專利名稱：水溶性球形致孔劑及其制法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及材料領域，更具體地涉及可用于制備組織工程三維支架的水溶性致孔劑及其制法和用途。
背景技術：
組織、器官的喪失或功能障礙是人類健康所面臨的主要危害之一，也是人類疾病和死亡的最主要原因之一。我國因創(chuàng)傷和疾病造成的組織、器官喪失或功能障礙病例居世界各國之首，成為國家和患者一個沉重的負擔。新興的組織工程技術提供了一種嶄新的修復和制造器官的手段，為器官的缺損、壞死患者帶來了新的治療途徑。
組織工程涉及種子細胞、生物可降解材料和組織構建三方面的內(nèi)容。其中，生物可降解材料是組織工程研究的重要領域之一[Grande D.A，evaluation ofmatrix scaffolds for tissue engineering of articular cartilage grafts，J Biomed MaterRes，1997，34211]。作為種植細胞支架的生物可降解材料，是對于細胞外基質(zhì)的仿生，是保證組織工程化組織形成的前提。組織工程支架除了必須具有生物可降解性和生物相容性外，支架的物理性質(zhì)也非常重要，如支架必須具有足夠大的表面積，以利于細胞的粘附、分化和增殖；具有足夠大的孔隙，以利于細胞的遷移；具有良好的孔隙通透性，以利于營養(yǎng)物的進入和細胞分泌的廢物擴散排出；而支架的物理性質(zhì)與支架的制備方法有密切的關系。
常用的三維支架制備方法有1)纖維粘結(jié)法這是最早使用的一種方法，利用熱處理或溶液粘結(jié)無紡纖維網(wǎng)狀物形成三維多孔支架[Mikos，A G.，Bao，Y.，Cima，L G.，Ingber D E，Vacati，J P，andLanger，R，Preparation of Poly(glycolic acid)bonded fiber structures for cellattachment and transplantation.J Biomed Mat Res，1993，27183-189；Mooney D J，Mazzoni C L，Breuer C，McNamara，K，Hem D and Vacanti J P，Stablizedpo1yglycolic acid fiber-based tubes for tissue engineering，Biomaterials，1996，17115-124]，該支架的孔隙率高達81％，孔徑達到500μm，孔隙間連通性良好，但是機械強度低、孔隙形態(tài)難控制而限制了其應用范圍。
2)溶劑澆鑄/顆粒瀝取法將聚合物溶液澆鑄在盛有NaCl等水溶性顆粒的模具中，待有機溶劑揮發(fā)后，用水溶解出聚合物/顆粒復合物中的顆粒，即可獲得多孔聚合物支架[MikosA G，Sarakinos G，Vacanti J P，Langer R S，Cima L G，US5514378；Levene H B，Lhommeau C M，Kohn J B，US6103255；Mikos，A G.，Thorsen，A J，Czerwonka，LA，Bao，Y.，Langer，R，Winslow，D N，and Vacati，J P，Preparation andcharacterization of poly(L-lactic acid)foams，Polymer，1994，351068-1077；]，顆粒瀝取法的優(yōu)點是可以根據(jù)所用鹽粒的顆粒尺寸控制支架的孔隙大小，但是孔隙之間的連通性較差、鹽會保留在支架中、孔隙的形態(tài)粗糙，不利于細胞的生長。
3)氣體發(fā)泡技術利用高壓二氧化碳發(fā)泡技術[Mooney，D J，Baldwin，D F，Suh，N P，Vacanti，J P，and Langer，R，Noval approach to fabricate porous sponges of poly(D，L-lcatic-co-glycolic acid)without the use of organic solvents，Biomaterials，1996，171417-1422；]和氣體致孔劑技術[Nam Y S，Yoon，J J and Park T G，A novel fabricationmethod of macroporous biodegradable polymer scaffolds using gas foaming salt asa porogen additive，J Biomed Mat Res(Applied Biomaterials)，2000，531-7]可以制備出大體積的多孔支架，孔隙率高達90％以上，高壓二氧化碳發(fā)泡技術獲得的孔徑為100μm以下，但是大多數(shù)孔隙不連通；氣體致孔劑技術獲得的孔徑為200-500μm，具有較高的孔隙間連通性，封閉孔隙中的致孔劑不能完全去除，不能控制孔隙間連通通道形態(tài)和尺寸。
4)液-液相分離技術利用熱動力學原理在聚合物溶液中形成聚合物富相和貧相，通過升華等方式去掉聚合物貧相后，即可獲得多孔的聚合物支架Lo H，Ponticiello M S，andLeong K W，fabrication of controlled release biodegradable foams by phaseseparation，Tissue Engineering，1995，115-28；Schugens C，Maquet V，GrandfilsC，Jerome R and Teyssie P，Polylactide macroporous biodegradable implants forcell transplantation II Preparation of polylactide foams for liquid-1iquid phaseseparation，J Biomed Mat Res 1996，30449-461；Nam Y S and Park T G，Biodegradable polymeric microcellular foams by modified thermally induced phaseseparation method，Biomaterials，1999，201783-1790；Nam Y S and Park T G，Porous biodegradable polymeric scaffolds prepared by thermally induced phaseseparation，J Biomed Mat Res 1999，478-17]。獲得的支架孔隙率高達90％，但是孔徑在100μm以下，并且孔隙形態(tài)、孔徑分布、連通性與聚合物濃度、冷卻方法和時間、溶劑/非溶劑比例以及表面活性劑存在與否有關，孔隙間的連通性不夠，孔隙形態(tài)和結(jié)構難以控制。
5)改進的顆粒瀝取法顆粒瀝取法與相分離技術結(jié)合[昌塔爾·E·霍利，莫莉·S·紹伊切特，約翰·E·戴維斯，可生物降解的聚合物支架，CN1285757A]制備的方法，可以獲得通透性良好的三維支架，但是，孔隙之間的通道很小，且不易控制，不利于細胞的遷移。鹽溶方法[Murphy，W L，Dennis R G，Kileny J L，and Mooney D J，Salt Fusionan approach to improve pore interconnectivity within tissueengineering scaffolds，Tissue Engineering，2002，8(1)43-52]可以增進孔隙間的連通性，但是，孔隙連通的通道形態(tài)和大小不易控制，且孔隙呈立方體狀；以熱熔結(jié)方式將球形石蠟顆粒粘結(jié)后的顆粒瀝取法[Ma P X，Choi J W，Biodegradable polymer scaffolds with well-defined interconnected spherical porenetwork，Tissue Engineering，2001，7(1)23-33]，可以獲得高孔隙率、孔隙間相互連通的球形孔隙三維支架，但是，石蠟顆粒為非水溶性致孔劑，限制了高聚物的溶劑選擇范圍，實驗中采用了氣味讓人難以接受的吡啶作為高聚物的溶劑，另一方面，由于熱熔粘結(jié)中存在溫度梯度問題，導致該法不能制備大體積三維支架。
因此，本領域迫切需要開發(fā)新的水溶性的球形致孔劑，以便制備孔隙形態(tài)、大小可以人為控制的理想的組織工程用三維支架。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種水溶性的球形致孔劑以及用該致孔劑制備的高孔隙率、孔隙間相互連通的球形孔隙三維支架。
本發(fā)明的另一目的是提供所述球形致孔劑和三維支架的制備方法。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種水溶性球形致孔劑，所述的致孔劑的直徑大小為100-1000微米，且由選自下組的組分構成氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物。
在一優(yōu)選例中，所述的致孔劑的直徑大小為100-600微米。
在另一優(yōu)選例中，所述的致孔劑由氯酸鈉構成。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種制備本發(fā)明球形致孔劑的方法，包括步驟(a)將致孔劑原料與分散劑混合，形成混合物，其中致孔劑原料選自下組氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物，所述致孔劑原料的熔點為T1；且分散劑是閃點T2高于300℃的有機溶劑；(b)將步驟(a)的混合物攪拌加熱至大于T1且小于T2的溫度范圍；(c)以低于2℃/分鐘的速度降溫至T1溫度之下，形成固態(tài)微球；(d)分離出步驟(d)的固態(tài)微球，得到球形致孔劑。
在一優(yōu)選例中，在步驟(d)之后還包括步驟(e)洗滌和干燥球形致孔劑；(f)篩分，得到直徑為100-1000微米球形致孔劑。
在另一優(yōu)選例中，所述的分散劑選自下組甲基硅油、硅油、硅酮。
在另一優(yōu)選例中，所述的分散劑是甲基硅油，所述的致孔劑原料是氯酸鈉，且步驟(a)中加熱至260-270℃。
在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明所述的水溶性球形致孔劑的用途，用于制備組織工程三維支架。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種制備組織工程三維支架的方法，包括步驟(a)將本發(fā)明所述的水溶性致孔劑置于模具中；(b)在20±10℃，80±10％相對濕度下，粘結(jié)20-100小時，形成成型的致孔劑；(c)將生物可降解材料的溶液滴加在成型的致孔劑；
(d)干燥步驟(c)中滴加了生物可降解材料的成型致孔劑，形成生物可降解材料一致孔劑的復合材料；(e)將步驟(f)的復合材料置于水中，使致孔劑溶解，從而獲得成型的、生物可降解材料的三維支架。
在一優(yōu)選例中，所述的步驟(e)之后，還包括步驟(f)洗滌和干燥成型的、生物可降解材料的三維支架。


圖1顯示了不同直徑的球形致孔劑的光學顯微鏡照片。圖中標尺總長為1.0mm。
圖2A-2D顯示了不同處理過程對粘結(jié)效果的影響。其中，粘結(jié)條件為25℃、80％相對濕度，總粘結(jié)時間為30小時。
圖2A的粘結(jié)過程粘結(jié)10h離心→粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)7.5h離心→干燥→檢測。
圖2B的粘結(jié)過程粘結(jié)10h離心→粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)7.5h干燥→檢測。
圖2C的粘結(jié)過程粘結(jié)4h離心→粘結(jié)4h離心→粘結(jié)2h粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)3.5h離心→粘結(jié)4h離心→干燥→檢測。
圖2D的粘結(jié)過程粘結(jié)30h干燥→檢測。
圖3A-3C顯示了不同粘結(jié)時間對粘結(jié)效果的影響。其中粘結(jié)條件為25.5℃、80％相對濕度，致孔劑直徑為450-600微米。
圖3A的粘結(jié)過程粘結(jié)12h離心→粘結(jié)11h離心→干燥→檢測。
圖3B粘結(jié)過程粘結(jié)12h離心→粘結(jié)11h離心→粘結(jié)12.5h離心→干燥→檢測。
圖3C的粘結(jié)過程粘結(jié)12h離心→粘結(jié)11h離心→粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)11.5h離心→干燥→檢測。
圖4顯示了三維PDLA支架外觀。
圖5是三維支架顯微圖片(×40)。
圖6A和6B是.三維支架掃描電鏡圖片。其中6A的粘結(jié)時間36小時；而6B的粘結(jié)時間48小時。
具體實施例方式
本發(fā)明人進行深入而廣泛的研究，開發(fā)出一類球形水溶性致孔劑，并用于制備組織工程用三維多孔支架。用該水溶性致孔劑可制備孔隙率高、孔隙為球形，且孔隙間相互連通，孔隙大小和連通通道尺寸可以人為控制的大體積三維生物可降解支架。
本發(fā)明提供了球形水溶性致孔劑制備方法，它包括步驟(a)將致孔劑原料與分散劑混合，形成混合物可用于本發(fā)明的致孔劑原料的選擇標準是致孔劑原料具有結(jié)晶性質(zhì)、良好的水溶性、適當?shù)奈毙?、適當?shù)娜埸c(最好低于260度)、無毒性或低毒性、來源廣泛、成本低廉、不溶于有機溶劑、化學性質(zhì)比較穩(wěn)定。合適的致孔劑原料是選自下組的化合物氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物。致孔劑原料的熔點為T1。
可用于本發(fā)明的分散劑是閃點T2比致孔劑熔點T1高出50-100℃的有機溶劑，較佳地T2高于300℃的有機溶劑，代表性的例子包括(但并不限于)甲基硅油、硅油、硅酮。(b)形成液態(tài)微球通常，將步驟(a)的混合物加熱至大于T1且小于T2的溫度范圍，并攪拌；例如，當分散劑為甲基硅油，致孔劑原料為氯酸鈉時，加熱至260-270℃，時間約30±10分鐘；當分散劑為硅油，致孔劑原料為丁二酰亞胺時，加熱至130-140℃，時間約15±5分鐘；當分散劑為甲基硅油，致孔劑原料為丁二酰亞胺時，加熱至130-140℃，時間約20±10分鐘；當分散劑為甲基硅油，致孔劑原料為硫氰酸鉀時，加熱至180-190℃，時間約20±10分鐘。
(c)形成固態(tài)微球通常，緩慢地降溫(如以低于2℃/分鐘的速度降溫)至T1溫度之下，形成固態(tài)微球；(d)分離獲得球形致孔劑用常規(guī)方法(如顆粒瀝取法等)，分離出步驟(d)的固態(tài)微球，得到球形致孔劑。
(e)篩分不同大小的球形致孔劑用不同大小的篩來篩分，即可獲得不同大小的球形致孔劑。
本發(fā)明還提供了三維支架制備方法，它包括以下步驟●應用濕度粘結(jié)方法將球形致孔劑顆粒粘結(jié)在一起，形成成型的致孔劑；●利用溶液澆鑄技術，將生物可降解材料溶解于有機溶劑的溶液，澆鑄到粘結(jié)好的致孔劑上，待有機溶劑揮發(fā)后，形成生物可降解材料—致孔劑的復合材料；●將復合材料浸泡于水中，溶解去除致孔劑后；●真空干燥，可獲得結(jié)構可控的高孔隙率三維組織工程支架。
可用于制備組織工程三維支架的生物可降解材料材料沒有特別限制。常用的生物可降解材料包括(但并不限于)聚乳酸(PLLA，PDLLA)、聚羥基乙酸(PGA)、聚(D，L-乳酸-共聚-乙醇酸)(PLGA)、聚己內(nèi)酯(PCL)、聚羥基丁酸酯、聚二氧六環(huán)。
用于形成的生物可降解材料溶液的溶劑沒有特別限制。代表性的例子包括(但并不限于)二氯甲烷、氯仿、丙酮、二甲基亞砜、二甲基甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、二氧六環(huán)、四氫呋喃、乙酸乙酯、甲乙酮。
結(jié)果表明，本發(fā)明方法利用調(diào)節(jié)球形致孔劑的直徑和致孔劑顆粒間的粘結(jié)程度，可以實現(xiàn)三維組織工程支架孔隙形態(tài)、結(jié)構和連通性的控制，能制備出滿足組織工程要求的細胞外支架，是一種比較理想的組織工程三維多孔支架制備方法。
本發(fā)明的主要優(yōu)點在于(1)可形成結(jié)構可控的三維多孔組織工程支架。
(2)通過球形致孔劑顆粒直徑控制球形孔隙大小，通過顆粒之間的粘結(jié)程度控制孔隙間通道尺寸，可控制三維支架孔隙的結(jié)構；(3)高聚物的溶劑選擇不受致孔劑的限制，(4)能制備出大體積的、高孔隙率、高壓模量的三維組織工程支架。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
設備1.DW-2型多功能電動攪拌器，河南省鞏義市英峪豫華儀器廠2.真空干燥箱DZF-6000型，上海一恒科技有限公司3.顯微鏡Nikon ECLIPSE E600W，JAPAN4.分樣篩浙江上虞市華美儀器紗篩廠5.培養(yǎng)箱CO2 water jacketed incubator series II，model 3111，formascientific.Inc.USA6.電子天平PB303-S型，METTLER TOLDO，Switzerland7.離心機ALC，PK110，ALC international srl，made in EC12.電鏡scanning electron microscope，hitachi s-520，Japan14.純水裝置Millipore，milli-Q型，F(xiàn)rance實施例1球形致孔劑的制備(致孔劑原料為氯酸鈉)1.在500ml的燒杯中，加入400ml H-201甲基硅油(閃點大于300℃、比重0.96-0.975/25℃，粘度500cp/25℃。購自杭州師范學院附屬廠)和10-20g氯酸鈉，將燒杯置于控溫加熱裝置上，安裝機械攪拌裝置。調(diào)節(jié)攪拌速度為200轉(zhuǎn)/min，在攪拌狀態(tài)下，慢慢加熱甲基硅油至260-270℃[不能高于280℃]，使氯酸鈉呈液態(tài)微球；然后，維持攪拌速度不變，以2℃/分鐘的速率慢慢降溫至246℃，此時液態(tài)的氯酸鈉微球轉(zhuǎn)化為固態(tài)微球，停止攪拌，卸下攪拌裝置，靜置數(shù)分鐘，使球形致孔劑(即固態(tài)的氯酸鈉)沉積，傾去上層的甲基硅油，經(jīng)布式漏斗抽濾，即可獲得球形致孔劑。
將球形致孔劑轉(zhuǎn)移到廣口瓶中，用三氯甲烷洗滌致孔劑8-10次，經(jīng)布式漏斗抽濾后，再用乙醚漂洗2-3次，抽濾后，在真空干燥器中干燥。
干燥后的球形致孔劑，分別用孔徑為600μm，450μm，355μm，220μm和100μm的分樣篩篩分樣品，得到直徑為＜100μm，100-220μm，220-355μm，355-450μm，450-600μm，＞600μm的球形致孔劑，置于干燥器中密封、保存。
稱量即可計算各種直徑的球形致孔劑的產(chǎn)率；利用光學顯微系統(tǒng)對不同直徑的致孔劑進行觀察和攝影。
結(jié)果如圖1所示，獲得了直徑100-600微米的球形致孔劑，其產(chǎn)率分別為2.6％(＜100μm)，11.6％(100-220μm)，19.3％(220-355μm)，15.0％(355-450μm)，19.3％(450-600μm)，32.2％(＞600μm)。
實施例2球形致孔劑的制備(致孔劑原料為丁二酰亞胺)重復實施例1的步驟，不同點在于用10-20克丁二酰亞胺替換氯酸鈉，加熱溫度為130-140℃。
干燥后的球形致孔劑，分別用孔徑為600μm，450μm，355μm，220μm和100μm的分樣篩篩分樣品，得到直徑為＜100μm，100-220μm，220-355μm，355-450μm，450-600μm，＞600μm的球形致孔劑，置于干燥器中密封、保存。
結(jié)果同樣獲得了直徑100-600微米的球形致孔劑。
實施例3不同條件下致孔劑的粘結(jié)情況將1g實施例1制備的球形致孔劑置于一模具(頂部開口、底部有微孔的圓柱狀容器)，然后將模具置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在一定的條件下(溫度、相對濕度、時間)粘結(jié)后，于1000轉(zhuǎn)/min條件下離心5min，再次粘結(jié)、離心；反復多次至設定條件，置于真空干燥箱內(nèi)充分干燥，用手術刀片從中部橫切成對等的兩段，然后，在顯微鏡下觀察上、中、下三個面的粘結(jié)效果。
結(jié)果1.粘結(jié)過程對粘結(jié)效果的影響粘結(jié)條件為25℃、80％相對濕度，致孔劑直徑為450-600微米，總粘結(jié)時間為30小時。結(jié)果如圖2A-2D所示。
圖2A的粘結(jié)過程粘結(jié)10h離心→粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)7.5h離心→干燥→檢測。
圖2B的粘結(jié)過程粘結(jié)10h離心→粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)7.5h干燥→檢測。
圖2C的粘結(jié)過程粘結(jié)4h離心→粘結(jié)4h離心→粘結(jié)2h粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)3.5h離心→粘結(jié)4h離心→干燥→檢測。
圖2D的粘結(jié)過程粘結(jié)30h干燥→檢測。
由圖2A-2D可見，致孔劑粘結(jié)的處理過程不同，導致致孔劑顆粒間的粘結(jié)程度不同、粘結(jié)的均勻性也不同；粘結(jié)和離心交替進行，可以提高粘結(jié)的均勻性。
2.粘結(jié)時間對粘結(jié)效果的影響粘結(jié)條件為25.5℃、80％相對濕度，致孔劑直徑為450-600微米。結(jié)果如圖3A-3C所示。
圖3A的粘結(jié)過程粘結(jié)12h離心→粘結(jié)11h離心→干燥→檢測。
圖3B粘結(jié)過程粘結(jié)12h離心→粘結(jié)11h離心→粘結(jié)12.5h離心→干燥→檢測。
圖3C的粘結(jié)過程粘結(jié)12h離心→粘結(jié)11h離心→粘結(jié)12.5h離心→粘結(jié)11.5h離心→干燥→檢測。
由圖3A-3C可見，隨著粘結(jié)時間的延長，致孔劑顆粒間的粘結(jié)程度提高，但是粘結(jié)的均勻性有所降低；在給定的粘結(jié)條件下，通過36小時左右的粘結(jié)，可以獲得比較良好的粘結(jié)效果。
實施例4結(jié)構可控的三維組織工程支架制備(a)生物可降解材料溶液的配制配制12.5％PDLA的三氯甲烷溶液取2.50g PDLA(poly(DL-lactide)，購自Sigma公司，分子量90,000～120,000)置于磨口三角瓶內(nèi)，用移液管加入20ml三氯甲烷，蓋好磨口玻璃塞，室穩(wěn)下靜置溶解即可。
(b)支架制備將0.4g實施例1的球形致孔劑置于模具中，小心振蕩平整后置于培養(yǎng)箱內(nèi)，在25℃、80％的相對濕度下粘結(jié)36小時，每粘結(jié)12小時，離心一次，離心條件為1000轉(zhuǎn)/min離心5min，粘結(jié)完成后，置于干燥器中干燥24小時，真空干燥箱內(nèi)充分干燥后，置于干燥器中待用。
用滴管吸取PDLA的三氯甲烷溶液，逐滴滴加到粘結(jié)成型的致孔劑上，至溶液剛好超過致孔劑表面，在室溫下放置干燥12小時后，再次滴加PDLA的三氯甲烷溶液，共滴加三次。
待三氯甲烷揮發(fā)完全后，置于真空干燥箱內(nèi)充分干燥；從模具中取出澆鑄了PDLA的致孔劑，用手術刀片修切上、下表面，獲得高度為4.3mm，直徑為8.3mm的柱狀樣品。
柱狀樣品放置于蒸餾水中，攪拌下溶解致孔劑，并用蒸餾水漂洗3次，獲得三維PDLA支架，真空干燥箱內(nèi)充分干燥后，進行性能表征。
(c)三維支架的性能表征1.宏觀和微觀結(jié)構觀測三維支架的外觀如圖4所示。
干燥后的三維PDLA支架，真空條件下噴金后，用掃描電子顯微鏡和光學顯微鏡觀察三維支架的表面結(jié)構。支架的光學顯微照片如圖5所示。掃描電鏡如圖6所示由圖5和圖6可見，制備出的三維支架具有大的球形孔隙，并且球形孔隙之間相互連通，連通通道大小隨粘結(jié)時間延長而增大，即本文提出的三維支架構筑技術，能夠制備出內(nèi)部孔隙形態(tài)和結(jié)構可以人為控制的多孔三維支架。
2.孔隙率的測定利用稱重的方法計算三維支架的孔隙率，計算公式如下孔隙率＝[1-w/(ρv)]×100％
式中w為支架的重量(g)v為支架的體積(cm3)ρ為PDLA的密度，非結(jié)晶區(qū)的PDLA密度為1.25；因此，計算中均采用1.25表1到表4列出了不同實驗條件下構筑的三維支架的孔隙率。表1結(jié)果表明致孔劑的直徑對三維支架的孔隙率沒有顯著影響；澆鑄次數(shù)、溶液濃度和粘結(jié)時間均對三維支架的孔隙率有顯著影響，澆鑄次數(shù)增加孔隙率降低，溶液濃度增大孔隙率降低，粘結(jié)時間延長孔隙率增大。利用本發(fā)明的三維支架構筑技術可以制備出高孔隙率的三維支架，完全可以滿足組織工程的需要。
表1.致孔劑的直徑對孔隙率的影響

表2.澆鑄次數(shù)對孔隙率的影響(220-355μm用12.5％PDLA澆鑄)

表3.溶液濃度對孔隙率的影響(220-355μm用PDLA澆鑄3次)

表4.粘結(jié)時間對孔隙率的影響

3.吸水率的測定將三維支架置于蒸餾水中，在磁力攪拌器攪拌下，讓水充分進入支架的內(nèi)部孔隙；用濾紙吸去支架的表面附著水，稱量后計算吸水率。
計算公式如下吸水率＝[(W1-W0)/W0]*100％式中W1為支架吸水后的重量(g)W0為支架的干重量(g)表5.列出了致孔劑直徑與三維支架的吸水率的關系。結(jié)果表明致孔劑的直徑對支架的吸水率有顯著的影響。
表5.致孔劑直徑與三維支架的吸水率的關系

4.壓模量的測定干燥后的三維PDLA支架，置于instron 5542力學測定儀上，橫桿移動速為0.50mm/min的條件下測定壓應力，取應變?yōu)?％～10％的范圍計算三維支架的壓模量。
表6到表9列出了不同實驗條件下構筑的三維支架的抗壓能力。結(jié)果表明致孔劑的直徑、澆鑄次數(shù)和溶液濃度都顯著影響三維支架的壓模量，致孔劑直徑為100-220μm時壓模量最大，直徑在220-600μm范圍內(nèi)，隨直徑增大壓模量增大；隨澆鑄次數(shù)增加壓模量顯著增大；用濃度為12.5％的溶液澆鑄，可以獲得最大的壓模量。
表6.致孔劑的直徑對壓模量的影響(12.5％PDLA澆鑄3次)

表7.澆鑄次數(shù)對壓模量的影響(d＝0.22-0.355，12.5％PDLA澆鑄)

表8.溶液濃度對壓模量的影響(d＝220-355μm，澆鑄3次)

表9.粘結(jié)時間對壓模量的影響(d＝220-355μm，澆鑄3次)

討論三維支架的性能檢測結(jié)果表明，致孔劑顆粒的粘結(jié)時間越長或粘結(jié)過程中環(huán)境濕度越高，孔隙之間的連通通道尺寸越大；致孔劑顆粒直徑(100-220μm，220-355μm，355-450μm，450-600μm)對支架孔隙率沒有顯著影響，而澆鑄次數(shù)和溶液濃度顯著影響孔隙率，澆鑄越多或溶液濃度越大支架孔隙率越?。活w粒直徑為220-355μm時，用12.5％PDLA溶液澆鑄一次和3次的孔隙率分別為94.7％和88.9％；5.0％和20.0％PDLA溶液澆鑄3次的孔隙率分別為93.3％和85.4％；三維支架的壓模量隨支架的孔隙率升高而降低，壓模量隨顆粒直徑(220-355μm，355-450μm，450-600μm)增大而升高；澆鑄溶液濃度和澆鑄次數(shù)對壓模量也有顯著影響；12.5％PDLA溶液澆鑄粒徑為220-355μm的致孔劑獲得的支架，其壓模量高達517kPa，濃度12.5％的溶液澆鑄出的支架模量最大。三維支架的初始吸水率隨孔徑(100-220μm，220-355μm，355-450μm)增加而增大，孔徑為355-450μm的支架的初始吸水率為208％，在蒸餾水中浸泡一周后，吸水率增大為429％。
由上述實施例可以發(fā)現(xiàn)，應用本方法構筑的三維組織工程支架具有如下一些優(yōu)點可以通過球形致孔劑顆粒直徑控制球形孔隙大小，通過顆粒之間的粘結(jié)程度控制孔隙間通道尺寸，即可以控制三維支架孔隙的結(jié)構；同時，高聚物的溶劑選擇不受致孔劑的限制，并能制備出較大體積的、孔隙率高達94.7％的、高壓模量的三維組織工程支架。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種水溶性球形致孔劑，其特征在于，所述的致孔劑的直徑大小為100-1000微米，且由選自下組的組分構成氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物。
2.如權利要求1所述的球形致孔劑，其特征在于，所述的致孔劑的直徑大小為100-600微米。
3.如權利要求1所述的球形致孔劑，其特征在于，所述的致孔劑由氯酸鈉構成。
4.一種制備權利要求1所述的球形致孔劑的方法，其特征在于，包括步驟(a)將致孔劑原料與分散劑混合，形成混合物，其中致孔劑原料選自下組氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物，所述致孔劑原料的熔點為T1；且分散劑是閃點T2高于300℃的有機溶劑；(b)將步驟(a)的混合物攪拌加熱至大于T1且小于T2的溫度范圍；(c)以低于2℃/分鐘的速度降溫至T1溫度之下，形成固態(tài)微球；(d)分離出步驟(d)的固態(tài)微球，得到球形致孔劑。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，在步驟(d)之后還包括步驟(e)洗滌和干燥球形致孔劑；(f)篩分，得到直徑為100-1000微米球形致孔劑。
6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的分散劑選自下組甲基硅油、硅油、硅酮。
7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的分散劑是甲基硅油，所述的致孔劑原料是氯酸鈉，且步驟(a)中加熱至260-270℃。
8.權利要求1所述的水溶性球形致孔劑的用途，其特征在于，用于制備組織工程三維支架。
9.一種制備組織工程三維支架的方法，其特征在于，包括步驟(a)將權利要求1所述的水溶性致孔劑置于模具中；(b)在20±10℃，80±10％相對濕度下，粘結(jié)20-100小時，形成成型的致孔劑；(c)將生物可降解材料的溶液滴加在成型的致孔劑；(d)干燥步驟(c)中滴加了生物可降解材料的成型致孔劑，形成生物可降解材料一致孔劑的復合材料；(e)將步驟(f)的復合材料置于水中，使致孔劑溶解，從而獲得成型的、生物可降解材料的三維支架。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述的步驟(e)之后，還包括步驟(f)洗滌和干燥成型的、生物可降解材料的三維支架。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種水溶性球形致孔劑，所述的致孔劑的直徑大小為100－1000微米，且由選自下組的組分構成氯酸鈉、丁二酰亞胺、尿素、硫氰酸鈉、硫氰酸鉀，或其混合物。用所述水溶性致孔劑可制備孔隙率高、孔隙為球形，且孔隙間相互連通，孔隙大小和連通通道尺寸可以人為控制的大體積三維生物可降解支架。
文檔編號A61L31/06GK1511591SQ02158989
公開日2004年7月14日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權日2002年12月27日
發(fā)明者曹誼林, 陳際達, 崔磊, 劉偉 申請人:上海組織工程研究與開發(fā)中心