專利名稱：黃芩甙鋅配合物藥物用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及黃芩甙鋅配合物在藥物制備中的用途。
黃芩甙鋅分子式ZnC23O13H20(1-3.5)H2O(簡稱BA-Zn)，分子量為587-632，結(jié)構(gòu)式見

圖1和《發(fā)明專利申請公開說明書》(申請日990419，申請?zhí)?9114810.X，
公開日000216，公開號1244533A)。黃芩甙鋅是由黃芩甙(簡稱BA)與二價鋅離子(Zn2+)形成的配合物。黃芩甙是中藥黃芩的主要有效成份，黃芩在中藥學上主要用于清熱解毒抗菌消炎。國內(nèi)外對黃芩的研究已有較完整的理論基礎，并積累了豐富的臨床經(jīng)驗。實驗證明金屬鋅離子本身具有修復粘膜組織的作用。因此，黃芩甙與金屬鋅離子結(jié)合形成絡合物后不但加強了抗菌消炎的作用，而且還具有修復粘膜組織促進潰瘍愈合等新的藥理作用。黃芩甙鋅主要用于治療各種潰瘍性疾病，如口腔潰瘍、鼻粘膜炎、宮頸炎、宮頸糜爛等。另據(jù)《生物化學雜志》1991年7卷6期“黃芩甙及其銅、鋅配合物對超氧自由基的排除作用”、《鐵道醫(yī)學》1989年17卷6期“黃芩甙鋅絡合物對小鼠免疫功能影響的初步觀察”、《西北藥學雜志》1994年9卷4期“黃芩甙鋅配合物與黃芩甙對免疫反應的初步比較研究”文獻報道，黃芩甙與Zn2+結(jié)合后，具有以下幾方面的藥理作用(1)對超氧自由基具有消除作用；(2)黃芩甙鋅不僅有抗I型變態(tài)反應作用，而且對小鼠非特異性免疫和細胞免疫系統(tǒng)功能有較好的增強作用；(3)黃芩甙鋅對脂加氧酶具有抑制作用；(4)黃芩甙鋅具有抗炎抗變態(tài)反應作用。
本發(fā)明目的在于提供黃芩甙鋅配合物在制備預防和治療艾滋病的藥物中的應用。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)黃芩甙鋅具有抗艾滋病病毒HIV-1活性。
本發(fā)明的實驗結(jié)果表明黃芩甙鋅的細胞毒性低于黃芩甙，對HIV-1的治療指數(shù)(TI)高于黃芩甙。BA-Zn對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體的抑制作用與BA的相似，BA-Zn的TI值約為4，BA的TI值約為1。BA與BA-Zn均能抑制HIV-1感染細胞與正常細胞間的融合，BA-Zn的效果好于BA。融合阻斷的結(jié)果和化合物在不同時間段對HIV-1誘導C8166合胞體形成的抑制作用的結(jié)果均提示BA與BA-Zn抗HIV-1活性作用的機制可能為阻斷HIV與細胞的結(jié)合或融合。
圖1黃芩甙鋅的化學結(jié)構(gòu)式。
圖2黃芩甙BA對C8166細胞的毒性作用。
圖3黃芩甙鋅BA-Zn對C8166細胞的毒性作用。
圖4黃芩甙BA對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體的抑制作用。
圖5黃芩甙鋅BA-Zn對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體的抑制作用。
圖6不同濃度的黃芩甙BA在不同時間段的抗HIV-1活性。
圖7不同濃度的黃芩甙鋅BA-Zn在不同時間段的抗HIV-1活性。
以下為黃芩甙鋅抗HIV-1的活性實驗。
試驗材料1.試劑和溶液(1)試劑MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)；SDS(sodium dodecyl sulfate)購自Sigma公司；L-谷氨酰胺、HEPES和2-巰基乙醇購自Bio-Rad公司；DMF(N，N-dimethyl formamine)為上海試劑一廠產(chǎn)品。
(2)RPMI-1640完全培養(yǎng)基，含有10％新生小牛血清(自制)，2mM谷氨酰胺，10mM HEPES，50μM 2-巰基乙醇，100000IU青霉素，100μg/ml硫酸鏈霉素。
2.黃芩甙和黃芩甙鋅黃芩甙鋅(baicalin-Zn，簡稱BA-Zn)和黃芩甙(Baicalin，簡稱BA)昆明貴金屬研究所提供。BA-Zn溶于DMSO中，4℃保存，儲存濃度為25mg/ml。BA溶于RPMI-1640培養(yǎng)基中，過濾除菌。4℃保存，貯存液濃度為2.5mg/ml。
3.細胞和病毒C8166是T淋巴細胞系，為HIV敏感宿主細胞，由中國科學院動物研究所保存和提供。C8166HIV-1IIIB/H9均由英國Medical Researchcouncil，AIDS Reagent Project惠贈。按常規(guī)方法制備HIV-IIIB，滴定并計算出病毒的TCID50。病毒儲存液分裝后，置70℃保存。細胞和病毒均按常規(guī)方法凍存和復蘇。
試驗方法和結(jié)果實施例1黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn對C8166的細胞毒性檢測實驗3×106/ml C8166細胞懸液100μl與不同濃度的BA或BA-Zn化合物溶液混合，同時設置不含化合物的對照孔，37℃ 5％CO2培養(yǎng)三天，采用MTT法檢測細胞毒性。490nm EL×800ELISA儀測定OD值。計算化合物對細胞的CC50(50％Cytotoxic Concentration，即引起50％細胞死亡的化合物濃度)。
黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn配合物對C8166的細胞毒性作用見圖2和圖3，黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn配合物對C8166的細胞毒性的CC50分別為20μg/ml和92.2μg/ml。實驗結(jié)果表明黃芩甙鋅BA-Zn的細胞毒性比黃芩甙BA低。
實施例2黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn對HIV-1誘導C8816合胞體形成的抑制實驗將6×105/ml C8166細胞50μl與不同濃度的BA或BA-Zn化合物溶液混合，加入50μl HIV-1稀釋上清，M.O.I為0.0099，同時設置不含化合物的對照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)三天，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體(五個視野)。計算化合物的EC50(50％Effective Concentration，即化合物抑制50％合胞體形成的濃度)。計算化合物的TI(TherapeuticIndex，即選擇指數(shù)，其值等于CC50/EC50)。
表1列出了多次實驗中BA和BA-Zn對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體的抑制作用的EC50。圖4和圖5分別顯示了不同濃度的黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn抑制HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體的量效關系。實驗結(jié)果表明，BA-Zn抗HIV活性的作用效果與BA相似，但由于BA-Zn的細胞毒性比BA低，因此BA-Zn的治療指數(shù)較BA高。BA和BA-Zn的治療指數(shù)分別為約1和4。
表1.BA和BA-Zn體外對HIV-1誘導的合胞體形成的抑制作用
實施例3黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn化合物對HIV-1慢性感染H9細胞與正常C8166細胞間融合的阻斷作用實驗將3×105/ml正常C8166細胞50ul與1×105/ml H9/HIV-1 IIIB感染細胞50ul同時加入到100ul含有不同濃度的BA或BA-Zn化合物溶液中，同時設置不含化合物的對照孔，HIV-1慢性感染H9細胞與正常C8166細胞比為1∶3，37℃，5％CO2培養(yǎng)4h，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)HIV-1慢性感染H9細胞與正常C8166細胞間融合形成的合胞體數(shù)(五個視野)。計算化合物的EC50(50％ Effective Concentration，即化合物抑制50％HIV-1慢性感染H9細胞與正常C8166細胞間融合形成合胞體的濃度)。
表2列出了多次實驗中BA和BA-Zn對H9/HIV-1慢性感染細胞與正常C8166細胞間融合的阻斷作用的EC50。結(jié)果表明，BA和BA-Zn抗HIV活性的作用機制可能是阻斷病毒與細胞的結(jié)合和融合，BA-Zn阻斷病毒與細胞的結(jié)合和融合的作用較BA強。表2.BA和BA-Zn化合物對H9/HIV-1慢性感染細胞與正常C8166細胞間融合的阻斷作用
實施例4BA或BA-Zn化合物在不同時間段對HIV-1誘導C8166合胞體形成的抑制實驗在HIV-1感染前1小時、感染同時和感染后1小時，分別加入不同濃度的BA或BA-Zn化合物溶液，同時設置不含化合物的對照孔，37℃，5％CO2培養(yǎng)3d，倒置顯微鏡下(100×)計數(shù)合胞體(五個視野)。計算化合物的EC50(50％Effective Concentration，即化合物抑制50％合胞體形成的濃度)。
為了研究黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn配合物的作用機制，以黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn處理HIV-1感染細胞前后的抗HIV活性。表3列出了BA和BA-Zn在不同時間段抑制HIV-1誘導C8166合胞體形成的EC50值。圖6和圖7分別顯示了不同濃度的BA和BA-Zn在不同時間段抗HIV-1活性的量效關系。結(jié)果表明HIV-1感染前和感染同時處理病毒感染宿主細胞比感染后加入化合物效果好。進一步表明黃芩甙BA和黃芩甙鋅BA-Zn配合物抗HIV活性的作用機制可能是阻斷病毒進入細胞，黃芩甙鋅BA-Zn配合物阻斷病毒與細胞的結(jié)合和融合的作用比黃芩甙BA配合物強。表3.不同時段化合物對HIV-1誘導C8166細胞形成合胞體的抑制作用
權(quán)利要求
1.配合物黃芩甙鋅ZnC23O13H20(1-3.5)H2O在制備預防和治療艾滋病的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了配合物黃芩甙鋅在制備預防和治療艾滋病的藥物中的應用，其結(jié)構(gòu)式見圖1，分子式為ZnC
文檔編號A61P31/00GK1462619SQ0212250
公開日2003年12月24日 申請日期2002年5月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月28日
發(fā)明者普紹平, 鄭永唐, 王玉天, 王茜, 劉偉平, 劉祝東, 高文桂, 余堯 申請人:昆明貴金屬研究所, 中國科學院昆明動物研究所