專利名稱：：一種通過聚羥基鏈烷酸酯的自降解生產(chǎn)羥基羧酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種通過聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的自降解生產(chǎn)羥基羧酸羥基羧酸單體(主要為光學(xué)活性的(R)-(-)構(gòu)型)的方法，具體地說，本發(fā)明涉及一種制備羥基羧酸單體的方法，包括步驟(a)通過培養(yǎng)多種微生物合成并積累PHA；和(b)通過PHA的自降解制備光學(xué)活性(R)-(-)-羥基羧酸，它是PHA的單體，這是通過過將含有PHA的細胞放置于降解溶液中，例如水，鹽溶液，水和有機溶劑的混合物，和緩沖液中進行的。本發(fā)明的方法也包括進一步分離的方法，以分離制備的(R)-(-)-羥基羧酸，如果它們以兩種或多種(R)-(-)-羥基羧酸的混合物存在時，使用的是液相色譜(LC)或者高效液相色譜(HPLC)，和本發(fā)明也包括進一步純化的方法，通過有機溶劑提取將雜質(zhì)從純凈分離的(R)-(-)-羥基羧酸中出去的步驟，和純化的(R)-(-)-羥基羧酸的粉末制備方法。(R)-(-)-3-羥基羧酸由于以下原因可被廣泛用作手性前體它含有兩個功能基團，羥基基團和羧基集團；這些功能基團可方便地進行修飾；和可引入一個新的手性中心。(R)-(-)-3-羥基羧酸可被廣泛地用于合成抗生素，維生素，芳香劑，信息素等；用作開發(fā)用于藥物設(shè)計中的非-肽配體的材料；用作開發(fā)新藥的前體；以及特別是用作系抗生素物質(zhì)(carbapenemantibiotics)的前體，它最近引起了人們的注意，因為它可取代β-內(nèi)酰胺類抗生素，例如青霉素(Scott,In不對稱合成(AsymmetricSynthesis),Morrison和Scott,Eds.,AcademicPressInc.,orlando,FL,1984)。此外，據(jù)報道，(+)-thienamycin(噻吩阿霉素)可從甲基-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯合成(Chiba和Nakai,Chem.Lett.,651-654,1985；Seebach和Zuger,HelveticaChim.Acta,65:495-503,1982)。目前，(R)-(-)-3-羥基羧酸主要是通過下述方法合成的通過發(fā)酵過程對脂肪二醇進行氧化(Harada和Hirayashi,Agric.Biol.Chem.,32:1175,1968)；使用微生物對羧酸進行(R)-(-)-β-羥基化(Hasegawa等，發(fā)酵技術(shù)雜志(J.Ferment.Technol.),60:501,1982)；和使用手性催化劑對β-二酮進行氫化(Noyori等，美國化學(xué)學(xué)會雜志(J.Am.Chem.Soc.),109:5856,1987；Brussel等，WO97/14500A1,1997)。聚羥基鏈烷酸酯(PHA)是很多微生物中合成和積累的碳和/或能量貯存材料(Anderson和Dawes，微生物學(xué)評論(Microbiol.Rev.),54:450-472,1990)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過120種的單體為PHA的構(gòu)成單元，根據(jù)所培養(yǎng)的微生物，所使用的化學(xué)底物或者共底物，和培養(yǎng)條件的不同而有所不同(Lee，生物技術(shù)生物工程(Biotechnol.Bioeng.),49:1-14,1996；Steinbuchel和Valentin,FEMSMicrobiol.Lett.,128:219-228,1995).光學(xué)純凈的(R)-(-)-羥基羧酸可容易地通過降解生物合成的PHA來制備，因為生物合成的PHA的單體全部是由(R)-(-)構(gòu)型的單體組成的，如果該單體在攜帶羥基基團的碳原子上具有手性中心，這是由于生物合成酶的光學(xué)特異性造成的。已報道了一種從聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯(PHB)或者聚(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-(R)-(-)-3-羥基戊酸酯(PHB/V)通過化學(xué)降解生產(chǎn)(R)-(-)-3-羥基丁酸和(R)-(-)-3-羥基戊酸的方法(Seebach等，Org.Synth.,71:39-47,1992；Seebach和Zuger,HelveticaChim.Acta,65:495-503,1982；Pennetreau,US005107016A,1992；Pennetreau,EP0377260A1,1989)。但是，在上述的通過化學(xué)降解生產(chǎn)(R)-(-)-3-羥基丁酸和(R)-(-)-3-羥基戊酸的方法中大量使用了有機溶劑，并且由于過程復(fù)雜產(chǎn)率很低。因而，迫切需要一種能夠克服上述缺點的生產(chǎn)光學(xué)活性羥基羧酸的新方法。最近報道了一種通過微生物生產(chǎn)(R)-(-)-3-羥基丁酸的方法(Akira和Tatsuhiko,JP9-234091,1997)。這一方法是基于這樣一個簡單的假設(shè)，即一些積累聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯(PHB)的微生物也能夠產(chǎn)生它的單體，(R)-(-)3-羥基丁酸。他們篩選了產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸的微生物，發(fā)現(xiàn)假單胞菌(Pseudomonassp.)，伯克氏菌(Burkholderiasp.)和真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)能夠產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸。應(yīng)當(dāng)指出的是最近真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)被重新命名為Ralstoniaeutropha，因而，它不再屬于產(chǎn)堿菌屬(Yabuuchi等，微生物免疫學(xué)(Microbiol.Immunol.),39:897-904,1995).在上述方法中，將微生物培養(yǎng)幾天(4-7天)，然后轉(zhuǎn)移至磷酸鉀緩沖液中產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸。據(jù)報道，單體的產(chǎn)率很低，為2-8％，而且只產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸，沒有其它的(R)-(-)羥基羧酸。由于單體的產(chǎn)率非常低并且需要幾天的時間才能達到這一產(chǎn)率(由每單位體積每單位時間產(chǎn)生的產(chǎn)物的克數(shù)來定義)，因而這一方法不適用于工業(yè)生產(chǎn)。通常，當(dāng)生長因子中的一種，例如氮，磷，氧，鉀和硫有限，而碳源過量時PHA在細胞內(nèi)合成并積累(Anderson和Dawes,Microbiol.Rev.,54:450-472,1990).因而，如果再次添加成為限定因素的生長因子時，細胞降解積累的PHA并生長。所有的合成PHA的微生物含有細胞內(nèi)PHA解聚酶以及PHA生物合成酶。已知細胞內(nèi)PHA解聚酶以兩種形式存在，溶解形式和PHA顆粒的附著形式(Merrick和Dourdoroff，細菌學(xué)雜志(J.Bacteriol.),88:60-71,1964；Merrick等,J.Bacteriol.,89:234-239,1965；Merrick和Yu,生物化學(xué)(Biochem.),5:3563-3568,1966；Griebel等,Biochem.,7:3676-3681,1968；Griebel和Merrick,J.Bacteriol.,108:782-789,1971；Anderson和Dawes,Microbiol.Rev.,54:450-472,1990)。Merrick和Doudoroff(J.Bacteriol.88:60-71,1964)證實，天然的聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯(PHB)顆粒，而不是溶劑提取的PHB顆粒，可被細胞內(nèi)解聚酶系統(tǒng)解聚。它們證實，在巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)中積累的PHB顆?？杀簧罴t紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)的除去PHB的細胞的粗酶級分水解成(R)-(-)-3-羥基丁酸。而且，據(jù)Hippe和Schlegel(Arch.Mikrobiol.56:278-299,1967)報道，來自產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)(Hydrogenomonas)spp.的可溶的解聚酶可降解天然的PHB，產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸。這些早期的研究清楚地表明細胞含有細胞內(nèi)PHA解聚酶，并且可將PHA降解成單體。但是，天然(無定型)PHA顆粒的分離在較大的規(guī)模上不僅復(fù)雜而且昂貴。而且，用于PHA解聚的細胞內(nèi)解聚酶的分離也是復(fù)雜和昂貴的。如果使用含有細胞內(nèi)PHA解聚酶的粗細胞提取物將PHA降解成單體，由于粗細胞提取物中的各種成分的污染會造成嚴重的產(chǎn)品純化的問題。使用細胞將PHA降解成單體的另一個問題是降解的產(chǎn)物，即PHA的單體，被細胞進一步代謝。因而，除非將進一步代謝羥基羧酸單體的代謝途徑失活或阻斷，不可能通過pHA的降解生產(chǎn)單體。本發(fā)明基于這樣一個假設(shè)，即有可能通過控制環(huán)境因素將降解羥基羧酸單體的代謝途徑失活，而同時保持細胞內(nèi)PHA解聚酶的活性。這一構(gòu)思明顯不同于Akira和Tatsuhiko(JP9-234091,1997)的方法，在本發(fā)明中，細胞內(nèi)PHA解聚酶系統(tǒng)被用于生產(chǎn)(R)-(-)-羥基羧酸單體，而Akira和Tatsuhiko的方法是基于3種新分離的微生物的能力(假單胞菌(Pseudomonassp.)，伯克氏菌(Burkholderiasp.,)Rlastoniaeutropha(原名為真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)；Yabuuchi等，Microbiol.Immunol.,39:897-904,1995))，它們能夠產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸。因而，本發(fā)明基于這樣一個假設(shè)，即通過控制環(huán)境條件，合成的PHA可以從完整的細胞中自降解，并且單體可釋放到細胞外環(huán)境中。因而，本發(fā)明提供了一種有效和廉價并且高產(chǎn)率地生產(chǎn)各種光學(xué)活性(R)-(-)-羥基羧酸單體的方法。本發(fā)明的發(fā)明人成功地開發(fā)了一種從PHA積累的微生物中生產(chǎn)光學(xué)活性羥基羧酸單體的方法。本發(fā)明的方法包括步驟(a)通過培養(yǎng)多種微生物合成并積累PHA；和(b)制備羥基羧酸，它們是PHA的單體(主要是具有光學(xué)活性的(R)-(-)構(gòu)型)，這是通過將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中進行自降解進行的，例如水，鹽溶液，水和有機溶劑的混合物，和緩沖液。本發(fā)明的方法包括使用液相色譜(LC)或者高效液相色譜(HPLC)分離制備的(R)-(-)-羥基羧酸的方法，也包括進一步純化的方法，通過有機溶劑提取將雜質(zhì)從純凈分離的(R)-(-)-羥基羧酸中出去，和純化的(R)-(-)-羥基羧酸的粉末制備方法。最后，本發(fā)明的目的是提供一種高產(chǎn)率生產(chǎn)各種光學(xué)活性(R)-(-)-羥基羧酸單體的新方法，包括步驟(a)通過培養(yǎng)多種微生物，包括可積累并細胞內(nèi)降解PHA的重組菌株，合成并積累PHA和細胞內(nèi)降解PHA；和(b)通過PHA的自降解制備光學(xué)活性(R)-(-)-羥基羧酸單體。本發(fā)明的目的也是提供一種生產(chǎn)(R)-(-)-羥基羧酸單體的方法，還包括使用液相色譜(LC)或者高效液相色譜分離制備的(R)-(-)-羥基羧酸單體的步驟。本發(fā)明的目的也是提供一種制備最終的(R)-(-)-羥基羧酸粉末產(chǎn)品的方法，還包括通過有機溶劑提取純化純凈分離的(R)-(-)羥基羧酸的步驟；和通過干燥制備純化的(R)-(-)-羥基羧酸粉末。在上述方法中，所述的微生物可以是任何一種積累PHA并具有細胞內(nèi)解聚酶活性的野生型，突變型，重組的微生物(Doi,MicrobialPolyesters,VCH,NewYork,1990；Steinbuchel,In:Biomaterials.Byrom,Eds.,MacMillanPublishers,Busingstoke,1991；Lee,Biotechnol.Bioeng.,49:1-14,1996)，并且可以是選自下組的一種無色桿菌(Achromobacter)屬的微生物，包括無色桿菌(Achromobactersp.)，木糖氧化無色桿菌(Achromobacterxylosoxidans)等；食酸菌(Acidovorax)屬的微生物，包括德氏食酸菌(Acidovoraxdelafieldii)，敏捷食酸菌(Acidovoraxfacilis)等；不動桿菌(Acinetobacter)屬的微生物，包括乙酸鈣不動桿菌(Acinetobactercalcoaceticus)，魯氏不動桿菌(Acinetobacterlwoffii)等；放線桿菌(Actinobacillus)；放線菌(Actinomycessp.)；豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)；產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)屬的微生物，包括海水產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesaestus)，反硝化產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesdenitrjficans)，糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalis)，廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)，太平洋產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenespacificus)，爭論產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesparadoxus)，迷人產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesvenustus)等；麥氏交替單胞菌(Alteromonasmacleodii)；可變桿菌(Amoebobacter)屬的微生物，包括玫瑰色可變桿菌(Amoebobacterroseu)，懸掛可變桿菌(Amoebobacterpendens)等；隱球藍細菌(Aphanocapsasp.)；隱桿藍細菌(Aphanothecesp.)；自養(yǎng)水螺菌(Aquaspirillumautotrophicum)；莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)；固氮螺菌(Azospirillum)屬的微生物，包括巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)，生脂固氮螺菌(Azospirillumlipoferum)等；固氮菌(Azotobacter)屬的微生物，包括敏捷固氮菌(Azotobacteragilis)，拜氏固氮菌(Azotobacterbeijerinckii)，褐色球固氮菌(Azotobacterchroococcum)，巨胞氮單胞菌(Azotobactermacrocytogenes)，鹽居固氮菌(Azotobactersalinestris)，棕色固氮菌(Azotobactervinelandii)等；芽孢桿菌(Bacillus)屬的微生物，包括炭疽芽孢桿菌(Bacillusanthracis)，蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)，巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)，枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)等；貝日阿托氏菌(Beggiatoa)屬的微生物，包括白色貝日阿托氏菌(Beggiatoaalba)等；拜葉林克氏菌(Beijerinckia)屬的微生物，包括弗留明拜葉林克氏菌(Bejjerinckiafluminensis)，運動拜葉林克氏菌(Beijerinckiamobilis)等；貝內(nèi)克氏菌(Beneckea)屬的微生物，包括海蛹弧菌(Beneckeanereida)，海利斯頓氏菌(Beneckeapelagia)等；白日咳桿菌(Bordetellapertussis)；大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)；闊顯核菌(Caryophanonlatum)；柄桿菌(Caulobacter)屬的微生物，包括桿狀柄桿菌(Caulobacterbacteroides)，新月柄桿菌(Caulobactercrescentus)等；橙色綠曲撓菌(Chloroflexusaurantiacus)；綠膠藍細菌(Chlorogloea)屬的微生物，包括佛氏綠膠藍細菌(Chlorogloeafritschii)等；著色菌(Chromatium)屬的微生物，包括最細著色菌(Chromatiumminutissimum)，奧氏著色菌(Chromatiumokenii)，絳紅著色菌(Chromatiumpurpuratum)，微溫著色菌(Chromatiumtepidum)，酒色著色菌(Chromatiumvinosum)等；色桿菌(Chromobacterium)屬的微生物，包括紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum)等；梭菌(Clostridium)屬的微生物，包括肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)，楔形梭菌(Clostridiumsphenoides)等；叢毛單胞菌(Comamonas)屬的微生物，包括食酸叢毛單胞菌(Comamonasacidovorans)，睪丸酮叢毛單胞菌(Comamonastestosteroni)等；科里氏桿菌(Corynebacterium)屬的微生物，包括自養(yǎng)棒桿菌(Corynebacteriumautotrophicum)，烴氧化棒桿菌(Corynebacteriumhydrocarbooxydans)等；德克斯氏菌(Derxia)屬的微生物，包括膠德克斯氏菌(Derxiagummosa)等；雜食脫硫球菌(Desulfococcusmultivorans)；脫硫線菌(Desulfonema)屬的微生物，包括居泥脫硫線菌(Desulfonemalimicola)，巨大脫硫線菌(Desulfonemamagnum)等；可變脫硫八疊球菌(Desulfosarcinavariabilis)；脫硫弧菌(Desulfovibrio)屬的微生物，包括Desulfovibriocarbinolicus，食皂脫硫弧菌(Desulfovibriosapovorans)等；外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira)屬的微生物，包括鹽綠外硫紅螺菌(Ectothiorhodospirahalochloris)，運動外硫紅螺菌(Ectothiorhodospiramobilis)，沙氏外硫紅螺菌(Ectothiorhodospirashaposhnikovii)，小空泡外硫紅螺菌(Ectothiorhodospiravacuolata)等；氧化亞鐵亞鐵桿菌(Ferrobacillusferrooxidans)；黃桿菌(Flavobacteriumsp.)；流感桿菌(Haemophilusinfluenzae)；鹽桿菌(Halobacterium)屬的微生物，包括吉氏鹽桿菌(Halobacteriumgibbonsii)，沃氏鹽桿菌(Halobacteriumvolcanii)等；地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei)；Hydroclathratusclathratus；敏捷食酸菌(Hydrogenomonasfacilis)；氫嗜胞菌(Hydrogenophaga)屬的微生物，包括黃色氫嗜胞菌(Hydrogenophagaflava)，類黃色氫嗜胞菌(Hydrogenophagapseudoflava)，螺紋氫嗜胞菌(Hydrogenophagataeniospiralis)等；生絲微菌(Hyphomicrobium)屬的微生物，包括普通生絲微菌(Hyphomicrobiumvulgare)，札氏生絲微菌(Hyphomicrobiumzavarzinii)等；Ilyobacterdelafieldii；單-雙頭菌(Labrysmonachus)；乳酸桿菌(Lactobacillus)屬的微生物，包括短乳酸桿菌(Lactobacillusbrevis)，Lactobacillusbulgricys，干酪乳酸桿菌(Lactobacilluscasei)等；乳球菌(Lactococcus)屬的微生物，包括Lactococcuscremoris，乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)等；桃紅色閃囊菌(Lamprocystisroseopersicina)；透明俊片菌(Lampropediahyalina)；軍團菌(Legionellasp.)；生盤纖發(fā)菌(Leptothrixdiscophorus)；甲基桿菌(methylobacterium)屬的微生物，包括扭脫甲基桿菌(methylobacteriumextorquens)，嗜有機甲基桿菌(methylobacteriumorganophilum)，羅得西亞甲基桿菌(methylobacteriumrhodesianum)等；嗜熱甲基桿菌(methylococcusthermophilus)；小甲基胞囊菌(methylocystisparvus)；甲烷甲基單胞菌(methylomonasmethanica)；甲基彎曲菌(methylosinus)屬的微生物，包括生胞甲基彎曲菌(methylosinussporium)，發(fā)胞甲基彎曲菌(methylosinustrichosporium)等；索氏甲基弧菌(methylovibriosoehngenii)；微球菌(Micrococcus)屬的微生物，包括脫氮副球菌(Micrococcusdenitrificans)，鹽脫氮副球菌(Micrococcushalodenitrificans)等；微鞘藍細菌(Microcoleus)屬的微生物；微囊藍細菌(Microcystis)屬的微生物；莫拉氏菌(Moraxella)屬的微生物；分枝桿菌(Mycobacterium)屬的微生物，包括白色分枝桿菌(Mycobacteriumalbum)，母牛分枝桿菌(Mycobacteriumvaccae)等；紅色枝動菌(Mycoplanarubra)；硝化桿菌(Nitrobacter)屬的微生物，包括活躍假單胞菌(Nitrobacteragilis)，亞硝化膠桿菌(Nitrobacterwinogradskyi)等；硝化球菌(Nitrococcus)屬的微生物；奴卡氏菌(Nocardia)屬的微生物，包括白色奴卡氏菌(Nocardiaalba)，星狀奴卡氏菌(Nocardiaasteroides)，巴西奴卡氏菌(Nocardiabrasiliensis)，珊瑚奴卡氏菌(Nocardiacorallina)，嗜石油奴卡氏菌(Nocardiapetroleophila)等；泥生顫藍細菌(Oscillatorialimosa)；(脫氮副球菌(paracoccusdentrificans)；嗜鹽四聯(lián)球菌(Pediococcushalophilus)；Penicilliumcyclopium；發(fā)光桿菌(Photobacterium)屬的微生物，包括曼達帕姆發(fā)光桿菌(Photobacteriummandapamensis)，明亮發(fā)光桿菌(Photobacteriumphosphoreum)等；Physarumpolycephalum；扭脫原單胞菌(Protomonasextorquens)；假單胞菌(Pseudomonas)屬的微生物，包括銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，產(chǎn)堿假單胞菌(Pseudomonasalcaligenes)，鐵角蕨假單胞菌(Pseudomonasasplenii)，食丁酸假單胞菌(Pseudomonasbutamovora)，洋蔥伯克氏菌(Pseudomonascepacia)，香茅醇假單胞菌(Pseudomonascitronellolis)，暈斑假單胞菌(Pseudomonascoronafaciens)，德阿昆哈假單胞菌(Pseudomonasdacunhae)，脫氮假單胞菌(Pseudomonasdenitrificans)，缺陷短波單胞菌(Pseudomonasdiminuta)，刺狀假單胞菌(Pseudomonasechinoides)，熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens)，格氏假單胞菌(Pseudomonasglathei)，產(chǎn)靛假單胞菌(Pseudomonasindigofera)，萊氏假單胞菌(pseudomonaslemonnieri)，鼻疽伯克氏菌(Pseudomonasmallei)，Pseudomonasmarina，門多薩假單胞菌(pseudomonasmendocina)，Pseudomonasmixta，食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)，草酸假單胞菌(pseudomonasoxalaticus，假產(chǎn)堿桿菌假單胞菌(Pseudomonaspseudoalcaligenes)，Pseudomonaspseudoflava，惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)，食樹脂假單胞菌(Pseudomonasresinovorans)，嗜糖假單胞菌(Pseudomonassaccharophila)，施氏假單胞菌(Pseudomonasstutzeri)，丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)，嗜熱假單胞菌(Pseudomonasthermophilus)，綠黃假單胞菌(Pseudomonasviridiflava)等；Ralstonia屬的微生物，包括Ralstoniaeutropha(原名為真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)；Yabuuchi等，Microbiol.Immunol.,39:897-904,1995)；根瘤菌(Rhizobium)屬的微生物，包括山羊豆根瘤菌(Rhizobiumgalega)，Rhizobiumhedysarum，豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)，羽扇豆根瘤菌(Rhizobiumlupini)，中華根瘤菌(Rhizobiummeliloti)，菜豆根瘤菌(Rhizobiumphaseoli)，三葉草根瘤菌(Rhizobiumtrifoli)等；紅桿菌(Rhodobacillus)屬的微生物；紅細菌(Rhodobacter)屬的微生物，包括莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)，類球紅細菌(Rhodobactersphaeroides)等；紅球菌(Rhodococcus)屬的微生物，包括混濁紅球菌(Rhodococcusopacus)，紫紅紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)，赤紅球菌(Rhodococcusruber)等；紅環(huán)菌(Rhodocyclus)屬的微生物，包括膠狀紅環(huán)菌(Rhodocyclusgelatinosus)，纖紅紅環(huán)菌(Rhodocyclustenuis)等；萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobiumvannielii)；紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬的微生物，包括嗜酸紅假單胞菌(Rhodopseudomonasacidophila)，莢膜紅細菌(Rhodopseudomonascapsulata)，血色紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)等；紅螺菌屬的微生物(Rhodospirillum)，包括莫氏紅螺菌(Rhodospirillummolischianum)，深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)等；浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)；少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)；螺菌(Spirillum)屬的微生物，包括伊氏螺菌(Spirillumitersonii)，生脂螺菌(Spinllumlipoferum)，蔓延螺菌(Spinllumserpens)等；螺旋藍細菌(Spirulina)屬的微生物，包括強氏螺旋藍細菌(Spirulinajenneri)，最大螺旋藍細菌(Spirulinamaxima)，盤狀螺旋藍細菌(Spirulinaplatensis)，鹽澤螺旋藍細菌(Spirulinasubsalsa)等；葡萄球菌(Staphylococcus)屬的微生物，包括金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)，木糖葡萄球菌(Staphylococcusxylosus)等；星狀菌(Stella)屬的微生物，包括土壤星狀菌(Stellahumosa)，氣泡星狀菌(Stellavacuolata)等；嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus；鏈霉菌(Streptomyces)屬的微生物，包括抗生鏈霉菌(Streptomycesantibioticus)，天藍色鏈霉菌(Streptomycescoelicolor)，委內(nèi)瑞拉鏈霉菌(Streptomycesvenezuelae)等；聚球藍細菌(Synechococcus)屬的微生物；沃氏共養(yǎng)單胞菌(Syntrophomonaswolfei)；硫桿菌(ThiobaciUus)屬的微生物，包括嗜酸硫桿菌(Thiobacillusacidophilus)，善變硫桿菌(Thiobacillusversutus)等；莢硫菌(Thiocapsa)屬的微生物，包括普氏莢硫菌(Thiocapsapfennigii)等；紫囊硫菌(Thiocystisviolacea)；網(wǎng)硫菌(Thiodictyon)屬的微生物；泛養(yǎng)副球菌(Thiosphaerapantotropha)；鐵氏束毛藍細菌(Trichodesmimumthiebautii)；副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)；自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)；嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia)；動膠菌(Zoogloea)屬的微生物，包括生枝動膠菌(Zoogloearamigera)?？捎啥喾N微生物通過PHA的自降解制備的(R)-(-)-羥基羧酸單體可以是下述的一種或多種，以及任何其它的可按照微生物的培養(yǎng)過程中使用的碳源或化合物整合到PHA中的單體。(Lee,Biotechnol.Bioeng.,49:1-l4,1996；Steinbuchel和Valentin,FEMSMicnobiol.Lett.,128:219-228,1995以及其中引用的參考文獻)(R)-(-)-3-羥基丁酸，(R)-(-)-3-羥基戊酸，4-羥基丁酸，C6toC14中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸單體((R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基庚酸，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基壬酸，(1Z)-(-)-3-羥基癸酸，(R)-(-)-3-羥基十一烷酸，(R)-(-)-3-羥基十二烷酸和(R)-(-)-3-羥基十四烷酸)，3-羥基丙酸，(R)-(-)-3-羥基十六烷酸，(R)-(-)-4-羥基戊酸，(R)-(-)-4-羥基己酸，(R)-(-)-4-羥基庚酸，(R)-(-)-4-羥基辛酸，(R)-(-)-4-羥基癸酸，5-羥基戊酸，(R)-(-)-5-羥基己酸，(R)-(-)-6-羥基十二烷酸，(R)-(-)-3-羥基-4-戊烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4-反-己烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4-順-己烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5-己烯酸，(R)-(-)-3-羥基-6-反-辛烯酸，(R)-(-)-3-羥基-6-順-辛烯酸，(R)-(-)-3-羥基-7-辛烯酸，(R)-(-)-3-羥基-8-壬烯酸，(R)(-)-3-羥基-9-癸烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5-順-十二碳烯酸，(R)-(-)-3-羥基6-順-十二碳烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-7-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5,8-順-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4-甲基戊酸，(R)-(-)-3-羥基-4-甲基己酸，(R)-(-)-3-羥基-5-甲基己酸，(R)-(-)-3-羥基-6-甲基庚酸，(R)-(-)-3-羥基-4-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-5-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-6-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-6-甲基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-8-甲基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基癸酸，(R)-(-)-3-羥基-9-甲基癸酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸，蘋果酸，(R)-(-)-3-羥基琥珀酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基己二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基辛二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基壬二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基癸二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基辛二酸-乙基酯，(R)-(-)-3-羥基癸二酸-乙基酯，(R)-(-)-3-羥基庚二酸-丙基酯，(R)-(-)-3-羥基癸二酸芐基酯，(R)-(-)-3-羥基-8-乙酰氧基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-9-乙酰氧基壬酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基丁酸，苯氧基(R)-(-)-3-羥基戊酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基庚酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基辛酸，對-氰基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基丁酸，對-氰基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基戊酸，對-氰基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基己酸，對-硝基苯氧基(R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸，(R)-(-)-3-羥基-5-環(huán)己基丁酸，(R)-(-)-3，12-二羥基十二烷酸，(R)-(-)-3,8-二羥基-5-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4,5-環(huán)氧癸酸，(R)-(-)-3-羥基-6,7-環(huán)氧十二烷酸，(R)-(-)-3-羥基-8,9-環(huán)氧-5,6-順-十四烷酸，7-氰基-(R)-(-)-3-羥基庚酸，9-氰基-(R)-(-)-3-羥基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-7-氟庚酸，(R)-(-)-3-羥基-9-氟壬酸，(R)-(-)-3-羥基-6-氯己酸，(R)-(-)-3-羥基-8-氯辛酸，(R)-(-)-3-羥基-6-溴己酸，(R)-(-)-3-羥基-8-溴辛酸，(R)-(-)-3-羥基-11-溴十一烷酸，3-羥基-2-丁烯酸，(R)-(-)-6-羥基-3-十二碳烯酸，(R)-(-)-3-羥基-2-甲基丁酸，(R)-(-)-3-羥基-2-甲基戊酸和(R)-(-)-3-羥基-2,6-二甲基-5-庚烯酸。在上述的PHA的單體中，3-羥基丙酸，4-羥基丁酸，5-羥基戊酸和3-羥基-2-丁烯酸不具有手性中心，因而它們沒有光學(xué)異構(gòu)體。其它的具有手性中心的單體全部以(R)-(-)-的形式存在。作為優(yōu)選的實施例，在上述各種單體中通過自降解產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸，(R)-(-)-3-羥基丁酸/4-羥基丁酸，(R)-(-)-3-羥基丁酸/(R)-(-)-3-羥基戊酸，C6至C14的(R)-(-)-羥基羧酸單體和(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸。詳細地說，通過培養(yǎng)廣泛產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123,Ralstoniaeutropha(原名為真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))NCIMB11599,Ralstoniaeutropha(原名為真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))H16ATCC17699，棒狀菌(Corynebacteriumsp.)SS-15(Hur等，Kor.J.Biotechnol.Bioeng.,12:554-559,1997)，芽孢桿菌(Bacillussp.)SS-19(Hur等，Kor.J.Biotechnol.Bioeng.,12:554-559,1997),發(fā)孢甲基彎曲菌(Methylosinustrichosporium)KCTC2591，深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)KCTCl372，食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)ATCC29347，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1DSMl707或者重組的具有擴增的PHA生物合成酶活性的Ralstoniaeutropha(Choi和Lee,HwahakKonghak,35:684-689,1997)在含有適當(dāng)碳源的培養(yǎng)基中合成PHB和其它的PHA。然后通過離心收集培養(yǎng)的細胞，分散于降解溶液中，并在各種條件下進行自降解。最后測定制備的單體的濃度。結(jié)果證實了(R)-(-)-羥基羧酸單體可通過PHA的自降解進行有效的制備，并且確定了適當(dāng)降解的條件。制備(R)-(-)-羥基羧酸的適當(dāng)?shù)慕到鈼l件是在微生物是廣泛產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123的情況下，降解溶液的pH值是2-11，優(yōu)選2-5，最優(yōu)選3-4，反應(yīng)溫度是4-55℃，優(yōu)選30-50℃，最優(yōu)選37℃。反應(yīng)時間是30分鐘-10小時；在微生物是RalstoniaeutrophaNCIMB11599(RalstoniaeutrophaH16ATCC17699的葡萄糖利用突變株)，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是20小時或更多；在微生物是棒狀桿菌(Corynebacteriumsp.)SS-15的情況下，降解溶液的pH是5-9，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是2-30小時；在微生物是芽孢桿菌(Bacillussp.)SS-19的情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是10小時；在微生物是MethylosinustrichosporiumKCTC2591的情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是20小時或更多；在微生物是深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)KCTC1372情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是20小時或更多；在微生物是RalstoniaeutrophaH16ATCC17699的情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是20小時或更多；和在微生物是具有擴增的PHA生物合成酶活性的重組Ralstoniaeutropha的情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是20小時或更多。用于制備(R)-(-)-3-羥基丁酸/4-羥基丁酸的適當(dāng)?shù)淖越到鈼l件是在微生物是廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123的情況下，降解溶液的pH低于7，優(yōu)選2-5，反應(yīng)溫度是30-40℃，優(yōu)選37℃，反應(yīng)時間是30分鐘-10小時。此外，用于制備(R)-(-)-3-羥基丁酸/(R)-(-)-3-羥基戊酸的適當(dāng)?shù)淖越到鈼l件是在微生物是RalstoniaeutrophaNCIMB11599的情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是20小時或更多。用于制備C6至C14的(R)-(-)-羥基羧酸單體適當(dāng)?shù)淖越到鈼l件是在微生物是食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)ATCC29347或者銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PAO1DSM1707，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是10小時或更多。用于制備(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸的適當(dāng)?shù)淖越到鈼l件是在微生物是食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)ATCC29347的情況下，降解溶液的pH是2-12，反應(yīng)溫度是30-40℃，反應(yīng)時間是10小時或更多。通過使用多種微生物和碳源/化合物可很簡便地制備其它的單體(Lee,Biotechnol.Bioeng.,49:1-14,1996；Steinbuchel和Valentin,FEMSMicrobiol.Lett.,128:219-228,1995)。在本發(fā)明中，高濃度的PHA也進行自降解，產(chǎn)生高濃度的相應(yīng)的單體，而且，產(chǎn)生單體的效率可通過在堿性條件下熱降解殘留的二聚體而得到改善。它是在PHA的自降解過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品。水，水和有機溶劑的混合物或者具有或者沒有各種鹽的緩沖液可被用作降解溶液。由于所使用的降解溶液的不同而帶來的差異是不存在的或可忽略不計，但是為了便于單體的分離和純化，優(yōu)選使用水。如果被降解的PHA為共聚物，在上述條件下自降解的產(chǎn)物是單體的混合物。這些單體可容易地通過各種常規(guī)的方法進行分離，例如離子交換，電透析，提取，蒸餾，液相色譜(LC)和高效液相色譜(HPLC)，優(yōu)選使用LC或者HPLC。將純凈分離的(R)-(-)-羥基羧酸通過常規(guī)的方法進一步純化，例如有機溶劑提取，并通過常規(guī)的方法制粉，例如干燥加工。詳細地說，諸如氫氧化鈉或者氫氧化鉀的強堿被加入到純凈的(R)-(-)-羥基羧酸溶液中，這是通過自降解制備的，并將溶液的pH調(diào)節(jié)至大于9。然后除去被抽提進有機相的雜質(zhì)，并將保留在水相中的(R)-(-)-羥基羧酸干燥，得到終粉末產(chǎn)物，純度為90％或者更高。下文將通過實施例對本發(fā)明進行進一步的說明，它不限定權(quán)利要求的保護范圍。&lt;實施例1&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是在廣泛產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneslatus)中合成并積累的確定由廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123合成的PHB自降解的適當(dāng)條件。首先將微生物培養(yǎng)在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基上，以批量的形式積累PHB。該培養(yǎng)基示于表1，在氮氣限定的條件下添加了30g/l的蔗糖，并通過離心收集培養(yǎng)的細胞。在細胞中積累的PHB通過下文所述的方法進行自降解。然后測定在多種條件下產(chǎn)生的(R)-(-)-3-羥基丁酸及其二聚體的濃度。在自降解的過程中檢測了幾種因素，包括降解溶液的ph(表2)，碳源和攪拌(表3和表4)和自降解的溫度(表5和表6)。當(dāng)自降解是在pH4.0和37℃并在沒有攪拌(并且沒有氧氣)的條件下進行時可最有效地制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。作為降解溶液，比較了水和基于沒有碳源的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的各種鹽溶液，用各種酸(鹽酸，硫酸，乙酸)或者堿(氫氧化鈉，氨水)，或者緩沖液(40mM磷酸鹽緩沖液，40mM乙酸鹽緩沖液，40mM檸檬酸鹽緩沖液，Tris-HCl緩沖液，MOPS緩沖液)調(diào)節(jié)其pH。只要pH相同，降解溶液的不同沒有產(chǎn)生任何差異或者所產(chǎn)生的差異可以忽略不計(產(chǎn)率的最大差異小于3％)。因而，考慮到對隨后的分離和純化過程的有利的影響，在下文的所有實施例中均使用pH-調(diào)節(jié)的水。表1.化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基的成分表2.通過變化降解溶液的pH得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸(3HB)及其二聚體的濃度(最初的PHB濃度1.07g/l，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時間30分鐘)。表3．通過變化蔗糖濃度帶有或不帶有攪拌(最初的pHB濃度1.01g/l，最初的pH7.0，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時間8小時)得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸(3HB)及其二聚體的濃度，產(chǎn)率和最終的pH。表4．通過變化蔗糖濃度帶有或不帶有攪拌(最初的PHB濃度1.07g/l，最初的pH4.0，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時間30分鐘)得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸(3HB)及其二聚體的濃度和產(chǎn)率。表5．通過改變反應(yīng)溫度(最初的pHB濃度10.9g/1，最初的pH7.0)得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸(3HB)濃度的時間依賴性變化表6.在不同的反應(yīng)溫度(最初的PHB濃度1.07g/l，最初的pH4.0，反應(yīng)時間30分鐘)得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸(3HB)及其二聚體的濃度和產(chǎn)率此外，測定了隨著pH和反應(yīng)時間的變化(R)-(-)-3-羥基丁酸的產(chǎn)生量，這是在初始pH被調(diào)節(jié)在7.0的降解溶液中進行的，以詳細研究降解溶液的pH和自降解反應(yīng)之間的關(guān)系(圖1)。如圖1所示，PHB的自降解對降解溶液的pH非常敏感。當(dāng)初始pH被調(diào)節(jié)至7時，在開始的時候PHB的降解幾乎難以發(fā)生，但隨著pH的降低，反應(yīng)逐漸加速(在反應(yīng)開始6小時后pH快速降低，并且(R)-(-)-3-羥基丁酸快速產(chǎn)生)。在一個在pH7運行的發(fā)酵器中進行的自降解反應(yīng)也觀察到相似的pH效應(yīng)(圖2)。即將含有PHB的細胞(PHB濃度為10.1g/l)裝入發(fā)酵器并在氮氣氛中進行反應(yīng)。然后通過加入4NNaOH將pH調(diào)節(jié)至7.0進行自降解反應(yīng)。在30小時后也僅有16％的PHB被降解，因而僅得到2g/l的(R)-(-)-3-羥基丁酸。因而，可以得出結(jié)論，對于通過PHB(由廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123合成)的自降解產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸來說，降解溶液pH是最重要的一個因素，并且也得出結(jié)論，低pH條件加速PHB自降解成它的單體(R)-(-)-3-羥基丁酸。如上文所示，通過在不同條件下PHB的自降解可有效制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。特別是當(dāng)初始pH為4，反應(yīng)溫度為34-50℃時，可在30分鐘內(nèi)得到大于90％的單體產(chǎn)率。這些結(jié)果顯著高于Akira和Tatsuhiko(JP9-234091,1997)報道的結(jié)果，其結(jié)果為在6-8天的長時間內(nèi)僅得到2-8％的產(chǎn)率。此外，將通過HPLC分析得到的產(chǎn)物的保留時間(retentiontime)與購自SigmachemicalCo.(USA)的3-羥基丁酸的外消旋混合物的保留時間進行比較，以證實該產(chǎn)物為(R)-(-)-3-羥基丁酸(圖5和圖7)。兩種樣品均是在12.9分鐘在相同的操作條件下檢測的，證實了該產(chǎn)物為3-羥基丁酸。這一點進一步被核磁共振(NMR)證實(參考實施例18)。同樣，通過在其它的廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)菌株，包括廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1122和廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1124，中積累的PHB的自降解也可以80-90％的產(chǎn)率制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。&lt;實施例2&gt;通過高濃度的PHB的自降解制備高度純化的(R)-(-)-3-羥基丁酸，這是在廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)中合成并積累的，以及作為副產(chǎn)物產(chǎn)生的二聚體的降解因而，在這一實施例中，廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123可以批量喂料的方式進行培養(yǎng)，并按照已經(jīng)報道的方式生產(chǎn)高濃度的PHB(Wang和Lee,Appl.Environ.Microbiol.,63:3703-3706,1997)。然后，將PHB調(diào)節(jié)至115.3g/l的高濃度，并在pH4，37℃進行自降解1小時。結(jié)果，得到117.8g/l的(R)-(-)-3-羥基丁酸(產(chǎn)率84％)和15.2g/l的二聚體(產(chǎn)率12％)。因而可以得出結(jié)論，高濃度的PHB也可被用于通過自降解高效率地制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。如實施例2-1和實施例2-2所示，可從高濃度的PHB高效率地制備高濃度的(R)-(-)-3-羥基丁酸，并且如果需要，可通過在堿性條件下二聚體的降解進一步提高產(chǎn)率。&lt;實施例3&gt;通過聚(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯共聚物的自降解制備單體，它是在廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)中合成并積累的將廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123培養(yǎng)在化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有10g/l蔗糖和3g/l4-羥基丁酸。細胞積累聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯至70％細胞干重，其中12mol％的聚合物為4-羥基丁酸酯。離心收集培養(yǎng)的細胞，分散在自降解溶液中，共聚物濃度為21g/l，進行自降解。當(dāng)自降解是在初始pH為4，在37℃進行4小時時，13.6g/l的(R)-(-)-3-羥基丁酸和2.4g/l的4-羥基丁酸。產(chǎn)率分別為68％和79％。同樣，通過聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯的自降解可產(chǎn)生兩種單體。這是按照Hiramitsu等(Biotechnol.Lett.,15:461-464，1993)已經(jīng)報道的方法，在蔗糖和γ-丁內(nèi)酯上培養(yǎng)廣泛產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123產(chǎn)生的因而，可通過聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯的自降解高效率地制備(R)-(-)-3-羥基丁酸和4-羥基丁酸，并且可使用LC或者HPLC(參考實施例16)進行純凈分離。&lt;實施例4&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是在Ralstoniaeutropha中合成并積累的Ralstoniaeutropha(原名真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))NCIMB11599(Yabuuchi等,Microbiol.Immunol.,39:897-904,1995)，是一種RalstoniaeutrophaH16ATCC17699的葡萄糖利用突變菌株，按照已經(jīng)報道的方法(Kim等,Biotechnol.Bioeng.,43:892-898,1994)在氮氣限定條件下進行培養(yǎng)，得到含有高達70％細胞干重PHB的細胞。將PHB的濃度調(diào)節(jié)至34g/l并在30℃在初始pH為4.0或者7.0的條件下自降解34小時。當(dāng)初始為4.0時，產(chǎn)生5.2g/l的(R)-(-)-3-羥基丁酸和0.4g/l的二聚體。當(dāng)初始pH為7.0時，產(chǎn)生9.3g/l的(R)-(-)3-羥基丁酸和0.9g/l的二聚體?？偖a(chǎn)率分別為14％和25％。在Ralstoniaeutropha的情況下PHB的降解不完全，這不同于廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)。而且，單體產(chǎn)生的條件也不同于廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)。然而，通過在Ralstoniaeutropha積累的PHB的自降解可以產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸，雖然使用Ralstoniaeutropha的生產(chǎn)條件與廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)使用的生產(chǎn)條件相比不太有效。&lt;實施例5&gt;通過聚(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-(R)-(-)-3-羥基戊酸酯的自降解生產(chǎn)單體，它是在Ralstoniaeutropha中合成并積累的將RalstoniaeutrophaNCIMB11599，按照已經(jīng)描述的方法(Kim等，EnzymeMicrobial.Technol.,16:556-561,1994)培養(yǎng)在含有10g/l葡萄糖和1g/l丙酸的培養(yǎng)基中。聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯-共聚-(R)-(-)-3-羥基戊酸酯(PHB/V)共聚物(含有8mol％(R)-(-)-3-羥基戊酸酯)積累至細胞干重的63％，自降解產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸和(R)-(-)-3-羥基戊酸。將細胞分散在水中，共聚物濃度為27.4g/l。自降解反應(yīng)在pH7和30℃進行35小時。結(jié)果得到5.8g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸和0.6g/l(R)-(-)-3-羥基戊酸。因而，通過共聚物的自降解可有效地從積累的PHB/V聚合物制備(R)-(-)-3-羥基丁酸和(R)-(-)-3-羥基戊酸的混合物，并且可使用LC或者HPLC進行分離(參考實施例16)。&lt;實施例6&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是在Corynebacteriumsp.中合成并積累的Corynebacteriumsp.SS-15[Hur等，Kor.J.Biotechnol.Bioeng.,12:554-559,1997；該菌株可從DepartmentofChemicalEngineeringofKAIST(KoreaAdvancedInstituteofScienceandTechnologyinKorea)獲得]，它是從土壤中分離的，并被培養(yǎng)在含有20g/l木糖作為碳源的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3天。PHB積累至33％細胞干重。通過離心收集細胞，并分散在pH被調(diào)節(jié)至4.0,7.0或者10.0的水中，得到初始PHB濃度3.4g/l并保持在30℃。檢測(R)-(-)-3-羥基丁酸形成的時間曲線(圖3)。當(dāng)初始pH為7.0時，在反應(yīng)開始41小時后得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸的最大量為3.42g/l，單體產(chǎn)率為83％。因而，通過在Corynebacteriumsp.,一種格蘭氏陽性細菌，中積累的PHB的自降解可有效產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸。&lt;實施例7&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是在Bacillussp.中合成并積累的Bacillussp.SS-19[Hur等，Kor.J.Biotechnol.Bioeng.,12:554-559,1997；該菌株可從DepartmentofChemicalEngineeringofKAIST(KoreaAdvancedInstituteofScienceandTechnologyinKorea)獲得]，它是從土壤中分離的，并被培養(yǎng)在含有20g/l木糖作為碳源的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)3天。PHB積累至15％細胞干重。通過離心收集細胞，并分散在pH被調(diào)節(jié)至4.0,7.0或者10.0的水中，得到1.4g/l的初始PHB濃度，并保持在30℃。檢測(R)-(-)-3-羥基丁酸形成的時間曲線(圖4)。當(dāng)初始pH為7.0時，在反應(yīng)開始20小時后得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸的最大量為0.96g/l，單體產(chǎn)率為57％。因而，通過在Bacillussp.，一種格蘭氏陽性細菌，中積累的PHB的自降解可有效產(chǎn)生(R)-(-)-3-羥基丁酸。&lt;實施例8&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是在Methylosinustrichosporium中合成并積累的在上述實施例中，所使用的細菌為需氧的或兼性需氧的。但本實施例中的MethylosinustrichosporiumKCTC2591為厭氧性和甲基利用性細菌，將其按照Whang和Park(Whang和Park,Kor.J.Biotechnol.Bioeng.,11:246-253,1996)的方法進行培養(yǎng)，直至細胞濃度達到1.lg細胞干重/L，其中PHB含量為細胞干重的10％。在自降解之前將PHB濃度調(diào)節(jié)至10.5g/l，然后使用與前述實施例(實施例1-7)相同的方法在pH4和37℃通過積累的PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。結(jié)果在24小時后，得到1.15g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸，產(chǎn)率9％。因而證實，通過甲烷利用型厭氧微生物積累的PHB的自降解也可以制備(R)-(-)-3-羥基丁酸(即使效率較低)。&lt;實施例9&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是光合成微生物Rhodospirillumrubrum合成并積累的RhodospirillumrubrumKCTC1372是厭氧和光合成細菌。將其按照Hashimoto等(Hashimoto等，J.Chem.Eng.Japan,26:56-58,1993)的方法進行培養(yǎng)。140小時后，得到1.5g細胞干重/L的細胞，其中PHB含量為細胞干重的16％。使用與前述實施例(實施例1-8)相同的方法在pH4和37℃進行PHB的自降解。結(jié)果在24小時后，得到1.61g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸，產(chǎn)率11％。因而證實，通過光合成細菌積累的PHB的自降解也可以制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。&lt;實施例10&gt;通過PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，它是在RalstoniaeutrophaH16(ATCC17699)，果糖利用型菌株中合成并積累的RalstoniaeutrophaH16(原名真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)H16)ATCC17699，它利用果糖作為碳源，將其按照Hughes等(Hughes等，美國專利4433053,1984)的方法進行培養(yǎng)。70小時后，細胞濃度和PHB含量分別達到42g細胞干重/L和65％。在pH7和30℃使用濃縮至42g/l的PHB進行自降解。結(jié)果在36小時后得到11.7g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸，產(chǎn)率23％。因而證實，通過培養(yǎng)利用果糖作為碳源的野生型Ralstoniaeutropha積累的PHB的自降解也可以制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。&lt;實施例11&gt;通過PHA的自降解制備光學(xué)活性中等鏈長的羥基羧酸，它是在食油假單胞菌Pseudomonasoleovorans中合成并積累的已有報道表明由C6至C14的中等鏈長的羥基羧酸(HA)組成的PHA可在假單胞食油菌(Pseudomonasoleovorans)中在烷羧酸酯，醇類，烷醇類，烷烴類，烷烯類中作為碳源培養(yǎng)時進行合成并積累，并且PHA聚合物中單體的種類或組成可根據(jù)所使用的碳源的不同而改變(Brandl等，Appl.Environ.Microbiol.,54:1977-1982,1988；Steinbuchel,In:Biomaterials,Byrom,Eds.,MacMillanPublishers,Busingstoke,1991；Lee,Biotechnol.Bioeng.,49:1-14,1996)。例如,如果己酸被用作碳源，合成的PHA由3-羥基己酸(C6)；3-羥基庚酸(C7)；3-羥基辛酸(C8)；和3-羥基癸酸(C10)組成，它們?nèi)繛?R)-(-)構(gòu)型。在上述單體中3-羥基己酸是最主要的單體，約占82mol％。3-羥基辛酸的比率是17mol％，3-羥基庚酸和3-羥基癸酸的比率少至1mol％。如果庚酸被用作碳源，合成的PHA由六種單體組成(3-羥基己酸，3-羥基庚酸，3-羥基辛酸，3-羥基壬酸，3-羥基癸酸，3-羥基十一烷酸)，它們是C6至C11的化合物，全部為(R)-(-)構(gòu)型。在上述單體中(R)-(-)-3-羥基庚酸是主要的單體，為94mol％。如果辛酸被用作碳源，合成的PHA有相同數(shù)量的碳化合物組成，即(R)-(-)-3-羥基己酸(C6)，(R)-(-)-3-羥基辛酸(C8)，和(R)-(-)-3-羥基癸酸(C10)。其中(R)-(-)-3-羥基辛酸是最主要的單體，為86mol％。(R)-(-)-3-羥基己酸的比率是10mol％，(R)-(-)-3-羥基癸酸的比率為4mol％。特別是在這種情況下，合成的聚合物被方便地稱作聚-(R)-(-)-3-羥基己酸酯-共聚-(R)-(-)-3-羥基辛酸酯，因為在該合成的PHA中含有的大多數(shù)單體為(R)-(-)-3-羥基辛酸和(R)-(-)-3-羥基己酸。如果壬酸被用作碳源，合成的PHA與使用庚酸的情況相同，由六種單體組成。(R)-(-)-3-羥基壬酸是主要的單體，為58mol％。(R)-(-)-3-羥基庚酸，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸的比率以及(R)-(-)-3-羥基己酸的比率分別為31,6,3和1mol％。同時也存在少量的(R)-(-)-3-羥基十一烷酸。如果癸酸被用作碳源，合成的PHA由五種單體組成，它們?yōu)镃6,C8,C9,C10和C11。(R)-(-)-3-羥基辛酸是主要的單體，為63mol％。(R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸，(R)-(-)-3-羥基十一烷酸的比率以及(R)-(-)-3-羥基壬酸的比率分別為20,11,3和1mol％。因而，優(yōu)選(R)-(-)-3-羥基己酸是從己酸制備的；(R)-(-)-3-羥基庚酸是從庚酸制備的；(R)-(-)-3-羥基辛酸是從辛酸制備的；(R)-(-)3-羥基壬酸是從壬酸制備的；和(R)-(-)-3-羥基癸酸和(R)-(-)-3-羥基十一烷酸是從癸酸制備的。在本實施例中，辛酸鈉或者壬酸被用作碳源，以產(chǎn)生中等鏈長的PHA，并通過自降解制備它們的單體。將假單胞食油菌(Pseudomonasoleovorans)ATCC29347培養(yǎng)在僅含有辛酸鈉或者壬酸作為碳源的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，按照已經(jīng)描述的方法(Lee,Biotechnol.BioprocessEng.,1:51-53,1996)進行培養(yǎng)。細胞中共聚物積累至5％至40％細胞干重。當(dāng)使用辛酸鈉作為碳源時，細胞中PHA共聚物積累至20％細胞干重。當(dāng)壬酸被用作碳源時，細胞中PHA共聚物積累至18％細胞干重。將通過離心收集的細胞分散在水中，將pH調(diào)節(jié)至7.0，濃度為75克細胞干重/L，在30℃進行自降解4天(表7和表8)。表7通過PHA的自降解制備中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸，該PHA是在PseudomonasoleovoransATCC29347通過在辛酸鈉作為碳源的培養(yǎng)中產(chǎn)生的(初始pH7.0，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間4天)。<tablesid="table7"num="007"><table>單體聚合物中的摩爾比率(％)產(chǎn)生量(g/l)產(chǎn)率(％)(R)-(-)-3-羥基己酸100.139.2(R)-(-)-3-羥基辛酸861.429.7(R)-(-)-3-羥基癸酸4-0</table></tables>表8通過PHA的自降解制備中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸，該PHA是在PseudomonasoleovoransATCC29347通過在壬酸作為碳源的培養(yǎng)中產(chǎn)生的(初始pH7.0，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間4天)。<tablesid="table8"num="008"><table>單體聚合物中的摩爾比率(％)產(chǎn)生量(g/l)產(chǎn)率(％)(R)-(-)-3-羥基己酸1-0(R)-(-)-3-羥基庚酸310.358.3(R)-(-)-3-羥基辛酸6-0(R)-(-)-3-羥基壬酸580.899.47(R)-(-)-3-羥基癸酸3-0</table></tables>如表7和表8所示，通過自降解產(chǎn)生的單體的產(chǎn)率為8-10％。截至目前，還沒有關(guān)于生產(chǎn)中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸的方法的報道。中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸可通過本發(fā)明公開的方法進行制備，雖然效率稍微低于(R)-(-)-3-羥基丁酸。而且，其它中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸單體也可在PHA積累過程中通過改變碳源來制備。&lt;實施例12&gt;通過PHA的自降解制備光學(xué)活性的中等鏈長的羥基羧酸，它是在Pseudomonasaeruginosa中合成并積累的根據(jù)已有的報道，使用乙酸作為碳源培養(yǎng)PseudomonasaeruginosaAO232時，由C6,C8,C10和C12化合物((R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸和(R)-(-)-3-羥基十二烷酸)組成的PHA被合成并積累；并且使用丙酸作為碳源，由C6-C12化合物的七種不同的單體((R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)3-羥基庚酸，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基壬酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸，(R)-(-)-3-羥基十一烷酸和(R)-(-)-3-羥基十二烷酸)組成的PHA被合成并積累(Saito和Doi,int.JBiol.Macromol.,15:287,1993；Lee和Chang,Adv.Biochem.Eng.,52:27-58,1995)。此外，據(jù)報道，由含有PseudomonasaeruginosaPAO1的PHA合成酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的Pseudomonasputida當(dāng)使用葡萄糖酸鹽作為碳源培養(yǎng)時可合成由單體C6,C8,C10和C12化合物((R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸和(R)-(-)-3-羥基十二烷酸)組成的PHA(Timm和Steinbuchel,Eur.J.Biochem.,209:15-30,1992)。因而，可以斷定使用Pseudomonasaeruginosa通過自降解可制備多種中等鏈長的(R)-(20)-3-羥基羧酸，特別是可以制備(R)-(-)-3-羥基十二烷酸。在本實施例中，將PseudomonasaeruginosaPAO1DSM1707培養(yǎng)在含有葡萄酸鹽作為碳源的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基中，如(Timm和Steinbuchel,Eur.JBiochem.,209:15-30,1992)所述，然后將細胞分散在水中，PHA濃度為15g/l,pH被調(diào)節(jié)至7.0。在30℃進行自降解4天來制備中等鏈長的羥基羧酸(表9)。表9通過PHA的自降解制備中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸，該PHA是在PseudomonasaeruginosaPAO1DSM1707中通過在葡萄酸鹽作為碳源的培養(yǎng)中產(chǎn)生的(初始pH7.0，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間4天)。如表9所示，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸和(R)-(-)3-羥基十二烷酸可以6至10％的產(chǎn)率產(chǎn)生，并且這三種化合物可通過LC或者HPLC進行分離。因而，中等鏈長的(R)-(-)-3-羥基羧酸可通過在Pseudomonasaeruginosa中積累的PHA的自降解來制備。特別是本實施例提供了制備(R)-(-)-3-羥基癸酸和(R)-(-)-3-羥基十二烷酸的方法。&lt;實施例13&gt;通過PHA的自降解制備光學(xué)活性中等鏈長的羥基烷酸和(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸，該PHA是在假單胞食油菌(Pseudomonasoleovorans)中通過使用5-苯基戊酸和壬酸作為共底物合成并積累的在本實施例中，檢測含有稀有單體組成成分的PHA是否可進行自降解，產(chǎn)生相應(yīng)的光學(xué)活性單體。據(jù)報道(Fritzsche等，Makromol.Chem.,191:1957,1990；Kim等，Macromol.,24:5256,1991),Pseudomonasoleovorans當(dāng)在5-苯基戊酸的存在下生長時可產(chǎn)生含有光學(xué)活性3-羥基-5-苯基戊酸單體的PHA。在本實施例中，PseudomonasoleovoransATCC29347本生長在混合底物中(總量10mM,5-苯基戊酸與壬酸的摩爾比為2∶1)。PHA最終含量為22％，3-羥基-5-苯基戊酸單體在PHA中的比率為35mol％。將含有PHA的細胞收集并懸浮在水中(初始pH被調(diào)節(jié)至7.0)，初始PHA濃度為20g/l，并在37℃培養(yǎng)4天。產(chǎn)生的(R)-(-)-3-羥基庚酸，(R)-(-)-3-羥基壬酸和(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸的量分別為0.18,0.65和0.62g/l，產(chǎn)率分別為7.0％,8.1％和8.0％。本實施例表明，(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸單體雖然在微生物PHA中不常見，可通過含有這種單體的PHA的自降解產(chǎn)生。從這一結(jié)果可以看出，在微生物中積累的不常見的PHA可通本發(fā)明的描述的自降解方法進行降解得到相應(yīng)的光學(xué)活性的單體。如以上實施例所述，通過在多種微生物中積累的PHA的自降解可有效產(chǎn)生多種(R)-(-)羥基羧酸。單體的產(chǎn)率高使該方法具有經(jīng)濟價值。對于(R)-(-)-3-羥基丁酸來說，本發(fā)明描述的方法的單體的產(chǎn)生效率可與以前描述的方法(Akira和Tatsuhiko(JP9-234091,1997))比較。如下文中的綜述所示(表10)，本發(fā)明的方法得到的(R)-(-)-3-羥基丁酸的產(chǎn)率比JP9-234091描述的方法高50倍。因而，本發(fā)明描述的方法提供了一種制備(R)-(-)-3-羥基丁酸的更為經(jīng)濟和有效的方法。而且，本發(fā)明的方法不限于制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，并且可被用于制備多種(R)-(-)-羥基羧酸，如上文實施例所述?？梢悦黠@看出，任何一種積累PHA并具有細胞內(nèi)解聚酶活性的微生物可被用于制備多種(R)-(-)-羥基羧酸。而且，還可以明顯看出，上述微生物的突變菌株也可用于制備(R)-(-)-羥基羧酸，只要它們具有細胞內(nèi)PHA解聚酶活性。表10由自降解產(chǎn)生的(R)-(-)-3-羥基丁酸的產(chǎn)率的總結(jié)*“對比實施例1”和“對比實施例2”為日本專利JP9-234091中報道的計算結(jié)果，假定PHB含量相對于細胞干重為約50-80％。&lt;實施例14&gt;通過PHB的降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸，該PHB是在重組Ralstoniaeutropha中合成并積累的在上述實施例中(實施例1至實施例13)，提供了通過PHA聚合物的自降解制備(R)-(-)-羥基羧酸的方法，它們是在非重組微生物中合成并積累的。最近，已有幾個報道，其中將來自幾種微生物的PHA生物合成基因進行克隆，并用于提高含有擴增的PHA生物合成酶活性的重組微生物中聚合物的產(chǎn)生(Lee,Biotechnol.Bioeng.,49:1-14,1996；Lee,TrendsBiotechnol,14:431-438,1996；Steinbuchel等，F(xiàn)EMSMicrobiol.Rev.,103:217-230,1992以及其中引用的參考文獻)。在本實施例中，可合成并積累PHA的重組微生物可用于通過自降解制備(R)-(-)-羥基羧酸。將RalstoniaeutrophaNCIMB11599用寬宿主范圍質(zhì)粒pVK101(Knauf和Nester,Plasmid,8:45,1982)轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒含有RalstoniaeutrophaATCC17699的PHA生物合成基因(Schubert等，J.Bacteriol.,170:5837-5847,1988；Choi和Lee,HwahakKonghak,35:684-689,1997),將其按照已經(jīng)報道的方法進行培養(yǎng)(Kim等，Biotechnol.Bioeng.,43:892-898,1994)。細胞積累PHB至66％細胞干重。將細胞通過離心進行收集并分散在水中，將pH調(diào)節(jié)至4.0或者7.0，得到30g/l的初始PHB濃度，并保持在30℃，35小時。當(dāng)初始pH為4.0時，得到5g/l的(R)-(-)-3-羥基丁酸和0.3g/l的二聚體，而當(dāng)pH為7.0時得到8.7g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸和0.6g/l二聚體。產(chǎn)率分別為14.7％和26.8％。因而，可以證實，重組微生物，只要它們具有細胞內(nèi)解聚酶活性，也可被用于通過在重組微生物中積累的PHA的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。&lt;實施例15&gt;含有異源性PHA生物合成基因的重組大腸桿菌(Escherichiacoli)中合成并積累的PHB的自降解實施例14中使用的宿主微生物，Ralstoniaeutropha(原名真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))NCIMB11599即使在用PHA生物合成基因轉(zhuǎn)化之前也具有天然的PHA合成活性。在本實施例中，兩種不具有天然的PHA合成活性(因而不能積累細胞內(nèi)PHA)的Escherichiacoli菌株被用作宿主微生物，并使用含有RalstoniaeutrophaH16ATCC17699或者廣泛產(chǎn)堿桿菌(Alcaligeneslatus)DSM1123的PHA生物合成基因進行轉(zhuǎn)化。在本實施例中使用重組大腸桿菌BATCC11303和大腸桿菌XLl-Blue(StratageneCloningSystems,LaJolla,CA92037)，并使用含有真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus)PHA生物合成基因的高-拷貝-數(shù)量質(zhì)粒pSYL105(Lee等，Biotechnol.Bioeng.,44:1337-1347,1994)或者含有廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)PHA生物合成基因的質(zhì)粒pJC4(KCTC0481BP)(Choi等，Appl.Environ.Microbiol.,inpress(December,1998)；Lee等，韓國專利申請No.98-1423,1998)進行轉(zhuǎn)化。將這些重組大腸桿菌菌株培養(yǎng)在含有20g/l葡萄糖作為碳源的LB培養(yǎng)基(pH7.0)中，這是按照已經(jīng)描述的方法進行的(Lee等，Biotechnol.Bioeng.,44:1337-1347,1994)。通過離心收集積累PHB至75％-80％細胞干重的細胞。在多種初始pH(pH4,7和10)和多種反應(yīng)溫度下(20,30,37和45℃)進行自降解。在任一種使用各種重組大腸桿菌菌株的條件下，即使在4天之后也沒檢測到(R)-(-)-3-羥基丁酸。如上述實施例所示(實施例14和15)，在重組微生物具有天然PHA合成活性的情況下，從微生物通過自降解產(chǎn)生了(R)-(-)-羥基羧酸，因為該微生物也具有細胞內(nèi)PHA解聚酶。但在重組微生物不具有天然PHA合成活性例如大腸桿菌的情況下，不能從微生物通過自降解產(chǎn)生(R)-(-)-羥基羧酸，因為微生物不具有細胞內(nèi)PHA解聚酶。但是，如果不具有天然PHA合成活性的重組微生物被含有克隆的細胞內(nèi)PHA解聚酶以及PHA合成基因轉(zhuǎn)化后，可由轉(zhuǎn)化的微生物通過自降解方法產(chǎn)生單體。因而，重組微生物可以通過其中積累的PHA的自降解產(chǎn)生(R)-(-)-羥基羧酸單體，只要它們天然具有或通過重組DNA技術(shù)獲得細胞內(nèi)PHA解聚酶活性。&lt;實施例16&gt;使用HPLC分離光學(xué)純凈的羥基羧酸單體通過PHA共聚物的自降解產(chǎn)生的羥基羧酸單體的混合物可通過常規(guī)的已知的方法進行分離，例如離子交換，電透析，抽提，蒸餾，液相色譜(LC)和高效液相色譜(HPLC)。作為優(yōu)選的實施方案，在實施例3中制備的(R)-(-)-3-羥基丁酸和4-羥基丁酸是使用HPLC分離的(圖5，圖6和圖8)。具體地說，將羥基羧酸單體分離，并通過HPLC(HitachiCo.,Japan)純化，它裝備了HitachiL6000泵，L-3300RI檢測器，和有機酸分離柱，例如，AminexHPX-87H柱(Bio-Radlab.Co.,USA)或者ORH-801柱(RaininCo.,USA)。0.01N的H2SO4溶液被用作流動相。從圖5,6和8可以看出，兩種單體可有效地分離。AminexHPX-87H柱是一種在分離和分析糖和有機酸中常用的離子交換柱。因而，裝備了離子交換柱LC或者HPLC可有效分離羥基羧酸單體。而且，離子交換柱的使用具有可容易放大的優(yōu)點。對于分離較長鏈長的單體，例如中等鏈長的羥基羧酸，也可使用疏水相互作用柱。&lt;實施例17&gt;(R)-(-)-羥基羧酸的純化從同聚物例如聚-(R)-(-)-3-羥基丁酸酯制備的單體，(R)-(-)-羥基羧酸單體，在自降解后可通過實施例16所示的方法進行純凈分離，它可通過常規(guī)的化學(xué)方法或者通過下述方法進行進一步的分離，使終產(chǎn)物適用于特殊的用途。在本實施例中，檢測了兩種用于純化實施例1和實施例2制備的(R)-(-)-3-羥基丁酸的優(yōu)選的方法。一種方法是Seebach等(Seebach等，Org.Synth.,71:39-47,1992)的方法的改進型1mL的0.1N氫氧化鈉被加入在10mL的(R)-(-)-3-羥基丁酸-硫酸溶液中(200g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸)，進行中和，并使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器除去水分。然后加入20ml的醚將混合物溶解，并加入無水硫酸鎂進行干燥。最后將混合物過濾。將加入的醚使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行蒸發(fā)濃縮，并在減壓下在100℃使用Kugelrohr(AldrichCo.,USA)進行濃縮。結(jié)果，得到約1.58g的(R)-(-)-3-羥基丁酸(約79％產(chǎn)率)，純度大于90％。在上述方法中需要大量的能量，例如在減壓下蒸餾，這將增加生產(chǎn)成本。因而開發(fā)了另外一個方法。首先，將10ml的(R)-(-)-3-羥基丁酸溶液(200g/l(R)-(-)-3-羥基丁酸)的pH通過加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)至11。然后，通過用10ml氯仿或醚的溶劑抽提除去雜質(zhì)(雜質(zhì)被抽提進有機相)。在干燥箱中在95℃干燥含有產(chǎn)物的水相。將得到的干物質(zhì)溶解在乙醇中并再次干燥。最后，得到約1.97克的粉末形式的(R)-(-)-3-羥基丁酸-鈉鹽(約82％產(chǎn)率)，純度大于90％。在本方法中，也可使用例如氫氧化鉀的其它的強堿來調(diào)節(jié)pH，使其處于堿性范圍內(nèi)，而不影響方法的正常進行，只是最終的鹽形式發(fā)生變化。此外，在本實施例中作為抽提溶劑除去雜質(zhì)的氯仿和醚可由任意一種其它的與水不相混合的有機溶劑替換，而不影響方法的進行。實際上，Seebach等(Seebach等，有機化學(xué)合成(Org.Synth.),71:39-47,1992)的方法難以使用，因為該方法需要高的操作費用和復(fù)雜的設(shè)備。因而，本發(fā)明開發(fā)的方法更為實用，并且該方法可有效地對(R)-(-)-3-羥基丁酸進行純化并制成粉末。在本實施例中僅對(R)-(-)-3-羥基丁酸進行了純化，但該純化方法可被用于高純度地純化任何一種其它的(R)-(-)羥基羧酸單體。&lt;實施例18&gt;純化的(R)-(-)-3-羥基羧酸的鑒定以及光學(xué)純度的檢測將純化的產(chǎn)物溶解在CDCl3中并通過質(zhì)子NMR(Bruker,Germany)進行分析，以證實該純化的產(chǎn)物是(R)-(-)-3-羥基丁酸。如圖9所示，證實該純化的產(chǎn)物是(R)-(-)-3-羥基丁酸。如果單體具有光學(xué)異構(gòu)體(對于3-羥基丙酸，4-羥基丁酸，5-羥基戊酸和3-羥基-2-丁烯酸來說沒有異構(gòu)體)，在微生物中積累的PHA僅由具有(R)-(-)-構(gòu)型的光學(xué)活性的單體組成，這是由于生物合成酶的光學(xué)特異性決定的。因而，所有產(chǎn)生的單體在理論上來說為光學(xué)純凈的。為證實這一點，將純化的粉末溶解在蒸餾水中并使用極性計(Perkin-ElmerCo.,USA)測定光旋轉(zhuǎn)。光旋轉(zhuǎn)為-24.7°，與Seebach等(Seebach等，Org.Synth.,71:39-47,1992)報道的結(jié)果完全一致，因而，證實純化的(R)-(-)-3-羥基丁酸為光學(xué)純凈的。本發(fā)明的效果如上文所述，各種光學(xué)活性羥基羧酸可通過各種PHA的自降解制備，它們是在多種微生物中合成并積累的，并且如果它們以兩種多種單體的混合物形式存在時所產(chǎn)生的單體可容易地進行分離。此外，純凈分離的(R)-(-)羥基羧酸可通過有機溶劑抽提進行分離，除去雜質(zhì)，以及通過干燥粉化。本發(fā)明的制備多種(R)-(-)-羥基羧酸的方法是經(jīng)濟的，因為光學(xué)活性的(R)-(-)羥基羧酸可通過簡單的過程高產(chǎn)率地有效制備。而且，該方法對保護環(huán)境有利，因為在傳統(tǒng)方法中大量使用的有機溶劑在本發(fā)明中只使用很少的量。權(quán)利要求1．一種制備多種光學(xué)活性的(R)-(-)-羥基羧酸的方法，包括(a)通過培養(yǎng)具有細胞內(nèi)聚羥基鏈烷酸酯解聚酶活性的微生物合成并積累聚羥基鏈烷酸酯(PHA)；和(b)將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中，通過在上述培養(yǎng)的微生物中積累的PHA的自降解制備光學(xué)活性的(R)-(-)-羥基羧酸單體。2．按照權(quán)利要求1所述的方法，其中，所說的微生物選自無色桿菌(Achromobacter)屬的微生物，食酸菌(Acidovorax)屬的微生物，不動桿菌(Acinetobacter)屬述的微生物，放線桿菌(Actinobacillussp.)，放線菌(Actinomycessp.)，豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)，產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)屬的微生物，麥氏交替單胞菌(Alteromonasmacleodii)，可變桿菌(Amoebobacter)屬的微生物，隱球藍細菌(Aphanocapsasp.)，隱桿藍細菌(Aphanothecesp.)，自養(yǎng)水螺菌(Aquaspirillumautotrophicum)，莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)，固氮螺菌(Azospirillum)屬的微生物，固氮菌(Azotobacter)屬的微生物，芽孢桿菌(Bacillus)屬的微生物，貝日阿托氏菌(Beggiatoa)屬的微生物，拜葉林克氏菌(Beijerinckia)屬的微生物，貝內(nèi)克氏菌(Beneckea)屬的微生物，白日咳桿菌(Bordetellapertussis)，大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，闊顯核菌(Caryophanonlatum)，柄桿菌(Caulobacter)屬的微生物，橙色綠曲撓菌(Chloroflexusaurantiacus)，綠膠藍細菌(Chlorogloea)屬的微生物，著色菌(Chromatium)屬的微生物，色桿菌(Chromobacterium)屬的微生物，梭菌(Clostridium)屬的微生物，叢毛單胞菌(Comamonas)屬的微生物，科里氏桿菌(Corynebacterium)屬的微生物，德克斯氏菌(Derxia)屬的微生物，雜食脫硫球菌(Desulfococcusmultivorans)，脫硫線菌(Desulfonema)屬的微生物，可變脫硫八疊球菌(Desulfosarcinavariabilis)，脫硫弧菌(Desulfovibrio)屬的微生物，外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira)屬的微生物，氧化亞鐵亞鐵桿菌(Ferrobacillusferrooxidans)，黃桿菌(Flavobacteriumsp.)，流感桿菌(Haemophilusinfluenzae)，鹽桿菌(Halobacterium)屬的微生物，地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei),Hydroclathratusclathratus，敏捷食酸菌(Hydrogenomonasfacilis)，氫嗜胞菌(Hydrogenophaga)屬的微生物，生絲微菌(Hyphomicrobium)屬的微生物，Ilyobacterdelafieldii，單-雙頭菌(Labrysmonachus)，乳酸桿菌(Lactobacillus)屬的微生物，乳球菌(Lactococcus)屬的微生物，桃紅色閃囊菌(Lamprocystisroseopersicina)，透明俊片菌(Lampropediahyalina)，軍團菌(Legionellasp.)，生盤纖發(fā)菌(Leptothrixdiscophorus)，甲基桿菌(methylobacterium)屬的微生物，嗜熱甲基桿菌(methylococcusthermophilus)，小甲基胞囊菌(methylocystisparvus)，甲烷甲基單胞菌(methylomonasmethanica)，甲基彎曲菌(methylosinus)屬的微生物，索氏甲基弧菌(methylovibriosoehngenii)，微球菌(Micrococcus)屬的微生物，微鞘藍細菌(Microcoleus)屬的微生物，微囊藍細菌(Microcystis)屬的微生物，莫拉氏菌(Moraxella)屬的微生物，分枝桿菌(Mycobacterium)屬的微生物，紅色枝動菌(Mycoplanarubra)，硝化桿菌(Nitrobacter)屬的微生物，硝化球菌(Nitrococcus)屬的微生物，奴卡氏菌(Nocardia)屬的微生物，泥生顫藍細菌(Oscillatorialimosa)，脫氮副球菌(Paracoccusdentrificans)，嗜鹽四聯(lián)球菌(Pediococcushalophilus)，Penicilliumcyclopium，發(fā)光桿菌(Photobacterium)屬的微生物，Physarumpolycephalum，扭脫原單胞菌(Protomonasextorquens)，假單胞菌(Pseudomonas)屬的微生物，Ralstonia屬的微生物，根瘤菌(Rhizobium)屬的微生物，紅桿菌(Rhodobacillus)屬的微生物，紅細菌(Rhodobacter)屬的微生物，紅球菌(Rhodococcus)屬的微生物，紅環(huán)菌(Rhodocyclus)屬的微生物，萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobiumvannielii)，紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬的微生物，紅螺菌屬的微生物(Rhodospirillum)，浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)，少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)，螺菌(Spirillum)屬的微生物，螺旋藍細菌(Spirulina)屬的微生物，葡萄球菌(Staphylococcus)屬的微生物，星狀菌(Stella)屬的微生物，嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，鏈霉菌(Streptomyces)屬的微生物，聚球藍細菌(Synechococcus)屬的微生物，沃氏共養(yǎng)單胞菌(Syntrophomonaswolfei)，硫桿菌(Thiobacillus)屬的微生物，莢硫菌(Thiocapsa)屬的微生物，紫囊硫菌(Thiocystisviolacea)，網(wǎng)硫菌(Thiodictyon)屬的微生物，泛養(yǎng)副球菌(Thiosphaerapantotropha)，鐵氏束毛藍細菌(Trichodesmimumthiebautii)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)，嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia)，和動膠菌(Zoogloea)屬的微生物。3．按照權(quán)利要求1所述的方法，其中所說的單體選自(R)-(-)-3-羥基丙酸，(R)-(-)-3-羥基戊酸，(R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基庚酸，(R)-(-)-3-羥基辛酸，(R)-(-)-3-羥基壬酸，(R)-(-)-3-羥基癸酸，(R)-(-)-3-羥基十一烷酸，(R)-(-)-3-羥基十二烷酸，(R)-(-)-3-羥基十四烷酸，(R)-(-)-3-羥基十六烷酸，4-羥基丁酸，(R)-(-)-4-羥基戊酸，(R)-(-)-4-羥基己酸，(R)-(-)-4-羥基庚酸，(R)-(-)-4-羥基辛酸，(R)-(-)-4-羥基癸酸，5-羥基戊酸，(R)-(-)-5-羥基己酸，(R)-(-)-6-羥基十二烷酸，(R)-(-)-3-羥基-4-戊烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4-反-己烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4-順-己烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5-己烯酸，(R)-(-)-3-羥基-6-反-辛烯酸，(R)-(-)-3-羥基-6-順-辛烯酸，(R)-(-)-3-羥基-7-辛烯酸，(R)-(-)-3-羥基-8-壬烯酸，(R)-(-)-3-羥基-9-癸烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5-順-十二碳烯酸，(R)-(-)-3-羥基-6-順-十二碳烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-7-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-5,8-順-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4-甲基戊酸，(R)-(-)-3-羥基-4-甲基己酸，(R)-(-)-3-羥基-5-甲基己酸，(R)-(-)-3-羥基-6-甲基庚酸，(R)-(-)-3-羥基-4-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-5-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-6-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-6-甲基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-8-甲基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基癸酸，(R)-(-)-3-羥基-9-甲基癸酸，(R)-(-)-3-羥基-7-甲基-6-辛烯酸，蘋果酸，(R)-(-)-3-羥基琥珀酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基己二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基辛二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基壬二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基癸二酸-甲基酯，(R)-(-)-3-羥基辛二酸-乙基酯，(R)-(-)-3-羥基癸二酸-乙基酯，(R)-(-)-3-羥基庚二酸-丙基酯，(R)-(-)-3-羥基癸二酸芐基酯，(R)-(-)-3-羥基-8-乙酰氧基辛酸，(R)-(-)-3-羥基-9-乙酰氧基壬酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基丁酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基戊酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基庚酸，苯氧基-(R)-(-)-3-羥基辛酸，對-氰基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基丁酸，對-氰基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基戊酸，對-氰基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基己酸，對-硝基苯氧基-(R)-(-)-3-羥基己酸，(R)-(-)-3-羥基-5-苯基戊酸，(R)-(-)-3-羥基-5-環(huán)己基丁酸，(R)-(-)-3,12-二羥基十二烷酸，(R)-(-)-3,8-二羥基-5-順-十四烯酸，(R)-(-)-3-羥基-4,5-環(huán)氧癸酸，(R)-(-)-3-羥基-6,7-環(huán)氧十二烷酸，(R)-(-)-3-羥基-8,9-環(huán)氧-5,6-順-十四烷酸，7-氰基-(R)-(-)-3-羥基庚酸，9-氰基-(R)-(-)-3-羥基壬酸，(R)-(-)-3-羥基-7-氟庚酸，(R)-(-)-3-羥基-9-氟壬酸，(R)-(-)-3-羥基-6-氯己酸，(R)-(-)-3-羥基-8-氯辛酸，(R)-(-)-3-羥基-6-溴己酸，(R)-(-)-3-羥基-8-溴辛酸，(R)-(-)-3-羥基-11-溴十一烷酸，3-羥基-2-丁烯酸，(R)-(-)-6-羥基-3-十二碳烯酸，(R)-(-)-3-羥基-2-甲基丁酸，(R)-(-)-3-羥基-2-甲基戊酸和(R)-(-)-3-羥基-2,6-二甲基-5-庚烯酸。4．按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所說的微生物選自廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)，科里氏桿菌(Corynebacteriumsp.)，芽孢桿菌(Bacillussp.)，發(fā)胞甲基彎曲菌(methylosinustrichosporium)，深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)，真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Ralstoniaeutropha)，銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)。5．按照權(quán)利要求1,2或3所述的方法，其中所說的微生物是銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或者食油假單胞菌(Pseudomonasoleovorans)，所說的單體是一種或多種選自具有6至14個碳原子的(R)-(-)-3-羥基羧酸。6．按照權(quán)利要求1,2或3所述的方法，其中所說的降解溶液是選自水，鹽溶液，水和有機溶劑的混合物，和緩沖液中的一種。7．按照權(quán)利要求6所述的方法，其中所說的降解溶液的pH范圍是pH2-12，溫度范圍是4-60℃，反應(yīng)時間超過半小時。8．按照權(quán)利要求1所述的方法，還包括使用液相色譜(LC)或者高效液相色譜(HPLC)分離制備的光學(xué)活性羥基羧酸單體的步驟。9．按照權(quán)利要求1或8所述的方法，還包括純化并將純凈分離的光學(xué)活性羥基羧酸單體制成粉末的步驟。10．按照權(quán)利要求8所述的方法，其中，LC或者HPLC柱是離子交換柱或者疏水相互作用柱，流動相是酸性溶液，其pH范圍是1-5。11．按照權(quán)利要求9所述的方法，其中，純化和制成粉末的步驟由以下步驟組成(a)向光學(xué)活性的羥基羧酸溶液中加入強堿，將pH調(diào)節(jié)至高于7的堿性范圍；(b)通過有機溶劑抽提除去雜質(zhì)；(c)干燥純化的光學(xué)活性羥基羧酸。12．按照權(quán)利要求1,2或3所述的方法，其中所說的光學(xué)純凈的羥基羧酸單體是通過在含有PHA的高的細胞濃度下進行自降解高濃度制備的。13．按照權(quán)利要求1,2或3所述的方法，其中通過熱降解它們的二聚體提高制備(R)-(-)-羥基羧酸單體的效率，這種二聚體是在堿性條件下PHA自降解的副產(chǎn)物。14．一種制備(R)-(-)-3-羥基丁酸的方法，包括(a)通過培養(yǎng)具有細胞內(nèi)聚羥基鏈烷酸酯解聚酶活性的微生物合成并積累聚羥基丁酸酯(PHB)，該微生物選自無色桿菌(Achromobacter)屬的微生物，食酸菌(Acidovorax)屬的微生物，不動桿菌(Acinetobacter)屬的微生物，放線桿菌(Actinobacillussp.)，放線菌(Actinomycessp.)，豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)，產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes)屬的微生物，麥氏交替單胞菌(Alteromonasmacleodii)，可變桿菌(Amoebobacter)屬的微生物，隱球藍細菌(Aphanocapsasp.)，隱桿藍細菌(Aphanothecesp.)，自養(yǎng)水螺菌(Aquaspirillumautotrophicum)，莖瘤固氮根瘤菌(Azorhizobiumcaulinodans)，固氮螺菌(Azospirillum)屬的微生物，固氮菌(Azotobacter)屬的微生物，芽孢桿菌(Bacillus)屬的微生物，貝日阿托氏菌(Beggiatoa)屬的微生物，拜葉林克氏菌(Beijerinckia)屬的微生物，貝內(nèi)克氏菌(Beneckea)屬的微生物，白日咳桿菌(Bordetellapertussis)，大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，闊顯核菌(Caryophanonlatum)，柄桿菌(Caulobacter)屬的微生物，橙色綠曲撓菌(Chloroflexusaurantiacus)，綠膠藍細菌(Chlorogloea)屬的微生物，著色菌(Chromatium)屬的微生物，色桿菌(Chromobacterium)屬的微生物，梭菌(Clostridium)屬的微生物，叢毛單胞菌(Comamonas)屬的微生物，科里氏桿菌(Corynebacterium)屬的微生物，德克斯氏菌(Derxia)屬的微生物，雜食脫硫球菌(Desulfococcusmultivorans)，脫硫線菌(Desulfonema)屬的微生物，可變脫硫八疊球菌(Desulfosarcinavariabilis)，脫硫弧菌(Desulfovibrio)屬的微生物，外硫紅螺菌(Ectothiorhodospira)屬的微生物，氧化亞鐵亞鐵桿菌(Ferrobacillusferrooxidans)，黃桿菌(Flavobacteriumsp.)，流感桿菌(Haemophilusinfluenzae)，鹽桿菌(Halobacterium)屬的微生物，地中海富鹽菌(Haloferaxmediterranei)，Hydroclathratusclathratus，敏捷食酸菌(Hydrogenomonasfacilis)，氫嗜胞菌(Hydrogenophaga)屬的微生物，生絲微菌(Hyphomicrobium)屬的微生物，Ilyobacterdelafieldii，單-雙頭菌(Labrysmonachus)，乳酸桿菌(Lactobacillus)屬的微生物，乳球菌(Lactococcus)屬的微生物，桃紅色閃囊菌(Lamprocystisroseopersicina)，透明俊片菌(Lampropediahyalina)，軍團菌(Legionellasp.)，生盤纖發(fā)菌(Leptothrixdiscophorus)，甲基桿菌(methylobacterium)屬的微生物，嗜熱甲基桿菌(methylococcusthermophilus)，小甲基胞囊菌(methylocystisparvus)，甲烷甲基單胞菌(methylomonasmethanica)，甲基彎曲菌(methylosinus)屬的微生物，索氏甲基弧菌(methylovibriosoehngenii)，微球菌(Micrococcus)屬的微生物，微鞘藍細菌(Microcoleus)屬的微生物，微囊藍細菌(Microcystis)屬的微生物，莫拉氏菌(Moraxella)屬的微生物，分枝桿菌(Mycobacterium)屬的微生物，紅色枝動菌(Mycoplanarubra)，硝化桿菌(Nitrobacter)屬的微生物，硝化球菌(Nitrococcus)屬的微生物，奴卡氏菌(Nocardia)屬的微生物，泥生顫藍細菌(Oscillatorialimosa)，脫氮副球菌(Paracoccusdentrificans)，嗜鹽四聯(lián)球菌(Pediococcushalophilus)；Penicilliumcyclopium，發(fā)光桿菌(Photobacterium)屬的微生物，Physarumpolycephalum，扭脫原單胞菌(Protomonasextorquens)，假單胞菌(Pseudomonas)屬的微生物，Ralstonia屬的微生物，根瘤菌(Rhizobium)屬的微生物，紅桿菌(Rhodobacillus)屬的微生物，紅細菌(Rhodobacter)屬的微生物，紅球菌(Rhodococcus)屬的微生物，紅環(huán)菌(Rhodocyclus)屬的微生物，萬尼氏紅微菌(Rhodomicrobiumvannielii)，紅假單胞菌(Rhodopseudomonas)屬的微生物，紅螺菌屬的微生物(Rhodospirillum)，浮游球衣菌(Sphaerotilusnatans)，少動鞘氨醇單胞菌(Sphingomonaspaucimobilis)，螺菌(Spirillum)屬的微生物，螺旋藍細菌(Spirulina)屬的微生物，葡萄球菌(Staphylococcus)屬的微生物，星狀菌(Stella)屬的微生物，嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)，鏈霉菌(Streptomyces)屬的微生物，聚球藍細菌(Synechococcus)屬的微生物，沃氏共養(yǎng)單胞菌(Syntrophomonaswolfei)，硫桿菌(Thiobacillus)屬的微生物，莢硫菌(Thiocapsa)屬的微生物，紫囊硫菌(Thiocystisviolacea)，網(wǎng)硫菌(Thiodictyon)屬的微生物，泛養(yǎng)副球菌(Thiosphaerapantotropha)，鐵氏束毛藍細菌(Trichodesmimumthiebautii)，副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，自養(yǎng)黃色桿菌(Xanthobacterautotrophicus)，嗜麥芽黃單胞菌(Xanthomonasmaltophilia)，和動膠菌(Zoogloea)屬的微生物；和(b)將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中，通過在上述培養(yǎng)的微生物中積累的PHB的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸。15．按照權(quán)利要求14的方法，其中所說的微生物選自廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)，科里氏桿菌(Corynebacteriumsp.)，芽孢桿菌(Bacillussp.)，發(fā)胞甲基彎曲菌(methylosinustrichosporium)，深紅紅螺菌(Rhodospirillumrubrum)，和Ralstoniaeutropha(原名真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))H16。16．按照權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所說的降解溶液是選自水，鹽溶液，水和有機溶劑的混合物，和緩沖液中的一種。17．按照權(quán)利要求16所述的方法，其中所說的降解溶液的pH范圍是pH2-12，溫度范圍是4-60℃，反應(yīng)時間超過半小時。18．按照權(quán)利要求14所述的方法，還包括使用液相色譜(LC)或者高效液相色譜(HPLC)分離制備的(R)-(-)-3-羥基丁酸的步驟。19．按照權(quán)利要求14或18所述的方法，還包括純化并將純凈分離的(R)-(-)-3-羥基丁酸制成粉末的步驟。20．一種制備(R)-(-)-3-羥基丁酸和4-羥基丁酸的方法，包括(a)通過培養(yǎng)具有細胞內(nèi)聚羥基鏈烷酸酯解聚酶活性的微生物合成并積累聚-3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯；和(b)將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中，通過在上述培養(yǎng)的微生物中積累的聚-3-羥基丁酸酯-共聚-4-羥基丁酸酯的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸和4-羥基丁酸。21．按照權(quán)利要求20所述的方法，其中所說的微生物是廣泛產(chǎn)堿菌(Alcaligeneslatus)。22．一種制備(R)-(-)-3-羥基丁酸和(R)-(-)-3-羥基戊酸的方法，包括(a)通過培養(yǎng)具有細胞內(nèi)聚羥基鏈烷酸酯解聚酶活性的微生物合成并積累聚-3-羥基丁酸酯-共聚-3-羥基戊酸酯；和(b)將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中，通過在上述培養(yǎng)的微生物中積累的聚-3-羥基丁酸酯-共聚-3-羥基戊酸酯的自降解制備(R)-(-)-3-羥基丁酸和(R)-(-)-3-羥基戊酸。23．按照權(quán)利要求22所述的方法，其中所說的微生物是Ralstoniaeutropha(原名真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))。24．一種制備多種光學(xué)活性的(R)-(-)-羥基羧酸單體的方法，包括(a)通過培養(yǎng)具有細胞內(nèi)聚羥基鏈烷酸酯解聚酶活性的重組微生物合成并積累聚羥基鏈烷酸酯(PHA)；和(b)將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中，通過在上述培養(yǎng)的微生物中積累的PHA的自降解制備光學(xué)活性的(R)-(-)-羥基羧酸單體。25．按照權(quán)利要求24所述的方法，其中所說的重組微生物是含有RalstoniaeutrophaPHA生物合成基因的Ralstoniaeutropha(原名真養(yǎng)產(chǎn)堿菌(Alcaligeneseutrophus))。全文摘要本發(fā)明提供了一種通過聚羥基鏈烷酸酯(PHA)的自降解制備光學(xué)活性羥基羧酸單體的方法。具體地說,本發(fā)明提供了一種制備羥基羧酸單體的方法(主要為光學(xué)活性的(R)－(－)－構(gòu)型),包括步驟:(a)通過培養(yǎng)多種微生物合成并積累PHA;和(b)通過PHA的自降解制備光學(xué)活性羥基羧酸,它們是PHA的單體,這是通過將培養(yǎng)的微生物保持在降解溶液中進行的,例如水,鹽溶液,水和有機溶劑的混合物,和緩沖液。本發(fā)明也提供了一種使用液相色譜(LC)或者高效液相色譜(HPLC)分離制備的(R)－(－)－羥基羧酸的方法,也提供了進一步純化的方法,通過有機溶劑提取將雜質(zhì)從純凈分離的(R)－(－)－羥基羧酸中出去,和純化的(R)－(－)－羥基羧酸的粉末制備方法。本發(fā)明的制備多種(R)－(－)－羥基羧酸的方法是經(jīng)濟的,因為光學(xué)活性的(R)－(－)羥基羧酸可通過簡單的過程高產(chǎn)率地有效制備。而且,該方法對保護環(huán)境有利,因為在傳統(tǒng)方法中大量使用的有機溶劑在本發(fā)明中只使用很少的量。文檔編號C12R1/05GK1301310SQ98811749公開日2001年6月27日申請日期1998年12月2日優(yōu)先權(quán)日1997年12月9日發(fā)明者李相燁,王福來,李英申請人:凱羅拜歐公司