專利名稱：用于治療炎性疾病的雙歧桿菌的制作方法
導(dǎo)論本發(fā)明涉及在食品和藥品中有各種應(yīng)用的益生菌雙歧桿菌菌株。更具體地說，本發(fā)明涉及能夠有利地修飾并且結(jié)果導(dǎo)致減輕炎性疾病的可觀察到的癥狀的益生菌雙歧桿菌菌株。
消費者越來越想知道保持其環(huán)境，健康和營養(yǎng)所必需要的物質(zhì)。因此，科學(xué)研究已經(jīng)集中于食物，緊張狀態(tài)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實踐(例如抗生素和放射治療)在危害人的健康中所起的作用。特別是，群體動力學(xué)向老年社會的變化增加了由缺陷或危害植物區(qū)系引起的疾病的發(fā)生例如胃腸道(GIT)感染，便秘，過敏的腸道癥(IBS)，炎癥性腸病(IBD)-節(jié)段性回腸炎和潰瘍的結(jié)腸炎，食物過敏，抗生素誘導(dǎo)的腹瀉，心血管疾病和某些癌癥(例如直腸癌)。
已經(jīng)將益生菌定義為通過改善胃腸道微生物的平衡而有利地影響宿主的活的微生物食品補劑，或更廣泛地定義為活的微生物，在保證固有的基本營養(yǎng)時攝取一定數(shù)量的所說微生物對健康產(chǎn)生影響。通常各種微生物，特別是乳桿菌和鏈球菌的種類的混合物已經(jīng)用于發(fā)酵的日消耗產(chǎn)品中以有利于健康。
近年來，功能食品(以有目的的方式影響身體的功能以便對生理和營養(yǎng)產(chǎn)生有利影響的食品)，特別是(嗜酸-雙岐)酸奶的商業(yè)制造和銷售已經(jīng)從日本適宜的建立的小環(huán)境市場擴散到合算的和擴大的歐盟。現(xiàn)在許多來源于人的益生菌的細菌在商業(yè)上被開發(fā)利用(例如嗜酸乳桿菌LA-1)，許多消費者，消費機構(gòu)和科學(xué)委員會的成員懷疑這樣的產(chǎn)品并且他們要求公布益生菌。因此日用食品工業(yè)在巨大的壓力下需要驗證這些新的益生菌食品。
已經(jīng)建立了用于選擇潛在的有效的益生菌微生物的標(biāo)準概括如下人來源，非病原體行為，對技術(shù)處理的抗性(即在釋放載體中的存活率和活性)，對胃酸性和膽堿性的抗性，胃表皮組織的吸附，形成GIT集落的能力，抗微生物物質(zhì)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力，影響代謝活性(例如膽固醇同化，乳糖酶活性，維生素的產(chǎn)生)的能力(Huis in′t Veld J，Shortt C.益生菌微生物的選擇標(biāo)準。在Leeds，A.R.Rowland，I.R.版，腸論壇和健康-過去，現(xiàn)在和將來。倫敦皇家醫(yī)學(xué)協(xié)會出版社，199619-26)。
雙歧桿菌是在形成集落的微生物菌群中存在的幾個主要的可培養(yǎng)的細菌之一。
現(xiàn)在還沒有完全闡明直腸中內(nèi)源性雙歧桿菌的功能。但是認識到與用配方制劑喂養(yǎng)的嬰兒相比只有喂母乳的嬰兒降低了腹瀉的危險。這些嬰兒具有更大量的直腸雙歧桿菌的事實部分解釋了觀察到的對健康的益處，因為大量的非病原體雙歧桿菌侵占GIT的可獲得的小場所可以幫助阻止細菌的感染。節(jié)段性回腸炎的發(fā)病據(jù)認為與直腸微生物群落有關(guān)(Targan，S.和Shanahan，F(xiàn).炎癥性腸病從實驗臺到病床，Williams和Wilkins 1994)。近來已經(jīng)發(fā)現(xiàn)患有活性節(jié)段性回腸炎的患者其糞便中可回收的雙歧桿菌明顯低于健康的個體。所觀察到的雙歧桿菌數(shù)量的減少與β-D-半乳糖苷酶的產(chǎn)生和活性的水平的降低直接相關(guān)(Favier，C.等人Dig.Dis.Sci.1997，42817-822)。
β-D-半乳糖苷酶是由雙歧桿菌產(chǎn)生的酶。這些結(jié)果支持了在其他研究中提出雙歧桿菌菌株在維持平衡的健康的腸道微生物菌群中起著重要的作用的建議。
據(jù)認為雙歧桿菌是益生菌，因為它們是在保證基本營養(yǎng)時被攝取足夠量時對健康有影響的活生物體。許多攝取的雙歧桿菌必須達到腸道的作用的位點才能發(fā)揮益生菌作用。已經(jīng)建議了每克腸道內(nèi)含物中約106-107的活的雙歧桿菌的基本水平(Bouhnik，Y.，Lait199373241-247)。文獻報道顯示在成人和嬰兒中完成的體內(nèi)研究表明一些雙歧桿菌菌株能夠通過胃腸道的傳代而存活。在能忍受酸和膽汁鹽的不同的雙歧桿菌菌株的能力之間已經(jīng)觀察到顯著的不同，表明存活是用于選擇潛在的益生菌菌株的重要的標(biāo)準。
雙歧桿菌的攝取可以改善胃腸道的運輸。
再者，關(guān)于人的間接的證據(jù)證實通過雙歧桿菌發(fā)酵消耗的奶導(dǎo)致某些糞便酶例如用于將原致癌物轉(zhuǎn)變?yōu)橹掳┪镔|(zhì)的β-D-半乳糖苷酶的水平的減低(Bouhnik Y.等人，歐洲臨床營養(yǎng)雜志199650269-273)。當(dāng)個體攝取由長雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌發(fā)酵的奶時也降低了糞便產(chǎn)生的腐敗代謝物例如p-甲酚，吲哚和氨(Takiguchi，R.等人，Bifidus-Flores，F(xiàn)ructus et Semina 1996；9135-140)。
已經(jīng)報道了抗微生物活性與雙歧桿菌有關(guān)。也已經(jīng)證實了雙歧桿菌調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的各種參數(shù)。
已經(jīng)報道通過給受試動物喂食乳酸細菌制劑降低了IL-10缺陷的小鼠的粘膜炎癥(Madsen，K.等人胃腸道1997；112A1030)。在大鼠上完成的進一步的研究已經(jīng)證實除了顯著減低腸管癌癥的發(fā)生和腫瘤存在的數(shù)量(singh，J.等人致癌作用1997；18833-841)，攝取雙歧桿菌可以抑制在腸道中形成畸變的腺管病灶(早期發(fā)生損傷)(kulkarni，N.和Reddy，B.實驗生物醫(yī)學(xué)協(xié)會年報1994；207278-283)。
對營養(yǎng)和治療和一般來說對健康具有特定的、有利的影響的益生菌菌株一直以來都在進行研究。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到的雙歧桿菌菌株，在由人口服所述菌株之后具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。
優(yōu)選地當(dāng)導(dǎo)入到包括與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞和免疫系統(tǒng)細胞的一個系統(tǒng)時雙歧桿菌菌株實現(xiàn)免疫學(xué)標(biāo)記的變化。優(yōu)選地與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞是表皮細胞。優(yōu)選的是免疫學(xué)標(biāo)記是細胞因子，尤其是TNFα。
在一個優(yōu)選的實施方案中，與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞和免疫系統(tǒng)細胞的來源匹配。
與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞是胃腸道，呼吸道或泌尿生殖道來源的。
本發(fā)明還提供了從切下交洗滌過的人的胃腸道分離到的在由人口服之后具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用的長嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium longum infantis)菌株。
由人口服之后雙歧桿菌菌株具有顯著的抗炎性作用。
優(yōu)選的是，從切下并洗滌過的人的胃腸道分離雙歧桿菌菌株，所述的胃腸道能夠抗擊炎癥性腸病，在生理濃度的人膽汁和人胃液存在下保持所述的能力。通過測量在幾個并發(fā)的免疫缺陷受體小鼠(SCID)中誘導(dǎo)的消瘦疾病的逆轉(zhuǎn)測量抗擊炎癥性腸病的作用的能力，所述的小鼠已經(jīng)用純化的CD4+，CD45RBhighT細胞給藥。
通過將本發(fā)明的一個或多個長嬰兒雙歧桿菌菌株單獨或與唾液乳桿菌菌株結(jié)合給藥之后，測量IL-10缺陷小鼠(IL-10+129 Svex菌株)中結(jié)腸炎癥的降低也可以測量長嬰兒雙歧桿菌菌株抗炎癥性腸病的作用的能力。
白細胞介素10(IL-10)是抑制巨噬細胞/單核細胞，T輔助1(Th1)細胞，和天然殺傷細胞的效應(yīng)子功能的重要調(diào)節(jié)細胞因子。另外，IL-10擴大了B細胞的增殖和分化。缺失了IL-10基因的鼠模型自發(fā)發(fā)展為炎癥性腸病和胃腸道腫瘤。在這些疾病狀態(tài)的病理發(fā)展過程中已經(jīng)涉及了胃腸道菌群，因為沒有微生物的動物不產(chǎn)生疾病。
優(yōu)選的是，所述雙歧桿菌菌株對廣譜革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌具有抑制作用。
優(yōu)選的是，所述雙歧桿菌菌株顯示廣譜的抗細菌包括鏈球菌，假單胞菌，大腸桿菌和芽孢桿菌種類的活性。
在特定的方面，本發(fā)明提供了長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624或其突變體或其變異體。
長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624于1999年1月13日保藏于國立工業(yè)和海洋細菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏號為NCIMB 41003。
在一個實施方案中該突變體是經(jīng)過遺傳修飾的突變體。
在一個實施方案中，變異體是長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624的天然存在的變異體。
所述雙歧桿菌菌株是活細胞形式的。或者雙歧桿菌菌株是非活細胞形式的。
本發(fā)明還提供了從本發(fā)明的雙歧桿菌菌株獲得的抗微生物制劑，所述試劑是其他生物體的拮抗劑。
在進一步的方面，本發(fā)明提供了包括本發(fā)明的雙歧桿菌菌株的制劑。
該制劑包括兩個或多個雙歧桿菌菌株。
該制劑進一步包括唾液乳桿菌菌株。
唾液乳桿菌菌株可以是活細胞或非活細胞形式。
唾液乳桿菌菌株優(yōu)選的是從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到，在人口服之后唾液乳桿菌具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能。優(yōu)選的是唾液乳桿菌菌是從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到，所述的胃腸道抑制廣譜的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性微生物。
在優(yōu)選的實施方案中唾液乳桿菌分泌具有抗微生物活性的產(chǎn)物到無細胞的上清液，所述的活性僅僅是通過生長細胞產(chǎn)生并且由蛋白酶K和鏈霉蛋白酶E破壞，在生理濃度的人膽汁和人胃液存在下保持了所述菌株和其分泌的產(chǎn)物的抑制作用。
這樣的唾液乳桿菌公開于WO98/35014。
理想的是，唾液乳桿菌菌株是唾液乳桿菌菌株UCC118或其突變體或變異體。突變體是遺傳修飾的變異體。變異體是天然存在的唾液乳桿菌變異體。
唾液乳桿菌菌株UCC118于1996年11月27日保藏于NCIMB，保藏號為NCIMB 40829。
優(yōu)選的是，該制劑包括可攝食載體?？蓴z食載體是藥物學(xué)可接受的載體例如膠囊，片劑或粉劑。
可攝食載體是食品例如發(fā)酵乳，酸乳酪，凍酸乳酪，奶粉，濃縮奶，軟質(zhì)奶酪，布丁或飲料。
該制劑包括蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酸/谷氨酰胺，脂，碳水化合物，維生素，礦物質(zhì)和/或微量元素的蛋白質(zhì)和/或肽。
在一個實施方案中雙歧桿菌以每克輸送系統(tǒng)大于106cfu存在。
在另一個實施方案中，該制劑包括佐劑。
該制劑包括細菌成分。該制劑另外包括藥物成分。該制劑也可以包括生物學(xué)化合物。
該制劑可以是口服免疫接種形式。
本發(fā)明進一步提供了用于食品中的雙歧桿菌菌株或其制劑。
在另一個方面，本發(fā)明提供了用作為藥物的雙歧桿菌菌株或其制劑。
所述菌株或制劑可用于預(yù)防和/或治療不希望的炎性活動。
所述菌株或制劑可用于預(yù)防和/或治療不希望的胃腸道炎性活動，例如炎癥性腸病例如節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎，過敏性腸綜合癥，囊炎(pouchifis)或傳染病后結(jié)腸炎。
不希望的炎性活動可能是由于癌癥引起的。
另外，所述菌株或制劑可用于預(yù)防和/或治療胃腸道癌癥。
該菌株或制劑可用于預(yù)防癌癥。進一步，該菌株或制劑可用于預(yù)防和/或治療全身性疾病例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。
該菌株或制劑可用于預(yù)防和/或治療由于不希望的炎性活動產(chǎn)生的自身性紊亂。
該菌株或制劑可用于預(yù)防和/或治療由于不希望的炎性活動產(chǎn)生的腹瀉疾病，例如與腹瀉相關(guān)的艱難梭菌，與腹瀉相關(guān)的輪狀病毒或傳染病后腹瀉。
附圖簡述

圖1是在實施例2中描述的長嬰兒雙歧桿菌菌株35612的cfu/ml對時間的圖；圖2是在實施例2中描述的長嬰兒雙歧桿菌菌株35624的cfu/ml對時間的圖；圖3是對于實施例5中描述的以菌株UCC35612給藥的5個SCID小鼠(1-5)，重量變化百分數(shù)對時間(天)的圖；圖4是對于實施例5中描述的以菌株UCC35624給藥的5個SCID小鼠(1-5)，重量變化百分數(shù)對時間(天)的圖；圖5是對于實施例5中描述的以唾液乳桿菌菌株UCC118和UCC35612結(jié)合給藥的小鼠(6-10)，重量變化百分數(shù)對時間(天)的圖；圖6是對于實施例5中描述的以唾液乳桿菌菌株UCC118和UCC35624結(jié)合給藥的小鼠(6-10)，重量變化百分數(shù)對時間(天)的圖；圖7是對于實施例5中描述的以唾液乳桿菌菌株UCC118和UCC35612結(jié)合給藥的小鼠(11-15)，重量變化百分數(shù)對時間(天)的圖；圖8是對于實施例5中描述的以唾液乳桿菌菌株UCC118和UCC35624結(jié)合給藥的小鼠(11-15)，重量變化百分數(shù)對時間(天)的圖9是如實施例7描述的在PBMCs和長嬰兒雙歧桿菌存在下在患者和對照樣品中的TNFα的條狀圖；圖10是如實施例7描述的顯示表皮細胞，PBMCs和長嬰兒雙歧桿菌的共培養(yǎng)物中TNFα和IL-8水平的條狀圖。對照代表只有表皮細胞和PBMCs時的共培養(yǎng)物；圖11是如實施例8描述的健康人志愿者(n＝18)攝取長嬰兒雙歧桿菌三周之后外周血細胞因子水平的條狀圖；圖12是如實施例8描述的健康人志愿者(n＝18)攝取長嬰兒雙歧桿菌菌后血清TNFα和IL-1RA水平的條狀圖；圖13是如實施例9描述的長嬰兒雙歧桿菌和MRS對照的無細胞用盡的的培養(yǎng)物上清液中TNFα水平的條狀圖；圖14是在用長嬰兒雙歧桿菌治療之后SCID小鼠下部腸道的示意圖。
圖15是未治療的SCID小鼠的下部腸道的示意圖。
發(fā)明詳述我們已經(jīng)分離了能夠有利地修飾和導(dǎo)致減輕可觀察到的炎性紊亂的癥狀的益生菌菌株。這些菌株和由其制備的制劑可用于各種各樣的食物和藥物以用于抗擊炎性紊亂的作用。
利用益生菌菌株實施體內(nèi)和體外研究。發(fā)現(xiàn)進食含有長嬰兒雙歧桿菌UCC35624的酸奶的人顯示全身的IL-8水平顯著降低。因此該菌株具有治療各種炎性紊亂的潛在的應(yīng)用，特別是如果與現(xiàn)在的抗炎性治療劑，如非甾醇類抗炎性藥物(NSAIDs)或Infliximab結(jié)合時。
還檢測了攝取了長嬰兒雙歧桿菌的SCID小鼠。該試驗顯著減弱了炎性活動，同時攝取長嬰兒雙歧桿菌的小鼠恢復(fù)了固體大便，而對照小鼠患有腹瀉。該抗腹瀉的作用與本發(fā)明的抗炎性活動有關(guān)，可能由cAMP調(diào)節(jié)介導(dǎo)的。
還未知是否需要完整的細菌發(fā)揮抗炎性作用或是否可以單獨使用本發(fā)明的各個活性成分。已經(jīng)鑒別了某些細菌菌株的促炎成分。由脂多糖(LPS)介導(dǎo)革蘭氏陰性細菌的促炎作用。單獨的LPS誘導(dǎo)了促炎網(wǎng)，部分地是由于結(jié)合到單核細胞的CD14受體的LPS。推測益生菌細菌的成分由于整個細胞的作用具有抗炎性作用。在這些成分的分離時引入了藥品級操作。
長嬰兒雙歧桿菌UCC35624的一般使用是活細胞形式。但是，也可以延伸到非活細胞例如含有由長嬰兒雙歧桿菌UCC35624表達的有用因子的滅活培養(yǎng)物或組合物。這包括熱滅活的微生物或通過接觸改變的pH或加壓而滅活的微生物。由于非活細胞產(chǎn)品制劑更簡單，易于將細胞摻入到藥物，其儲存條件比活細胞更不受限制。酪蛋白乳桿菌YIT9018提供了將熱滅活的細胞用于治療和/或阻止腫瘤生長的方法的有效應(yīng)用的實例，如在美國專利US4347240中描述的。
根據(jù)下面的實施例將更清楚地了解本發(fā)明。
實施例1益生菌細菌的分離在重建性的手術(shù)過程中獲得的人G.I.T.的闌尾以及大腸和小腸切片用于篩選益生菌菌株，如表1所示。
表1用于篩選益生菌存在的胃腸道組織樣品樣品 位置A 回腸B 直腸C 回腸-盲腸區(qū)D 闌尾E 闌尾F 回腸G 回腸-盲腸區(qū)在手術(shù)之后立即將所有的樣品儲存在-80℃的無菌容器。將冷凍組織解凍，稱重和置于胱氨酸化的1/4強度的林格斯溶液。緩慢地振蕩各個樣品以便去除松散地吸附的微生物(稱為洗滌“W”)。在轉(zhuǎn)移到第二個體積的林格斯溶液之后，將樣品渦旋7分鐘以去除緊密吸附的細菌(稱為樣品“S”)。為了分離組織包埋的細菌，樣品A，B和C也在Braum攪拌機中勻漿化(稱為勻漿物“H”)。將該溶液連續(xù)稀釋(來自于洗滌樣品的10-1稀釋液稱為W1，10-2稀釋液標(biāo)記為W2，相同標(biāo)記系統(tǒng)用于“S”和“H”樣品)并且(100微升)涂布在下面的瓊脂培養(yǎng)基上RCM(加強的梭菌培養(yǎng)基)和用乙酸調(diào)到pH5.5的RCM；TPY(胰蛋白酶，胨和酵母提取物)，Chevalier，P等人(1990)，應(yīng)用細菌雜志68，619-624)，MRS(de Mann，Rogosa和Sharpe)；ROG(Rogosa的乙酸鹽培養(yǎng)基(SL))；LLA(Lapiere的肝臟乳糖瓊脂)；BHI(腦心灌注瓊脂)；LBS(乳桿菌選擇性瓊脂)和TSAYE(補充了0.6％酵母提取物的胰胨黃豆瓊脂)。所有的瓊脂培養(yǎng)基均由Oxoid化學(xué)試劑公司提供，除了TPY瓊脂。利用產(chǎn)生CO2的試劑盒(Anaerocult A，Merck)將平皿在厭氧罐(BBL，Oxoid)中37℃培養(yǎng)2-5大。
將革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性的桿狀或分叉狀的/多形的細菌分離物在完全的非選擇性培養(yǎng)基(TPY)上劃線培養(yǎng)以進行純化。除非另有說明，將分離物在TPY培養(yǎng)基上，37℃，厭氧條件下常規(guī)培養(yǎng)。將推定的雙歧桿菌儲存于40％的甘油并且儲存于-20℃和-80℃。
發(fā)酵終產(chǎn)物的分析利用LKB Bromma，aminex HPX-87H高效液相層析(HPLC)柱檢測碳水化合物葡萄糖和隨后的有機酸終產(chǎn)物的代謝。將該柱保持在60℃，流速為0.6ml/分鐘(常壓)。所使用的HPLC緩沖液是0.01N硫酸。在分析之前，利用10mM檸檬酸鹽，10mM葡萄糖，20mM乳酸鹽和10mM乙酸鹽作為標(biāo)準校正該柱。將培養(yǎng)物在修飾的MRS肉湯中37℃，厭氧繁殖1-2天。在14000g離心10分鐘之后，用HPLC緩沖液以1∶5稀釋上清液。以HPLC分析200微升。所有的上清液設(shè)置2個重復(fù)進行分析。
生化和生理特性測定細菌分離物的生化和生理特性以幫助鑒定。分析了硝酸鹽的還原，吲哚的形成和β-半乳糖苷酶活性的表達。測定15℃和45℃時的生長和明膠上的蛋白酶活性。還評價了石蕊牛奶中的菌株的生長特性。
抗生素敏感性分析利用“盤(disc)敏感性”分析測定分離物的抗生素敏感性狀況。在合適的肉湯培養(yǎng)基中將培養(yǎng)物生長24-48小時，涂布(100微升)在瓊脂培養(yǎng)上，將含有已知濃度的抗生素的盤置于瓊脂上。在厭氧條件下，37℃檢測菌株對抗生素的敏感性1-2天。如果看到1毫米或更大的抑制圈認為該菌株是敏感。
雙歧桿菌菌種的分離篩選來自于人G.I.T.的7個組織切片中屬于雙歧桿菌屬的菌株的存在。組織樣品之間有如下所述一些差異。樣品A(回腸)和E(闌尾)具有最低計數(shù)，每克組織分離了約102個細胞。比較而言，從其他樣品回收了大于103cfu/克組織的細菌。在“洗滌”和“樣品”步驟過程中分離到類似量的細菌，在F(回腸)和G(回腸-盲腸)的“樣品”溶液中計數(shù)稍微高一些。在篩選的緊密吸附的細菌(勻漿化)中，C(回腸-盲腸)是獲得顯著計數(shù)的唯一的組織切片。
在篩選一些組織切片例如C和B過程中，在系列稀釋過程中獲得的計數(shù)之間沒有直接的關(guān)系。這說明血液或組織衍生的一些生長因子在起始懸浮液中為難養(yǎng)細菌提供生長，隨后被稀釋掉。
菌株的選擇和定性從樣品中分離了約1500個過氧化氫酶陰性的細菌分離物并且根據(jù)其革蘭氏反應(yīng)，細胞大小和形態(tài)學(xué)，在15℃和45℃生長和從葡萄糖發(fā)酵獲得的終產(chǎn)物進行定性。所測試的分離物中大于60％是革蘭氏陽性，以四個，鏈狀或串排列的同型發(fā)酵球菌。18％的分離物是革蘭氏陰性桿狀和異型發(fā)酵球桿菌。
其余的分離物(22％)是優(yōu)勢的同型發(fā)酵的球桿菌。對38個菌株進行更詳細的定性-來自于G的13個分離物；來自于F的4個分離物，來自于D的8個分離物，來自于C的9個分離物，來自于B的3個分離物，來自于E的1個分離物。測試的38個分離物其硝酸鹽還原和從色氨酸產(chǎn)生吲哚都是陰性。
抗生素敏感性概況將人臨床使用的重要的抗生素用于檢測選定的雙歧桿菌的敏感性概況。所測試的雙歧桿菌對氨芐青霉素，阿莫西林，頭孢噻肟(ceftaxime)，頭孢曲松(ceftriaxone)，環(huán)丙沙星(ciprofloxacin)，頭孢拉定，利福霉素，丁胺卡那霉素，慶大霉素和氯霉素敏感。它們對奈替米星，甲氧芐啶，萘啶酸(nalidixic acid)，頭孢呋辛(cefuroxime)，萬古霉素和四環(huán)素有抗性。
實施例2抗酸性人攝取之后微生物達到的胃部宿主防御系統(tǒng)的第一條線是胃酸。影響細菌的關(guān)鍵因子是在胃液中存活。檢測長嬰兒雙歧桿菌菌株35612和35624在低pH值環(huán)境中的存活率和生長。按照常規(guī)方法在胰蛋白酶-胨-酵母提取物(TPY)培養(yǎng)基，37℃，嚴格厭氧條件下(利用Merck Anaerocult A gas pak系統(tǒng)的BBL氣體罐)培養(yǎng)12-24小時。用經(jīng)鼻胃管(Mercy醫(yī)院，Cork，愛爾蘭)吸移從健康的個體獲得人的胃液。立即以13000g離心30分鐘以除去所有的固體顆粒，通過0.45微米濾膜和0.2微米的濾膜過濾滅菌并且存儲在4℃。在實驗使用之前檢測pH和胃蛋白酶活性。利用定量的血紅蛋白測試檢測胃蛋白酶活性(Guantam，S.和R.S.de la Motte.1989，蛋白酶實用方法，第3章，R.J.Beynon和J.S.Bond，IRL出版社，牛津大學(xué)出版社；Dawson，R.M.1969，pH和緩沖液，生化研究資料，第138頁，R.M.Dawson，D.C.Elliot和K.M.Jones，Clarendon出版社，牛津大學(xué))。利用下面的測試方法調(diào)查菌株在體外低pH時的存活率(a)從新鮮的培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物收集細胞，在磷酸鹽緩沖液(pH6.5)中洗滌2次，重新懸浮于(用1N鹽酸)調(diào)到pH3.5，3.0，2.5和2.0的MRS肉湯至終濃度為約106cfu/ml。將細胞在37℃培養(yǎng)并且利用平板計數(shù)方法以5，30，60和120分鐘的間隔測量存活率。
在pH3.5菌株存活，沒有失去活性。在pH2.5在60分鐘培養(yǎng)過程降低了3個log，如圖1和2。
在胃液中雙歧桿菌菌株的存活率收集新鮮的培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物，在緩沖液(pH6.5)中洗滌2次，重新懸浮于人胃液至終濃度為約106cfu/ml。在37℃培養(yǎng)30-60分鐘檢測存活率并且利用pH1.2(未調(diào)節(jié))和pH2.0和2.5(用1N氫氧化鈉調(diào)節(jié))胃液進行試驗。
當(dāng)與pH1.2的胃液比較時pH2.0的胃液中菌株存活率增加。在30分鐘保溫之后在任一pH沒有回收到活細胞，如表2所示。
表2人胃液中雙歧桿菌的存活性*時間(分鐘)菌株 pH 0 5 30 6035612 1.2 7.560.000.000.002.0 6.276.312.880.0035624 1.2 5.964.180.000.002.0 6.336.320.000.0035652 1.2 6.163.780.000.002.0 8.458.403.450.0035648 1.2 6.000.000.000.002.0 7.896.450.000.0035687 1.2 6.680.000.000.002.0 8.758.773.340.00BO 2.0 8.418.568.428.4310 2.0 8.398.564.640.006.3 2.0 8.758.758.298.42長雙歧 6 2.0 8.158.020.000.00桿菌*以log10cfu/ml表示的存活性實施例3對膽汁的抗性在評價以乳酸細菌作為胃腸道的有益成員的效果時，認為對膽汁酸的抗性是在該有害環(huán)境中存活所需的重要的生物學(xué)菌株特性，并且另外它們不能通過產(chǎn)生毒性化合物例如脫氧膽酸(DCA)和石膽酸(LCA)侵害宿主的健康，這些化合物在許多細胞毒性現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)。
將長嬰兒雙歧桿菌菌株在補充了濃度為0.3，0.5，1.0，1.5，5.0，和7.5％(w/v)的豬膽汁(B-8631，Sigma化學(xué)制劑有限公司，Poole)的TPY瓊脂平板上劃線(Legrand-Defretin，R.等人，脂類1991；26(8)，578-583)。就膽汁鹽/膽固醇和磷脂/膽固醇比例而言豬膽汁的組分最接近人膽汁。在厭氧條件下，37℃將該平板培養(yǎng)并且在24-48小時之后記錄生長。發(fā)現(xiàn)菌株35624對膽汁有強烈的抗性且在膽汁高達55時仍生長至匯合，如表3所示。
表3在豬膽汁存在下雙歧桿菌分離物的生長％(w/v)豬膽汁菌株0.0 0.3 0.5 1.0 1.5 5.0 7.534612+- - - - - -35624++ + + + + -35652+- - - - - -35658++ + + - - -35687+- - - - - --沒有生長；+匯合生長從幾個人的膽囊獲得人膽汁，在80℃滅菌10分鐘。根據(jù)Dekker，R.R等人，層析，1991，31(11/12)，255-256的方法利用反相高效液相層析(HPLC)與脈沖安培計結(jié)合測定人膽汁的膽酸組分。加入0.3％(v/v)濃度的人膽汁。24和48小時之后檢查新鮮的劃線培養(yǎng)的培養(yǎng)物的生長。
菌株35624能夠在生理相關(guān)的人膽汁存在下(0.3％(v/v))生長。
在各種綴合的和脫綴合的膽酸存在下檢查菌株的生長。在生理條件下經(jīng)常發(fā)現(xiàn)膽酸為鈉鹽。在含有下面各種膽酸的綴合的和脫綴合的鈉鹽的TPY瓊脂中篩選生長的菌株。
(a)綴合形式甘氨膽酸(GCA)；甘氨脫氧膽酸(GDCA)；和甘氨鵝脫氧膽酸(GCDCA)；(b)脫綴合形式石膽酸(LCA)；鵝脫氧膽酸(GDCA)；脫氧膽酸(DCA)；和膽酸(CA)。對于每一膽酸使用了1，3和4mM的濃度。在24和48小時厭氧培養(yǎng)之后記錄生長。
研究了5個菌株在補充了5mMGCA和GCDCA的瓊脂培養(yǎng)基上和在補充了1mMGDCA的瓊脂培養(yǎng)基上的生長，顯示于表4。菌株35624對濃度5mM LCA(數(shù)據(jù)未顯示)有抗性，菌株35612能夠在濃度5mM CA生長，顯示于表5。在1mMCDCA存在下沒有觀察到生長(數(shù)據(jù)未顯示)。
表4在甘氨酸綴合的膽汁存在下雙歧桿菌分離物的生長
-，無生長；+匯合生長GCDCA，甘氨鵝脫氧膽酸；GDCA，甘氨脫氧膽酸；GCA，甘氨膽酸表5在未綴合膽酸(CA)存在下雙歧桿菌分離物的生長
-，沒有生長；+，匯合生長實施例4抗微生物活性通過排除由入侵性病原體形成長期菌落雙歧桿菌種類對其他細菌具有抑制作用。這樣的拮抗活性是由于在發(fā)酵過程中產(chǎn)生乙酸和乳酸(Scardovi，V，(1986)，系統(tǒng)分類細菌學(xué)的貝杰氏手冊的雙歧桿菌，第2卷，Sheath，P.H.，Main，N.S.，Sharpe，M和Holdt，J.G.，Williams和Wilkins出版社，Baltimore M.D.，p1418)。關(guān)于除了酸以外的抗微生物化合物的產(chǎn)生的報道非常少(Anand，S.K.等人，發(fā)酵乳制品1985；J.2，21-23)。細菌素和其他化合物可以影響細菌在生態(tài)學(xué)的環(huán)境中的細菌的存活并且允許它們有效地在發(fā)酵生態(tài)系統(tǒng)中占優(yōu)勢。這樣的特點對于益生菌菌株是良好的特性。
采用Tagg等人的方法(Tagg.J.R.等人細菌學(xué)綜述1976；40，722-756)測定各種雙歧桿菌菌株的抑制譜。分析無細胞上清液對廣譜革蘭氏陽性和革蘭氏陰性微生物的抑制活性。在瓊脂平板上制備各種指示劑的覆蓋層，使其干燥。將無細胞上清液的斑點(5毫升)置于播種的平板上，使其干燥，將平板培養(yǎng)過夜。
在TPY培養(yǎng)基上測試時觀測到所述菌株對各種各樣的鏈球菌，假單胞菌，大腸桿菌，芽孢桿菌種類有抑制作用?？辜賳伟玩溓蚓囊志Ω哌_4.4毫米，芽孢桿菌周圍的抑菌圈高達7.0毫米，如表6和7顯示的。但是，當(dāng)在緩沖的TPY培養(yǎng)基上進行延期測試時，沒有觀測到抗指示菌株的抑菌圈。因此，抑制作用似乎是僅由于存在雙歧桿菌產(chǎn)生的酸所致。
表6在未緩沖的培養(yǎng)基上雙歧桿菌對鏈球菌菌株的抑制作用* *所給出的值是抑菌圈的半徑，以毫米表示(產(chǎn)生者菌落的邊緣到抑菌圈邊緣的距離)
表7在未緩沖的培養(yǎng)基上雙歧桿菌對假單胞菌和芽孢桿菌菌株的抑制作用* *所給出的值是抑菌圈的半徑，以毫米表示(產(chǎn)生者菌落的邊緣到抑菌圈邊緣的距離)實施例5進行小鼠喂養(yǎng)試驗以調(diào)查唾液乳桿菌唾液亞種UCC118和長嬰兒雙歧桿菌35624減輕炎癥性腸病(IBD)癥狀的能力背景近來通過遺傳工程或免疫手段產(chǎn)生了許多小鼠模型以研究IBD的機理。這些模型之一涉及從正常小鼠轉(zhuǎn)移脾臟或淋巴結(jié)衍生的CD4+T淋巴細胞到嚴重聯(lián)合免疫缺陷受體小鼠(SCID)。已經(jīng)證實接受了純化的CD4+，CD45RBhighT細胞的小鼠發(fā)展為特征是慢性腸道炎癥的消瘦疾病，而這種癥狀在結(jié)腸中更嚴重。在該研究中，用CD4+CD45RBhigh注射對照組SCID，小鼠發(fā)展為漸進性消瘦疾病包括顯示出彎腰駝背，外皮豎毛，腹瀉，體重下降和肉眼及顯微鏡下結(jié)腸損傷。建立了喂養(yǎng)試驗，以UCC118和菌株35624(也稱之為UCC35624)喂食以測定是否該模型的IBD的癥狀被改變。
細菌菌株從成年人的回腸-盲腸區(qū)區(qū)域分離唾液乳桿菌唾液亞種UCC118和長嬰兒雙歧桿菌35624，如實施例1所述。在本實施例中通過將預(yù)先生長過夜并隨后在1/4強度的林格氏溶液洗滌后的細胞，在分別含有50微克/毫升利福平(Sigma)的MRS和TPY瓊脂和含有400微克/毫升鏈霉素(Sigma)的MRS上進行平板培養(yǎng)產(chǎn)生了菌株的自發(fā)利福平和鏈霉素抗性衍生菌。將平板在37℃厭氧培養(yǎng)2天。測定獲得的抗生素抗性衍生菌，其表型類似于親本菌株。該可選擇的特性使得菌株在腸轉(zhuǎn)移之后易于計數(shù)。
動物和飼養(yǎng)供體小鼠(C57BL/6×BALB/C)F1是從Simosen實驗室購買(Gilroy，CA)并在加利福尼亞大學(xué)-洛杉磯動物園通風(fēng)籠架(Thoren籠系統(tǒng)，Hazelton，PA)中在無特異性病原體(SPF)條件下飼養(yǎng)。CB-17 SCID小鼠在通風(fēng)籠架中養(yǎng)育，最初是從加利福尼亞大學(xué)-洛杉磯SCID設(shè)備中心獲得。這些小鼠是菌群降低(RF)小鼠而不是無菌小鼠并作為受體小鼠(Aranda R等人，免疫學(xué)雜志1997；158(7)，3464-3473)。
將8周齡大的雌性CB-17(SCID)小鼠成對圈養(yǎng)于通風(fēng)籠架的頂部過濾籠。將小鼠分為4個組，組A攝取10％的脫脂奶，對照；組B攝取唾液乳桿菌UCC118，組C攝取唾液乳桿菌UCC118和長嬰兒雙歧桿菌UCC35624(1∶1比例)；組D攝取長嬰兒雙歧桿菌UCC35624。UCC118和UCC35624分別在MRS肉湯和補充了0.05％胱氨酸(Sigma)的MRS肉湯中生長過夜，在PBS中洗滌，重新懸浮于脫脂奶(10％(v/v))并在無其他的菌的飲用水(PBS)中給予。各個相應(yīng)組的小鼠每天接受2.55×108cfu/毫升的UCC118和2.35×108cfu/毫升的UCC35624以持續(xù)喂養(yǎng)期。對照小鼠接受在無菌磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中稀釋的無菌牛奶，在如測試組相同的條件下養(yǎng)育。
試驗設(shè)計根據(jù)分組將各自的飼料提供給所有CB-17小鼠2天，然后用CD4+CD45RBhigh高細胞注射。將分選的供體淋巴細胞(3-4×105)重新懸浮于200微升的無菌PBS并且腹膜內(nèi)注射到受體CB-17SCID小鼠。開始時所有的小鼠稱重，然后每周稱2次。觀測到臨床發(fā)病信號彎腰駝背，外皮豎毛，腹瀉。
給藥的益生菌對來自于小鼠糞便的固有細菌數(shù)量的影響的評估當(dāng)UCC118和UCC35624單獨給藥或相互結(jié)合給藥后調(diào)查對CB-17SCID小鼠腸道的微生物區(qū)系的影響。每周對各個小鼠搜集糞便樣品，稱重和重新懸浮于10毫升PBS。然后在PBS中連續(xù)稀釋樣品，在合適稀釋度將其傾倒到或涂覆到合適的培養(yǎng)基平板上，設(shè)置2個重復(fù)。計數(shù)下列細菌組乳桿菌；雙歧桿菌；腸球菌；擬桿菌和大腸菌。所使用的選擇性培養(yǎng)基是de Mann，Rogosa和Sharpe(MRS)瓊脂；補充了0.2％氯化鋰(BDH)，5％丙酸鈉(Fluke化學(xué)試劑公司)，0.5％鹽酸胱氨酸(Sigma)和5％羊血的MRS瓊脂，Slanetz和Bartley瓊脂；補充了厭氧補充劑SR108和5％馬血的Wilkins和Chalgren瓊脂；Violet紅膽汁瓊脂。(所有均是Oxoid產(chǎn)品，除非另有說明)。分別將VRBA和Slanetz和Bartley平板厭氧條件下培養(yǎng)24和45小時。所有其他平板在37℃厭氧條件下培養(yǎng)48小時。
來自于CB17SCID小鼠G.I.T.的特異性節(jié)段的可培養(yǎng)的固有菌群的計數(shù)在喂養(yǎng)期之后，殺死所有的小鼠并且解剖。取出回腸-盲腸區(qū)區(qū)域，小腸，大腸。也取出外周淋巴結(jié)(PLN)，腸系膜的淋巴結(jié)(MLN)和-片脾臟。將所有組織稱重，然后重新懸浮于10毫升的PBS。然后將樣品勻漿化并且在PBS中連續(xù)稀釋并且在合適的稀釋度將其涂覆或傾倒在合適的培養(yǎng)基平板上，設(shè)置2個重復(fù)。計數(shù)的細菌組類似于在糞便樣品分析的細菌組，如前所述培養(yǎng)樣品。
上皮內(nèi)和固有層淋巴細胞的制備根據(jù)Aranada，R等人((1997)，見上文)的方法進行粘膜淋巴細胞的分離。
淋巴細胞群體的流式細胞計數(shù)分析根據(jù)Aranada，R等人((1997)，見上文)進行分析。
從小腸，大腸，和回腸-盲腸區(qū)域獲取組織樣品并且固定于10％福爾馬林。根據(jù)Aranada，R等人((1997)，見上文)進行分析。
從該試驗觀測到，與以前結(jié)果-致，用CD4+CD45RBhighT淋巴細胞復(fù)原的和只攝取了脫脂奶的(對照組)SCID小鼠發(fā)展為由其體重顯著下降代表的漸進性消瘦疾病。在約2周半和3周時該疾病變得明顯，并且病鼠的特征為顯示出彎腰駝背，外皮豎毛，松散糞便。在25天之后對照組的-個小鼠(小鼠4)死亡，小鼠1，2，3和5顯示體重變化分別為-20％，25％，21％和-35％，如圖3和4描述的。
僅僅攝取UCC 118的CB-17SCID的小鼠獲得的結(jié)果類似于對照，具有特征性的體重的損失。14天之后小鼠3死亡，小鼠4，5和6分別顯示-15％，-25％和-28％的重量變化(數(shù)據(jù)未顯示)。發(fā)現(xiàn)進食UCC118和UCC35624的結(jié)合物的小鼠與對照相比具有明顯的改進。在喂食期間這些小鼠損失的重量不象對照小鼠那樣高。甚至在35天之后該組的三個小鼠顯示體重幾乎沒有變化。(圖5和6)。該組的2個小鼠僅僅在約30天之后顯示體重損失，而對照小鼠在14天時顯示體重損失(圖3和4)。
只進食UCC35624的小鼠顯示良好的健康狀態(tài)，當(dāng)與對照相比時體重損失相當(dāng)小(圖7和8)。因此可以總結(jié)出僅僅進食UCC35624或與UCC118結(jié)合進食減輕了炎癥性腸病癥狀。
表8是用UCC118和UCC35624混合治療CD45RB結(jié)腸炎誘導(dǎo)的CB17和SCID小鼠的研究的實驗數(shù)據(jù)概述。
在該研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用淋巴細胞成功地復(fù)原了小鼠，淋巴細胞來自于供體模型(數(shù)據(jù)未顯示)。
表8用唾液乳桿菌UCC118和雙歧桿菌混合治療CD45RB結(jié)腸炎誘導(dǎo)的CB 17 SCID小鼠
A炎癥滲濾的程度；B粘膜蛋白的損失；C表皮增生；D小囊的TEL數(shù)；E每個高倍視野炎性位點數(shù)實施例7體外研究檢測長雙歧桿菌的免疫感受用來自于健康自愿者(n＝9)和患有炎癥性腸病的人(n＝5)外周血液單核細胞(PBMCs)培養(yǎng)雙歧桿菌的洗滌的過夜培養(yǎng)物。采用ELISA在72小時培養(yǎng)上清液中測量促炎細胞因子腫瘤壞死因子α(TNFα)的產(chǎn)生。將人PBMCs與長雙歧桿菌共培養(yǎng)沒有導(dǎo)致刺激TNFα的產(chǎn)生(圖9)。因此，全身免疫系統(tǒng)與該細菌的接觸誘導(dǎo)炎性應(yīng)答。
為了評價粘膜表面的長雙歧桿菌的免疫感受，在transwell腔室進行表皮細胞與PBMCs的共培養(yǎng)。簡單地說，在上部腔室生長表皮細胞單層，在下部腔室培養(yǎng)PBMCs。它們是由多孔的膜分隔的，該膜允許可溶性介質(zhì)在兩個腔室之間傳遞，但是不允許細胞-細胞接觸。利用該模型，在PBMC腔室中在有和沒有長雙歧桿菌時測量TNFα和白細胞介素-8(IL-8)的產(chǎn)生。表皮細胞，PBMCs和長雙歧桿菌的共培養(yǎng)導(dǎo)致顯著抑制TNFα和白細胞介素-8(IL-8)的產(chǎn)生(圖10)。因此，涉及表皮細胞，PBMCs和長雙歧桿菌的三細胞網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)致促炎細胞因子的產(chǎn)生的抑制。
實施例8長雙歧桿菌的體內(nèi)抗炎性活性由18個健康人進食發(fā)酵的奶(酸奶)產(chǎn)品形式的長雙歧桿菌(1×109細胞/天)三個星期。在益生菌菌株進食之前和之后收集血清進行細胞因子分析。獲得糞便樣品進行微生物分析。
在該喂食研究中觀察到外周血液細胞因子水平的大的改變。在進食益生菌菌株之后血清可溶性白細胞介素-6受體(sIL-6R，p＝0.007)，干擾素-γ(IFNγ，p＝0.041)和IL-8(p＝0.004)水平顯著降低(圖11)。沒有觀察到血清TNFα和白細胞介素-1(IL-1)受體拮抗劑(IL-1RA)水平變化(圖12)。在喂食研究過程中檢測到長嬰兒雙歧桿菌約1×105菌落形成單位/克糞便。
反映GI環(huán)境的復(fù)雜相互作用的定向體外選擇標(biāo)準使得能識別在重新導(dǎo)入到該環(huán)境中時能有效發(fā)揮功能的益生菌菌株。利用上面概述的選擇性標(biāo)準，可證實益生菌長雙歧桿菌具有體外免疫調(diào)節(jié)特性。在SCID小鼠和人自愿者進食之后，注意到全身免疫參數(shù)的顯著改進。因此，長雙歧桿菌可用作為治療免疫介導(dǎo)的疾病的生物治療劑具有了根據(jù)。
實施例9在無長雙歧桿菌UCC35624細胞的上清液中測量TNFα將長雙歧桿菌的過夜培養(yǎng)物離心并且檢測無細胞上清液中細胞因子抑制劑的存在。在37C將人TNFα與該無細胞上清液保溫20分鐘。之后采用ELISA定量測定TNFα水平。在與雙歧桿菌上清液接觸之后，TNFo水平顯著降低(圖13)。因此長雙歧桿菌UCC35624分泌拮抗TNFα活性的因子。長雙歧桿菌在胃腸道表面體內(nèi)產(chǎn)生該因子顯著限制了宿主的炎性應(yīng)答。
這表明由于由UCC35624釋放的可溶性因子，TNFα的拮抗作用也以分子水平出現(xiàn)。
炎癥術(shù)語炎癥用于描述在長期物理損害，感染或有正在產(chǎn)生的免疫系統(tǒng)應(yīng)答的位點，液體，血漿蛋白質(zhì)和白血細胞的局部積累。炎性應(yīng)答的控制以各種水平發(fā)揮作用(參見Henderson B.，和WilsonM.1998的綜述，健康和疾病中細菌-細胞因子的相互作用，波蘭出版社，79-130)?？刂埔蜃影毎蜃?，激素(例如皮質(zhì)甾醇)，前列腺素，反應(yīng)性中間體和白三烯。細胞因子是低分子量的生物學(xué)活性蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)參與免疫和炎性應(yīng)答的產(chǎn)生和控制，而也調(diào)節(jié)發(fā)育，組織修復(fù)和造血。它們提供了白細胞本身之間和其它細胞類型之間的通訊手段。大多數(shù)細胞因子是多效性，并且表達多個生物學(xué)重疊活性。細胞因子級聯(lián)和網(wǎng)絡(luò)而不是特定的細胞因子對特定的細胞類型的作用控制炎性應(yīng)答(Arai KI等人，生物化學(xué)的年度綜述1990；59783-836)。炎性應(yīng)答的無力導(dǎo)致合適的激活信號和其它炎性介質(zhì)濃度降低，導(dǎo)致炎性應(yīng)答停止。TNFα是關(guān)鍵的促炎細胞因子，因為它起始細胞因子和生物學(xué)作用的級聯(lián)，導(dǎo)致產(chǎn)生炎性狀態(tài)。因此，抑制TNFα的試劑現(xiàn)在可用于治療炎性疾病，例如infliximab。
促炎細胞因子被認為在許多炎性疾病，包括炎癥性腸病(IBD)的發(fā)病過程中起主要作用。目前的用于治療IBD的治療劑目的在于降低這些促炎細胞因子，包括IL-8和TNFα的水平。已經(jīng)有人建議這樣的治療劑也可以在治療全身炎性疾病例如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎起重要作用。進食含有長雙歧桿菌UCC35624的酸奶的人已經(jīng)顯示其全身性IL-8水平降低。因此該菌株在治療各種各樣的炎性疾病中具有潛在的應(yīng)用，特別是如果與現(xiàn)在的抗炎性治療劑結(jié)合使用，例如非甾類抗炎性藥物(NSAIDs)或infliximab。
腹瀉疾病在神經(jīng)(乙酰膽堿)和免疫(組氨酸)介導(dǎo)的分泌過程中腸道上皮細胞的屏障功能可被消除。某些細菌毒素也可誘導(dǎo)鈣離子和PKC依賴性分泌，從而可干擾上皮細胞的屏障(Ganguly NK和Kaur T.印度醫(yī)學(xué)研究雜志1996；10428-37，Groot JA.Vet Q 1988；20(S3)45-9)。幾個研究已經(jīng)檢測了利用益生菌細菌預(yù)防和治療腹瀉。前瞻性研究已經(jīng)證明對早產(chǎn)兒，新生兒，兒童給予乳酸細菌在抗腹瀉的預(yù)防和治療(Isolauri E.等人Dig Dis Sci 1994 12月；39(12)2595-600)和在治療抗生素相關(guān)的腹瀉(Siitonen S等人，醫(yī)學(xué)年報1990 2月；22(1)57-9)和旅行者的腹瀉(Oksanen PJ，等人，醫(yī)學(xué)年報1990 2月；22(1)53-6)中的效力。
我們已經(jīng)檢測了由SCID小鼠進食長雙歧桿菌UCC35624。發(fā)現(xiàn)炎性活動明顯減輕并且進食長雙歧桿菌UCC35624的小鼠恢復(fù)了固體糞便，而對照小鼠患有腹瀉。圖14和15顯示治療和未治療的SCIC小鼠的下腸道。所顯示的下腸道包括盲腸2，腸道3和肛門5。圖14中用長雙歧桿菌UCC35624治療小鼠，在腸道中已經(jīng)恢復(fù)了固體糞便4。與圖15比較顯示未治療的小鼠腸道3具有特征性的發(fā)炎。沒有出現(xiàn)水分的吸收，以致于沒有恢復(fù)固體糞便而導(dǎo)致腹瀉。
觀察到的抗腹瀉作用與抗炎活性，可能是借助于cAMP調(diào)節(jié)的介導(dǎo)。環(huán)化的AMP依賴性C1分泌是人腸中主要的分泌途徑(Brzuszczak IM，等人，胃腸道造血的雜志1996；11(9)804-10)。長雙歧桿菌UCC35624的抗腹瀉作用不僅僅限于產(chǎn)生胃腸道炎癥的腹瀉，也可用于一般治療腹瀉疾病。
自身免疫疾病免疫系統(tǒng)具有由B和T細胞表達的巨大的特異性組成成分。這些特異性成分中的一些是指自我成分。自我識別通常受自我反應(yīng)性淋巴細胞的克隆缺失和失活的控制。但是存在自體免疫性的不變背景抗血清中存在許多蛋白質(zhì)的抗體。自我-非自我識別系統(tǒng)的破壞導(dǎo)致自身免疫性。當(dāng)出現(xiàn)自身免疫疾病時，獲得的免疫應(yīng)答損壞攜帶攻擊抗原的組織。免疫復(fù)合物沉積，II型超敏感性和細胞介導(dǎo)的反應(yīng)是出現(xiàn)免疫病理學(xué)損毀的最重要的機理。自體免疫疾病的例子包括，但不限于全身性的紅斑狼瘡，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，胰島素依賴型糖尿病，肌無力和惡性的貧血。長嬰兒雙歧桿菌和唾液乳桿菌唾液亞種是免疫調(diào)節(jié)細菌。因此，由患有自體免疫疾病的患者進食單一成分或與這些細菌結(jié)合可以限制器官損毀和幫助恢復(fù)正常身體體內(nèi)平衡。
炎癥和癌癥對于廣譜的腫瘤類型產(chǎn)生多個功能性的細胞因子顯示癌癥患者中進行顯著的炎性應(yīng)答。這種應(yīng)答抵抗體內(nèi)腫瘤細胞的生長和發(fā)育的保護性作用目前還不清楚。但是，這些炎性應(yīng)答有害地影響攜帶腫瘤的宿主。復(fù)雜的細胞因子的相互作用參與腫瘤和正常組織內(nèi)調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生和細胞增殖(McGee DW等人，免疫學(xué)1995；9月；86(1)6-11，Wu S，等人，Gynecol Oncol 1994，4月；53(1)59-63)。長期以來認識到重量損失(惡病質(zhì))是癌癥患者死亡的單一的最普遍的原因(Inagaki J，等人，癌癥1974 2月；33(2)568-73)和起始營養(yǎng)不良指示不良的預(yù)后(Van Eys營養(yǎng)綜述雜志1982 12月；40(12)353-9)。為了腫瘤生長和擴散，它必須誘導(dǎo)新的血管的形成和降解細胞外基質(zhì)。炎性應(yīng)答可能在上述機理中起重要的作用，因此導(dǎo)致宿主衰退和腫瘤增大。由于這些細菌菌株的抗炎性特性，它們可能誘導(dǎo)惡性細胞轉(zhuǎn)化的比例。此外，腸道細菌可以從可食用的化合物，產(chǎn)生具有基因毒性，致癌作用和腫瘤促進活性的物質(zhì)，腸道細菌可以激活原致癌物為DNA反應(yīng)劑(Rowland I.R.(1995))。腸道的毒性腸道微生物菌群的作用。Gibson G.R.人的腸道細菌在營養(yǎng)，生理學(xué)和病理學(xué)中的作用，第155-174頁，Bocaraton CRC出版社)。一般地說，與在腸道內(nèi)其他群體例如類細菌，真細菌和梭菌相比雙歧桿菌和乳桿菌具有低活性的異生素代謝酶(saito Y.等人，微生物生態(tài)健康1992；5，105-110)。因此，在腸道內(nèi)乳酸細菌數(shù)量增加有利于修飾這些酶的水平。
益生素通過進食合適的載體中的微生物完成益生菌生物體的導(dǎo)入。提供促進這些益生菌在大腸中生長的培養(yǎng)基是有利的。加入一種或多種寡聚糖，多糖或其他益生素加強乳酸細菌在胃腸道中生長(Gibson，GR，英國營養(yǎng)雜志1998；80(4)S209-12)。益生素是指任何非活性的食物成分，它們經(jīng)被認為是正值的固有的細菌例如雙歧桿菌、乳桿菌，在腸道中特異性發(fā)酵。益生素的類型可包括含有果糖，木糖，大豆，半乳糖，葡萄糖和甘露糖的那些。益生菌菌株和一種或多種益生素化合物結(jié)合施用可以加強所施用的益生菌的體內(nèi)生長，導(dǎo)致更深遠的健康利益，并且稱之為synbiotic。
其他活性成分應(yīng)理解的是雙歧桿菌可以用于預(yù)防給藥或其本身或與如上所述其他益生菌和/或益生素物質(zhì)結(jié)合作為治療的方法。另外，細菌可用作為利用其他活性物質(zhì)例如用于治療炎癥或其他紊亂尤其是胃腸道紊亂的預(yù)防或治療方式的一部分。這樣的結(jié)合劑可以以單一制劑或作為在相同或不同時間給藥以及利用相同或不同給藥途徑的獨立配方給藥。
本發(fā)明不限于前面描述的實施方案，其詳細情況可以變化的。
權(quán)利要求
1.從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到的雙歧桿菌菌株，其在由人口服之后具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙歧桿菌菌株，當(dāng)導(dǎo)入到包括與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞和免疫系統(tǒng)細胞的一個系統(tǒng)時，該菌株實現(xiàn)免疫標(biāo)記的改變。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雙歧桿菌菌株，其中與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞是表皮細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的雙歧桿菌菌株，其中免疫標(biāo)記是細胞因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙歧桿菌菌株，其中細胞因子是TNFα。
6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項所述的雙歧桿菌菌株，其中與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞和免疫系統(tǒng)細胞的來源匹配。
7.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的雙歧桿菌菌株，其中與免疫系統(tǒng)相互作用的細胞來源于胃腸道，呼吸道或泌尿生殖道。
8.根據(jù)權(quán)利要求2-6任一項所述的雙歧桿菌菌株，其中免疫系統(tǒng)細胞來源于胃腸道，呼吸或泌尿生殖道。
9.從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到的在由人口服之后具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用的長嬰兒雙歧桿菌(Bifidobacterium longuminfantis)菌株。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項所述的雙歧桿菌菌株，該菌株由人口服之后具有顯著的抗炎作用。
11.從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到的雙歧桿菌菌株，其具有抗擊炎癥性腸病的作用的能力，所述的能力在生理濃度的人膽汁和人胃液存在下保持。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的雙歧桿菌菌株，其中通過測量在嚴重聯(lián)合免疫缺陷受體小鼠(SCID)中誘導(dǎo)的消瘦疾病的逆轉(zhuǎn)測量抗擊炎癥性腸病的作用的能力，所述的小鼠已經(jīng)用純化的CD4+，CD45RBhighT細胞給藥。
13.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株，所述菌株對廣譜革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌具有抑制作用。
14.根據(jù)前述任一項權(quán)利要求所述的雙歧桿菌菌株，其中所述菌株顯示廣譜的抗包括葡萄球菌，假單胞菌，大腸菌和芽孢桿菌在內(nèi)的細菌的活性。
15.長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624或其突變體或變異體。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624，其中突變體是經(jīng)過遺傳修飾的突變體。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624，其中變異體是天然存在的長嬰兒雙歧桿菌菌株UCC35624的變異體。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項所述的雙歧桿菌菌株，它是活細胞形式的。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17任一項所述的雙歧桿菌菌株，它是非活細胞形式的。
20.從權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株獲得的抗微生物劑，其對其它微生物的生長有拮抗作用。
21.包括權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株的制劑。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的制劑，該制劑包括兩個或多個雙歧桿菌菌株。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22所述的制劑，它包括另一種益生菌物質(zhì)。
24.根據(jù)權(quán)利要求21-23任一項所述的制劑，它包括一種益生素物質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21-24任一項所述的制劑，該制劑包括唾液乳桿菌菌株。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的制劑，其中唾液乳桿菌菌株是活細胞形式。
27.根據(jù)權(quán)利要求25所述的制劑，其中唾液乳桿菌菌株是非活細胞形式。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27任一項所述的制劑，其中唾液乳桿菌菌株是從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到，在人口服之后該唾液乳桿菌具有顯著的免疫調(diào)節(jié)功能。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28任一項所述的制劑，其中唾液乳桿菌菌是從切下并洗滌過的人的胃腸道分離到，其抑制廣譜的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性微生物。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-29任一項所述的制劑，其中唾液乳桿菌分泌具有抗微生物活性的產(chǎn)物到無細胞的上清液中，所述的活性僅僅通過生長細胞產(chǎn)生并且由蛋白酶K和鏈霉蛋白酶E破壞，所述菌株和其分泌產(chǎn)物的抑制作用在生理濃度的人膽汁和人胃液存在下保持。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-30任一項所述的制劑，其中唾液乳桿菌菌株是唾液乳桿菌菌株UCC118或其突變體或變異體。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的唾液乳桿菌菌株UCC118，其突變體是遺傳修飾的突變體。
33.根據(jù)權(quán)利要求31所述的唾液乳桿菌菌株UCC118，其變異體是天然存在的唾液乳桿菌變異體。
34.根據(jù)權(quán)利要求21-33任一項所述的制劑，該制劑包括可攝食的載體。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的制劑，其中可攝食的載體是藥物學(xué)可接受的載體例如膠囊，片劑或粉劑。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的制劑，其中可攝食的載體是食品例如發(fā)酵乳，酸乳酪，凍酸乳酪，奶粉，濃縮奶，軟質(zhì)奶酪，布丁或飲料。
37.根據(jù)權(quán)利要求21-36任一項所述的制劑，其進一步包括蛋白質(zhì)和/或肽，特別是富含谷氨酸/谷氨酰胺的蛋白質(zhì)和/或肽，脂類，碳水化合物，維生素，礦物質(zhì)和/或微量元素。
38.根據(jù)權(quán)利要求21-37任一項所述的制劑，其中雙歧桿菌以每克輸送系統(tǒng)大于106cfu存在。
39.根據(jù)權(quán)利要求21-38任一項所述的制劑，該制劑包括佐劑。
40.根據(jù)權(quán)利要求21-39任一項所述的制劑，該制劑包括細菌成分。
41.根據(jù)權(quán)利要求21-40任一項所述的制劑，該制劑包括藥物本體。
42.根據(jù)權(quán)利要求21-41任一項所述的制劑，該制劑包括生物學(xué)化合物。
43.根據(jù)權(quán)利要求21-42任一項所述的制劑，該制劑用于口服免疫接種。
44.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑作為食品的應(yīng)用。
45.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑作為藥物的應(yīng)用。
46.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療不希望的炎性中的應(yīng)用。
47.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療不希望的胃腸道炎性，如炎癥性腸病例如節(jié)段性回腸炎或潰瘍性結(jié)腸炎，過敏性腸綜合征，囊炎或感染后結(jié)腸炎中的應(yīng)用。
48.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療胃腸道癌癥中的應(yīng)用。
49.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療全身性疾病例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用。
50.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療由于不希望的炎性導(dǎo)致的自身免疫疾病中的應(yīng)用。
51.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療由于不希望的炎性導(dǎo)致的癌癥中的應(yīng)用。
52.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療癌癥中的應(yīng)用。
53.根據(jù)權(quán)利要求1-19任一項所述的雙歧桿菌菌株，或權(quán)利要求21-43任一項所述的制劑在預(yù)防和/或治療由于不希望的炎性導(dǎo)致的腹瀉疾病，例如艱難梭菌相關(guān)的腹瀉，與輪狀病毒相關(guān)的腹瀉或傳染病后腹瀉中的應(yīng)用。
全文摘要
從切下并沖洗過的人的胃腸道分離到的雙歧桿菌菌株在由人口服之后具有顯著的免疫調(diào)節(jié)作用。該菌株可用于預(yù)防和/或治療不希望出現(xiàn)的炎性活動,尤其是胃腸道炎性活動例如炎癥性腸病或過敏性腸綜合征。炎性活動也可以是癌癥引起的。
文檔編號A61P31/04GK1342196SQ00804089
公開日2002年3月27日 申請日期2000年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1999年1月15日
發(fā)明者約翰·凱文·柯林斯, 杰拉爾德·克里斯托弗·奧沙利文, 利亞姆·奧馬霍尼, 弗格斯·沙納漢 申請人:愛爾蘭企業(yè)(貿(mào)易上稱作愛爾蘭生物學(xué)研究公司), 國立愛爾蘭大學(xué)科克分校