專利名稱：靶向ccp22基因的干擾性rna、含有該干擾性rna的藥物組合物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及靴向CCP22 (complement control protein 22，CCP22)的新的干擾性 RNA(interfering RNA)、含有該干擾性RNA的藥物組合物及其醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
CCP22 (SEQ ID NO :1，GeneBank 登記號(hào) AY916667)是 2005 年我們實(shí)驗(yàn)室首次報(bào)道 的從人乳腺文庫(kù)中分離得到的新基因，該基因的開放閱讀框架編碼1497個(gè)氨基酸。CCP22 能夠與抑癌蛋白Smad4相互作用(引用文獻(xiàn)韓聚強(qiáng)，方言，嚴(yán)景華，焦園園，呂秋軍，黃翠 芬，楊曉，葉棋濃.一種含多個(gè)CCP結(jié)構(gòu)域的新型基因的克隆及生物學(xué)特性初探.中華微生 物學(xué)和免疫學(xué)雜志.2005,25(12) :963-969)，但CCP22的具體功能目前未見報(bào)道。RNA干擾(RNA interference, RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA (dsRNA)誘導(dǎo) 細(xì)胞內(nèi)同源mRNA發(fā)生特異性降解，從而抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象。在RNAi過程中，長(zhǎng)鏈dsRNA 被Dicer酶剪切成小干擾RNA(siRNA)，siRNA的一條鏈與RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)結(jié) 合，隨后以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式與靶mRNA結(jié)合，導(dǎo)致mRNA的降解。由于siRNA可以抑制特 定基因的表達(dá)，該技術(shù)已被廣泛用于各種研究領(lǐng)域，包括基因治療研究。目前siRNA導(dǎo)入體 內(nèi)的方法主要有兩種一是直接注射裸露的shRNA(short hairpin RNA)或經(jīng)化學(xué)修飾的 shRNA ；二是使用病毒載體表達(dá)siRNA，如慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等。RNA干擾技術(shù)雖然已被用于腫瘤治療研究，但目前所能達(dá)到的效果仍然有限，現(xiàn) 有技術(shù)中迫切需要新的、有效治療腫瘤的方法。

發(fā)明內(nèi)容
定義本文中使用的術(shù)語(yǔ)“CCP22基因靶區(qū)域”指的是本發(fā)明的多核苷酸或siRNA所針對(duì) 的CCP22基因mRNA上的區(qū)域，其中編碼或表達(dá)的siRNA或者所述的siRNA本身能夠指導(dǎo)通 過RNA干擾作用裂解CCP22靶基因的mRNA。CCP22基因靶區(qū)域既可以位于CCP22基因mRNA 的5’端，又可以位于3’端，還可以位于中間部位。在本發(fā)明中，針對(duì)多核苷酸或siNA、siRNA、shRNA提及“正義鏈”時(shí)，指的是包含與 CCP22基因靶區(qū)域相同或高度相似的核苷酸序列的核酸鏈；提及“反義鏈”時(shí)，指的是與前 述正義鏈基本或完全互補(bǔ)的核苷酸序列。因此，本發(fā)明一方面提供了一種干擾性RNA分子，其中包含與CCP22基因靶區(qū) 域互補(bǔ)的第一核苷酸序列，能夠通過RNA干擾作用而降低或消除CCP22基因mRNA的 表達(dá)。所述干擾性RNA分子可以是雙鏈RNA，例如siRNA (short interfering RNA)、 miRNA (microinterfering RNA)等，或者單鏈 RNA，例如 shRNA (short hairpinRNA)，它們能 通過RNA干擾作用引起CCP22靶基因mRNA的降解(例如siRNA或miRNA的情形)或者能 夠形成具有這種功能的分子(例如shRNA的情形)。
在本發(fā)明中，所述干擾性RNA分子可以針對(duì)CCP22基因mRNA內(nèi)的任何合適靶區(qū) 域。例如，CCP22基因靶區(qū)域位于CCP22基因編碼序列內(nèi)，或者可以位于CCP22基因mRNA的 5’或3’非編碼序列內(nèi)。該靶區(qū)域可以具有任何合適的長(zhǎng)度，例如5-30nt，優(yōu)選18_25nt，更 優(yōu)選20-23nt。最優(yōu)詵地，所沭靶區(qū)域詵自下沭組中5 ’ ATGCATGGAAGGCTTTGTA3 ’ (SEQ ID N0:2)，和 5’ GAACCAATCTGCATTCTTC 3’ -(SEQ ID NO :3)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的干擾性RNA分子是SiRNA (short interfering RNA)。 這樣的siRNA分子包含與CCP22基因mRNA內(nèi)的靶區(qū)域反向互補(bǔ)的一條核糖核酸鏈(稱為 “反義鏈”)，以及與之互補(bǔ)的另一核糖核酸鏈(稱為“正義鏈”)。在本發(fā)明中，所述siRNA 可以具有任何合適的長(zhǎng)度。優(yōu)選地，其長(zhǎng)度為15-30bp，更優(yōu)選18-25bp，尤其優(yōu)選20-23bp。 例如，所述 siRNA 的長(zhǎng)度可以是 15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、 25bp、26bp、27bp、28bp、29bp 或 30bp。 優(yōu)選地，本發(fā)明的干擾性RNA分子是siRNA，其靶向CCP22基因cDNA或“mRNA”中 的以下區(qū)域ATGCATGGAAGGCTTTGTA (SEQ ID NO 2)或 GAACCAATCTGCATTCTTC (SEQ ID NO 3)。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的干擾性RNA分子是shRNA，其在同一核酸鏈中包含 與CCP22基因mRNA靶區(qū)域互補(bǔ)的第一核苷酸序列(在本文中稱為“反義區(qū)”)、與所述第一 核苷酸序列反向互補(bǔ)的第二核苷酸序列(在本文中稱為“正義區(qū)”)以及位于其間的連接序 列。在shRNA中，所述正義區(qū)可以位于5’端，而反義區(qū)位于3’端；或者，所述反義區(qū)可以位 于5’端，而正義區(qū)位于3’端。所述shRNA可以是單鏈的，能夠形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，其 中正義區(qū)和反義區(qū)構(gòu)成雙鏈體部分，而連接序列形成環(huán)。形成環(huán)的連接序列的長(zhǎng)度可以變 化。例如，在一些實(shí)施方式中，所述連接序列具有5個(gè)核苷酸(nucleotide，簡(jiǎn)稱nt)、6nt、 7nt、8nt、9nt、IOnt、1 Int、12nt或13nt的長(zhǎng)度。該shRNA形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可以包含5，或 3’突出端。在一些實(shí)施方式中，所述突出端具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的干擾性RNA分子是靶向CCP22基因cDNA或“mRNA” 中區(qū)域5，GAACCAATCTGCATTCTTC3，(SEQID NO 3)的shRNA。優(yōu)選地，其具有下述核苷酸序 列5' -Nx GAACCAATCTGCATTCTTCTTCAAGAGAGAAGAATGCAGATTGGTTC TTTTTTGGAAA-3 ’ (SEQ ID NO :4，在 RNA 的情形下“T” 替 換為“U”)；其中N為任何合適的核苷酸殘基，χ為0-10的任何整數(shù)，例如0、1、2、3、4、5、6、7、 8或9。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的干擾性RNA是靶向CCP22基因cDNA或“mRNA”中 區(qū)域5，ATGCATGGAAGGCTTTGTA3，(SEQID NO 2)的shRNA。優(yōu)選地，其具有下述核苷酸序 列5' -N' y ATGCATGGAAGGCTTTGTATTCAAGAGATACAAAGCCTTCCATGCAT TTTTTTGGAAA-3 ‘ (SEQ ID NO :5，在 RNA 的情形下 “T” 替 換為“U”)；其中N’為任何合適的核苷酸殘基，y為0-10的任何整數(shù)，例如0、1、2、3、4、5、6、7、 8或9。
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在本發(fā)明中，可以對(duì)本發(fā)明的干擾性RNA分子如SiRNA或shRNA進(jìn)行多種方式修 飾。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾性RNA分子中包含硫代磷酸酯鍵，即包含硫原子取代磷酸 二酯鍵的非橋氧原子，也即P-S鍵替代P-O鍵。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾性RNA分子 如siRNA或shRNA中包含的一個(gè)或多個(gè)核苷酸的2'-羥基被氟或甲基等替代。在另一個(gè) 實(shí)施方案中，所述干擾性RNA分子如siRNA或shRNA的一條或兩條鏈末端有1、2、3或4個(gè)核 苷酸被修飾。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾性RNA分子如siRNA或shRNA在正義鏈或正 義區(qū)中包含一個(gè)或多個(gè)修飾。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述干擾性RNA分子如siRNA或shRNA 在正義鏈/正義區(qū)或者反義鏈/反義區(qū)的3'端突出核苷酸被脫氧核苷酸替代。在又一個(gè) 實(shí)施方案中，所述干擾性RNA分子如siRNA或shRNA的正義鏈/正義區(qū)末端含有親脂性基 團(tuán)，例如膽固醇等。可列舉的膽固醇基團(tuán)有C16烷醇、C18烷醇或C20烷醇等。本發(fā)明的干擾性RNA分子如siRNA或shRNA還可以被化學(xué)修飾。通過化學(xué)修飾， 可以提高siRNA分子對(duì)核酸酶降解的抗性和/或改善其細(xì)胞攝取，而仍保留了降低CCP22 基因表達(dá)的能力。這樣的化學(xué)修飾的非限制性實(shí)例有硫代磷酸酯核苷間鍵(phosphoroth ioateinternucleotide linkages), 2，-脫氧核糖核苷酸(2 ‘ -deoxyribonucleotides), 2，-0-甲基核糖核苷酸(2 ‘ -Ο-methylribonucleotides)，2，-脫氧-2，-氟核糖核 苷酸(2 ‘ -deoxy-2 ‘ -fluororibonucleotides)，4，-硫代核糖核苷酸(4 ‘ -thio ribonucleotides)，2，-O-三氟甲基核苷酸(2 ‘ -0-trif luoromethyl nucleotides), 2，_0_ 乙基三氟甲氧基核苷酸(2 , -O-ethyl-trifluoromethoxy nucleotides)， 2，-O-二氟甲氧基乙氧基核苷酸(2 ' O-difluoromethoxy-ethoxy nucleotides,“ 通用堿基"核苷酸，“無環(huán)"核苷酸，5-C-甲基核苷酸，2’ -脫氧-2’ -氟阿拉伯糖基 (2' -deoxy-2‘ -fluoroarabino, FANA)摻入。這些化學(xué)修飾在siNA構(gòu)建體(例如基于 RNA的siNA構(gòu)建體)中的應(yīng)用仍能保留它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的RNAi活性，同時(shí)能極大地提高其血 清穩(wěn)定性。在又一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA分子或shRNA分子在形成的雙鏈體內(nèi)包含 一個(gè)或多個(gè)核苷酸或非核苷酸突出。術(shù)語(yǔ)“突出”指的是本發(fā)明的siRNA分子或shRNA形 成的雙鏈體在兩條鏈之間并不能堿基配對(duì)的核苷酸序列末端部分?！巴怀觥笨梢晕挥谌我庖?條或兩條鏈的3’端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述siRNA分子或shRNA形成的雙鏈體包含選自 下述的核苷酸突出端2' -O-甲基、2'-脫氧、2'-脫氧-2'-氟，2'-脫氧-2'-氟 阿拉伯糖(FANA)，4'-硫、2' -O-三氟甲基、2' -O-乙基-三氟甲氧基，2‘ -O-二氟甲氧 基_乙氧基、通用堿基或5-C-甲基核苷酸。為了提高siRNA或shRNA的穩(wěn)定性或者CCP22靶基因mRNA區(qū)域與siRNA的特異 性相互作用，還可以通過化學(xué)合成在siRNA兩條鏈的3’末端或者shRNA內(nèi)正義區(qū)和反義區(qū) 的3 ’末端延伸兩個(gè)核苷酸-dTdT或UU。在一些實(shí)施方案中，可以通過化學(xué)衍生物或者標(biāo)記 分子對(duì)合成的siRNA/shRNA改性，以便提高其生理學(xué)穩(wěn)定性和追蹤其在細(xì)胞內(nèi)的分布。本發(fā)明的siRNA或shRNA可以通過多種方式獲得，包括例如化學(xué)合成、由載體表達(dá) 或者酶促合成等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的siRNA或shRNA是通過化學(xué)合成而得到的。有關(guān)化 學(xué)合成和修飾核酸的方法，在本領(lǐng)域中有眾多的教導(dǎo)，這些都在所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員 的能力范圍內(nèi)。
在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的SiRNA或shRNA是通過酶促合成的。有關(guān)酶促合 成核酸的方法，在本領(lǐng)域中也有眾多的教導(dǎo)，這些也都在所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的能力 范圍內(nèi)。本發(fā)明的干擾性RNA如SiRNA或shRNA可通過多種合適的方法引入到靶細(xì)胞、組 織、器官或受試者內(nèi)，例如脂質(zhì)體轉(zhuǎn)導(dǎo)法、電穿孔、顯微注射、微粒轟擊等。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的干擾性RNA分子如SiRNA或shRNA在細(xì)胞、組織或 生物體內(nèi)產(chǎn)生。因此，本發(fā)明還提供了核酸構(gòu)建體，其中包含編碼本發(fā)明干擾性RNA的核苷酸序 列，以及與之可操作連接的、驅(qū)動(dòng)該核苷酸序列在導(dǎo)入到宿主細(xì)胞內(nèi)后表達(dá)所述干擾性RNA 的表達(dá)元件。在本文中，凡提及第一核酸序列與第二核酸序列“可操作連接”時(shí)，指的是該 第一核酸序列與第二核酸序列相對(duì)處于發(fā)揮其各自預(yù)定功能的位置，例如啟動(dòng)子序列能夠 啟動(dòng)與其“可操作連接”的編碼序列在靶細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)。所述表達(dá)元件包括例如啟 動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、增強(qiáng)子等。可選用的啟動(dòng)子有多種，包括例如RNA聚合酶II啟動(dòng)子(pol II)、RNA聚合酶III啟動(dòng)子(pol III)，比如人源和鼠源的TO啟動(dòng)子和人Hl啟動(dòng)子、持家 基因啟動(dòng)子如肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子等。為實(shí)現(xiàn)特異性表達(dá)，還可以選用一些特異性表達(dá)啟動(dòng)子， 例如時(shí)間特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子、細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子、發(fā)育階段特異性啟動(dòng) 子等，其實(shí)例有珠蛋白啟動(dòng)子等。還可選用一些可誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，例如四環(huán)素可誘導(dǎo)型啟動(dòng) 子。病毒啟動(dòng)子在本發(fā)明中也可應(yīng)用，例如SV40早期啟動(dòng)子、逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子、巨細(xì)胞病 毒立即早期啟動(dòng)子等。終止子和增強(qiáng)子的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的，例如終止 子可選用5' -TTTTT-3 ‘。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼本發(fā)明shRNA的核苷酸序列。 所述shRNA能夠形成siRNA。優(yōu)選地，所述siRNA的雙鏈體部分長(zhǎng)度不超過30bp，例如長(zhǎng) 度為 12-30bp、15-28bp、18-25bp 或 20-23bp。例如，所述 siRNA 的長(zhǎng)度可以是 12bp、13bp、 14bp、15bp、16bp、17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、 29bp 或 30bp。在本發(fā)明中，還可以各從兩個(gè)分開的啟動(dòng)子表達(dá)siRNA的兩條鏈即正義鏈和反義 鏈，然后組合成雙鏈siRNA。因此，在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼本發(fā) 明siRNA正義鏈的核苷酸序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼本發(fā) 明siRNA反義鏈的核苷酸序列。在又一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體包含編碼本發(fā) 明siRNA兩條鏈的核苷酸序列，它們各在分開的啟動(dòng)子控制下表達(dá)。本發(fā)明還提供表達(dá)載體，其中包含本發(fā)明上述的核酸構(gòu)建體。有多種合適的載體可用于表達(dá)本發(fā)明的干擾性RNA，如siRNA或shRNA，包括例如 質(zhì)粒載體、病毒載體如腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體等。這樣的載體中不僅包 含用于啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還包含增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)或其它表達(dá)調(diào)節(jié)序列。本發(fā)明的載 體可以作為裸質(zhì)粒DNA、與轉(zhuǎn)染劑或靶遞送材料相復(fù)合的復(fù)合物或者作為重組病毒載體而 遞送到宿主細(xì)胞內(nèi)。表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所知曉的，并可參考一 些因素進(jìn)行，例如待轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞的狀態(tài)或類型、期望的siRNA表達(dá)時(shí)間和水平等。本發(fā)明的表達(dá)載體可通過轉(zhuǎn)染載體遞送到靶細(xì)胞或宿主細(xì)胞內(nèi)，所述轉(zhuǎn)染載體例 如有脂質(zhì)體、水凝膠、生物粘合性微球等(Akhtar etal. , Trends Cell Bio. 1992，2，139)。本發(fā)明的表達(dá)載體還可通過磷酸鈣沉淀法、直接顯微注射法、電穿孔法、微粒轟擊法等遞送 到靶細(xì)胞或宿主細(xì)胞內(nèi)。這樣的方法也是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。本發(fā)明還提供了一種宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá) 載體。在一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞。在另一些實(shí)施方案中，所述宿主細(xì)胞 是真核細(xì)胞，例如原代細(xì)胞培養(yǎng)物、細(xì)胞系、酵母、完整器官或生物體的細(xì)胞群等。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，其中包含藥學(xué)有效量的本發(fā)明的干擾性 RNA (如siRNA或shRNA)、核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和/或宿主細(xì)胞以及藥學(xué)上可接受的載體。 “藥學(xué)有效量”指的是在導(dǎo)入受試者后可降低CCP22mRNA水平至期望程度或者可實(shí)現(xiàn)期望效 果的藥物劑量。藥學(xué)有效量可由治療醫(yī)師根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，并可能取決于多種因素，例如給藥 途徑、制劑性質(zhì)、疾病狀況、受試者的體格、體重、年齡、性別等。本發(fā)明的藥物組合物可以配制成固體、半固體、液體或氣體的形式，例如可以是片 劑、膠囊、粉劑、顆粒、油膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑等。這類制劑的制備方法是本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員所知曉的。本發(fā)明的藥物組合物可通過合適的給藥途徑施用給待處理/治療的細(xì)胞、組織、 器官和/或受試者，例如可以將藥物組合物配制成合適的制劑形式而通過口服、口含、胃腸 外、皮下、眼內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、經(jīng)鼻、經(jīng)直腸等方式給藥。為了促進(jìn)本發(fā)明的干擾性RNA分子、核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體遞送到目的細(xì)胞、組 織、器官或受試者內(nèi)，可以將所述干擾性RNA分子、核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體與運(yùn)載體或賦性 劑相混合?？蓱?yīng)用的運(yùn)載體或賦性劑包括鹽水、緩沖液(如乙酸緩沖液、檸檬酸緩沖液、磷 酸緩沖液等)、氨基酸、抗壞血酸、醇類、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)體、甘油、山梨醇等。本領(lǐng)域熟知制備這 樣的制劑的方法，例如可參見Remington' sPharmaceutical Sciences。本發(fā)明還提供了一種降低受試者體內(nèi)CCP22表達(dá)水平和/或活性的方法，其包括 對(duì)有此需要的受試者、細(xì)胞或組織施用本發(fā)明的一種或多種干擾性RNA、核酸構(gòu)建體、表達(dá) 載體、宿主細(xì)胞或者藥物組合物，其中降低CCP22水平能取得有益效果。本發(fā)明又提供了一種預(yù)防、治療或緩解CCP22基因相關(guān)疾病或病癥、例如腫瘤的 方法，其包括對(duì)有此需要的個(gè)體施用本發(fā)明的一種或多種干擾性RNA、核酸構(gòu)建體、表達(dá)載 體、宿主細(xì)胞或者藥物組合物，在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“受試者”和“個(gè)體”可以互換使用，指的是在其中降低CCP22水 平能取得有益效果的任何動(dòng)物，優(yōu)選脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物，其實(shí)例有人、馬、牛、小鼠、大鼠等。


圖1顯示CCP22siRNA_Z的序列分析結(jié)果。圖2顯示CCP22siRNA_F的序列分析結(jié)果。圖3顯示了 siRNA表達(dá)載體pSiIencer 2. l_U6neo的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4顯示CCP22 siRNA能降低細(xì)胞中CCP22蛋白質(zhì)水平。將對(duì)照siRNA (con siRNA) 表達(dá)載體和CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞72h后，收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，用針對(duì) CCP22的抗體進(jìn)行Western blot檢測(cè)，GAPDH作為內(nèi)參。圖5顯示CCP22 siRNA可顯著抑制不同腫瘤細(xì)胞錨定依賴的生長(zhǎng)。將對(duì)照siRNA
8表達(dá)載體和CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MCF7和肝癌細(xì)胞系HepG2后，按圖中 所示不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定細(xì)胞生長(zhǎng)情況。圖6顯示CCP22 siRNA可抑制多種腫瘤細(xì)胞錨定非依賴的生長(zhǎng)能力。對(duì)照siRNA 表達(dá)載體和CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞系H460、乳腺癌細(xì)胞系ZR75-1和肝癌細(xì)胞 系!fepG2后，利用軟瓊脂實(shí)驗(yàn)觀察集落形成情況。“_” 100 μ m。圖7顯示CCP22 siRNA可升高抑癌基因pl5和p21的表達(dá)。對(duì)照siRNA表達(dá)載體 和CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞系MCF7后，收集細(xì)胞總蛋白，利用pl5和p21抗 體進(jìn)行檢測(cè)，GAPDH作為內(nèi)參。圖8顯示了 CCP22基因cDNA全序列(SEQ ID NO 1)及靶序列。
具體實(shí)施例方式下面通過具體的實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明，但是，應(yīng)當(dāng)理解為，這些實(shí)施例僅僅是 用于更詳細(xì)具體地說明之用，而不應(yīng)理解為用于以任何形式限制本發(fā)明。本部分對(duì)本發(fā)明試驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明仍然在此作盡 可能詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說明，本發(fā)明所用材料和操作 方法是本領(lǐng)域公知的。實(shí)施例1、靶向CCP22基因mRNA的siRNA的構(gòu)建(一)、方法選取的CCP22 siRNA革巴向CCP22基因cDNA(mRNA)的核心序列為 5’ ATGCATGGAAGGCTTTGTA3’ (SEQ ID NO 2)禾口 5，GAACCAATCTGCATTCTTC3’ -(SEQ ID NO 3)。UCCP22 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)siRNA靶序列篩選設(shè)計(jì)原則，結(jié)合分析人CCP22的基因序列，以Ambion公司 提供的siRNA靶序列分析設(shè)計(jì)系統(tǒng)，選擇確定2條特異性siRNA靶序列，分別命名為CCP22 siRNA-Z 和 CCP22siRNA-F。利用 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)(www. ncbi. nlm. nih. gov/blast)，對(duì)該序列進(jìn) 行Blast分析，證明選定的siRNA序列與其他已知基因沒有同源性，然后設(shè)計(jì)并合成寡核苷 酸的正義鏈和反義鏈，用于CCP22 siRNA表達(dá)載體的構(gòu)建。用于構(gòu)建CCP22 siRNA-Z的正義鏈為5 ‘ -GATCC-GAACCAATCTGCATTCTTC-TTCAAGAGAGAAGAATGCAGATTGGTTCTTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO 6),反義鏈為5 ‘ -AGCTTTTCCAAAAAAGAACCAATCTGCATTCTTCTCTCTTGAAGAAGAATGCAGATTGGTTCG-3，(SEQ ID NO 7)；用于構(gòu)建CCP22 SiRNA-F的正義鏈為5' -GATCC ATGCATGGAAGGCTTTGTA TTCAAGAGATACAAAGCCTTCCATGCAT-TTTTTTGGAAA-3' (SEQ ID NO 8),反義鏈為5' -AGCTTTTCCAAAAAA ATGTTTCGGAAGGTACGTA
TCTCTTGAATACAAAGCCTTCCATGCATG-3' (SEQ ID NO 9) 將合成的寡核苷酸片段的正義鏈和反義鏈進(jìn)行退火處理。即先將其分別溶于雙蒸 水中，等摩爾數(shù)混合后95°C加熱3min，自然降溫至37°C后，形成雙鏈的寡核苷酸。將合成的 發(fā)卡cDNA插入經(jīng)BamH I和HindIII (購(gòu)自英國(guó)Biolabs公司)雙酶切的siRNA表達(dá)載體 pSilencer2. l_U6neo (結(jié)構(gòu)參見圖3，購(gòu)自美國(guó)Ambion公司)中，構(gòu)建成CCP22siRNA重組 質(zhì)粒，并經(jīng)DNA序列分析鑒定。2、CCP22抗體的制備由于沒有商業(yè)化的抗體，我們根據(jù)推測(cè)的CCP22氨基酸序列，分別在其N端 和C端各選取一個(gè)肽段作為抗原制備抗體，這2條肽段序列分別為GEPPSIMNGYASGS和 SffTGHNCSRKRRTGF，其序列與人類基因組中其他編碼序列無同源性。由Abmart (www, ab-mart. com, cn)公司制備針對(duì)這2條肽段的兔源性多克隆抗體，獲得的抗體分別稱為 CCP22-N 和 CCP22-C。3、Western免疫印跡分析(I)SDS-PAGE電泳將變性的細(xì)胞總蛋白離心后以每孔20 μ g的總蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳；電壓 120V，約 1. 5h。(2)轉(zhuǎn)膜電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上；電壓15V，轉(zhuǎn)移約2h。(3)封閉5%脫脂奶粉(用TBST溶液配制，TBST溶液為每升水溶液中含Tris 2. 42g、NaCl 8g、Tween-20 10ml, ρΗ7· 6)室溫封閉硝酸纖維素膜Ih或4°C封閉過夜。(4) 一抗結(jié)合在硝酸纖維素膜上，加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的一抗 (兔抗人CCP22抗體，購(gòu)自上海Ab-Mart公司；兔抗人GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司)，室溫輕搖lh，TBST溶液洗膜3次，每次7min。(5) 二抗結(jié)合在硝酸纖維素膜上，加入用5%脫脂奶粉按一定比例稀釋的辣根過 氧化物酶偶聯(lián)的IgG (羊抗兔IgG抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司)，室溫輕搖lh， TBST溶液洗膜3次，每次7min。(6)顯影按公司提供的說明(美國(guó)Pierce公司)，用化學(xué)發(fā)光法顯色5min，壓片顯影。(二)結(jié)果1、CCP22siRNA抑制CCP22基因表達(dá)的鑒定CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA-F表達(dá)載體經(jīng)DNA序列分析測(cè)定表明，插入到載體中的靶向CCP22的cDNA序列完全正確(參見圖1和圖2)，表 明已重組成功。將CCP22 siRNA表達(dá)載體和相應(yīng)空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，收集細(xì)胞裂解物，利用 CCP22-N或CCP22-C抗體進(jìn)行Western blot，檢測(cè)CCP22 siRNA抑制CCP22基因表達(dá)的效 果(參見圖4，其中代表性地顯示CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞后能抑制CCP22蛋 白水平的表達(dá))。實(shí)施例2、CCP22 siRNA抑制體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞錨定依賴的生長(zhǎng)(一)方法用MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定CCP22 siRNA對(duì)不同腫瘤細(xì)胞系錨定依賴生長(zhǎng)的影響，步驟如下 用0. 25%胰酶(購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司)消化腫瘤細(xì)胞，包括乳腺癌細(xì)胞株MCF7和
10肝癌細(xì)胞株ifepG2(均購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù))。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，稀釋至合適的濃度，將0. Iml 細(xì)胞液放入96孔板中，使每孔中的細(xì)胞數(shù)約為200個(gè)。按實(shí)施例1中所述方法將CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染這些腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)期間，每天每孔加入20 μ 1 MTT(購(gòu)自美國(guó) Amerreso公司，50mg/100ml)，結(jié)合4_6h后，吸出上清，每孔加入0. Iml 10% SDS，充分裂解 后在490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以O(shè)D值代表細(xì)胞相對(duì)生長(zhǎng)速率。(二)結(jié)果結(jié)果表明，CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA_F均能不同程度地抑制上述腫瘤細(xì)胞 的生長(zhǎng)(參見圖5，其代表性地顯示CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞株MCF7和肝癌 細(xì)胞株ifepG2后能抑制這些細(xì)胞的生長(zhǎng))。實(shí)施例3、CCP22 siRNA抑制多種腫瘤細(xì)胞的錨定不依賴牛長(zhǎng)(一)方法用軟瓊脂實(shí)驗(yàn)測(cè)定CCP22 siRNA對(duì)腫瘤細(xì)胞錨定不依賴生長(zhǎng)的影響。首先，按實(shí)施 例1中所述方法將對(duì)照siRNA表達(dá)載體和CCP22siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人腫瘤細(xì)胞株。這些腫 瘤細(xì)胞株包括肺癌細(xì)胞株H460、乳腺癌細(xì)胞株MCF7和肝癌細(xì)胞株H印G2。然后采用60mm2 細(xì)胞培養(yǎng)皿，在培養(yǎng)皿中加入3ml含0.7%瓊脂的DMEM培養(yǎng)基(購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公 司)，凝固后在其上加入3ml含上述5，000個(gè)腫瘤細(xì)胞和0. 25%瓊脂的DMEM培養(yǎng)基，每組 細(xì)胞設(shè)3個(gè)平行樣，培養(yǎng)3周后在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)每組細(xì)胞的集落形成數(shù)。(二)結(jié)果結(jié)果表明，無論集落大小，還是集落數(shù)量，CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA_F均能 抑制上述所有腫瘤細(xì)胞的集落形成(參見圖6，其代表性地顯示CCP22 siRNA重組表達(dá)載體 轉(zhuǎn)染人肺癌細(xì)胞株H460、乳腺癌細(xì)胞株MCF7和肝癌細(xì)胞系H印G2后能抑制這些細(xì)胞的錨定 不依賴生長(zhǎng)能力。實(shí)施例4、CCP22 siRNA能增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞中抑癌基因的表達(dá)(一)方法將5X IO5個(gè)細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后將對(duì)照siRNA表達(dá)載體和CCP22 siRNA表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MCF7。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，收集細(xì)胞，按實(shí)施例1中的方法分別用pl5 抗體(鼠抗人pl5抗體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司)、p21抗體(兔抗人p21抗 體，購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司)等進(jìn)行Western免疫印跡分析，檢測(cè)上述MCF7細(xì) 胞中相應(yīng)蛋白的表達(dá)情況。(二)結(jié)果圖7結(jié)果表明，CCP22 siRNA-Z和CCP22 siRNA-F在人乳腺癌MCF7細(xì)胞中促進(jìn)了 抑癌基因P15和p21的表達(dá)。由此看來，通過CCP22 siRNA可以降低乳腺癌、肝癌、肺癌等腫瘤細(xì)胞中CCP22基 因的表達(dá)，并達(dá)到抑制這些腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。本文中引用的多篇出版物，包括專利文件和非專利文件等，它們的公開內(nèi)容均通 過引用而全文并入本文中。
權(quán)利要求
一種干擾性RNA，其中包含與CCP22mRNA內(nèi)的靶區(qū)域互補(bǔ)的第一核苷酸序列。
2.權(quán)利要求1的干擾性RNA，其能夠通過RNA干擾作用而降低或消除CCP22基因mRNA 的表達(dá)。
3.權(quán)利要求1的干擾性RNA，其中所述第一核苷酸序列與CCP22mRNA5’或3’非編碼 序列內(nèi)的區(qū)域或者編碼序列內(nèi)的區(qū)域互補(bǔ)。
4.權(quán)利要求1的干擾性RNA，其中所述區(qū)域的長(zhǎng)度為15-30nt，優(yōu)選18_25nt，更優(yōu)選 20-23nt，最優(yōu)選所述區(qū)域選自下述組中ATGCATGGAAGGCTTTGTA (SEQ ID N0:2)，和 GAACCAATCTGCATTCTTC (SEQ ID NO 3)。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的干擾性RNA，其是siRNA(shortinterferingRNA)。
6.權(quán)利要求5的多核苷酸，其長(zhǎng)度為15-30bp，優(yōu)選18-25bp，更優(yōu)選20_23bp。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)的干擾性RNA，其是shRNA(shorthairpinRNA)，在同一核酸 鏈中還包含與所述第一核苷酸序列反向互補(bǔ)的第二核苷酸序列以及位于其間的連接序列。
8.權(quán)利要求7的干擾性RNA，其具有選自下述的核苷酸序列 CCP22 siRNA-Z 5' -NxGAACCAATCTGCATTCTTC TTCAAGAGA GAAGAATGCAGATTGGTTC TTTTTTGGAAA-3‘(SEQ ID NO :4，在RNA的情形下“T”替換為“U”)；其中N為任何合適的核苷酸殘基，χ為0-10的任何整數(shù)，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或 9 ；或或者 CCP22siRNA-F 5 ‘ -N， y ATGCATGGAAGGCTTTGTATTCAAGAGA TACAAAGCCTTCCATGCAT TTTTTTGGAAA-3 ‘ (SEQ ID NO :5，在 RNA 的情形下 “T” 替換為 “U” )；其中N’為任何合適的核苷酸殘基，y為0-10的任何整數(shù)，例如0、1、2、3、4、5、6、7、8或9。
9.權(quán)利要求6或7的干擾性RNA，其中包含一個(gè)或多個(gè)修飾。
10.權(quán)利要求8的干擾性RNA，其中所述修飾選自下述組中硫代磷酸酯鍵替代磷酸酯 鍵、一個(gè)或多個(gè)核苷酸的2'-羥基被氟或甲基等替代、5’和/或3'端突出的一個(gè)或多個(gè) 核苷酸被脫氧核苷酸替代、siRNA的正義鏈末端含有親脂性基團(tuán)，例如膽固醇等，或者包含 一個(gè)或多個(gè)核苷酸或非核苷酸突出。
11.權(quán)利要求9的干擾性RNA，其中所述膽固醇基團(tuán)選自C16烷醇、C18烷醇或C20烷 醇等。
12.權(quán)利要求9的干擾性RNA，其在兩條鏈的3’末端包含兩個(gè)延伸的核苷酸dTdT或UU。
13.一種核酸構(gòu)建體，其中包含權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的多核苷酸以及與之可操作連 接的表達(dá)元件，例如啟動(dòng)子、終止子和可選的增強(qiáng)子等。
14.一種表達(dá)載體，其中包含權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體。
15.權(quán)利要求14的表達(dá)載體，其是質(zhì)?；虿《拘问?。
16.權(quán)利要求15的表達(dá)載體，其是腺病毒表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒表達(dá)載體或慢病毒表 達(dá)載體。
17.一種宿主細(xì)胞，其中轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染了權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建體或者權(quán)利要求14-16 中任一項(xiàng)的表達(dá)載體。
18.一種藥物組合物，其中包含至少一種權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的干擾性RNA、權(quán)利要 求13的核酸構(gòu)建體、權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的表達(dá)載體和/或權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞， 以及藥學(xué)可接受載體。
19.權(quán)利要求18的藥物組合物，其是適于靜脈內(nèi)、經(jīng)皮、口服、或經(jīng)鼻途徑給藥的形式。
20.一種降低細(xì)胞、組織、器官或受試者體內(nèi)CCP22活性水平的方法，其中包括以有效 降低CCP22活性水平的量將權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的干擾性RNA、權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建 體、權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的表達(dá)載體、權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，或者權(quán)利要求18或19 的藥物組合物與所述細(xì)胞、組織或器官接觸，或者施用給所述受試者。
21.一種預(yù)防、治療或緩解患有與CCP22水平過高有關(guān)的疾病、例如腫瘤的方法，其包 括對(duì)有此需要的受試者施用權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的干擾性RNA、權(quán)利要求13的核酸構(gòu)建 體、權(quán)利要求14-16中任一項(xiàng)的表達(dá)載體、權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，或者權(quán)利要求18或19 的藥物組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及靶向CCP22(complement control protein 22，CCP22)的干擾性RNA(interfering RNA)、含有該干擾性RNA的藥物組合物及其醫(yī)藥用途。
文檔編號(hào)A61P35/00GK101962642SQ201010213739
公開日2011年2月2日 申請(qǐng)日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月30日
發(fā)明者嚴(yán)景華, 馮帆, 葉棋濃, 徐小潔, 朱翠, 王凌雪, 韓聚強(qiáng) 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所