專利名稱：用于移植術(shù)的藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于從供體向需要器官的接受者移植組織或器官的藥劑。
組織(器官)移植是保健系統(tǒng)中發(fā)展迅速的一個領(lǐng)域，每年的移植術(shù)數(shù)量都在增加。組織(器官)的供應(yīng)十分有限，并且移植術(shù)前組織(器官)僅能在普通環(huán)境中存放幾小時。其限制性因素是時間問題，即從供體摘除組織(器官)到它在組織(器官)接受者中起作用這一段有效時間。這一時間因素非常重要，并且需要夜間手術(shù)(因為白天的幾個小時是不夠的)、救護車和空運，同時還要為在不同醫(yī)院的多達5-6個接受者準(zhǔn)備多個手術(shù)。接受者的肝移植手術(shù)可長達12小時。
在下述說明和權(quán)利要求書中，術(shù)語“組織”可包括所有可被移植的組織、器官和細胞。在說明書中這些術(shù)語可互換使用。
移植術(shù)中存在三個難處理的步驟，均與潛在的氧化應(yīng)激反應(yīng)(stress)問題有關(guān)，即組織(器官)的特性、存活問題I.對供體的深入細致照料時間。這意味著要暴露于氧環(huán)境(高比例和壓力的)和面臨許多正常受體功能的衰竭。
II.從摘除到在接受者中起作用的時間。這是非常關(guān)鍵的。器官需冷卻至+4℃，并且用儲藏和運輸?shù)娜芤喝鏤W-溶液洗滌。摘除后的器官存放于置于冰上的所述溶液中。UV溶液是一種含有添加劑的鹽水，所述添加劑的目的在于維持鹽平衡和避免組織損害。
III.對于接受者來說也存在幾個關(guān)鍵步驟，首先是再灌注即灌注到血流中這可造成大量的氧化猝發(fā)。其次是移植術(shù)存在的免疫反應(yīng)和長期效應(yīng)問題(某些細胞組的部分細胞死亡)。
移植術(shù)步驟的最優(yōu)化是非常重要的，有些接受者的生命就依賴于整個步驟的有效性和在該方法中器官未受到破壞。
當(dāng)氧化劑和自由基與例如SOD酶、過氧化氫酶、DNA-修復(fù)等保護機制失衡時，就會發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激反應(yīng)是多數(shù)疾病的主要或次要部分，這些疾病包括心/腦梗塞、創(chuàng)傷、膿毒病、關(guān)節(jié)炎、免疫系統(tǒng)疾病、癌癥、炎癥、感染和CNS-疾病。在所有這些疾病中，氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致細胞損傷，其結(jié)果取決于器官是否能在急性期存活，這種情形適用于梗塞，但也與慢性病有關(guān)，例如關(guān)節(jié)炎就伴隨著長期的關(guān)節(jié)氧化應(yīng)激反應(yīng)。
本發(fā)明涉及藥劑在從供體向需要器官的接受者移植器官中的用途。本發(fā)明藥劑適用于移植術(shù)的不同步驟中。該藥物可a)經(jīng)口、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)給予將要摘除器官的供體；b)加到儲藏和運輸器官的溶液中(如UW溶液)；c)經(jīng)口、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)給予器官接受者，即將要植入器官的病人。
氧化應(yīng)激反應(yīng)可通過幾種不同的機理如氧化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA影響組織，因此組織的退化(Degradetion)就有幾種機理。在組織的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化期間，其結(jié)構(gòu)遭到自由基的嚴(yán)重損害，其結(jié)果是功能的損失，從而導(dǎo)致細胞死亡并最終導(dǎo)致組織的死亡。
本發(fā)明令人驚奇地發(fā)現(xiàn)使用下面式I的取代吲哚喹喔啉即可保護移植器官，使之在實施移植術(shù)的整個必需步驟中避免了由于氧化應(yīng)激反應(yīng)所導(dǎo)致的退化現(xiàn)象。
本發(fā)明與移植術(shù)聯(lián)用的藥物是下面式I化合物及其與酸或鹵素優(yōu)選碘、一氯化碘或一溴化碘形成的生理可接受的加合物 其中R1在位置1-4和/或1-7為氫?；蛞粋€或幾個、優(yōu)選1-4個相同或不同的取代基，選自鹵素優(yōu)選溴、不高于4個碳的低級烷基/烷氧基、三氟甲基基團、三氯甲基基團；R1在位置7-10之一可以是羥基；X為-(CH2)n-R2，其中R2是含氮的堿基如NH2、NHR4或NR5R6，其中R4、R5和R6獨立地為低級烷基或環(huán)烷基并且n為1-4的整數(shù)，R3為氫、不高于4個碳的低級烷基/環(huán)烷基、R1優(yōu)選為氫和低級烷基、特別優(yōu)選甲基。更優(yōu)選R1在位置2和3為甲基，而在其他位置為氫。
下面式II化合物被證明特別有效 此類化合物及其制備參見專利EP0238459和US4990510的描述，在此引入作為參考。
本發(fā)明藥劑這三種應(yīng)用[I、II和III]用于防止移植術(shù)過程中對組織的損傷。因此，通過對欲移植的組織進行原位處理可激活其保護機制，從而使器官得以存活。本發(fā)明藥劑可以下調(diào)或阻斷組織的退化機理，這意味著可延長組織的儲藏和運輸時間。這種延期也意味著可在更廣泛的國家和區(qū)域間進行移植組織的交換。這樣，由于組織的DNA/蛋白質(zhì)/酶等受到保護而不會被降解，因而移植的組織就不會發(fā)生退化。
通常，測定其代謝能力或組織功能即可測得組織損傷。這樣，對于組織如肝而言，其降低血液中乳酸鹽和生成膽汁的能力就可作為標(biāo)識(指示劑)。由于DNA控制著細胞和組織的整個功能，所以DNA的氧化對于整個組織存活也是一個風(fēng)險因素。因此說DNA的氧化也是一種前誘變物。
在DNA的氧化中，細胞暴露于活性氧下。在這種氧化應(yīng)激反應(yīng)期間，羥基和過氧化物自由基可使dG氧化，結(jié)果可形成8-OH-dG，這是一種前誘變物，其導(dǎo)致發(fā)生了鏈斷裂、堿基取代、dG開環(huán)和/或影響DNA-甲基化(dG是脫氧鳥苷，DNA的一種堿基)。
由于式I化合物大幅度地降低了氧化應(yīng)激反應(yīng)，它在移植術(shù)中可用作提高細胞和器官存活的重要的潛在藥劑。式I化合物在體內(nèi)無毒并且可以兩種方法保護組織。首先是阻滯可產(chǎn)生氧化劑的氧化性酶(氧化酶)。其次是通過基因調(diào)控而激活非特異性(general)細胞防御。這樣，式I化合物就不單純作為抗氧劑，而且能激活細胞的防御機制從而上調(diào)抵御氧化應(yīng)激反應(yīng)。
附圖簡述

圖1表示肝灌流系統(tǒng)中DNA(8-OH-dG)的氧化性損傷。
圖2表示大鼠肝分析8-OH-dG體內(nèi)試驗。
圖3表示肝灌流系統(tǒng)中局部缺血的誘因和乳酸鹽的降低。
圖4和5表示灌流系統(tǒng)中大鼠肝的乳酸鹽和膽汁流。
圖6和7表示灌流系統(tǒng)中大鼠肝的總膽汁流。
圖8表示灌流系統(tǒng)中大鼠肝的乳酸鹽水平。
為了研究本發(fā)明用于移植術(shù)中的藥劑，采用心/肺機對灌流液中的大鼠肝進行了試驗。為了測定器官損傷，分析了肝中的8-OH-dG量。將二甲亞砜(DMSO，已知可影響細胞膜的化合物)作為8-OH-dG的誘導(dǎo)物加到灌流系統(tǒng)中。試驗中使用了不同試驗組一個不加任何物質(zhì)到灌流液中的肝對照組指定為對照C；另一組為把100μlDMSO加到灌流液中，該組使8-OH-dG顯著提高；和加入100μlDMSO前分別加有2、5和10mg本發(fā)明化合物(B220)的三個組。結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出B220的抗DNA氧化作用存在劑量/響應(yīng)關(guān)系。另外，B220還可將8-OH-dG降低到對照值以下(下調(diào)節(jié))。
在另一試驗中，對大鼠進行了體內(nèi)試驗并分析了肝的8-OH-dG。在該試驗中有三個試驗組。一個對照組，一組經(jīng)口給予2，7-二硝基-芴(2，7-dNF)，它是已知的柴油機排氣中的致癌物質(zhì)和8-OH-dG的誘導(dǎo)物，另一組聯(lián)合給予2，7-dNF和本發(fā)明化合物(B220)。在給予2，7-dNF的-48、-24和+6小時給予B220。所有劑量均以玉米油為載體經(jīng)口給予，而對照組僅給予載體。測量肝中DNA的氧化(鳥嘌呤的氧化，8-OH-DG)，8-OH-dG為幾種不同類型疾病如癌癥、糖尿病和感染的預(yù)誘變物。
結(jié)果如圖2所示。B220不僅能抗2，7-dNF-誘導(dǎo)的8-OH-dG形成。而且還可將8-OH-dG降低到對照值以下(下調(diào))。
又進行了第3個試驗，其中將大鼠肝取出并置于心/肺機上灌注。灌流液是含有移植的肝的血液。當(dāng)系統(tǒng)達到平衡時，截斷灌流液10-20分鐘后再接通，即所謂的再灌注(局部缺血)。再灌注(局部缺血/梗塞)的已知毒性作用(氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的組織損傷)是從灌注液中清除乳酸的能力降低。在該試驗中，本發(fā)明用于移植術(shù)的藥劑(B220)與三種不同的已知可保護組織的化合物進行了比較，它們是乙酰水楊酸(ASA，已知的炎癥性損傷和發(fā)熱的保護劑)、Clomethiasol(一種治療梗腦塞所致腦損傷的潛在新藥物)和維生素E(一種已知的抗氧劑和自由基清除劑)。對照組(C)僅誘發(fā)局部缺血。其他4組在局部缺血以前在灌注液中加入指示物質(zhì)(5mg)。B220是唯一能顯著降低乳酸鹽的物質(zhì)。但是，已知可對發(fā)熱、炎癥和疼痛下調(diào)的ASA并不顯示任何保護作用，Clomethiasol(一種保護梗腦塞后腦組織的藥物)和已知的抗氧劑和組織保護劑維生素E也如此。
結(jié)果如圖3所示。B220是試驗中唯一可提供統(tǒng)計學(xué)顯著意義的保護作用的物質(zhì)。
取大鼠肝在心/肺機上進行了系列試驗(圖4和5)。
將乳酸鹽加到對照肝灌注液中，測定膽汁流和乳酸鹽水平隨時間的變化。膽汁流是肝功能的臨床參數(shù)，膽汁流越高表明肝功能越好。對照組的結(jié)果見圖4和5的上圖。正常肝可下調(diào)乳酸鹽快速達到體內(nèi)水平(3-5mM)。虛線代表對照組中的正常膽汁流。
在下一試驗中，先關(guān)閉心/肺機10分鐘，再啟動以誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)(再灌注)。測定狀表組織損傷的乳酸鹽的量隨時間的變化，同時也測量代表毒性作用的膽汁流隨時間的變化。結(jié)果見圖4，中間的圖表示再灌注后高水平乳酸鹽(實線)和降低的膽汁流(虛線)。它們均是組織損傷的標(biāo)識。
在下一試驗中進行了同樣的再灌注試驗，其中系統(tǒng)中含有2mgB220。以乳酸鹽含量和膽汁流為標(biāo)識的結(jié)果見圖4下圖。如圖4所示，乳酸鹽含量和膽汁流快速調(diào)節(jié)到正常值，這表明B220可消除再灌注所致的組織損傷。乳酸鹽的排除和膽汁流均好于對照組。
在下一試驗中(圖5)，將一種非常有毒的化合物Triphorbolester(TPA)加到灌注液中。TPA是炎癥的誘導(dǎo)物和非常有效的腫瘤啟動子。以乳酸鹽含量和膽汁流為標(biāo)識的結(jié)果見圖5中圖，表明僅有非常有限的降低乳酸鹽和生產(chǎn)膽汁的能力。
除了灌注液中加有2mgB220外，其他條件相同又進行了同樣的試驗。結(jié)果如圖5的下圖所示。結(jié)果表明，當(dāng)系統(tǒng)中含有B220時，TPA的毒性效果被抑制并且乳酸鹽和膽汁流的值得到恢復(fù)(甚至好于如圖5上圖的對照組)。這些數(shù)據(jù)與B220在體內(nèi)長期試驗中可中止TPA(在動物試驗中是最有效的腫瘤啟動子)的強效腫瘤啟動子作用和“切斷”腫瘤過程相關(guān)。這種作用的模式在于阻斷了增生/炎癥。
在另一試驗中，對隔離灌注液中的大鼠肝進行了試驗，其中給予供體B220。在手術(shù)摘除肝的24小時前，給予供體單劑量B220，肝在放入灌注液前在+30℃下保溫2小時(組3)。(鼠肝在高溫(+30℃)下“短期”存放(2小時)是為了刺激移植術(shù))。第2組不給予B220，第1組為直接放入灌注液中的對照組。給予供體一定劑量的B220(術(shù)前24小時腹膜內(nèi)給藥)，灌注期間，測量總膽汁流可測定其降低的毒性效果?！斑\輸”和灌注過程可產(chǎn)生大量導(dǎo)致組織損傷的氧化應(yīng)激反應(yīng)。
在圖6中，以總膽汁流作為移植術(shù)所致組織損傷的標(biāo)識。對照組直接“移植”到灌注系統(tǒng)中，而第2組肝在“移植術(shù)”前30℃存放2小時。第3組為30℃處理2小時，但是給予供體B220。如圖所示，B220將膽汁流完全恢復(fù)到對照樣品的水平。
重復(fù)同樣的試驗，但是采用運輸人肝時的溫度(+4℃)。在放入灌注系統(tǒng)前將肝存放24小時，而人肝移植術(shù)時的最大存放時間為12小時。如圖7所示，經(jīng)B220預(yù)處理的供體的膽汁流得到了恢復(fù)。圖8表明對乳酸鹽水平也有同樣的保護作用。該試驗除了時間和溫度與圖6不同外，其他均相同。
試驗表明式I藥劑可在適用于人肝移植術(shù)的環(huán)境下對肝提供保護。這表明該藥劑可對人肝移植術(shù)中采用的儲存溫度(+4℃)和運輸時間起作用，經(jīng)腹膜、口或靜脈給給藥，該藥劑均可達到保護效果。如果在緊急情況下時間不夠用，可縮短預(yù)處理時間。從供體到接受者的移植術(shù)時間很可能延長至24小時，而目前最多為12小時。
從上述實施例可知，在移植術(shù)中用B220對供體進行預(yù)處理，可有效地下調(diào)氧化應(yīng)激反應(yīng)。這種下調(diào)不僅可消除移植術(shù)所致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，而且能將氧化應(yīng)激反應(yīng)下調(diào)到低于對照值水平。這種效果加上非常低的毒性(基本上無毒)意味著B220可干擾氧化應(yīng)激反應(yīng)的正常調(diào)節(jié)(保護)。另外，B220的親脂性使之可被細胞膜快速吸收。
對于移植術(shù)而言，組織的存活時間延長，即運輸和保存的時間可以延長(使更多的器官可以移植)，同時也增加了器官存活和正常運行的機會。
權(quán)利要求
1.通式I取代的吲哚喹喔啉及其與酸或鹵素優(yōu)選碘、一氯化碘或一溴化碘形成的生理可接受加合物在制備用于移植術(shù)中保護組織、器官和細胞的藥劑中的用途， 其中R1在位置1-4和/或1-7為氫?；蛞粋€或幾個、優(yōu)選1-4個相同或不同的取代基，選自鹵素優(yōu)選溴、不高于4個碳的低級烷基/烷氧基、三氟甲基、三氯甲基；R1在位置7-10之一可以是羥基；X為-(CH2)n-R2，其中R2是含氮的堿性殘基如NH2、NHR4或NR5R6，其中R4、R5和R6獨立地為低級烷基或環(huán)烷基并且n為1-4的整數(shù)，R3為氫、不高于4個碳的低級烷基/環(huán)烷基。
2.如權(quán)利要求1的用途，其中化合物的R1在位置2和3為甲基，而在其他位置為氫。
3.如權(quán)利要求1或2的用途，其中化合物的R1在位置7-10之一為羥基，優(yōu)選在位置9。
4.如前述任一權(quán)利要求的用途，其中化合物的X為CH2N(CH3)2和R3為氫。
5.如前述任一權(quán)利要求的用途，其特征在于將化合物加到貯藏或運輸移植器官的溶液中。
6.如權(quán)利要求1-4之一的用途，其特征在于將化合物加到與移植術(shù)連接的灌注系統(tǒng)中。
7.如權(quán)利要求1-4之一的用途，其特征在于將化合物注入或給予其組織將被移植的供體。
8.如權(quán)利要求1-4之一的用途，其特征在于將所述化合物給予移植組織的接受者。
全文摘要
式I化合物及其與酸或鹵素優(yōu)選碘、一氯化碘或一溴化碘形成的生理上可接受的加合物在制備用于移植術(shù)中保護組織、器官和細胞的藥物的用途,其中R
文檔編號A61P39/00GK1341023SQ00804108
公開日2002年3月20日 申請日期2000年2月18日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月25日
發(fā)明者L·默勒, J·博格曼 申請人:萊爾夫·J·I·倫德布拉得