專利名稱：用去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物治療腫瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物，尤其是含有天然氨基酸取代基的衍生物在治療腫瘤和病毒感染中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
癌癥是由多種遺傳和外在因素所導致，表現(xiàn)為在不同組織中產(chǎn)生了無法控制的細胞生長?？拱┭芯康娜蚰繕嗽谟陂_發(fā)臨床治療方法，使該治療能夠縮減腫瘤生長，對宿主無毒，且大多數(shù)患者都能夠承受。抑制特定細胞分裂的腫瘤藥物應(yīng)該是沒有明顯副作用的有效化療制劑。
細胞在細胞周期過程中要通過許多檢查點(checkpoints)。為了通過這些檢查點，需要滿足特定標準。在G2/M過渡期，最主要的調(diào)節(jié)子是細胞周期蛋白依賴性激酶CDC2。該激酶牢固地結(jié)合到調(diào)控性蛋白細胞周期蛋白B上，所形成的復合物被稱作促成熟因子(MPF)，它能激發(fā)一連串反應(yīng)導致細胞進入早期的初始階段(1)。很正常，當MPF的任一部分丟失或失活，都會阻礙細胞進程，而不進入G2期。
MPF的表達和活性在不同水平上受到調(diào)節(jié)。細胞周期蛋白B水平在細胞周期G1至S期期間緩慢提高，在G2至M期的過渡期間達到最高值，在有絲分裂期間急劇下降(2)。另一方面，CDC2蛋白一直存在于細胞周期中，而在G2期的最后階段CDC2蛋白水平略微升高(3)。蛋白的活性依賴于與之相關(guān)的相應(yīng)細胞周期蛋白，以及依賴于由磷酸酯酶CDC25C引起的蛋白抑制位點的脫磷酸化(4，5)。已經(jīng)顯示，由輻射或化學反應(yīng)導致的DNA損傷使脫磷酸化失敗而引發(fā)G2停滯。最近，有證據(jù)顯示任何剩余的CDC2可以在DNA損傷后被轉(zhuǎn)運到核外(6)。
一些天然存在的植物木酚素去甲二氫愈創(chuàng)木酸(NDGA)衍生物已經(jīng)顯示通過抑制病毒轉(zhuǎn)錄而阻止病毒復制的功能。這項早期的工作顯示了NDGA衍生物通過使Sp1-依賴性啟動子失活而抑制HIV(7，8)，HSV(9)和HPV(10)的轉(zhuǎn)錄，這些NDGA衍生物最初是從Larrea Tridentata中分離得到的，其后采用化學方法合成而得。沒有預料到的是，其中一個衍生物四-氧-甲基NDGA還表現(xiàn)出能誘導哺乳細胞系的細胞周期停止。以下所述證據(jù)表明M4N能夠誘導哺乳動物細胞的G2停滯，而沒有檢測到毒性，并且還說明停滯是由于抑制了細胞周期蛋白依賴性激酶CDC2。
人類乳頭瘤病毒(HPV)感染使得在各種類型的鱗狀上皮細胞中產(chǎn)生了無法控制的細胞生長，從而導致各種病癥，從良性pallilomae(疣)到子宮頸癌、陰莖癌和口腔癌。這些與HPV密切相關(guān)的癌癥和廣泛存在的感染顯示了研制抗HPV治療方法的重要性。
即使不是所有病毒，也是大多數(shù)病毒都寄生在宿主中，其中包括那些復制的活性突變體。它們需要特定細胞因子的參與以維持病毒的生長。與病毒蛋白質(zhì)不同，宿主細胞因子不存在突變壓力，通常結(jié)構(gòu)是不變的。因此，能夠在病毒生命周期各階段阻止病毒來利用細胞因子的化合物可能會是很好候選藥物，這種抗病毒藥物不受突變體的影響。利用細胞因子作為替代靶點用于抑制HIV-1的研究已有報道(11)。
申請人早期已報道從Creosote bush(Larrea tridentata)中分離得到的3’-氧-甲基NDGA(即Mal.4)能夠在人細胞培養(yǎng)物中明確地阻止基本HIV的轉(zhuǎn)錄，Tat-調(diào)控的反式激活，以及HIV復制(8，12，13)。Mal.4是通過干擾轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合到HIV前病毒模板啟動子上而發(fā)揮作用的。Mal.4的靶點被定位在核苷酸-87至-40，它是HIV長末端重復序列(LTR)的Sp1結(jié)合位點。在體外試驗中，未經(jīng)修飾的NDGA并不抑制HIV的轉(zhuǎn)錄，且對Sp1的結(jié)合也沒有作用(8)。
然而，植物木酚素的分離和純化需要花費大量的工作和費用。由于預見了植物木酚素可能會在臨床上用于控制人類Sp1-調(diào)控的病毒和腫瘤的生長，因而，采用非甲基化的NDGA作為母體大量低成本地化學合成了九種甲基化的NDGA(7)。在藥物濃度低于30μM時，四-氧-甲基NDGA通過抑制Sp1調(diào)控的前病毒轉(zhuǎn)錄和反式激活而最大程度地有效控制了HIV的復制(7)。此項研究已被進一步運用到控制單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)的生長中(9)。單純皰疹立早(immediate early(IE))ICP4基因是HSV復制的關(guān)鍵基因。該基因的啟動子區(qū)域具有八個Sp1相同的結(jié)合位點(15)，其中有五個是ICP4基因表達的必要基因。因此使ICP4基因成為這項試驗的很好候選基因。申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)3-氧-甲基NDGA(Mal.4)和四-氧-甲基NDGA(M4N)都是Vero細胞中HSV的ICP4基因表達的有效轉(zhuǎn)錄抑制劑，在電泳遷移率實驗(EMSA)觀察到它們是通過阻斷Sp1蛋白結(jié)合至ICP4啟動子而產(chǎn)生作用(9)。
在感染的Vero細胞中，通過測試M4N和Mal.4的抗-HSV活性，并與無環(huán)鳥苷(acyclovir，ACV)的活性相比，申請人觀察到作用于第10代HSV-1和第4代HSV-2的M4N的IC50值在11.7μM至4μM，并沒有需要更高藥物濃度的明顯上升趨勢。然而，ACV抑制第一代HSV-1和抑制第十代HSV-1，其IC50值從7μM升至444μM，抑制第四代HSV-2的IC50值＞88μM，顯示了Vero細胞內(nèi)快速形成了對ACV藥物的耐受。M4N的選擇指數(shù)S.I.(TC50/IC50)保持相對穩(wěn)定；在vero細胞中，病毒經(jīng)過十代后，ACV的S.I.下降了60倍(9)。可見，M4N是突變非敏感藥物，它可以有效抑制對ACV耐藥的HSV(9)。
鑒于事實，Sp1是一種重要的細胞轉(zhuǎn)錄因子(16)，應(yīng)該尋找對于Sp1調(diào)控的細胞基因的表達可能具有抑制作用的化合物。一旦Sp1牢固地結(jié)合在結(jié)合位點時，Mal.4不能替代Sp1(8)。因此，NDGA衍生物似乎對于增殖細胞中的Sp1調(diào)控的基因比穩(wěn)態(tài)細胞中Sp1調(diào)控的看家基因表達的作用更大。對于前者，藥物能夠在DNA合成期間與Sp1蛋白競爭基因啟動子中的Sp1位點，而在后者，藥物對于Sp1蛋白已經(jīng)牢固地結(jié)合在啟動子上的看家基因轉(zhuǎn)錄的染色質(zhì)幾乎沒有作用。其實這種現(xiàn)象已經(jīng)被顯示。正如下所示，通過對9600個表達的基因陣列進行研究，申請人發(fā)現(xiàn)大多數(shù)Sp1調(diào)控的基因產(chǎn)物保持在相似的水平上，培養(yǎng)的宮頸癌細胞C3并不受藥物處理的影響(圖5)。甚至，選擇指數(shù)較低的M4N，如果必需全身用藥時，則使其應(yīng)用受到限制，只能使用最低有效濃度。另一方面，人類乳突瘤病毒最初通過Sp1調(diào)控的HPV E6E7基因的表達導致子宮頸實體瘤和口腔腫瘤的形成(17)。申請人推理，如果藥物能夠原位傳輸，并且只維持在腫瘤區(qū)域，則高濃度藥物可以有效消滅腫瘤而對于患者幾乎沒有損傷。
Survivin是一種抑制細胞凋亡的物質(zhì)，它大量存在于人類癌細胞中卻不存在于正常成人組織中，被認為是細胞死亡/存活的終端效應(yīng)期可能的調(diào)節(jié)子(36)。Survivin以細胞周期依賴性方式表達于G2-M中，直接與有絲分裂紡錘體微管相結(jié)合。Survivin在Thr-34上的磷酸化似乎是在細胞分裂時維持細胞生存力的必要步驟(37)，已顯示磷酸化缺陷的survivin突變體的表達能夠激起幾種人類黑素瘤細胞系的凋亡(38)。磷酸化的survivin作用于凋亡酶(caspase)通路以抑制凋亡酶-3和凋亡酶-9的形成，通過該途徑而抑制細胞凋亡。(Ref.39，10頁，給出了凋亡信號通路的概要)。因此，能夠減少survivin表達的化合物將有可能加快細胞凋亡和死亡的速度。CDC-2已顯示是survivin磷酸化的必要物質(zhì)(37)。
發(fā)明概述本發(fā)明的一個目的在于提供用于治療動物，特別是哺乳動物，更特別是人類的癌性腫瘤和非癌性腫瘤的化合物和組合物。根據(jù)本發(fā)明的這個技術(shù)方案，提供了抑制腫瘤生長的新的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物。
去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物是指具有以下結(jié)構(gòu)的化合物 其中，R1，R2，R3和R4各自獨立代表-OH，-OCH3，-O(C＝O)CH3，或氨基酸殘基，但是不能同時都是-OH。氨基酸取代基包括丙氨酸，精氨酸，天冬酰氨，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酸，谷氨酰胺，甘氨酸，組氨酸，異亮氨酸，亮氨酸，賴氨酸，蛋氨酸，苯基丙氨酸，脯氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，色氨酸，酪氨酸，纈氨酸，5-羥賴氨酸，4-羥脯氨酸，甲狀腺素，3-甲基組氨酸，∈-N-甲基賴氨酸，∈-N，N，N-三甲基賴氨酸，氨基脂肪酸，γ-羧基谷氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸，磷酸酪氨酸，N-甲基精氨酸和N-乙酰賴氨酸。
本發(fā)明尤其優(yōu)選的化合物是M4N和G4N，見

圖1。
本發(fā)明進一步的目的在于提供一種治療癌性腫瘤和非癌性腫瘤的方法，該方法利用了這些新的衍生物以及已知的、但從前還沒有用于治療腫瘤的類似衍生物。該方法對于抑制含有細胞周期蛋白依賴性激酶CDC2的快速增殖細胞特別有效。本發(fā)明的進一步目的在于提供一種抑制真核細胞周期中的CDC2的方法，優(yōu)選動物細胞，更優(yōu)選哺乳動物細胞，最優(yōu)選人類細胞。
根據(jù)本發(fā)明方法治療的腫瘤包括對于上述化合物敏感的任意腫瘤，尤其包括對于細胞周期蛋白依賴性激酶CDC2周期的抑制敏感的快速分裂的癌性腫瘤和良性腫瘤。
術(shù)語“癌性腫瘤”包括任何可能已經(jīng)轉(zhuǎn)移或還沒有轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤。術(shù)語“非癌性腫瘤”包括任何良性腫瘤。這些術(shù)語是本領(lǐng)域技術(shù)人員通常使用和理解的術(shù)語。
可通過本發(fā)明的組合物和方法治療的良性和惡性腫瘤的例子在CancerBiology(Raymond W. Ruddon，Cancer Biology，3rdEd.，Oxford Univ.Press，1995，作為參考文獻引用)中的表1-1給出。用于治療的腫瘤包括已知的起源于病毒的腫瘤，以及不是起源于病毒的腫瘤。本發(fā)明的組合物和方法尤其有益于治療實體瘤。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種抑制細胞周期蛋白依賴性激酶CDC2周期的方法。該方法在抑制細胞增殖，尤其是在抑制快速分裂的細胞增殖方面非常有用。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明所述化合物和組合物被用于治療HPV-誘導的腫瘤。HPV-誘導的腫瘤尤其包括，但不受限于，與HPV感染相關(guān)的宮頸癌、口腔癌、陰莖癌和頭頸癌。本方法包括局部使用去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物，尤其是使用四-O-甲基去甲二氫愈創(chuàng)木酸(M4N)和四甘氨?；ゼ锥溆鷦?chuàng)木酸(G4N)治療癌性和非癌性HPV-誘導的腫瘤。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種通過施用含有氨基酸取代基的式I化合物來抑制病毒復制和生長的方法。該方法優(yōu)選采用氨基酸取代基R1，R2，R3和R4都相同的化合物。
本發(fā)明的另一個目的在于提供一種在表達survivin細胞的真核細胞周期中抑制survivin產(chǎn)生的方法，這種細胞尤其是癌細胞。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物下調(diào)survivin的mRNA和蛋白水平并活化CDC-2和凋亡酶通路，由此提高了表達survivin的細胞的凋亡水平。該方法提供了一種治療癌癥的方法，其中survivin的表達受到抑制或清除，而由此提高了癌細胞凋亡的速度。
預計M4N、G4N和其它衍生物可通過局部注射至腫瘤內(nèi)的方式給藥，通常隨同藥用可接受的稀釋劑，賦型劑和載體一起給藥。在優(yōu)選的實施方式中，M4N以DMSO溶液的形式注射至腫瘤內(nèi)，而G4N以PBS溶液形式給藥。G4N的使用補充了M4N的應(yīng)用，尤其是對大腫瘤(＞2cm3)，這是由于G4N的水溶解性使其能夠擴散到腫瘤的更廣泛區(qū)域。本發(fā)明的其它水溶性和水不溶性去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物的應(yīng)用類似。這些物質(zhì)也可以使用本領(lǐng)域公知的和常用的脂質(zhì)基質(zhì)的制劑進行全身給藥。
本發(fā)明的藥用可接受的稀釋劑，賦型劑和載體是與M4N，G4N和其它類似衍生物相容的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的物質(zhì)，而且這些物質(zhì)適用于人類或其它哺乳動物的局部給藥。盡管以下描述的實例是以局部注射的方式給藥，但也可以使用其它局部給藥方式如外用給藥或傳輸至腫瘤靶點的靶向給藥。
能獲得所需治療效果的化合物給藥劑量雖不盡相同，但其可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定出。劑量、給藥頻率和治療時間的長短視情況而定，主要由腫瘤大小和類型決定。舉例來說，M4N單獨給藥劑量是根據(jù)每克腫瘤重量用藥10mg-20mg，或與相似劑量的G4N共同給藥，給藥間隔從每天至每周或更少的頻率。將50μl至100μl的M4N以濃度200mg/ml溶于DMSO中，單獨或與G4N聯(lián)合給藥時，有望對于1-1.5cm3的多種腫瘤的治療有效。
附圖簡述圖1為M4N和G4N的結(jié)構(gòu)。
圖2A為顯示E6/E7啟動子(pPV16P97)區(qū)域和Sp1蛋白結(jié)合位點的HPV-16LCR。
圖2B為M4N對C-33A細胞的E6/E7啟動子活性的作用。(通過不同濃度的M4N來抑制E6/E7啟動子控制的熒光素酶基因的轉(zhuǎn)錄)圖3A-3C為通過40μM的M4N抑制病毒E6和E7的RNA轉(zhuǎn)錄物。C3細胞在含有40μM的M4N或僅含DMSO的培養(yǎng)基中處理71個小時，提取C3細胞的總RNA用于進行相對RT-PCR(relative RT-PCR)。該RTPCR樣品在增加的擴增循環(huán)后移走并溶在瓊脂糖凝膠上。凝膠圖片(3A和3B)指出了這些循環(huán)，生長基質(zhì)中M4N存在(+)或不存在(-)，以及pGMT載體的兩個消化產(chǎn)物作為尺寸標記物。擴增圖(2C)顯示了擴增產(chǎn)物的兩個期望大小，它是由早期病毒RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的交替接合而形成。
圖4A為M4N對C3細胞生長的抑制。
圖4B為除去M4N后對C3細胞生長的抑制。
圖5A-5B為基因檢測分析所測得的M4N對于C3細胞的基因表達的影響。5A，表示DMSO處理＞2小時后C3細胞(C3 DMSO)中表達的基因。
5B，表示用DMSO作為溶劑的M4N處理＞2小時后C3細胞(C3 M4N)中表達的基因。
圖6A-6B，M4N對長有腫瘤的小鼠處理后所進行的觀察。
6A，對長有單個腫瘤的小鼠進行原位注射DMSO(#3)或M4N(#7)。對于長有兩個腫瘤的小鼠#9中的一個腫瘤進行原位注射M4N。
6B，相同小鼠中的經(jīng)M4N處理后的腫瘤(白色疤痕)與未經(jīng)處理的腫瘤，如表2所描述的#9。
圖7為M4N和M4N/G4N對于小鼠中腫瘤生長的組織病理學影響。板的第一欄表示#4，10，12小鼠的大腫瘤用DMSO處理后(CON)與小劑量藥物處理(M4N或M4N/G4N)的#12，10，27和20小鼠的病變組織的比較(M4N)。其后的像片為(A、B、C用DMSO處理，D未處理，E、F、G、H用M4N或M4N/G4N處理)小鼠在100X放大下檢查的腫瘤實例(表1和表2)。
圖8為沒有藥物(HSV-C，HSV-SC)，存在無效藥物(ABDS1[″HSV-ABDS1″]，ABDS2[″HSV-ABDS2″])以及存在有效藥物(M4N[″HSV-4N″]和ACV[″HSV-ACV″])的情況下，HSV-1的復制。
圖9為M4N引起哺乳動物細胞生長的停止。(a-d)為用不同濃度的M4N處理的C3，CEM-T4，C33a，和TC-1細胞。實驗開始時存在的細胞數(shù)目顯示為第0天。三天后計數(shù)存活細胞并根據(jù)M4N的濃度制圖。(e)，將C3細胞分裝入T-25小瓶中，使每個小瓶含有5×103個細胞，其中給予含M4N的1％DMSO的基質(zhì)，或給予只含1％DMSO的基質(zhì)(第一次改變基質(zhì))。三天后，將M4N處理的一半細胞給予新鮮的僅含1％DMSO的基質(zhì)，而其余細胞則給予相同條件的新鮮基質(zhì)(第二次改變基質(zhì))。每天計數(shù)細胞并依據(jù)處理時間而制圖。
圖10為用M4N處理的細胞停止在G2/M期。C3細胞(a)，C33a細胞(b)，CEM-T4細胞(c)，以及TC1細胞(d)在含有1％DMSO或含有M4N的1％DMSO的基質(zhì)中生長三天。用胰蛋白酶使細胞消化，用乙醇固定，碘化丙啶染色，然后進行流式細胞術(shù)計數(shù)?；诘饣と旧珡姸蕊@示細胞數(shù)目的數(shù)值(總細胞數(shù)3-5×104)。指示的細胞周期階段被標記出，且其與通過染色強度確定的相對的細胞互補DNA對應(yīng)。
圖11是用40μM M4N處理的C3細胞證明具有G2細胞結(jié)構(gòu)。C3細胞在蓋玻片上，在含有1％DMSO(對照)或40μM M4N的1％DMSO(M4N)的基質(zhì)中生長三天。樣品用乙醇固定，并與抗α(綠色)和γ(橙色)微管蛋白(a)抗體一起培養(yǎng)，或用DAPI進行DNA染色(b)。通過熒光顯微鏡觀察細胞。
圖12為M4N使CDC2和病毒致癌基因減少。C3細胞在含有1％DMSO(D)或含40μM M4N的1％DMSO(M)的基質(zhì)中生長不同的時間。在一特定時間后，從細胞中分離總蛋白質(zhì)或總RNA。用抗CDC2或細胞周期蛋白B的抗體在相同的硝基纖維素過濾膜上進行Western印跡(a的上面兩個板)。細胞周期蛋白B的抗體通過與γ-32P ATP和組蛋白H1共同培養(yǎng)而發(fā)生免疫沉積后，進行激酶分析(a的下面兩個板)。將PAGE凝膠進行庫馬西染色(coomassie stain)作為承載對照。在藥物處理達24小時和72小時后，分別進行激酶檢測。對總RNA提取物進行Northern印跡(b)。將過濾器與CDC2或GAPDH的含有隨機引物的32P-標記DNA培養(yǎng)過夜，清洗，將膜暴露三天。用相同的過濾器檢測CDC2和GAPDH RNA。引物與HPV-16 E7或GAPDH的區(qū)域雜交，進行總RNA提取物的rtPCR分析(c)。兩個引物對都被用于相同的反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠電泳分析產(chǎn)物。
圖13為G4N與HIV Sp1-結(jié)合位點(-87至-49)相互作用的電泳遷移率分析(EMSA)。(A)，G4N對Sp1-167D與32P標記的HIV Sp1 DNA模板結(jié)合的抑制作用。泳道1，模板；泳道2，模板加上0.1μg Sp1-167D；泳道3-9，在加入0.1μg Sp1-167D之前，模板與增加濃度的G4N(0.25-1.75mM)共同培養(yǎng)。(B)G4N取代Sp1-167D與HIV模板相結(jié)合。泳道1，模板；泳道2，模板加上0.1μg Sp1-167D以及過量100倍未標記的模板；泳道3，模板加上0.1μgSp1-167D；泳道4-10，隨著G4N濃度增加(0.25-1.75mM)的Sp1/DNA復合物；泳道11，在含有1.75mM G4N的反應(yīng)緩沖液中培養(yǎng)的模板。(C)Sp1-167D替代G4N與模板相結(jié)合。泳道1，模板；泳道2-4，模板加上Sp1-167D的增加量(0.075，0.150，0.300μg)；泳道5-8，增加量的Sp1-167D(0.075，0.150，0.300μg)激起免疫反應(yīng)后，在含有1.2mM G4N的反應(yīng)緩沖液中培養(yǎng)的模板，泳道8沒有Sp1-167D。(D)對應(yīng)于用(A)---·---和(B)—·—表示的增加的G4N濃度，Sp1-167D/DNA復合物帶強度減小的圖。使用的凝膠是5％非變性聚丙烯酰胺，其每個泳道接受5μl的反應(yīng)液，如實驗部分和參考文獻中所描述[1]。
圖14為G4N對于Cos細胞中HIV Tat-調(diào)控的反式激活的抑制作用。
圖15為G4N存在下的SIV的生成。37℃，將107174×細胞以及人類T-細胞淋巴瘤細胞系與24小時收獲的SIV mac 239(4ng的p27)細胞混合2小時。細胞被再次懸浮，并在三個96孔培養(yǎng)板的每一個孔中加入含有1×105細胞的100μl基質(zhì)。從儲存液中配置新鮮的各種濃度的G4N，并將其加入六個孔中。在四天和八天后收集培養(yǎng)液的上清液用于病毒產(chǎn)生的分析。病毒產(chǎn)生是通過修飾的p27殼體蛋白抗原的捕獲ELISA進行分析檢測，如實驗部分所描述。
圖16為G4N抑制H9細胞產(chǎn)生HIV p24抗原的作用。
在AZT耐受的HIV株，HIV-1RTMF感染H9細胞9天后，通過G4N處理后的雙份培養(yǎng)液的平均p24水平和未處理的H9細胞的p24水平的比較，計算抑制百分數(shù)。
圖17為Survivin基因表達的RT-PCR分析。(a)上圖用40μM的M4N分別處理C3細胞達24小時和72小時的Survivin基因表達(泳道3和4)，以及未經(jīng)處理的對照物(泳道1和2)。下圖相應(yīng)的GAPDH對照物。帶強度用Scion Image進行定量。(b)將Survivin RT-PCR產(chǎn)物信號正?；癁镚APDH對照物并作圖。
圖18為藥物濃度-依賴性survivin蛋白的下調(diào)。(a)將C3細胞與各濃度的M4N培養(yǎng)72小時，所有細胞的溶解產(chǎn)物進行針對survivin的免疫印跡。(b)相對帶強度用Scion Image圖像軟件定量，并針對M4N濃度作圖。
圖19為用M4N處理72個小時的C3細胞中凋亡酶-3裂解片斷的免疫印跡分析。(a)凋亡酶-3的Western印跡顯示了32KD前凋亡酶-3的裂解并形成活性的20KD裂解的產(chǎn)物。(b)使帶強度量化并對M4N濃度作圖。
發(fā)明詳述實驗方法NDGA衍生物通過化學方法合成得到的(7)。細胞系C3是HPV16E+L加上活化的Ras轉(zhuǎn)染的C57 BL/6kh細胞系(原C57 BL/6kh細胞系是由Loyola University Medical Center，Chicago，Illinois，U.S.A.的W.Martin Kast提供)，它由Greenstone等(18)和Feltkamp等(19，20)所描述的方法進行維持與培養(yǎng)。
G4N的合成制備內(nèi)消旋-1，4-雙[3，4-(二甲氨基乙酰氧基)苯基]-(2R，3S)-二甲基丁烷鹽酸鹽，四甘氨?；鵑DGA，G4N的標準步驟。在含有NDGA(12.8g，42.3mmol，1.0equiv)和N，N，-二甲基甘氨酸(26.2g，254mmol，6.0equiv)的二氯甲烷(250ml)溶液中，加入DCC(52.4g，254mmol，6.0equiv)和DMAP(2.32g，18.9mmol，1.0equiv)。在室溫下，于氮氣氛圍中攪拌反應(yīng)混合物達24小時。過濾反應(yīng)混合物，減壓濃縮溶液。然后，將丙酮(250ml)加入反應(yīng)瓶中，通入過量的氯化氫氣體。將水溶性沉積物溶于水中，室溫下用丙酮重結(jié)晶兩次得到(1)(29，2g，36.8mmol)，其為白色固體，收率為87％。用VarianUnity-400(400MHz)核磁儀，D2O為溶劑，TSP為內(nèi)標，得到質(zhì)子NMR圖譜。用Varian Unity-400(400MHz)核磁儀，以D2O作溶劑，得到C-13 NMR圖譜。C-13化學位移以TSP單峰作為參照(50.0ppm)。
合成方法見路線1。

總步驟。除非另有說明，否則所有反應(yīng)都在用烘箱(120℃)烘干的玻璃器皿中和氮氣氛圍中進行。丙酮、二氯甲烷、1，4-二噁烷、乙酸乙酯、己烷和四氫呋喃都購自Mallinckrodt Chemical Co.。丙酮用4A分子篩干燥并蒸餾。二氯甲烷，乙酸乙酯和己烷用CaH2干燥并蒸餾。1，4-二噁烷和四氫呋喃在氮氣氛圍中，加入鈉和二苯甲酮進行蒸餾干燥。去甲二氫愈創(chuàng)木酸購自Fluka Chemical Co.。N，N′-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，4-二甲基氨基吡啶(DMAP)，嗎啉，三乙胺和碳酸鉀都購自Aldrich Chemical Co.。
分析薄層色譜(TLC)在已鋪制好的薄板(硅膠60 F-254)上進行，其購自Merck Inc.。氣相色譜分析在裝有25-m交聯(lián)甲基硅膠毛細管柱(0.32mm i.d.)的Hewlett-Packard 5890 Series II分析儀上進行。氮氣作為載氣，其流速保持14.0ml/分鐘的恒速。保留時間(tR)在以下條件下測定注射溫度260℃，柱溫等溫為280℃。氣相色譜和低分辨質(zhì)譜分析在配有Hewlett-Packard5971A質(zhì)量選擇探測器和毛細管HP-1柱的Hewlett-Packard 5890 Series II分析儀上進行。通過媒介-壓力液相色譜(MPLC)進行分離，其利用JascoModel 880-PU智能HPLC泵，流速為120ml/小時。MPLC的填充物為反相硅膠C18(顆粒尺寸為0.035-0.070mm)，購自Knauer Co.。通過比重柱色譜純化，其利用Merek試劑硅膠60(顆粒尺寸為0.063-0.200mm，70-230網(wǎng)篩ASTM)進行操作。
紅外光譜(IR)是利用Bomem Michelson Series FT-IR分析儀來測定。報告中的波數(shù)1601cm-1為聚苯乙烯的吸收。吸收強度用以下縮寫表示s，強；m，中等；w，弱。質(zhì)子NMR圖譜利用Varian Unity-400(400 MHz)分析儀獲得，以D2O為溶劑，3-(三甲硅基)丙酸鈉鹽為內(nèi)標。C-13NMR圖譜利用Varian Unity-400(100MHz)分析儀獲得，以D2O為溶劑，C-13化學位移是以3-(三甲硅基)丙酸鈉鹽的單峰中心(60.0ppm)為參照。峰的多樣性由以下縮寫表示s，單峰；d，雙峰；t，三重峰，q，四重峰；m，多重峰；J.耦合常數(shù)(hertz)。高分辨質(zhì)譜是利用JEOLJMS-HX110質(zhì)譜儀獲得。
內(nèi)消旋-1，4雙[3，4-(二甲氨基乙酰氧基)苯基]-3S-二甲基丁烷鹽酸鹽(2)。在含有NDGA(1，12.81g，42.37mmol，1.0equiv)和N，N-二甲基甘氨酸(26.21g，254.2mmol，6.0equiv)的二氯甲烷(250ml)溶液中加入DCC(52.45g，254.2mmol，6.0equiv)和DMAP(5.176g，42.37mmol，1.0equiv)。反應(yīng)混合物在氮氣保護下，于室溫攪拌24小時。在二環(huán)己基脲從反應(yīng)混合物中過濾出后，減壓濃縮得到的溶液。然后，將丙酮(250ml)加入殘余物中，將過量的氯化氫氣體通入所得溶液中。將沉積物溶于水中，并室溫下用丙酮重結(jié)晶兩次，得到2(28.97g，36.86mmol)，其為白色固體，收率為87％1H NMR(D20，400MHz)δ0.78(d，J＝6.0Hz，6H.2×CH3)，1.73(m，2H.2×CH)，2.38(dd，J＝13.2，9.6Hz，2H.2×ArCH)，2.78(dd，J＝13.2，4.4Hz，2H.2×ArCH)，3.03(s，24H.8×CH3N)，4.53(s，8H，4×CH2N)，7.22(m，4H.4×ArCH)，7.29(d，J＝8.4Hz，2H.2×ArH)；13CNMR(D20，100MHz)δ18.11，40.82，41.73，46.75，59.59，125.79，126.58，131.63，140.66，142.47，146.11，167.84；IR(KBr)3461(br)，2963(m)，1777(s，C＝O)，1620(m)，1478(m)，1377(m)，1210(m)，1106(m)，961(w)，852(w)cm-1；(2-4HCl)的MS(FAB)m/z(相對強度)643(M+，30)，600(20)，558(43)，515(20)，473(42)，430(13)，388(26)，185(18)，93(38)，58(100)，44(22)；(2-4HCl)的HRMS(FAB)C34H50N4O8的計算值642.3628，理論值642.3614；C34H54N4O8Cl4的分析計算值C，51.78；H，6.90；N，7.10；O，16.23。理論值C，51.70；H，6.85；N，7.05；O，16.21。
可以理解，通過取代合適的其它N，N-二甲基-取代的氨基酸，可以合成得其它的氨基酸取代的本發(fā)明的化合物。
實施例1M4N和幾個其它的NDGA衍生物對于SP1-調(diào)控的E6/E7啟動子活性的影響。
M4N和幾個其它的NDGA衍生物對于SP1-調(diào)控的E6/E7啟動子活性的影響是利用熒光素酶作為報告進行檢測。該測試方法通過磷酸鈣法將融合了熒光素酶報告的HPV16LCR(P97)的DNA轉(zhuǎn)染至C33A細胞中。C33A是一種宮頸腫瘤細胞系(ATCC序列號HTB-31)，其不包含任何整合的HPVDNA，但具有HPV早期基因啟動子強表達所必需的轉(zhuǎn)錄因子。在DNA轉(zhuǎn)染的第二天，將助溶于二甲基亞砜(DMSO)配制的不同濃度的藥物加入至所述細胞中。藥物處理30個小時后(以使測試能在瞬時轉(zhuǎn)染試驗標準的48小時內(nèi)完成)，將細胞裂解，并測定特定的熒光素酶活性(Luciferase AssaySystems，Promega，U.S.Pat.No.5283，179)。隨著M4N藥物濃度的增加，特定的熒光素酶活性隨之減小。
結(jié)果(見圖2)表明在熒光素酶測試中M4N顯著減少了Sp1調(diào)控的HPVE6/E7啟動子啟動的轉(zhuǎn)錄。
實施例2用M4N處理后E6/E7mRNA合成的抑制用M4N處理后E6/E7mRNA合成的抑制是通過宮頸細胞系C3中的RT-PCR進行測試。相關(guān)的RT-PCR是根據(jù)標準化細胞計數(shù)的總細胞RNA量而進行的。在2％瓊脂糖凝膠上對RT-PCR產(chǎn)物進行分析，結(jié)果見圖3。RT-PCR結(jié)果表明具有E7(321bp)和E6(204bp)的預期大小的擴增cDNAs在DMSO處理的細胞的第22循環(huán)時就被檢測出。在擴增30個循環(huán)的藥物處理的RNA提取物中則幾乎檢測不到這樣的產(chǎn)物。對于沒有模板的PCR對照或HPV16-陰性的C33a細胞系的總RNA提取物中都檢測不到擴增的產(chǎn)物。
實施例3通過M4N處理而抑制宮頸C3細胞生長將轉(zhuǎn)染HPV16的永生小鼠表皮細胞(C3細胞)置于小瓶中，使每瓶含有105個細胞。24小時后，將半數(shù)小瓶給予生長基質(zhì)，該基質(zhì)含有溶于1％DMSO的40μM M4N，而另一半則給予僅含1％DMSO的生長基質(zhì)。結(jié)果見圖4A。24小時內(nèi)，藥物處理的C3細胞和對照C3細胞的細胞形態(tài)已顯現(xiàn)出差別。藥物處理的細胞生長和分裂比未經(jīng)藥物處理的對照細胞明顯減少，而對于藥物處理的和僅含DMSO的對照細胞，存活細胞與總計數(shù)細胞的比值分數(shù)保持不變。這表明M4N能顯著減少細胞分化。
將M4N從基質(zhì)中除去后，其對C3細胞生長的影響也進行了檢測。將C3細胞置于小瓶中，使每瓶含有104個細胞。在時間＝0時，在2/3的小瓶中加入添加有40μM M4N的1％DMSO的生長基質(zhì)。其余的小瓶加入僅含1％DMSO的生長基質(zhì)。73個小時后，清洗半數(shù)已加入含M4N生長基質(zhì)的小瓶，然后加入僅含1％DMSO的生長基質(zhì)。清洗另一半小瓶，再加入與先前相同的基質(zhì)。結(jié)果見圖4B，其顯示M4N處理后的樣品在轉(zhuǎn)變成不含藥物的基質(zhì)后，其細胞生長速度并沒有明顯增加，該現(xiàn)象表明即使將細胞外環(huán)境中的M4N除去，其仍繼續(xù)顯著減少細胞的分裂。
實施例472個小時藥物處理前后的C3細胞中細胞基因表達的分析對于9600個基因陣列的基因表達進行了研究(圖5)。根據(jù)Genomics 51，313-324 1998所描述的方法，將M4N(40μM)處理72小時的(C3M4N)和未處理的(C3DMSO)中的polyA+RNA各5mg用于人9600基因陣列對的雜交研究。用配有Nikon 55mm AF微Niko鏡頭的彩色攝相機拍攝了雜交圖像并通過Macintosh LC630計算機進行數(shù)字化處理。該測試以單一色或雙重色模式通過酶底物與酶反應(yīng)形成顏色，該方法敏感度高，且可以復制(能夠從107細胞中檢測到每個細胞含有RNAs＜5次拷貝的轉(zhuǎn)錄)。
將顯示差異性表達的基因(C3M4N/C3DMSO＞10，C3DMSO/C3M4N＞10)的計算機打印結(jié)果列表進行分析。TIFF格式的圖像文件和MSexcel格式的數(shù)據(jù)文件被保存在zip磁盤中?？筛鶕?jù)基因名稱和克隆ID號來給獲得的克隆圖像，以便將來用于northern印跡分析。
在經(jīng)M4N處理72小時后的一組上調(diào)或下調(diào)基因中，以下是那些尤其與細胞分裂和凋亡相關(guān)的基因。一些其它細胞周期相關(guān)基因也根據(jù)M4N而被大幅度上調(diào)。除細胞周期蛋白依賴性激酶CDC2(實施例11)以外，還有例如增加細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑 (100X)凋亡(APO-1)抗原 (100X)死亡結(jié)構(gòu)域3 DR3(100X)Ras-相關(guān)蛋白RAP-1 (60X)人Map激酶 (40X)下列細胞周期相關(guān)基因根據(jù)M4N而被大幅度下調(diào)
處理 未處理細胞周期蛋白依賴性激酶7(5％)100％人類細胞因子受體 (2％)100％增殖的細胞核抗原，PCNA (1％)100％人TNF-相關(guān)的凋亡APO2(3％)100％半胱氨酸蛋白酶 (7％)100％在早期，如藥物處理后一個小時，其E6/E7水平與對照細胞中的相似，而4.5小時后，E6/E7水平則不能被RT-PCR檢測出(10)。9600基因陣列的基因表達能夠用從這些短時間(1小時和5小時)處理的細胞中分離出的RNA重復出，以進一步抑制藥物對細胞的最初作用。
實施例5通過局部注射M4N靶向抑制C3腫瘤生長在36只C57b1-16 NCR小鼠的后背肩部注入5×105C3細胞。其中24只在20天內(nèi)產(chǎn)生了腫瘤。每天注射(50μl-100μl的M4N或M4N/G4N)(M4N在DMSO中濃度為200mg/ml，G4N在PBS中濃度為200mg/ml)，對動物體內(nèi)腫瘤的生長具有明顯的影響，見表1和2，圖6和7。
表1.M4N和G4N對小鼠體內(nèi)單個腫瘤生長的影響


*DMSO＝藥物溶劑**第15天進行操作***大部分包含壞死細胞的病變組織也在小鼠6，7，11，14，15，17，19，21，28，19中出現(xiàn)(圖6，7)。藥物治療后的小鼠#11和#22中沒有病變。在對照小鼠#1，2，3，4中發(fā)現(xiàn)的腫瘤含有生長的細胞(圖2)。
實驗步驟將5×105C3細胞/只注入36只C57bl-16NCR小鼠中。在小鼠后背肩部皮下注射100μL。將細胞懸浮于低鹽HBSS中并輕微震動使懸浮液保持均勻。
24只小鼠長出腫瘤。其病變大小通過帶表卡尺(dial caliper)測得。將這些小鼠剃毛、稱重并開始治療(第一天)。將四只小鼠作為對照小鼠。對照小鼠每天接受腫瘤內(nèi)注射50μl DMSO。實驗小鼠(10)接受50μl溶于DMSO的M4N(200mg/mL)。其余10只小鼠在G4N治療(50μl，PBS中的濃度為200mg/ml)8天后再接受M4N治療8天。在腫瘤的幾個區(qū)域進行注射。小鼠在注射前給予乙醚或甲氧氟烷進行麻醉。
表2.M4N和G4N對含有多個腫瘤小鼠中的病變組織生長的影響

*DMSO中的藥物直接注射至腫瘤區(qū)**從鄰近腫瘤獲得藥物表3 小鼠中G4N的毒性研究

來自NCI的C57BL-16NCR雌性小鼠用于該實驗中。
每天制備新鮮的四甘氨酰基NDGA(G4N)PBS溶液，其濃度為75mg/ml。組1每次注射0.05ml，組2和組4每次注射0.1ml，組3注射0.2ml，注射6天。試驗持續(xù)了7天。在注射六天前后稱量體重。試驗期間，體重無顯著變化。
所有治療的小鼠，對照小鼠(小鼠編號1-4)和試驗小鼠(小鼠編號6，7，9，10，11，12，14，15，16，17給予M4N，編號18-22，24，26-29給予M4N/G4N)都呈現(xiàn)腫脹。用帶表卡尺測量病變大小。一些小鼠由于注射而出血。
治療方案和結(jié)果如下第10天再次稱重小鼠。所有小鼠體重增加2克。
第12天沒作治療。
第13天所有小鼠皮膚鼓起，但程度不同。一只M4N治療后的小鼠(#7)的皮膚剝離，“干狀腫瘤”從中脫離。
第14天注射量增加至100μl。
第15天由于麻醉過量而使其中一只M4N治療的小鼠(#17)死亡。#17小鼠病變部位處的皮膚裂開，“干狀腫瘤”顯露出來。將病變組織切除并稱重。
第16天4只更大劑量M4N治療的小鼠(#6，14，15，16)，三只M4N/G4N治療的小鼠(#19，21，28)和一只對照小鼠(#2)處以安樂死，然后切除、稱重。其余對照小鼠(#1，3，4)沒有進行侵入性檢測，其帶有腫瘤。
第21天用帶表卡尺測量對照小鼠的腫瘤大小。
觀察小鼠#10和#12(M4N治療區(qū))的病變部位處的皮膚裂開，“干狀腫瘤”顯露出來。
第24天小鼠#7皮膚完全恢復。實驗于今日結(jié)束。所有M4N治療后的存活小鼠(#7，9，10，11，12)和M4N/G4N治療后小鼠(#18，20，24，26，29)都處以安樂死，切除、檢測和稱重。
M4N和M4N/G4N對于小鼠C3腫瘤生長的作用在表1和2以及圖5和6中給予總結(jié)。表1顯示藥物對于只帶有單個腫瘤的小鼠C3細胞生長的影響。對照組四個切除的腫瘤平均重量為1.48g，而M4N治療后和M4N/G4N治療后的小鼠病變組織重量分別為0.142和0.51g。藥物治療后的病變組織主要由干狀壞死細胞組成(圖6)。對照組腫瘤表現(xiàn)出同質(zhì)性，且包含具有活性的生長細胞。表2顯示了藥物對于帶有多種腫瘤的小鼠中的C3腫瘤生長的影響。在該研究中，藥物被注射至其中一個腫瘤中。未治療的腫瘤平均重量為1.77g，而M4N治療的病變組織重量為0.15g。經(jīng)M4N/G4N注射后得到相似的結(jié)果，未經(jīng)治療的腫瘤平均重量為1.27g，而藥物治療后的病變組織的平均重量只有0.103g。在整個實驗期間，所有小鼠的體重變化不顯著(表1和2)。
實施例6兩組小鼠中經(jīng)藥物處理(M4N)和DMSO溶劑處理或未經(jīng)處理的腫瘤(CON)經(jīng)過組織病理學檢查。切除的腫瘤立即被固定，然后保存在磷酸緩沖鹽的4％甲醛溶液中。然后將組織通過一系列級別的乙醇和二甲苯脫水，用石蠟固定。將石蠟組織塊制成薄切片，并用蘇木精和曙紅進行染色用于顯微觀察。組織病理學研究顯示DMSO處理的對照組腫瘤未受影響，仍繼續(xù)生長。其顯示了高程度的核/質(zhì)比，多晶核變化，高有絲分裂形狀，像肉瘤形狀的紡錘體，和浸潤至周圍組織的癌細胞特征。相反，在開始接受M4N處理后不久，腫瘤即停止生長。表明腫瘤有顯著的壞死并且不再具有存活的能力。高倍數(shù)放大下能看到少量的藥物沉積物，而且焦點區(qū)域顯示慢性炎癥和纖維化。該治愈作用導致死亡的腫瘤細胞從病變區(qū)脫落。用M4N/G4N處理的結(jié)果與單獨M4N處理的結(jié)果相同。然而，由于G4N是水溶性的，其比M4N擴散至腫瘤的更大面積。預計將G4N與M4N協(xié)同使用在治療大尺寸的腫瘤中會更有效(即，大于2cm3)。
實施例7M4N對于幾內(nèi)亞豬的HSV-1皮膚感染的作用將藥物M4N用于幾內(nèi)亞豬皮膚感染HSV-1的病毒復制抑制作用實驗。將幾內(nèi)亞豬皮膚用針刺破，局部用HSV-1使每個刺破區(qū)域受到感染。每天使其感染達6天后，將M4N用于被感染區(qū)域。
將幾內(nèi)亞豬裸露的背部皮膚的六個區(qū)域用5＝DIN針進行滅菌穿孔。兩個區(qū)域接受HSV-1(HSV-C，培養(yǎng)物上清夜，或鹽水中分離出的HSV，HSV-SC)的感染。其它4個區(qū)域接受HSV-SC感染。感染后的15分鐘，將30μl實驗用化合物(DMSO中60mg/ml的ABDS1，ABDS2，ACV和M4N(4N)用于每個穿孔的被感染區(qū)域，每天操作5次，共進行六天。ABDS1和ABDS2作為陰性對照。圖8的照片是第6天拍攝的，其顯示了在不給予藥物(HSV-C，HSV-SC)，在給予無效藥物(HSV-ABDS1，HSV-ABDS2)以及在給予有效藥物(HSV-M4N和HSV-ACV)的情況下HSV-1的復制程度?？梢钥吹?，在經(jīng)HSV-C，HSV-SC，HSV-ABDS1，HSV-ABDS2處理的皮膚有6個大面積匯合的水泡，而經(jīng)M4N(4N)和ACV處理的被感染區(qū)域則沒有水泡形成。該模型體系得到的明確結(jié)果是M4N能夠阻止HSV復制，表現(xiàn)為皮膚病變消失且經(jīng)藥物處理4天后無病毒脫落。最初的動物研究還顯示了當M4N經(jīng)腹腔內(nèi)給藥且濃度高達300mg/kg，以及皮下或靜脈給藥濃度高達375mg/kg時對小鼠都無毒性作用(Table 3)(6)。
實施例8M4N原位注射的臨床治療將M4N直接施用于腫瘤內(nèi)的藥物傳輸途徑具有幾個顯著的優(yōu)勢。1)M4N是一種疏水化合物，易溶于DMSO中(200mg/ml)。因此，只需要注射少量的藥物溶液即可以達到有效的藥物劑量。在實施例5中描述的小鼠研究中，每日注射50μl至100μl達數(shù)日足以完全使小鼠中的腫瘤停止生長。從前對于使用大劑量DMSO治療疾病也進行了一些研究(每次治療靜脈給藥30ml)(21)。實驗結(jié)果沒有得出結(jié)論(22)。然而，由于過去世界范圍的上千萬人已經(jīng)安全的經(jīng)受了大量的DMSO的實驗，DMSO在少量使用時應(yīng)該是安全的藥物傳輸媒介(23)。2)通過原位注射，大部分藥物殘余物保持未溶狀態(tài)并集中在腫瘤區(qū)域，而不會進入循環(huán)系統(tǒng)，從而可以避免全身毒性。此外，由于有足夠的藥物保留在腫瘤內(nèi)以抑制其生長，則在幾次治療后無需繼續(xù)注射藥物。在實施例5的小鼠研究中，甚至在停止注射M4N后，腫瘤細胞繼續(xù)死亡。因此當直接靶向給藥時，腫瘤大小則成為給藥劑量的決定因素。人的體重與小鼠體重的差別則無相關(guān)性。在小鼠腫瘤研究中，每天給藥20mg，給藥10天，則足以消除腫瘤。對于治療大小為(1-1.5cm3)的人類腫瘤，則無須使用更高劑量。這將減小用人類作試驗的高風險。
實施例9用M4N處理細胞以阻止細胞增殖我們前面對于M4N的研究表明了M4N通過使Sp1-依賴性啟動子失活可以抑制病毒轉(zhuǎn)錄。很多哺乳動物細胞周期基因也包含基本的Sp1啟動子，M4N也因此能夠阻止其轉(zhuǎn)錄。該假設(shè)通過M4N對于多種細胞系的抗增殖作用而得以驗證。低濃度(10μM)的母體化合物，NDGA，先前即顯示了誘導哺乳動物細胞凋亡的作用(24)。然而，該作用能夠通過加大兒茶酚的一個氧原子位阻或在NDGA上加成親水基團(25)而受到阻止。在HPV-16/ras轉(zhuǎn)染的C3細胞系培養(yǎng)實驗中，通過增加NDGA衍生物M4N的量來確定所需的最佳增殖抑制濃度(26)(Figure 9a)。細胞對于M4N的響應(yīng)良好，72小時后，在濃度范圍40至60μM時細胞停止分裂。保持該濃度的三天后，細胞數(shù)目與開始用藥物處理時的細胞數(shù)目相等(第0天，F(xiàn)ig 9)。在更低的濃度時，細胞生長減少得更少，而在濃度大于60μM時可以看到一些細胞死亡的現(xiàn)象。
M4N對于C3細胞系的抗增殖作用不僅僅是由于藥物使Sp1-依賴性HPV-16 E6/E7致癌基因啟動子失活，在HPV-16轉(zhuǎn)染的TC-1細胞系中，其E6/E7致癌基因是由非-Sp1依賴性逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子所控制(27)，同樣也觀察到生長抑制現(xiàn)象(Figure 9d)。此外，C33a細胞系的生長(圖9c)、HPV-陰性人類宮頸癌細胞系和CEM-T4系(圖9b)、人類白血病細胞系(28)，通過M4N的處理也都受到阻礙。在該四種用藥物處理的細胞系中，直至M4N濃度超過一閾值(對于C3細胞為60μM，對于TC-1細胞為40μM等)時，幾乎所有(＞95％)停止生長的細胞都是存活的。高于該濃度以上，存活細胞的百分數(shù)則急劇下降。而停止生長的細胞在長時間的藥物處理后仍有＞95％的細胞是存活的。C3細胞在用40μM的M4N處理8天后，死亡的細胞數(shù)仍沒有增加(圖9e)。
實施例10用M4N處理的細胞停止于G2期一旦建立用M4N處理使細胞停止增殖，但仍使細胞存活的實驗后，則可以使用細胞的DNA含量分析和細胞結(jié)構(gòu)的熒光測試來確定細胞停止生長的周期點。將細胞用M4N處理達72小時，與對照細胞相比，顯示出G2/MDNA含量增加(圖10a-d)。最極端的響應(yīng)可以從C3和CEMT4細胞系中觀察到，其中＞90％的細胞顯示了G2/M DNA含量。
為了區(qū)別是在G2期還是在有絲分裂阻抑期停止，將抗α微管的抗體(綠色)和抗γ微管的抗體(紅色)用于確定M4N處理72小時后的C3細胞系的中心體狀態(tài)。如圖11a所示，M4N處理的細胞中心體被復制，但仍在細胞核附近彼此相鄰。由于在前期的早期中心體分離，因此可以斷定這些細胞還沒有開始有絲分裂。相反，對照細胞染色的γ微管具有G1或S期的輻射狀特征(29)。用DAPI染色還觀察到M4N處理后的細胞中缺少染色質(zhì)濃縮(圖12b)，這是細胞沒有從G2期繼續(xù)發(fā)展的另一證據(jù)(30)。
實施例1140μM M4N抑制了CDC2的生成由于細胞自G2之后的進程依賴于MPF的生成，對于40μM M4N處理的C3細胞中的蛋白質(zhì)組成狀態(tài)進行了檢測。不同步的細胞在含有M4N的1％DMSO、或只有1％DMSO的介質(zhì)中生長24個小時或72個小時。收集細胞，用western印跡分析相同量的總細胞蛋白。用M4N處理72小時的細胞CDC2數(shù)量顯著下降(圖12a)。然而，通過脫膜和重復探測相同膜進行檢測，細胞周期蛋白B的水平?jīng)]有改變。這些結(jié)果表明，在這些條件下細胞生長的停止不可能是響應(yīng)p53的結(jié)果，因為p53的過度表達會導致細胞周期蛋白B的減少(31，32)。與western印跡分析結(jié)果相一致，CDC2激酶在M4N處理72小時后而失活(圖12a)。這些試驗支持了一個觀點，即藥物是通過抑制CDC2蛋白的合成，導致MPF失活而起作用。
我們在前的研究表明M4N阻止Sp1-依賴性病毒轉(zhuǎn)錄的能力提示了CDC2 mRNA水平的降低可能是CDC2蛋白質(zhì)減少的機理。這與一個發(fā)現(xiàn)相一致，即基因表達時不需要Sp1的細胞周期蛋白B以正常水平合成；而基因啟動子上具有兩個必要的Sp1位點的CDC2蛋白，其數(shù)量顯著減少。為了證明該假設(shè)，對40μM M4N處理5至72個小時的C3細胞中收集到的RNA進行了northern印跡分析。如圖12b所示，在M4N僅處理24小時后，CDC2 mRNA的數(shù)量就減少了，而在72小時后則幾乎消失。非-Sp1調(diào)控的看家基因GAPDH的合成被用作承載RNA的對照(RNA loading control)，其水平不受40μM M4N的影響。
采用C3細胞系使我們得到了一種用于分析M4N介導細胞周期停止的機理的另外的對照，因為其它Sp1-依賴性基因啟動子也可能受到M4N的抑制。這種可能性是通過M4N對于C3細胞中Sp1依賴性HPV-16 E6/E7啟動子轉(zhuǎn)錄的抑制作用進行檢測的。對40μM M4N處理5至72小時的C3細胞中分離得到的RNA進行rtPCR分析，顯示E7轉(zhuǎn)錄物水平明顯減少(圖12c)。GAPDH被再次用作本試驗的內(nèi)部對照，其水平不受藥物處理的影響。這些結(jié)果為M4N減少了Sp1調(diào)控的啟動子的轉(zhuǎn)錄物提供了證據(jù)。
實施例12凝膠遷移率分析中G4N對于Sp1-結(jié)合活性的抑制Sp1家族蛋白誘導在DNA大溝處的結(jié)合(33)。Sp1蛋白的鋅指區(qū)域負責GC框序列5′-GGGGCGGGG-3′的結(jié)合。根據(jù)計算機分析，可以確定G4N作為NDGA的氨基酯衍生物，能夠與大溝處的序列形成穩(wěn)定的復合物。為了確定G4N是否能作為Sp1阻止劑以及Sp1替代物，我們通過凝膠遷移率分析，在存在G4N或不存在G4N時，僅對Sp1的DNB結(jié)合域進行p1/增強子相互作用的研究。在阻止實驗中，首先將不同濃度的G4N與32P-標記的DNA在結(jié)合緩沖液中，于25℃培養(yǎng)30分鐘。然后加入重組Sp1蛋白(Sp1-167D)的DNA結(jié)合域，并在過量BSA蛋白下繼續(xù)培養(yǎng)30分鐘。在替代研究中，先使重組SP1-167D與DNA結(jié)合，然后在培養(yǎng)的第二步加入G4N。G4N和Sp1-167D的濃度以及培養(yǎng)和凝膠電泳條件在兩個研究中都相同(實驗部分)。如圖13所示，在任一項研究中可以看到G4N能夠使DNA不與Sp1-167D蛋白相互作用。當只測試Sp1的DNA結(jié)合域時，凝膠遷移率分析顯示G4N表現(xiàn)出比阻止Sp1結(jié)合增強子更有效的替代結(jié)合Sp1的作用(圖13，A，B，D)。我們也已經(jīng)檢驗了結(jié)合的G4N是否能夠被Sp1-167D所替代。在該項研究中，G4N抑制Sp1-167D的結(jié)合作用首先通過遷移率分析而得(圖13C，泳道2和5)。當G4N結(jié)合的模板被其它Sp1-167D所替代，我們觀察到Sp1-167D/DNA復合物帶強度是劑量依賴性增強的(圖6C，帶6，7)，表明Sp1-167D替代了模板上的G4N。
實施例13G4N對于Sp1調(diào)控的Tat-反式激活的HIV啟動子活性的抑制作用如從前所報導的，甲基化的NDGA衍生物能夠阻止Sp1與多種病毒啟動子的增強子位點結(jié)合，包括HIV，HSV的ICP4，HPV的E6/E7基因的啟動子(8，9，10)。我們通過如前所述的SEAP實驗進一步驗證了G4N對于Cos細胞中的HIV啟動子的Tat-反式激活活性。Cos細胞中幾乎檢測不到HIVLTR驅(qū)動的SEAP表達的基本水平。當Cos細胞與CMV啟動子驅(qū)動的Tat基因共轉(zhuǎn)染時，則存在60倍或更多的SEAP表達(8)。這種Tat-驅(qū)動式HIVLTR啟動子活性的反式激活從前顯示是受Sp1調(diào)控的(7，8)。在G4N的存在下，我們觀察到HIV反式激活的抑制是劑量依賴的方式(圖14)。G4N的平均IC50值36μM可與3-O-甲基NDGA，Mal.4(IC5025μM)相比，并高于四甲基NDGA，M4N(IC5011μM)。這種差別可能是由于測試化合物的化學性質(zhì)影響了細胞對藥物的攝取。
實施例14G4N對于SIV-1和HIV-1在細胞培養(yǎng)物中合成的抑制作用HIV-1和SIV都是逆轉(zhuǎn)錄病毒，需要整合到宿主染色體中以完成復制。二者都依賴宿主轉(zhuǎn)錄因子進行原病毒轉(zhuǎn)錄。Sp1在這兩種病毒的表達中起關(guān)鍵作用，這兩種病毒享有幾乎相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控方式。我們已經(jīng)研究并比較了G4N對于174×CEM細胞中的SIV與H9細胞中的HIV的抑制作用，使用了SIV感染的恒河猴作為動物模型以測試G4N的抗病毒效果。也檢測了G4N在兩種細胞系中的細胞毒性。對于SIV的抑制作用研究，將107174×CEM細胞與高滴度儲存液SIVmac 239在37℃下混合兩個小時，然后用冷PBS緩沖液沖洗兩次以除去未被吸附的病毒。將細胞懸浮液等分加入3個96孔培養(yǎng)板中。用儲存液新鮮制備各種濃度的G4N溶液，然后分別等分加入至6個96孔培養(yǎng)板中。感染后(P.I.)，每4天收集一次培養(yǎng)物上清液，將含有適宜藥物濃度的新鮮介質(zhì)在收集上清液后加入至培養(yǎng)物中。通過修飾的p27核心抗原捕獲ELISA檢測病毒的生成，如圖示(圖15)。在G4N的濃度超過5CIM時沒有檢測到SIV的生成。與無藥物存在時的病毒合成相比較，當G4N的濃度低于2.5CIM，在感染后第4天和第8天的培養(yǎng)物上清液中才檢測到有SIV生成(圖15)。通過MTT測試法確定，G4N(250μM或更少)對于未感染的174×CEM細胞顯示無毒作用(34)。
在H9細胞中進行了G4N對HIV-1抑制作用的類似實驗。將H9細胞以1×105/ml濃度進行次培養(yǎng)，并用HIV-1(HIV-1RTMF)的AZT耐藥株感染該細胞。感染后2個小時后，加入不同濃度的G4N，每4天更換新鮮介質(zhì)。在9天的實驗期間，仔細監(jiān)測G4N存在時的細胞生長狀況。用p24核心抗原捕獲ELISA檢測病毒的產(chǎn)成。如圖所示(圖16)，G4N濃度為80 CIM時，H9細胞中的HIV復制完全受到抑制。G4N抑制HIV-1 RTMF的IC50為12μM。在測試范圍內(nèi)(低于250μM)，對于未感染的H9細胞沒有檢測到毒性作用。
實施例15M4N對于C3細胞中的Survivin基因表達的影響材料和方法細胞培養(yǎng)。C3細胞在補充有5％胎牛血清(GIBCO BRL)的Iscove′s修飾的Dulbecco′s基質(zhì)(GIBCO BRL)中，保持在潮濕的孵育箱中，于37℃，5％CO2環(huán)境中單層生長。
M4N處理。將C3細胞(5×106)接種于150-mm培養(yǎng)板中，并使其與培養(yǎng)板相接觸。接種后的24小時后，用PBS清洗培養(yǎng)物兩次，并用溶解于1％的DMSO中的M4N與生長基質(zhì)相混合。
細胞提取和免疫印跡。將細胞溶解于溶解緩沖液中，該緩沖液含有50mM HEPES pH7，250mM NaCl，0.1％(v/v)Nonidet P-40，10％甘油，1mMDTT，和雞尾酒療法的50μl/ml蛋白酶抑制劑(Sigma)。提取物的蛋白質(zhì)濃度采用Bradford測試(Bio-Rad Laboratories)，然后用SDS-PAGE分離50μg的蛋白質(zhì)，并電遷移至硝基纖維素膜上(ECL)。將膜與Survivin的一級抗體(Santa Cruz Biotechnology)和凋亡酶3(Santa Cruz Biotechnology)共同培養(yǎng)。印記再與抗兔生物素共軛的二級抗體培養(yǎng)，然后與Avidx-AP抗生物素蛋白鏈菌素-堿磷酸酯酶培養(yǎng)，用CSPD底物(Tropix)檢測。
RT-PCR分析。用硫氰酸胍鹽和苯酚方法，從分子克隆中所描述的培養(yǎng)細胞中分離出mRNA(40)。采用survivin-義寡核苷酸引物5′-GCATCGCCACCTTCAAGAACTGGCCC-3′和survivin-反義寡核苷酸引物5′CGGGTAGTCTTTGCAGTCTCTTCAAACTC-3′得到一個343-堿基對的RT-PCR產(chǎn)物。采用GAPDH和反義引物5′-GAATCTACTGGCGTCTTCACC-3′和5′-GTCATGAGCCCTTCCACGATGC-3′得到238-堿基對的RT-PCR產(chǎn)物作為對照。在與MMLV(Promega)的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，將mRNA等份物置入含有1U或rRNAsin和脫氧核糖核酸酶的20μl反應(yīng)緩沖液中，在75℃下培養(yǎng)5分鐘。將得到的c-DNA產(chǎn)物在PCR條件下擴增55℃達55秒，60℃達55秒，72℃達1分鐘，進行30個循環(huán)。在含有溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓的1.8％瓊酯糖凝膠上通過電泳分離PCR產(chǎn)物，并在UV下拍照。用Scion Image定量電泳帶，并將survivin PCR反應(yīng)產(chǎn)物的信號強度正?；罣APDH PCR產(chǎn)物的信號強度以生成survivin基因下調(diào)的圖片。
為了確定C3細胞中的Sp1-調(diào)控的survivin基因表達是否在接受M4N處理后而減少，我們用40μM M4N處理細胞達24小時和72小時。如圖1所示，用M4N處理的細胞導致survivin基因表達以時間-依賴性方式而顯著減少。用40μM M4N處理細胞達24小時和72小時導致survivin基因表達分別減少了65％和80％。未接受處理的細胞，其survivin基因表達未顯示任何減少。
通過免疫印跡也可以顯示Survivin蛋白在M4N處理72小時后出現(xiàn)下調(diào)。這種下調(diào)是劑量依賴性的(圖2)。
實施例16M4N處理誘導凋亡因為我們的數(shù)據(jù)顯示M4N導致survivin mRNA和蛋白質(zhì)的減少，由于survivin具有抗-凋亡功能，我們研究了上述減少是否能夠?qū)е碌蛲?。如凋亡?3的免疫印跡所示(圖3)，M4N處理達72小時促使凋亡酶-3活化。該活化有望導致M4N處理后的細胞凋亡的增加。
為便于參考，下面列出所參考的文獻。
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權(quán)利要求
1.一種在真核細胞周期中抑制survivin生成的方法，其包括給予有效劑量的通式化合物 其中，R1，R2，R3和R4各自獨立代表-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3，或氨基酸殘基，但不能同時都是-OH。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述的細胞為動物細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述的細胞為哺乳動物細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述的細胞為人類細胞。
5.一種在表達CDC-2和survivin的細胞中刺激細胞凋亡的方法，其包括給予有效量的通式化合物 其中，R1，R2，R3和R4各自獨立代表-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3，或氨基酸殘基，但不能同時都是-OH。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述細胞為動物細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述細胞為哺乳動物細胞。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述細胞為人類細胞。
9.一種處理腫瘤的方法，所述方法包括使用有效量的通式化合物 其中，R1，R2，R3和R4各自獨立代表-OH、-OCH3、-O(C＝O)CH3，或氨基酸殘基，但不能同時都是-OH。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述腫瘤存在于哺乳動物中。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述腫瘤為惡性腫瘤。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述腫瘤為良性腫瘤。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述腫瘤選自乳頭狀瘤、畸胎瘤和腺瘤。
14.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述腫瘤為實體瘤。
15.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述哺乳動物為人類。
16.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述腫瘤來自于轉(zhuǎn)染的細胞中。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述細胞為C3細胞。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述化合物與至少一種藥用可接受賦形劑或載體一同施用。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述賦形劑或載體是二甲基亞砜。
20.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述衍生物為四-O-甲基去甲二氫愈創(chuàng)木酸或四甘氨?；ゼ锥溆鷦?chuàng)木酸。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中四甘氨?；ゼ锥溆鷦?chuàng)木酸至少與一種藥用可接受賦形劑或載體一同施用。
全文摘要
去甲二氫愈創(chuàng)木酸衍生物抑制CDC－2和survivin，促使凋亡和治療腫瘤的應(yīng)用。
文檔編號A61K31/22GK1525857SQ02813862
公開日2004年9月1日 申請日期2002年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年5月9日
發(fā)明者黃汝吉, D 赫勒, 喬納森·D·赫勒, 張智全 申請人:約翰斯·霍普金斯大學, 約翰斯 霍普金斯大學