專利名稱：一種改良的人α型干擾素復(fù)合體的生產(chǎn)方法和用途的制作方法
本文涉及一種改良的重組復(fù)合型生物藥，該藥物主要由改良的α型干擾素+聚合物組成，屬于生物制品生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域。本發(fā)明的藥物主要用于丙型肝炎的治療。
丙型肝炎是常見的嚴(yán)重的病毒感染性肝臟疾病，丙型肝炎病毒感染是全球性的。在美國(guó)估計(jì)有2.7百萬人受感染，其中部分病人已發(fā)展為慢性肝炎，肝硬化和肝癌。在中國(guó)則有更多的感染病人。該病的嚴(yán)重性在于(1)大多數(shù)的感染者會(huì)發(fā)展為慢性肝炎，肝硬化和肝癌；(2)目前沒有特別有效的治療藥物。
目前治療丙型肝炎較為有效的藥物主要是α型干擾素，但目前生產(chǎn)和使用的α型干擾素在人體內(nèi)停留的時(shí)間比較短，會(huì)很快被機(jī)體清除。因此為確保療效，需要大劑量，長(zhǎng)時(shí)間地給藥。這往往導(dǎo)致病人因無法忍受藥物的副作用而停止治療。因此研發(fā)一種能較長(zhǎng)時(shí)間不被機(jī)體清除，而又活性高的α型干擾素，就能減少給藥劑量，減低給藥頻率，從而減輕α型干擾素給機(jī)體帶來的副作用，而得到較好的治療效果。此種藥物正是廣大醫(yī)生和病人所渴望的?；谶@種目的，本人經(jīng)過對(duì)現(xiàn)有的α型干擾素進(jìn)行大范圍的改造，篩選，從而發(fā)現(xiàn)了一種復(fù)合型的藥物改良的α型干擾素+聚合物。它們能較長(zhǎng)時(shí)間地置留在體內(nèi)而不被機(jī)體所清除，并具有活性高，能有效地清除丙型肝炎病毒的優(yōu)點(diǎn)。改良型α型干擾素的制備1.人白細(xì)胞文庫(kù)cDNA的建立人白細(xì)胞文庫(kù)含有100個(gè)18-40歲成人的白細(xì)胞混合物。這些人均為HIV，HBV，HCV陰性的正常人。
2.改良的干擾素PCR引物的設(shè)計(jì)5′-3′引物ACAAACCCACAGCCTGGGTA5′-3′引物ASTCATTCCTIACTTCTTATACTTTC3.以人白細(xì)胞cDNA文庫(kù)為底物，用上述改良的干擾素PCR引物，在下列條件下擴(kuò)增α型干擾素●10x擴(kuò)增緩沖液10ul●dNTP 1.25/L 16ul●引物A(溶于5ul水)●引物AS(溶于5ul水)●人白細(xì)胞cDNA2ug以上材料加滅菌雙蒸水至總體積100ul。
*10x擴(kuò)增緩沖液的配制●500mM/LKCI●100mM/L Tris.CH，PH8.3●15mM MgCl2●0.1％明膠
*擴(kuò)增條件為· 95℃4Mins · 72℃10Mins所得PCR擴(kuò)增物長(zhǎng)度經(jīng)1.8％凝膠電泳分析為486bp4.將486bp長(zhǎng)的PCR擴(kuò)增物插入pT7表達(dá)載體(該表達(dá)載體T7 promoter+ATG+6xHis+EK recognition site+GAT CCA ACC CTT PCR AGGG+Ampicillin resistance gene)CTA GGT TGG GA Product TTCCC1)新鮮PCR產(chǎn)物2ul鹽溶液 1ulpT7載體1ulT4 ligase 1ul共計(jì) 5ul將上述溶液混合后置于常溫下5分鐘。
2)從以上混合溶液中取2ul，加入30ul One Shot Chemically Competent E-Coli中輕輕混合。將其放置于冰上30分鐘，然后進(jìn)行42℃水浴30秒。再加入SOC溶液250ul，放入37℃振蕩培養(yǎng)箱2小時(shí)。
3)取100ul上述培養(yǎng)物均勻涂于含50-100ug/ml ampicillin的LB+Agarose培養(yǎng)皿表面，放入37℃ C CO2培養(yǎng)箱12小時(shí)后，可見大約100個(gè)該細(xì)菌。
4)抽提質(zhì)粒DNA取10個(gè)上述細(xì)菌，分別放入10個(gè)含5ml LB培養(yǎng)液+100ug/ml ampicillin的15ml試管內(nèi)，在37℃下振蕩培養(yǎng)12小時(shí)，然后4000rpm離心5分鐘，所得沉淀物即為所需的細(xì)菌。
按照QIAGEN公司QIAprep Miniprep Handbook說明書抽提質(zhì)粒DNA，具體步驟如下A.將10個(gè)試管中所收集的細(xì)菌分別溶解于250ul的P1溶液中并轉(zhuǎn)入1.5ml離心試管內(nèi)。
B.分別加入250ul P2溶液與其混合，再加入350ul N3溶液，混合后14000rpm離心10分鐘。
C.將上清液分別加入離心柱。
D.12000rpm離心30秒.
E.加入0.5ml B溶液到離心柱12000rpm離心30秒。
F.加入0.75ml PE溶液到離心柱12000rpm離心3分鐘。
G.將離心柱分別轉(zhuǎn)入清潔1.5ml試管，再加入50ul dd H2O 12000rpm離心1分鐘。
所得的離心液即為純化的含有插入改良干擾素的質(zhì)粒。
5.應(yīng)用引物5′-＞3′GATCCAACCCTTCAAACCC測(cè)序插入改良的α-干擾素我們選擇的核苷系列為1 gatccaaccc ttcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag61 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac ttgactttgg atttccccag121 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc181 cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc241 ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata301 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg361 aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg421 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt481 ataagaagta aggaatga其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如下DPTLQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRLDFGFPQEEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETLLDKFYTELYQ QLNDLEACVI GGVGVTETPL MNEDSILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS FSLSTNLQES IRSKE6.含有改良型α型干擾素在BL細(xì)菌中表達(dá)將步驟5經(jīng)測(cè)序確定的質(zhì)粒10ng DNA加入30ul BL細(xì)胞輕輕混合，冰上放置30分鐘后置于42℃水箱內(nèi)30秒。增加250ul 50C培養(yǎng)液37℃震蕩(200rpm)培養(yǎng)2小時(shí)，增加10ml含100ug/ml ampicillin的LB培養(yǎng)液37℃培養(yǎng)12小時(shí)。
將10ml上述培養(yǎng)液加入4L含100ul/ml ampicillin的LB培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)OD600為0.5時(shí)加入IPTG至終濃度為0.5mM。繼續(xù)培養(yǎng)約12小時(shí)，離心4000rpm(4℃)5分鐘，收集細(xì)菌，儲(chǔ)存于-80℃冰箱。
7.改良型α型干擾素蛋白質(zhì)的純化1)將上述收集的細(xì)菌(儲(chǔ)存于-80℃冰箱)拿出置于冰上15分鐘后溶于裂解溶液(50mMNaH2PO4，PH8.0；300mM NaCl；10m Mimidazole)2)增加Lysozyme 1mg/ml，放于冰上30分鐘。
3)聲波裂解細(xì)菌在4℃條件下，用200-300W聲波裂解(Sonicator)裂解細(xì)菌10秒，重復(fù)6次。
4)在4℃條件下，離心10000g，30分鐘。除去細(xì)胞碎片，保留上清液。
5)每4ml上清液加入1ml 50％Ni-NTA凝膠(QIAGEN公司生產(chǎn))混合，在4℃條件下攪拌30分鐘。
6)離心8000rpm 5分鐘，除去上清，加入清洗溶液(50mM NaH2PO4PH8.0；300mM NaCl；20mM Imidazole)，混合后離心8000rpm 5分鐘。
7)除去上清，加入1ml稀釋溶液(50mM NaH2PO4PH8.0；300mM NaCl；250mM imidazole)，離心8000rpm 5分鐘，收集上清液，重復(fù)4次，共得4ml上清液，加入Enterokinase50u后置于37℃水浴30分鐘即制得改良的α-型干擾素。
8)將上述4ml溶液加入透析袋，在4L透析液(0.01M Sodium borate，PH9；0.1％SDS)中透析24小時(shí)，更新透析液，重復(fù)透析三次。
8.聚合物與改良的α-型干擾素分子結(jié)合將改良的α-型干擾素加入Polyoxyethylated glycerol(POG)-ester glurate-N-hydrooxysucciminide，該物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)為 其中n≈38時(shí)，分子重量為5000dalton。我們選擇的分子重量范圍為350-30000dalton。
將制備純化的改良α-型干擾素按1mg/ml濃度溶于(0.01M Sodium borate，PH9；0.1％SDS)溶液，在22℃條件下，按照2克POG-ester glurate-N-hydrooxysucciminide比1克純化的改良α-型干擾素的比例混合后攪拌45分鐘，然后調(diào)節(jié)PH值到5.0[實(shí)例二]改良的α-型干擾素+聚合物藥物半衰期的測(cè)定選用重量在200克至250克之間的雄性大白鼠(SD)共計(jì)40只，每20只為一組，分為兩組。
第一組尾靜脈注射改良α-型干擾素+聚合物(100ug/kg)后，在選擇性時(shí)間(1小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)，200小時(shí))收集血樣本放入含有肝素的試管中，通過離心收集血小板，血小板的體積通過秤重而決定。存放于-70℃冰箱內(nèi)直至使用。
第二組尾靜脈注射市場(chǎng)使用的α-型干擾素50萬單位后，在選擇性時(shí)間(1小時(shí)，24小時(shí)，48小時(shí)，200小時(shí))收集血樣本放入含有肝素的試管中，通過離心收集血小板，血小板的體積通過秤重而決定。存放于-70℃冰箱內(nèi)直至使用。
使用前將血小板放于三倍體積的血小板稀釋液中測(cè)定藥物濃度，詳細(xì)方法見參考文獻(xiàn)(1)Le Maire et al，Anal，Biochem 1986，154，525-535；(2)Le Maire et al，Anal biochem 1980106，12-21。試驗(yàn)結(jié)果分析方法詳細(xì)說明見參考文獻(xiàn)Dunne，A 1985，20，269-275。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表普通α-型干擾素，改良α-型干擾素及改良α-型干擾素+聚合物的半衰期對(duì)照藥物類別 藥物半衰期普通α-型干擾素30分鐘改良α-型干擾素30分鐘改良α-型干擾素+聚合物350 60分鐘改良α-型干擾素+聚合物500 100分鐘改良α-型干擾素+聚合物1000 120分鐘改良α-型干擾素+聚合物2000 200分鐘改良α-型干擾素+聚合物3000 260分鐘改良α-型干擾素+聚合物4000 350分鐘改良α-型干擾素+聚合物5000 400分鐘改良α-型干擾素+聚合物10000460分鐘改良α-型干擾素+聚合物20000500分鐘改良α-型干擾素+聚合物30000520分鐘[實(shí)例三]改良α-型干擾素+聚合物治療慢性丙型肝炎感染大白鼠的效果研究選擇200只慢性感染丙型肝炎病毒的雄性大白鼠(重量約100-150克)，隨機(jī)分成四組，每組50只。
第一組，每周一次靜脈注射安慰劑，連續(xù)治療6個(gè)月后收集大白鼠全血。
第二組，每周一次靜脈注射1.5ug/kg改良α-型干擾素+聚合物(5000 dalton)，連續(xù)治療6個(gè)月后收集大白鼠全血。
第三組，每周一次靜脈注射3ug/kg改良α-型干擾素+聚合物(5000dalton)，連續(xù)治療6個(gè)月后收集大白鼠全血。
第四組，每周三次靜脈注射3萬unit/kg自然α-型干擾素(市場(chǎng)銷售)，連續(xù)治療6個(gè)月后收集大白鼠全血。
丙型肝炎病毒的檢測(cè)1.引物的設(shè)計(jì)A5’-GTC TAG CCA TGG CGT TAG TA-3’AS5’-CTC CCG GGG CAC TCG CAA GC-3’該設(shè)計(jì)的引物能放大220bp丙型肝炎病毒片段而不放大大白鼠的核酸片段。2.血液RNA的分離每個(gè)標(biāo)本取全血0.25ml與一清潔消毒1.5ml試管內(nèi)，加入0.75ml Trizol LS試劑(GIBCO BRL公司，Cat NO.10296)。充分混合后在室溫下放置15分鐘，增加0.2ml氯仿，使其充分混合后，于4℃條件下離心14000rpm 15分鐘。轉(zhuǎn)移上清與一清潔消毒1.5ml試管內(nèi)，加入等量的Isopropyl alcohol后在室溫下放置15分鐘，于4℃條件下離心14000rpm 15分鐘。
除去上清，加入0.75ml 100％乙醇，0.25ml DEPC水。于-20℃條件下放置30分鐘后，離心8000rpm 8分鐘。除去上清，沉淀干燥后即為總體RNA。最后將RNA溶于20ul水中，放入-80℃冰箱保存。3.cDNA的合成cDNA的含成參照GIBCO BRL公司cDNA Synthesis System(Cat No.18267013)第一鏈cDNA的合成在DEPC消毒處理的1.5ml試管內(nèi)加入5x First Strand Buffer10ul10mM dNTP Mix 25ulOligo(dT)12-185ul總RNA 10ul(5ug)0.1M DTT 5ulDEPC處理的水 15ulM-MLV RT 2.5ul最后反應(yīng)的組成為50mM Tris-HCL(PH8.3)75mM KCL3mM MgCl2500uM each dATP，dCTP，dGTP&dTTP50ug/ml Oligo(dT)12-18100ug/ml RNA10000units/mlM-MLV RT將上述反應(yīng)物放入37℃水浴約1-2小時(shí)后放入-20℃冰箱4.PCRPCR參照GIBCO BRL公司說明書(Cat No.10342-020)10xPCR buffer200mM Tris-HCL(PH8.4)500mM KCLPCR.各組成成分如下總體積為100ul10x PCR buffer10ul10mM dNTP 2ul50mM MgCl23ul引物A 100pmol引物AS100pmolTaq DNA酶(5u/ul) 0.5ulcDNA 1-20ul(50ng-200ng)消毒ddH2o至 100ul于Perkin Elmer公司生產(chǎn)的GeneAmp PCR Systrm9600機(jī)器上，按照下列條件擴(kuò)增94℃ 5分鐘 72℃ 10分鐘 延伸最后于-20℃冰箱保存。6.分析PCR產(chǎn)物agarose膠電泳陽(yáng)性對(duì)照陰性對(duì)照Ethidium bromide染色UV光下觀察7.結(jié)果分組HCVPositive Negative第一組(安慰劑對(duì)照) 50只 -(50只)第二組(1.5ug/kg)40只 10只(50只)第三組(3ug/kg) 36只 14只(50只)第四組(2萬單位/kg) 48只 2只(50只)序列表《110》耿東進(jìn)《120》一種改良的人α型干擾素復(fù)合體的生產(chǎn)方法和用途《140》02110839.0《141》2002-02-09《160》1《210》1《211》498《212》DNA《213》一種改良的人α型干擾素《400》11 gatccaaccc ttcaaaccca cagcctgggt agcaggagga ccttgatgct cctggcacag61 atgaggagaa tctctctttt ctcctgcttg aaggacagac ttgactttgg atttccccag121 gaggagtttg gcaaccagtt ccaaaaggct gaaaccatcc ctgtcctcca tgagatgatc181 cagcagatct tcaatctctt cagcacaaag gactcatctg ctgcttggga tgagaccctc241 ctagacaaat tctacactga actctaccag cagctgaatg acctggaagc ctgtgtgata301 cagggggtgg gggtgacaga gactcccctg atgaaggagg actccattct ggctgtgagg361 aaatacttcc aaagaatcac tctctatctg aaagagaaga aatacagccc ttgtgcctgg421 gaggttgtca gagcagaaat catgagatct ttttctttgt caacaaactt gcaagaaagt481 ataagaagta aggaatga《400》2gat cca acc ctt caa acc cac agc ctg ggt agc agg agg acc ttg atgAsp Pro The Leu Gln The His Ser Leu Gly Ser Arg Arg The Leu Met1 5 10 15ctc ctg gca cag atg agg aga atc tct ctt ttc tcc tgc ttg aag gacLeu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30aga ctt gac ttt gga ttt ccc cag gag gag ttt ggc aac cag ttc caaArg Leu Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45aag gct gaa acc atc cct gtc ctc cat gag atg atc cag cag atc ttcLys Ala Glu The Ile Pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60aat ctc ttc agc aca aag gac tca tct gct gct tgg gat gag acc ctcAsh Leu Phe Ser The Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu The Leu65 70 75 80cta gac aaa ttc tac act gaa ctc tac cag cag ctg aat gac ctg gaaleu Asp lys Phe Tyr The Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp leu Glu81 85 90 95gcc tgt gtg ata cag ggg gtg ggg gtg aca gag act ccc ctg atg aagAla Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Val The Glu The Pro Leu Met Asn100 105 110gag gac tcc att ctg gct gtg agg aaa tac ttc caa aga atc act ctcGlu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile The Leu115 120 125tat ctg aaa gag aag aaa tac agc cct tgt gcc tgg gag gtt gtc agaTyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140gca gaa atc atg aga tct ttt tct ttg tca aca aac ttg caa gaa agtAla Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser The Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160ata aga agt aag gaa tgaIle Arg Ser Lys Glu ***165《211》165《212》PRT《213》一種改良的人α型干擾素《400》3Asp Pro The Leu Gln The His Ser Leu Gly Ser Arg Arg The Leu Met15 10 15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Leu Phe Ser Cys Leu Lys Asp20 25 30Arg Leu Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Asn Gln Phe Gln35 40 45Lys Ala Glu The Ile pro Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Ile Phe50 55 60Asn Leu Phe Ser The Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu The Leu65 70 75 80leu Asp lys Phe Tyr The Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp leu Glu81 85 90 95Ala Cys Val Ile Gly Gly Val Gly Val The Glu The Pro Leu Met Asn100 105 110Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile The Leu115 120 125Tyr Leu Lys Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val Arg130 135 140Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Leu Ser The Asn Leu Gln Glu Ser145 150 155 160Ile Arg Ser Lys Glu165《211》165《212》PRT《213》一種改良的人α型干擾素
權(quán)利要求
一種改良的重組復(fù)合型生物藥，其特征為
1.該藥物主要由改良的α型干擾素+聚合物組成；
2.在第一項(xiàng)中所提及的改良的α型干擾素，其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如下DPTLQTHSLG SRRTLMLLAQ MRRISLFSCL KDRLDFGFPQEEFGNQFQKA ETIPVLHEMI QQIFNLFSTK DSSAAWDETLLDKFYTELYQ QLNDLEACVI GGVGVTETPL MNEDSILAVRKYFQRITLYL KEKKYSPCAW EVVRAEIMRS FSLSTNLQES IRSKE其中以下氨基酸的設(shè)計(jì)在原有α型干擾素氨基酸的基礎(chǔ)上加以改良第一位由Cys(半胱氨酸)改良為Asp(天冬氨酸)，第二位由Pro(脯氨酸)改良為Asp(天冬氨酸)，第三位由Leu(亮氨酸)改良為Thr(蘇氨酸)，第四位由Pro(脯氨酸)改良為L(zhǎng)eu(亮氨酸)，第三十四位由His(組氨酸)改良為L(zhǎng)eu(亮氨酸)，第一百二十一位由Leu(亮氨酸)改良為Ile(異亮氨酸)；
3.第一項(xiàng)中所說的聚合物的分子式為 分子重量范圍為500-30000daltons其中n值不同，分子重量不同，例如n≈38，分子重量為5000。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種重組的復(fù)合型生物藥(改良的重組α型干擾素復(fù)合體)及其制備方法和用途；屬于生物制品生產(chǎn)方法及用途領(lǐng)域。此生物藥是由人α型干擾素基因經(jīng)人工改造，并將含其cDNA序列表達(dá)的載體在細(xì)菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)純化后附著于一聚合物而形成。該藥物的組合為改良的α型干擾素+聚合物。本發(fā)明的藥物主要用于丙型肝炎的治療。與現(xiàn)有的α型干擾素基因工程藥物相比，具有活性及穩(wěn)定性更高，副作用更小及不易被機(jī)體清除等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)A61P31/00GK1436570SQ02110839
公開日2003年8月20日 申請(qǐng)日期2002年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2002年2月9日
發(fā)明者耿東進(jìn) 申請(qǐng)人:耿東進(jìn)