基，1-乙氧基羰氧基-1-乙基，1-環(huán)己基氧基羰基氧基-1-乙基；芳氧基-羰氧基烷基如2-(苯氧羰基氧基)乙基，2-(5-茚滿基氧羰基氧基)-乙基；烷氧基烷基羰基氧基烷基如2-(1-甲氧基-2-甲基丙-2-?；趸?-乙基；芳基烷氧基羰氧基烷基如2-(苯甲基氧羰基氧基)乙基；芳基烯氧基羰氧基烷基如2-(3-苯基丙烯-2-基氧羰基氧基)乙基；烷氧基羰基氨基烷基如t-丁基氧羰基氨基甲基；烷基氨基羰基-氨基烷基如甲基氨基羰基氨基甲基；烷酰基氨基烷基如乙?；被谆?；雜環(huán)羰氧基烷基如4-甲基哌嗪基-羰氧甲基；二烷基氨基羰基烷基如二甲基氨基羰基甲基，二乙基氨基羰基甲基；(5-(低級(jí)烷基)-2-氧代-1，3-dioxolen-4-yl)烷基如(5-t-丁基-2-氧代-1，3-dioxolen-4-yl)甲基；和(5-苯基-2-氧代-1，3-dioxolen-4-yl)烷基如(5-苯基-2-氧代-1，3-dioxolen-4-yl)甲基。代表性的酰胺羧基保護(hù)性基團(tuán)包括但不限于氨基羰基和低級(jí)烷基氨基羰基基團(tuán)。上述羧基保護(hù)性基團(tuán)中，優(yōu)選低級(jí)烷基，環(huán)烷基或芳基烷基酯，例如甲基酯，乙基酯，丙基酯，異丙基酯，丁基酯，仲-丁基酯，異丁基酯，戊基酯，異戊基酯，辛基酯，環(huán)己基酯，苯基乙基酯等等或烷?；趸榛h(huán)烷?；趸榛减；趸榛蚍蓟榛驶趸榛ァ?yōu)選的酰胺羧基保護(hù)性基團(tuán)是低級(jí)烷基氨基羰基。
在固相肽合成方法中，α-C-末端氨基酸與合適的固相載體或樹(shù)脂連接。用于上述合成的合適固相載體是對(duì)每步縮合-去保護(hù)反應(yīng)的試劑和反應(yīng)條件穩(wěn)定，以及在使用介質(zhì)中不溶的那些材料。優(yōu)選的合成α-C-末端羧基肽的固相載體是4-羥甲基苯氧基乙酰-4’-甲基二苯甲基胺樹(shù)脂(HMP樹(shù)脂)。優(yōu)選的合成α-C-末端酰胺肽的固相載體是Fmoc保護(hù)的Ramage樹(shù)脂，由Bachem Inc.，California生產(chǎn)和銷售。
在優(yōu)選合成中，連接性的賴氨酸被Aloc保護(hù)。合成完成后，用Pd(Ph3)4脫去Aloc而肽仍在樹(shù)脂上，并允許接頭分子和馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的偶聯(lián)。特別是，接頭是[2-(2-氨基)乙氧基〕乙氧基乙酸，馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)是3’-馬來(lái)酰亞胺基丙酸。修飾完成后，除去Fmoc基團(tuán)，并從樹(shù)脂上切除肽。
固相合成末期，以連續(xù)操作或在單一操作中，將肽從樹(shù)脂上除去并去保護(hù)。肽的除去和去保護(hù)可以用常規(guī)一次操作完成，通過(guò)用包含茴香硫醚、三異丙基硅烷、苯酚和三氟乙酸的切割試劑處理與樹(shù)脂結(jié)合的肽來(lái)實(shí)現(xiàn)。在肽的α-C-末端是烷基酰胺的情況下，樹(shù)脂用烷基氨進(jìn)行氨解斷裂?？晒┻x擇地，也可以通過(guò)酯交換法，如用甲醇，隨后氨解或通過(guò)直接酰胺基轉(zhuǎn)移除去肽。保護(hù)的肽可在這時(shí)進(jìn)行純化或者直接進(jìn)入下一步。使用上述切割混合物完成側(cè)鏈保護(hù)性基團(tuán)的去除。完全去保護(hù)的肽可以通過(guò)一系列層析步驟進(jìn)行純化，使用下列任何或全部類型層析在弱堿性樹(shù)脂(醋酸鹽形式)上的離子交換；在非衍生的聚苯乙烯-二乙烯基苯(如AmberliteXAD)上的疏水吸附層析；硅膠吸附層析；羧甲纖維素上的離子交換層析；分配層析，如葡聚糖凝膠G-25，LH-20或者反流分布法；高效液相色譜法(HPLC)，特別是用辛基-或苯基/己基甲硅烷基-硅石鍵合的相柱填充物上的反相HPLC法。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定可接受地純化gp41變體肽所需的優(yōu)選層析步驟或順序。
可供選擇地，可以在固相合成肽片斷，包括馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)的添加，然后可通過(guò)溶液偶聯(lián)這些片斷得到最終衍生的肽。
可以用電噴射質(zhì)譜法或者M(jìn)ALDI-TOF質(zhì)譜分析法確定這些肽的分子量。
修飾肽的治療用途gp41變體肽，包括表1、2、3和圖1中所列化合物，例如通過(guò)抑制細(xì)胞-細(xì)胞融合或者游離病毒感染而抑制病毒對(duì)細(xì)胞的感染。感染途徑可以包括膜融合，如同包膜或被囊病毒的情況，或者涉及病毒和細(xì)胞結(jié)構(gòu)如細(xì)胞受體的一些其它融合事件。
gp41變體肽可以給予體內(nèi)，使得在體內(nèi)發(fā)生與血液成分綴合；或者，它們可以首先離體和血液成分綴合，再將所得綴合的衍生物給予到體內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，利用血漿去除法從患者的血液樣品中分離需要的血液成分，然后將其與本發(fā)明的肽綴合，之后返回患者。
在體內(nèi)巰基比例如血漿蛋白上的氨基少。因此，馬來(lái)酰亞胺修飾的gp41變體肽共價(jià)結(jié)合的蛋白質(zhì)較少。例如，在白蛋白(最豐富的血蛋白質(zhì))中，只有一個(gè)巰基。因此，一個(gè)修飾的gp41肽-馬來(lái)酰亞胺-白蛋白綴合物將傾向于具有大約1∶1的gp41肽對(duì)白蛋白摩爾比例。除白蛋白之外，IgG分子(II類)也有游離的巰基。由于血液中可溶蛋白的大部分是IgG分子和血清白蛋白，所以它們也構(gòu)成了在血液中可以與gp41變體肽共價(jià)結(jié)合的游離巰基的大部分。
進(jìn)一步，由于白蛋白本身的獨(dú)特性質(zhì)，即使在帶有游離巰基的血液蛋白質(zhì)中，包括IgGs，用馬來(lái)酰亞胺進(jìn)行特異標(biāo)記使得優(yōu)先形成修飾的gp41肽-馬來(lái)酰亞胺-白蛋白綴合物。在不同種屬中高度保守的白蛋白單個(gè)游離巰基位于第34氨基酸殘基(Cys34)上。最近已經(jīng)證明，相對(duì)于其他含游離巰基的蛋白上的游離巰基，白蛋白中的Cys34的反應(yīng)性增加。這部分是由于白蛋白中的Cys34具有5.5的極低pK值。這比通常半胱氨酸殘基的典型pK值8.0低得多。由于這個(gè)pK值低，在正常生理?xiàng)l件下，白蛋白中的Cys34大部分呈離子化形式，這就顯著增強(qiáng)了其反應(yīng)性。除了Cys34的低pK值，另一個(gè)提高Cys34反應(yīng)性的因素是它的位置，它位于緊靠白蛋白V區(qū)域一個(gè)環(huán)表面的疏水袋中。該位置使Cys34非常有利于接觸各種類型的配體，在Cys34作為自由基收集器和自由硫醇清除劑的生物學(xué)作用中，它是一個(gè)重要的因素。這些特性使得Cys34對(duì)具有馬來(lái)酰亞胺連接的gp41肽具有高度反應(yīng)性，而且該反應(yīng)率可以比具有馬來(lái)酰亞胺連接的gp41變體肽與其它含游離巰基的蛋白質(zhì)發(fā)應(yīng)的速率反應(yīng)率高多達(dá)1000倍。
修飾的gp41肽-馬來(lái)酰亞胺-白蛋白綴合物的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是與肽以1∶1特異地加載至白蛋白的Cys34上相關(guān)的可重復(fù)性。其它技術(shù)，如戊二醛、DCC、EDC和其它化學(xué)活化，例如游離氨基，都缺乏這種選擇性。例如，白蛋白含有52個(gè)賴氨酸殘基，其中25-30個(gè)位于白蛋白表面并因此可以用于結(jié)合。活化這些賴氨酸殘基，或者作為替代方案修飾gp41變體肽使其通過(guò)這些賴氨酸殘基偶聯(lián)，會(huì)形成不均勻綴合物。即使采用1∶1摩爾比的gp41馬來(lái)酰亞胺肽和白蛋白，胺衍生的白蛋白產(chǎn)物將由多個(gè)綴合產(chǎn)物組成，其中的一些，每個(gè)白蛋白中含有0、1、2或更多gp41肽，每個(gè)產(chǎn)物中肽可以與25-30個(gè)可用的賴氨酸位點(diǎn)的任意一個(gè)或多個(gè)結(jié)合。由于有多種可能組合，表征每個(gè)綴合批次的確切組成和性質(zhì)變得很難，批次和批次的重復(fù)性幾乎是不可能的，使得很難將這種綴合物作為治療劑。
此外，盡管看起來(lái)通過(guò)白蛋白的賴氨酸殘基的綴合物將至少具有每一白蛋白分子傳遞更多治療劑的優(yōu)點(diǎn)，但是研究表明優(yōu)選治療劑與白蛋白的比例為1∶1。在Stehle等的文章″The Loading Rate Determines TumorTargeting properties of Methotrexate-Albumin Conjugates in Rats，″Anti-Cancer Drugs，Vol.8，pp.677-685(1988)中，(其全部?jī)?nèi)容并入這里作為參考)，作者報(bào)道了比例為1∶1的抗癌藥物氨甲蝶呤與通過(guò)戊二醛結(jié)合的白蛋白得到最理想的結(jié)果。這些綴合物被腫瘤細(xì)胞優(yōu)先吸收，而含有5∶1至20∶1的氨甲蝶呤分子的綴合物改變了HPLC的譜形，在體內(nèi)被肝臟快速吸收。一種假說(shuō)是，這種較高比例下，白蛋白的構(gòu)象改變減少了其作為治療載體的有效性。
通過(guò)將gp41變體肽在體內(nèi)控制給藥，可以控制體內(nèi)白蛋白和IgG的特異性標(biāo)記。在典型的給藥過(guò)程中，給予的衍生gp41變體肽的80-90％會(huì)標(biāo)記白蛋白，少于5％的會(huì)標(biāo)記IgG。游離巰基如谷光苷肽也會(huì)有微量標(biāo)記。體內(nèi)使用優(yōu)選這種特異性標(biāo)記，因?yàn)樗试S準(zhǔn)確計(jì)算gp41變體肽的估計(jì)半衰期。
除了提供體內(nèi)控制的特異性標(biāo)記外，衍生的gp41變體肽還可以提供離體血清白蛋白和IgG的特異性標(biāo)記。這種離體標(biāo)記包括將帶有馬來(lái)酰亞胺鍵的gp41變體肽加入含有血清白蛋白和/或IgG的血液、血清或鹽水溶液中。一旦與gp41變體肽離體綴合，可以把血液、血清或鹽水溶液重新給入患者的血液進(jìn)行體內(nèi)治療，或凍干。
gp41變體肽可以單獨(dú)或聯(lián)合使用以優(yōu)化它們的治療效果。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，gp41變體肽與一個(gè)或多個(gè)另外的抗病毒HIV治療藥物共同給予?？梢耘cgp41變體肽共同給予的另外的抗病毒HIV治療藥物包括，但不限于，AGENERASE(amprenavir；GlaxoSmithKline)；COMBIVIR(拉米夫定，齊多夫定；GlaxoSmithKline)；CRIXIVAN(indinavir，IDV，MK-639；Merck)；EMTRIVA(FTC，emtricitabine；Gilead Sciences)；EPIVIR(拉米夫定，3TC；GlaxoSmithKline)；FORTOVASE(沙奎那韋；Hoffmann-La Roche)；HIVID(扎西他濱，ddC，雙脫氧胞苷；Hoffmann-LaRoche)；INVIRASE(沙奎那韋甲磺酸，SQV；Hoffmann-La Roche)；KALETRA(lopinavir，ritonavir；Abbott Laboratories)；NORVIR(ritonavir，ABT-538；Abbott Laboratories)；RESCRIPTOR(Delaviridine，DLV；Pfizer)；RETROVIR(齊多夫定，AZT，疊氮胸苷，ZDV；GlaxoSmithKline)；REYATAZ(atazanavir sulfate；BristolMyers-Squibb)；SUSTIVA(efavirenz；Bristol Myers-Squibb)；TRIZIVIR(abacavir，齊多夫定，拉米夫定；GlaxoSmithKline)；VIDEXEC(腸衣去羥肌苷；Bristol Myers-Squibb)；VIDEX(去羥肌苷，ddl，雙脫氧肌苷；Bristol Myers-Squibb)；VIRACEPT(nelfinavir mesylate，NFV；Agouron Pharmaceuticals)；VIRAMUNE(奈韋拉平，BI-RG-587；Boehringer Ingelheim)；VIREAD(tenofovir disoproxil fumarate；Gilead)；ZERIT(stavudine，d4T；Bristol Myers-Squibb)；ZIAGEN(abacavir；GlaxoSmithKline).
本發(fā)明另外的實(shí)施方案中，gp41變體肽與用于治療HIV或HIV誘發(fā)疾病的一個(gè)或多個(gè)另外的化合物共同給藥。這些可與gp41肽共同給藥的其它藥物包括，但不限于，三甲曲沙葡糖醛酸鹽(治療卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎)；更昔洛韋(治療巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎)；噴霧型噴他脒(治療卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎)；紅細(xì)胞生成素(治療齊多夫定相關(guān)性貧血)；阿托伐醌(治療卡氏肺孢子蟲(chóng)肺炎)；利福布汀(治療鳥(niǎo)分枝桿菌)；VISTIDE(治療復(fù)發(fā)性巨細(xì)胞病毒性視網(wǎng)膜炎)；和SEROSTIM(治療AIDS相關(guān)的消瘦)。
gp41變體肽，包括但不限于表1、2、3和圖1提供的那些肽，可以與表1、2、3和圖1所列的一個(gè)或多個(gè)gp41變體肽共同給藥。本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，gp41變體肽，包括但不限于表1、2、3和圖1提供的那些肽，可以與T-20或T-1249肽共同給藥。
gp41變體肽可以用生理可接受的介質(zhì)給藥，如去離子水，磷酸緩沖鹽水(PBS)，鹽水，含水乙醇或其它醇，血漿，蛋白溶液，甘露糖醇，葡糖水溶液，醇類，植物油等等。優(yōu)選的是包含gp41變體肽的藥物組合物與藥物可接受載體給予。其它可以添加的成分包括緩沖劑，該介質(zhì)通常被緩沖至pH值范圍大約5至10，緩沖劑濃度范圍通常是50-250mM；鹽，鹽濃度范圍通常從5至500mM；生理可接受穩(wěn)定劑，等等。該組合物可以凍干以便于貯存和運(yùn)輸。
gp41變體肽可以經(jīng)口服，胃腸外，如靜脈內(nèi)(IV)、動(dòng)脈內(nèi)(IA)、肌內(nèi)(IM)、皮下(SC)或其它途徑給藥。在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候可以通過(guò)輸液給藥。有些情況下，當(dāng)功能性基團(tuán)的反應(yīng)相對(duì)緩慢時(shí)，可以采用經(jīng)口、鼻、直腸，及經(jīng)皮或噴霧方式給藥，在這種情況下綴合物的性質(zhì)允許輸送到脈管系統(tǒng)。通常采用一次注射，盡管需要時(shí)可以使用一次以上注射。肽衍生物可以通過(guò)任何方便工具給予，包括注射器、套針、導(dǎo)管或其它。給藥的具體方式將根據(jù)給藥量，是一次性大劑量還是連續(xù)給藥等等而變化。優(yōu)選，靜脈內(nèi)給藥，給藥部位對(duì)本發(fā)明不重要，優(yōu)選血液流動(dòng)快的部位，如靜脈內(nèi)、外周或中心靜脈。當(dāng)與緩釋技術(shù)或保護(hù)基質(zhì)聯(lián)合給藥時(shí)可以使用其它途徑。其目的是讓gp41變體肽有效地分布到血液中，以便它能夠與血液成分反應(yīng)。給予的綴合物量將在較寬范圍內(nèi)變化，通常范圍從1mg至500mg。血管內(nèi)給藥的總量范圍通常為大約0.5μg/公斤體重至大約50mg/公斤體重，更常用的是0.5mg/公斤體重至大約10mg/公斤體重。
通過(guò)與血液中壽命長(zhǎng)的成分，如免疫球蛋白、血清白蛋白、紅細(xì)胞和血小板等結(jié)合，產(chǎn)生了很多優(yōu)點(diǎn)。gp41變體肽活性延長(zhǎng)至幾天至幾周。在此期間，只需給藥一次。由于活性物質(zhì)主要與大分子結(jié)合，可以獲得更大的特異性，活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)和干涉其它生理過(guò)程的可能性更小。
與血液成分形成共價(jià)鍵可以發(fā)生在體內(nèi)或離體。對(duì)于離體形成共價(jià)鍵，衍生的gp41變體肽加入到血液血清或含有純化的血液成分如人血清白蛋白或IgG的鹽水溶液中，以允許衍生物和血液成分之間的共價(jià)鍵形成。在優(yōu)選實(shí)施方案中，gp41變體肽在鹽水溶液中與人血清白蛋白反應(yīng)。待結(jié)合物形成后，后者可以給予受試者或凍干。
gp41變體肽的活性和/或存在可以用哺乳動(dòng)物宿主的血液檢測(cè)。在不同時(shí)間從動(dòng)物身上獲取血液樣品，可以確定gp41變體肽是否已經(jīng)以足以產(chǎn)生治療活性的量結(jié)合了壽命長(zhǎng)的血液成分，同時(shí)還可以確定gp41變體肽在血液中的水平。如果需要，也可以確定gp41變體肽共價(jià)結(jié)合了哪個(gè)血液成分。也可以通過(guò)使用對(duì)gp41肽活性特異性的試驗(yàn)，HPLC-MS或gp41變體肽的抗體進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
gp41變體肽可以通過(guò)這里描述的方法或本領(lǐng)域已知的其它方法給予患者。考慮治療的患者包括那些在此所提到的任何病毒，尤其是HIV-1和HIV-2的感染患者。gp41變體肽的有效治療劑量可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的程序確定并考慮到這些gp41肽的潛在毒性。
gp41變體肽也可以預(yù)防性給予尚未被感染的個(gè)體。這種給藥有益于與病毒高危接觸的個(gè)體的情況，當(dāng)患者已經(jīng)接觸了感染的個(gè)體以及有病毒傳播高風(fēng)險(xiǎn)時(shí)這可以發(fā)生。這對(duì)于沒(méi)有已知治愈方法的病毒的情況，如HIV病毒時(shí)，特別有利。作為非限制性例子，在醫(yī)療工作者已經(jīng)接觸了來(lái)自HIV感染個(gè)體的血液的情況下，或患者從事可能接觸HIV病毒的高風(fēng)險(xiǎn)活動(dòng)的其它情況下，預(yù)防性給予gp41肽將是有益的。Gp41變體肽的其它應(yīng)用包括將相同物質(zhì)給予攜帶病毒如HIV的個(gè)體，以預(yù)防病毒從感染個(gè)體傳播到未感染個(gè)體。這種應(yīng)用也包括預(yù)防通過(guò)哺乳或其它日常接觸而發(fā)生的母嬰傳播，或通過(guò)性活動(dòng)發(fā)生的傳播。
本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，gp41變體肽，包括但不限于表1、2、3和圖1中提供的那些肽，可以與表1、2、3和圖1中所列的一個(gè)或多個(gè)另外的肽，T-20，T-1249，或者其它HIV治療藥物共同給藥，以防止HIV(包括HIV-1，HIV-2，及其所有其它血清型)和SIV病毒顆粒在患者體內(nèi)復(fù)制。
局部應(yīng)用gp41變體肽，包括表1、2、3和圖1中提供的那些，可以單獨(dú)，或以包含或基本上由有效劑濃度的肽和藥物可接受載體組成的組合物的形式使用。有效濃度可以通過(guò)觀察該制劑是否有效阻斷病毒感染來(lái)確定。
本發(fā)明的組合物包括體內(nèi)和體外局部殺滅微生物，殺滅病毒，或抗融合用途，特別是陰道內(nèi)和/或直腸內(nèi)使用。為了這些目的，修飾的肽可以配制在任何適當(dāng)?shù)馁x形劑中，條件是載體不減少修飾肽的抗融合活性。因此，該組合物的形式可以是乳膏、凝膠、泡沫、洗劑、軟膏、片劑，溶液或噴霧劑。載體或賦形稀釋劑可以是水溶性或非水溶性的，例如醇類的或油脂的，或其混合物，可以另外含有其它表面活性劑、潤(rùn)膚劑、滑潤(rùn)劑、穩(wěn)定劑、染料、香料、抗菌劑作為活性成分或防腐劑，和調(diào)節(jié)pH的酸或堿。優(yōu)選pH是大約4至5。制備該組合物使用常規(guī)方法。
優(yōu)選，局部應(yīng)用組合物的藥物可接受載體或賦形劑是含有本發(fā)明化合物的液體，膠狀物，或泡沫形式。該化合物可以加入到(a)軟膏和膠狀物，(b)插入物(栓劑、海綿等等)，(c)泡沫，(d)沖洗劑和(e)清洗流體或身體清洗液。優(yōu)選在性交時(shí)或優(yōu)選性交之前將該制劑導(dǎo)入女性陰道或男性或女性的直腸，但也可以用于其它粘膜。該組合物可以用來(lái)治療和預(yù)防性傳播疾病，包括HIV。設(shè)計(jì)給藥方式優(yōu)選使得含肽的本發(fā)明組合物與性傳播疾病的成因物直接接觸。
對(duì)局部應(yīng)用來(lái)說(shuō)，藥物可接受載體可另外包含有機(jī)溶劑、乳化劑、凝膠劑、潤(rùn)濕劑、穩(wěn)定劑、其它表面活性劑、濕潤(rùn)劑、防腐劑、緩釋劑、和少量保濕劑、螯合劑、染料、香料和其它在局部用藥的藥物組合物中通常使用的成分。
關(guān)于本發(fā)明可提供的產(chǎn)品，本發(fā)明的組合物可以加入到吸收性的襯底材料，如海綿中，或者在固體襯底材料表面涂覆，比如陰莖套、子宮帽或醫(yī)用手套，以優(yōu)選在性交前或性交過(guò)程中將組合物送遞到陰道或其它可能被感染的上皮。這種類型的其它產(chǎn)品和送遞系統(tǒng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員都是顯而易見(jiàn)的。目前優(yōu)選產(chǎn)品是陰莖套，陰莖套的表面通過(guò)噴霧被修飾肽而涂覆，或者通過(guò)本領(lǐng)域熟知技術(shù)在制造過(guò)程中將肽摻入陰莖套中。優(yōu)選的涂覆組合物包括硅氧烷(silicon)，它提供潤(rùn)滑功效，并且能夠以緩釋方式釋放修飾肽。生物粘附聚合物也可以用來(lái)延長(zhǎng)使用的特殊局部或其它藥劑的釋放時(shí)間。
局部給藥的固體劑型包括栓劑、粉末、片劑和顆粒劑。在固體劑型中，組分可以與至少一個(gè)惰性稀釋劑，如蔗糖、乳糖或淀粉混合，也可以另外含有潤(rùn)滑劑、緩沖劑和其它本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的成分。
本發(fā)明的組合物和產(chǎn)品中的修飾肽實(shí)際劑量水平可以變化，使得在性傳播流體部位達(dá)到對(duì)于特定肽和給藥方法獲得期望的治療或預(yù)防效果的量。因此，選擇的劑量水平會(huì)依賴于感染的性質(zhì)和部位、期望得到的治療反應(yīng)、給藥途徑、希望治療的持續(xù)時(shí)間和其它因素。一般來(lái)說(shuō)，本發(fā)明修飾肽的優(yōu)選劑量將在大約0.01-2.0wt％的范圍內(nèi)。一個(gè)優(yōu)選的局部陰道劑型是如上所述的乳膏或者栓劑，含有0.01-2.0wt％的根據(jù)本發(fā)明的組合物。每次治療中，典型的是每日兩次，每次1ml到5ml的這種劑型在陰道內(nèi)應(yīng)用，優(yōu)選在陰道口，或進(jìn)入直腸。通常避免更多劑量以減少泄漏。
本發(fā)明的方法和組合物可以用來(lái)預(yù)防和治療廣譜致病微生物的感染。
實(shí)施例為了便于更完全地理解本發(fā)明，下面提供了很多實(shí)施例。然而，這些實(shí)施例中公開(kāi)的具體實(shí)施方案并不限制本發(fā)明的范圍，而僅僅是為了舉例說(shuō)明的目的。
總論除非另外說(shuō)明，每個(gè)gp41變體肽的合成在Symphony肽合成儀上用自動(dòng)操作固相方法實(shí)施，在衍生物產(chǎn)生過(guò)程由手工介入。該合成在Fmoc保護(hù)的Ramage酰胺接頭樹(shù)脂上，用Fmoc保護(hù)的氨基酸進(jìn)行。使用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)在N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中作為活化劑，二異丙基乙基胺(DIEA)作為堿來(lái)完成偶聯(lián)。用20％哌啶/DMF溶液除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)。合成過(guò)程中使用的所有氨基酸具有L-立體化學(xué)。在合成過(guò)程中使用玻璃反應(yīng)容器。
實(shí)施例1 FB005的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Thr-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，并按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙?；?。
步驟2用85％TFA/5％三異丙基硅烷(TIPS)/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用以干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟2)。
實(shí)施例2FB005M的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Thr-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙酰化。
步驟2手動(dòng)實(shí)施Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)，并用3當(dāng)量的Pd(PPh3)4溶解在5ml C6H6 CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹(shù)脂2小時(shí)來(lái)完成(步驟2)。然后用CHCl3(6×5ml)，在DCM中的20％AcOH(6×5ml)，DCM(6×5ml)和DMF(6×5mL)洗滌樹(shù)脂。
步驟3該合成接著再自動(dòng)化進(jìn)行，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸(步驟3)。在每次偶聯(lián)之間，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌樹(shù)脂3次，和用異丙醇(iPrOH)洗滌樹(shù)脂3次。
步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例3FB005CM的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Thr-OH，F(xiàn)moc-Met-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Asn-OH，F(xiàn)moc-Trp-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln-OH，F(xiàn)moc-Glu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙酰化。
步驟2手動(dòng)實(shí)施Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)，并用3當(dāng)量的Pd(PPh3)4溶解在5ml C6H6 CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹(shù)脂2小時(shí)來(lái)完成(步驟2)。然后用CHCl3(6×5ml)，在DCM中的20％AcOH(6×5ml)，DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌樹(shù)脂。
步驟3該合成接著再自動(dòng)化進(jìn)行，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸(步驟3)。在每次偶聯(lián)之間，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌樹(shù)脂3次，和用異丙醇(iPrOH)洗滌樹(shù)脂3次。
步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例4FB006的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙?；?br> 步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例5FB006M的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙?；?。
步驟2手動(dòng)實(shí)施Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)，并用3當(dāng)量的Pd(PPh3)4溶解在5ml C6H6 CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹(shù)脂2小時(shí)來(lái)完成(步驟2)。然后用CHCl3(6×5ml)，在DCM中的20％AcOH(6×5ml)，DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌樹(shù)脂。
步驟3該合成接著再自動(dòng)化進(jìn)行，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸(步驟3)。在每次偶聯(lián)之間，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌樹(shù)脂3次，和用異丙醇(iPrOH)洗滌樹(shù)脂3次。
步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例6FB007M的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-His-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Arg(Pbf)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙?；?br> 步驟2手動(dòng)實(shí)施Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)，并用3當(dāng)量的Pd(PPh3)4溶解在5ml C6H6 CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹(shù)脂2小時(shí)來(lái)完成(步驟2)。然后用CHCl3(6×5ml)，在DCM中的20％AcOH(6×5ml)，DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌樹(shù)脂。
步驟3該合成接著再自動(dòng)化進(jìn)行，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸(步驟3)。在每次偶聯(lián)之間，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌樹(shù)脂3次，和用異丙醇(iPrOH)洗滌樹(shù)脂3次。
步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例7FB010M的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙?；?。
步驟2手動(dòng)實(shí)施Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)，并用3當(dāng)量的Pd(PPh3)4溶解在5ml C6H6 CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹(shù)脂2小時(shí)來(lái)完成(步驟2)。然后用CHCl3(6×5ml)，在DCM中的20％AcOH(6×5ml)，DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌樹(shù)脂。
步驟3該合成接著再自動(dòng)化進(jìn)行，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸(步驟3)。在每次偶聯(lián)之間，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌樹(shù)脂3次，和用異丙醇(iPrOH)洗滌樹(shù)脂3次。
步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例8FB010KM的合成步驟1該實(shí)施例描述了1mmol規(guī)模的化合物的固相肽合成。下列被保護(hù)的氨基酸被依次加到樹(shù)脂上Fmoc-Lys(Aloc)-OH，F(xiàn)moc-Phe-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ser(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Asp(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Tyr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Asn(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Leu-OH，F(xiàn)moc-Ala-OH，F(xiàn)moc-Thr(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Ile-OH，F(xiàn)moc-Lys(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH，F(xiàn)moc-Glu(tBu)-OH，F(xiàn)moc-Gln(Trt)-OH，F(xiàn)moc-Trp(Boc)-OH。它們?nèi)苡贜，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，按照順序用O-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化。用含20％(v/v)哌啶的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液20分鐘除去Fmoc保護(hù)性基團(tuán)(步驟1)。最后的氨基酸的氨基基團(tuán)用以O(shè)-苯并三唑-1-基-N，N，N′，N′-四甲基-脲鎓六氟磷酸鹽(HBTU)和二異丙基乙基胺(DIEA)活化的乙酸進(jìn)行乙?；?。
步驟2手動(dòng)實(shí)施Lys(Aloc)基團(tuán)的選擇性去保護(hù)，并用3當(dāng)量的Pd(PPh3)4溶解在5ml C6H6 CHCl3(1∶1)∶2.5％NMM(v∶v)∶5％AcOH(v∶v)中的溶液處理樹(shù)脂2小時(shí)來(lái)完成(步驟2)。然后用CHCl3(6×5ml)，在DCM中的20％AcOH(6×5ml)，DCM(6×5mL)和DMF(6×5mL)洗滌樹(shù)脂。
步驟3該合成接著再自動(dòng)化進(jìn)行，以添加Fmoc-AEEA-OH和3-馬來(lái)酰亞胺基丙酸(步驟3)。在每次偶聯(lián)之間，用N，N-二甲基甲酰胺(DMF)洗滌樹(shù)脂3次，和用異丙醇(iPrOH)洗滌樹(shù)脂3次。
步驟4用85％TFA/5％TIS/5％苯硫基甲烷和5％苯酚將肽從樹(shù)脂上切割下來(lái)，隨后用干冰冷卻的Et2O進(jìn)行沉淀(步驟4)。
實(shí)施例9修飾肽的病毒抑制作用在新鮮人PBMC培養(yǎng)物中針對(duì)HIV-1IIIB檢測(cè)FB005，F(xiàn)B006，F(xiàn)B006M，F(xiàn)B007M，F(xiàn)B010KM和FM010M的抗病毒活性和細(xì)胞毒性。在抗病毒檢測(cè)前通過(guò)混合使得四個(gè)修飾肽FB006M，F(xiàn)B007M，F(xiàn)B010M和FB010KM與人血清白蛋白(HSA)結(jié)合。下表8顯示了結(jié)果，其中IC50值是50％病毒抑制的藥物濃度，TC50值是50％細(xì)胞毒性的藥物濃度。
細(xì)胞上抗-HIV測(cè)定法臨使用之前從冷凍室(-80℃)中取出事先測(cè)定滴度的HIV-1IIIB，在生物安全箱中快速解凍至室溫。
從篩選的供體分離新鮮的人PBMCs，這些供體的HIV和HBV血清反應(yīng)呈陰性(Interstate Blood Bank，Inc.；Memphis，TN)。通過(guò)低速離心并重懸于PBS中將細(xì)胞沉淀/洗滌2-3次，以除去污染的血小板。接著用Dulbecco′s磷酸緩沖鹽水(PBS)將帶白細(xì)胞血1∶1稀釋，然后層疊于50ml離心試管中14ml的淋巴細(xì)胞分離介質(zhì)上，接著600Xg離心30分鐘。從產(chǎn)生的界面上輕輕吸取成帶的PBMCs，隨后用PBS在低速離心下洗滌2次。最后一次洗滌后，細(xì)胞用錐蟲(chóng)藍(lán)排除法進(jìn)行計(jì)數(shù)，并以1×107個(gè)細(xì)胞/mL重懸于補(bǔ)充了15％胎牛血清(FBS)，2mM L-谷氨酸，4μg/mL植物凝血素(PHA-P，Sigma)的RPMI 1640中。細(xì)胞被允許在37℃孵育48-72小時(shí)。孵育后，PBMCs被離心，并重懸于含15％FBS，2mM L-谷氨酸，100U/mL青霉素，100μg/mL鏈霉素，10μg/mL慶大霉素和20U/mL重組人IL-2(R&D Systems，Inc)的RPMI 1640中。PBMCs以1-2×106個(gè)細(xì)胞/mL的濃度維持在這個(gè)培養(yǎng)基中，隔周更換培養(yǎng)基，直到測(cè)定方案使用時(shí)。細(xì)胞在培養(yǎng)基中保持最多兩周，此后認(rèn)為用于試驗(yàn)已經(jīng)太老并丟棄之。由于貼壁到組織培養(yǎng)瓶的原因，培養(yǎng)物中單核細(xì)胞衰竭了。
對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)的PBMC試驗(yàn)，混合來(lái)自至少兩位正常供體的PHA-P刺激的細(xì)胞，用新培養(yǎng)基稀釋至終濃度為1×106個(gè)細(xì)胞/mL，以50μL/孔(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)鋪在96孔圓底微板的內(nèi)孔中。每板含有病毒/細(xì)胞對(duì)照孔(細(xì)胞加病毒)，實(shí)驗(yàn)孔(藥物加細(xì)胞加病毒)和化合物對(duì)照孔(藥物加培養(yǎng)基，不含細(xì)胞，細(xì)胞毒性的MTS監(jiān)測(cè)需要)。因?yàn)镠IV-1對(duì)PBMCs無(wú)細(xì)胞病變作用，這允許對(duì)抗病毒藥活性和細(xì)胞毒性測(cè)定使用同一試驗(yàn)板。在微量滴定管中以2倍濃度制備測(cè)試藥物的稀釋物，和使用標(biāo)準(zhǔn)格式將100μL每一濃度物質(zhì)置于合適的孔中。50μL的預(yù)先確定的稀釋病毒原液置于每一測(cè)試孔中(最終MOI≈0.1)。感染后PBMC培養(yǎng)物在37℃，5％CO2的條件下保持七天，之后收集無(wú)細(xì)胞的上清樣品以分析反轉(zhuǎn)錄酶活性和/或HIV p24含量。去除上清樣品后，通過(guò)向板中添加MTS確定細(xì)胞活力來(lái)測(cè)定化合物的細(xì)胞毒性。也用顯微鏡檢測(cè)各孔并記錄任何異常。
二級(jí)細(xì)胞毒性試驗(yàn)為了檢測(cè)比抗-HIV功效評(píng)估中所用更高濃度的化合物的毒性，使用二級(jí)試驗(yàn)。該試驗(yàn)基本上與上述抗-HIV功效評(píng)估的方法相同，只是不向孔中添加病毒(用沒(méi)有病毒的培養(yǎng)基代替)，高試驗(yàn)濃度增加到25μM。溫育后，使用MTS來(lái)檢測(cè)板的細(xì)胞活力，結(jié)果如下。
表8
盡管為了清楚理解的目的，通過(guò)舉例說(shuō)明和實(shí)施例詳細(xì)描述了前述發(fā)明，但很明顯可以在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)實(shí)施某些改變和修改。對(duì)醫(yī)學(xué)、免疫學(xué)、病毒學(xué)、藥理學(xué)、蛋白質(zhì)合成和修飾和/或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的實(shí)施本發(fā)明的上述方式的修改也意欲在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
本說(shuō)明中提及的所有出版物和專利申請(qǐng)表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的水平。所有這樣的出版物和專利申請(qǐng)并入這里作為參考，其程度如同具體和單獨(dú)指出各個(gè)出版物或?qū)＠暾?qǐng)并入作為參考。
2002年9月24日申請(qǐng)的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)60/412,797中公開(kāi)了有效預(yù)防和/或治療病毒感染，特別是HIV感染的某些肽及其衍生物，其全部?jī)?nèi)容(包括這里包含的任何序列)并入這里作為參考。
序列表<110>Xie，DongJiang，He<120>HIV感染的肽衍生物融合抑制劑<130>63024.000002<150>60/412,797<151>2002-09-24<160>15<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>1Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Glu Glu Trp Asp Arg1 5 10 15Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Glu Leu Ile His Glu Leu Ile Glu Glu Ser20 25 30Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu35 40<210>2<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>2Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Lys Leu Ile His1 5 10 15Glu Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu20 25 30Leu Leu<210>3
<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>3Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>4<211>36<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>4Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln1 5 10 15Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu20 25 30Trp Asn Trp Phe35<210>5<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>5Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His1 5 10 15Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu20 25 30
Leu Leu<210>6<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>6Trp Gln Glu Trp Glu Arg Lys Val Asp Phe Leu Glu Glu Asn Ile Thr1 5 10 15Ala Leu Leu Glu Glu Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu20 25 30Leu Gln<210>7<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<400>7Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Lys Leu Ile His1 5 10 15Glu Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Glu Asn Glu Gln Glu20 25 30Leu Leu<210>8<211>44<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(23)..(23)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基
<400>8Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Glu Glu Trp Asp Arg1 5 10 15Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Xaa Leu Ile His Glu Leu Ile Glu Glu Ser20 25 30Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu35 40<210>9<211>45<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(45)..(45)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>9Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Glu Glu Trp Asp Arg1 5 10 15Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Glu Leu Ile His Glu Leu Ile Glu Glu Ser20 25 30Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Xaa35 40 45<210>10<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>10
Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Xaa Leu Ile His1 5 10 15Glu Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Trp Glu20 25 30Leu Leu<210>11<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>11Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Glu Leu Ile His1 5 10 15Glu Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu20 25 30Leu Leu Xaa35<210>12<211>39<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>12Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Leu Xaa Gln Ala Gln1 5 10 15
Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe35<210>13<211>40<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(40)..(40)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>13Trp Gln Glu Trp Glu Gln Lys Ile Thr Ala Leu Ile Glu Gln Ala Gln1 5 10 15Ile Gln Gln Glu Lys Asn Glu Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asp Lys Trp20 25 30Ala Ser Leu Trp Glu Trp Phe Xaa35 40<210>14<211>34<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(13)..(13)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>14Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Xaa Leu Ile His1 5 10 15Glu Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Glu Asn Glu Gln Glu
2025 30Leu Leu<210>15<211>35<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>肽序列<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(35)..(35)<223>Xaa代表衍生有馬來(lái)酰亞胺部分的賴氨酸殘基<400>15Trp Glu Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Lys Leu Ile His1 5 10 15Glu Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Glu Asn Glu Gln Glu20 25 30Leu Leu Xaa3權(quán)利要求
1.包含SEQ ID NO1的序列的分離的FB005肽。
2.包含SEQ ID NO2的序列的分離的FB006肽。
3.包含SEQ ID NO7的序列的分離的FB066肽。
4.分離的經(jīng)修飾肽，其選自(a)SEQ ID NO1；(b)SEQ ID NO2；(c)SEQ ID NO3；和(d)SEQ ID NO7，并且在該肽序列的預(yù)定位置具有至少一個(gè)置換的氨基酸殘基，其中所述至少一個(gè)置換的氨基酸殘基是親水性氨基酸殘基、疏水性氨基酸殘基、具有形成α螺旋傾向性的氨基酸殘基、天然存在的L-氨基酸之一的D-異構(gòu)體或非天然存在的氨基酸殘基。
5.分離的衍生肽，其選自(a)SEQ ID NO8的FB005M肽；(b)SEQ ID NO9的FB005CM肽；(c)SEQ ID NO10的FB006M肽；(d)SEQ ID NO11的FB007M肽；(e)SEQ ID NO12的FB010M肽；(f)SEQ ID NO13的FB010KM肽；(g)SEQ ID NO14的FB066M肽；和(h)SEQ ID NO15的FB066KM肽。
6.分離的衍生肽，其選自(a)SEQ ID NO1；(b)SEQ ID NO2；(c)SEQ ID NO3；和(d)SEQ ID NO7，其中該肽序列中預(yù)定的氨基酸殘基通過(guò)將偶聯(lián)基團(tuán)與所述預(yù)定的氨基酸殘基綴合而衍生化。
7.權(quán)利要求4的經(jīng)修飾肽，其中該肽序列中預(yù)定的氨基酸殘基通過(guò)將偶聯(lián)基團(tuán)與所述預(yù)定的氨基酸殘基綴合而衍生化。
8.權(quán)利要求1的分離的肽，其中該肽通過(guò)將偶聯(lián)基團(tuán)與賴氨酸連接而衍生化，所述賴氨酸置換了第23位的谷氨酸或添加在C末端。
9.權(quán)利要求2的分離的肽，其中該肽通過(guò)將偶聯(lián)基團(tuán)與第13位的賴氨酸連接而衍生化。
10.權(quán)利要求2的分離的肽，其中該肽通過(guò)用谷氨酸置換第13位的賴氨酸而被修飾和通過(guò)將偶聯(lián)基團(tuán)與添加在C末端的另外的賴氨酸殘基連接而衍生化。
11.由SEQ ID NO3的序列組成的分離的衍生肽，其中該肽通過(guò)用賴氨酸置換第13位的谷氨酸和將偶聯(lián)基團(tuán)與該賴氨酸連接而被修飾，或?qū)⑴悸?lián)基團(tuán)與添加在C末端的賴氨酸綴合而衍生化。
12.權(quán)利要求3的分離的肽，其中該肽通過(guò)將偶聯(lián)基團(tuán)與第13位的賴氨酸、或與添加在C末端的另外的賴氨酸連接而衍生化。
13.權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的衍生肽，其中偶聯(lián)基團(tuán)選自下組(a)馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)；(b)琥珀酰亞胺基團(tuán)；(c)肼基團(tuán)；和(d)羰基基團(tuán)。
14.權(quán)利要求13的衍生肽，其中馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)是通過(guò)[2-(2-氨基)乙氧基]乙氧基乙酸與賴氨酸的ε氨基連接的3’-馬來(lái)酰亞胺基丙酸或其鹽。
15.包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽或權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的衍生肽的藥物組合物。
16.包含與血液成分綴合的權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的衍生肽的綴合物。
17.權(quán)利要求16的綴合物，其中血液成分選自下組(a)人血清白蛋白；(b)人轉(zhuǎn)鐵蛋白；(c)人鐵蛋白；(d)人免疫球蛋白；(e)人鐵蛋白；(f)人α-2-巨球蛋白；(g)人甲狀腺素結(jié)合蛋白；(h)人類固醇結(jié)合蛋白；和(i)它們的組合。
18.一種減少哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒感染的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽或根據(jù)權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的肽衍生物。
19.一種預(yù)防哺乳動(dòng)物細(xì)胞被病毒感染的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽或根據(jù)權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的肽衍生物。
20.一種防止病毒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中復(fù)制的方法，包括給所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的肽或根據(jù)權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的肽衍生物。
21.權(quán)利要求18-20的方法，其中所述的肽在所述病毒存在下提供。
22.權(quán)利要求18-21的方法，其中病毒選自下組(a)人免疫缺陷病毒(HIV)和(b)猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
23.權(quán)利要求18-21的方法，其中肽或肽衍生物通過(guò)口服、局部表面、靜脈內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下途徑給藥。
24.權(quán)利要求18-21的方法，其中肽或肽衍生物與一種或多種另外的HIV治療劑共同給予。
25.權(quán)利要求24的方法，其中所述一種或多種另外的HIV治療劑包括至少一種其它的gp41變體肽。
26.權(quán)利要求24的方法，其中另外的HIV治療劑選自下組(a)AGENERASE；(b)COMBIVIR；(c)CRIXIVAN；(d)EMTRIVA；(e)EPIVIR；(f)FORTOVASE；(g)HIVID；(h)INVIRASE；(i)KALETRA；(j)NORVIR；(k)RESCRIPTOR；(l)RETROVIR；(m)REYATAZ；(n)SUSTIVA；(o)TRIZIVIR；(p)VIDEX EC；(q)VIDEX；(r)VIRACEPT；(s)VIRAMUNE；(t)VIREAD；(u)ZERIT；和(v)ZIAGEN。
27.權(quán)利要求18-21的方法，其中病毒是HIV，哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人細(xì)胞。
28.一種預(yù)防或減少HIV感染的方法，包括將權(quán)利要求5-12任一項(xiàng)的衍生的gp41變體肽給予其細(xì)胞已經(jīng)接觸HIV的患者，其中所述肽衍生物與所述患者的血液成分綴合，由此延長(zhǎng)了該肽在所述患者的血液中的半衰期。
29.一種制備抗病毒綴合物的方法，包括將衍生的gp41變體肽與血液成分混合并允許衍生的gp41變體肽和血液成分之間形成共價(jià)鍵。
30.權(quán)利要求27-28的方法，其中血液成分選自下組(a)人血清白蛋白；(b)人轉(zhuǎn)鐵蛋白；(c)人鐵蛋白；(d)人免疫球蛋白；(e)人鐵蛋白；(f)人α-2-巨球蛋白；(g)人甲狀腺素結(jié)合蛋白；(h)人類固醇結(jié)合蛋白；和(i)它們的組合。
31.權(quán)利要求29的方法，其中血液成分是人血清白蛋白。
32.權(quán)利要求27-28的方法，其中綴合發(fā)生在體內(nèi)。
33.權(quán)利要求27-28的方法，其中綴合發(fā)生在體外。
34.權(quán)利要求32的方法，其中血液成分通過(guò)血漿去除法分離，之后與衍生肽綴合。
35.包含權(quán)利要求1-14的分離的肽和藥物可接受載體的藥物組合物。
36.一種產(chǎn)生具有抗病毒、抑制病毒或抗融合活性的肽的方法，包括(a)篩選具有病毒滅殺活性蛋白以鑒定其具有形成α螺旋傾向的序列；(b)通過(guò)改變或衍生所述鑒定序列的至少一個(gè)氨基酸殘基而設(shè)計(jì)改變的肽；(c)合成所述改變的肽；和(d)檢測(cè)所述肽以驗(yàn)證抗病毒、抑制病毒或抗融合活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及gp41變體肽，它們是病毒感染抑制劑和/或顯示出抗融合性質(zhì)。特別是，本發(fā)明涉及具有抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)活性、并且作用持續(xù)時(shí)間延長(zhǎng)的gp41變體肽用于治療相應(yīng)的病毒感染。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1668330SQ03816434
公開(kāi)日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2003年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月24日
發(fā)明者謝東, 姜和 申請(qǐng)人:重慶前沿生物技術(shù)有限公司