專利名稱：：參與脫落酸信號過程的蛋白質(zhì)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種脫落酸(ABA)信號成分，編碼該信號成分的核酸，和使用該成分的方法。植物激素ABA在植物生長和發(fā)育中起著重要作用。它在種子中幫助完成胚胎發(fā)生和種子儲存蛋白的形成。它能防止很多種子和芽的超前發(fā)芽和生長。在營養(yǎng)組織中ABA保護植物不受諸如干旱、高鹽度、低溫或霜凍的不利環(huán)境條件的影響。ABA的許多作用會導(dǎo)致相當(dāng)長時間的生理學(xué)變化，并且，主要表現(xiàn)在在轉(zhuǎn)錄水平上參與修飾基因表達。業(yè)已從各種植物中分離了超過150個ABA效應(yīng)基因。ABA作為應(yīng)急激素與缺水聯(lián)系在一起的重要性是由倫敦大學(xué)懷依學(xué)院的STCWright和RWPHiron在1969年第一次提出的。他們發(fā)現(xiàn)在發(fā)生枯萎的頭半個小時內(nèi)小麥葉片中的ABA含量增加了40倍?，F(xiàn)在已經(jīng)在單子葉植物和雙子葉植物的葉片中檢測到ABA的類似的增加。在很多物種上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，將ABA噴灑在葉片上會導(dǎo)致氣孔關(guān)閉或抑制氣孔打開。因此，在缺水階段，提高ABA含量能減少水的損失。我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)了一種介導(dǎo)由ABA引起的信號傳導(dǎo)的新型蛋白，并且該蛋白能對ABA作出反應(yīng)?，F(xiàn)在，根據(jù)本發(fā)明，提供了一種能夠影響ABA反應(yīng)的蛋白，該蛋白包括下列部分中的一個或幾個(ⅰ)疏水性C-末端；(ⅱ)至少一個卷曲螺旋區(qū)；(ⅲ)一個EF-手共有序列；(ⅳ)一個核苷酸結(jié)合位點；和(ⅴ)一個親水性N-末端；或其變體。在一種優(yōu)選實施方案中，所述蛋白具有上文所述的(ⅰ)、(ⅱ)、(ⅲ)、和(ⅳ)，和選擇性地具有(ⅴ)。另外，所述蛋白還能夠用肉毒桿菌C毒素裂解。因此，所述蛋白優(yōu)選包括肉毒桿菌C毒素的兩個識別結(jié)構(gòu)域和／或裂解位點。優(yōu)選至少有一個卷曲螺旋區(qū)相當(dāng)于上皮形成素模式。優(yōu)選具有三個卷曲螺旋區(qū)。優(yōu)選具有三個卷曲螺旋區(qū)，至少有一個相當(dāng)于上皮形成素模式。所述蛋白優(yōu)選還包括磷酸化位點。所述蛋白可以被描述為一種新的突觸融合蛋白(t-SNARE)同系物。在細(xì)胞水平上，最好是通過ABA在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞的質(zhì)膜上調(diào)節(jié)K+和Cl-通道中的作用鑒定ABA，這種調(diào)節(jié)作用會導(dǎo)致氣孔關(guān)閉，并減少葉片中水分的蒸騰損失。本發(fā)明的蛋白可以是與質(zhì)膜相關(guān)的膜錨錠蛋白。在活體內(nèi)，業(yè)已證實通過肉毒桿菌C毒素裂解所述蛋白和用該蛋白的可溶性C-截短的片段競爭，能夠抑制ABA在所述保衛(wèi)細(xì)胞中控制K+和Cl-通道的作用。以上結(jié)果和其它結(jié)果表明，本發(fā)明的蛋白與ABA信號復(fù)合體相關(guān)，并對ABA有反應(yīng)。序列2所示蛋白的特征可定義如下。特征內(nèi)部-氨基酸(ⅰ)疏水性C-末端282-296／280-294(ⅱ)卷曲螺旋區(qū)／上皮形成素模式210-247／216-240(ⅲ)一個EF-手共有序列16-28(ⅳ)一個核苷酸結(jié)合位點116，118和120／114-119(ⅴ)一個親水性N-末端1-281／1-279(ⅵ)肉毒桿菌毒素裂解位點269-274在一種特別優(yōu)選的實施方案中，所述蛋白包括序列2或序列4所示氨基酸序列。本發(fā)明包括上述蛋白的變體。所述變體包括與序列2的序列具有50％或更高總體同源性的蛋白。所述同源性通常為60％或更高，更通常為65％，優(yōu)選為70％，更優(yōu)選為75％，進一步優(yōu)選為80％或85％，特別優(yōu)選為90％、95％、98％或99％。百分比同源性優(yōu)選是根據(jù)兩個有關(guān)的序列在相應(yīng)位置上相同的氨基酸而計算的。保守性取代不計算在內(nèi)。在計算被研究的推測蛋白與序列2或4的同源性時，如果被研究的蛋白具有不同的長度，則所述計算是基于被研究分子與序列2或4所示序列重疊部分的氨基酸而進行的。具體地講，本文所說的“同源性”與術(shù)語“相同性”等同。在這里，序列同源性可以通過對所述序列的任一個或幾個和其它序列進行簡單地“目測”比較，看所述其它序列是否與所述序列具有至少75％的相同性而確定的。相對序列同源性(即序列相同性)還可以通過市售計算機程序測定，這種程序能計算兩個或兩個以上序列之間的百分同源性。所述計算機程序的一個典型例子是CLUSTAL。序列同源性(或相同性)還可以通過任何合適的同源性算法，用預(yù)設(shè)的參數(shù)測定。優(yōu)選使用BLAST算法，所使用的參數(shù)是預(yù)設(shè)值。BLAST算法詳細(xì)披露于http／／www．ncbi．nih．gov／BLAST／blast_help．html中，有關(guān)內(nèi)容內(nèi)收作本文參考文獻。檢索參數(shù)被確定如下，并優(yōu)選設(shè)定確定的預(yù)設(shè)參數(shù)。優(yōu)選地，BLAST所認(rèn)定的“顯著同源性”相當(dāng)于與EXPECT值吻合的序列至少為大約7，優(yōu)選為至少大約9，最優(yōu)選為大約10或更高。在BLAST檢索中，EXPECT的預(yù)設(shè)閾值通常為10。BLAST(基礎(chǔ)定位比較檢索工具)是被程序blastp，blastn，blastx，tblastn，和tblastx所使用的啟發(fā)式檢索算法；所述程序用作過一些改進的Karlin和Altschul統(tǒng)計方法確定其發(fā)現(xiàn)的顯著性。還可以用LasergeneDNA(Madison，美國)進行分析?？梢岳斫獾氖?，源于其它物種的能夠影響ABA反應(yīng)和／或?qū)BA有反應(yīng)的蛋白會具有種間差別，例如，在蛋白長度、氨基酸序列和糖修飾方面的差別。例如，在C-和／或N-末端殘基和分子量方面可能有所不同。一般來說，術(shù)語“變體”包括保留了其主要特性的蛋白，在本發(fā)明中，該特性為影響ABA反應(yīng)和／或?qū)BA作出反應(yīng)的能力。變體包括等位變體，和具有保守氨基酸改變差別的蛋白。所述變體可以是天然的或非天然存在的變體，例如，通過誘變產(chǎn)生的變體。我們所說的保守氨基酸改變是指用一種類型的氨基酸(即疏水性、極性、酸性或堿性氨基酸，取代同一種類型的另一種氨基酸。所述改變的一種例子是用甲硫氨酸取代纈氨酸和相反。證實一種蛋白是能夠影響ABA反應(yīng)的可以通過考慮序列同源性和／或考慮其結(jié)構(gòu)關(guān)系而完成。除了完整長度的蛋白之外，本發(fā)明還包括含有不夠完整長度序列的分子。所述分子或片段可以是多肽或肽。為了用作取代物，一個片段應(yīng)當(dāng)保留其親代分子的一種或幾種生物學(xué)活性?？捎脕頊y試一種推測的分子影響ABA反應(yīng)能力的一種方法是將爪蟾(Xenopuslaevis)卵母細(xì)胞作為異源表達，如下文所述。本發(fā)明不包括以下本發(fā)明的天然蛋白，即該蛋白存在于其天然環(huán)境中，由同樣存在于其天然環(huán)境中的天然核苷酸編碼序列表達的，并且該核苷酸序列處于也存在于其天然環(huán)境中的其天然啟動子控制之下。本發(fā)明的蛋白還可以是分離的，就是說它基本上不含有通常與其相關(guān)的其它蛋白。另外，本發(fā)明不包括處于其天然環(huán)境中的本發(fā)明的天然核苷酸編碼序列，該序列在也處于天然環(huán)境中的其天然啟動子的控制之下。盡管在下文所述的特定的非限定實施例中ABA信號成分獲自煙草(Nicotianatabacumm)，本發(fā)明總體上涉及ABA信號成分。例如，源于雙子葉和單子葉植物的ABA信號成分，所述植物包括諸如小麥、大麥、稻、玉米和高粱的禾谷類；除煙草之外的大田作物，如canola、向日葵、甜菜和棉花、水果和蔬菜。例如，玉米中的相應(yīng)ABA信號成分可以用反向轉(zhuǎn)錄方法發(fā)現(xiàn)，這一目的是用已知技術(shù)和根據(jù)序列1的序列設(shè)計的引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)進行的。證實ABA信號成分的獲得可以用本文所披露的本發(fā)明的分析方法完成。我們用該方法還測定了源于擬南芥(Arabidopsisthaliana)的相應(yīng)ABA信號成分。其核酸序列如序列3所示，相應(yīng)的氨基酸序列如序列4所示。本發(fā)明還包括本文所限定的序列的變體。為了消除懷疑，術(shù)語“能夠影響ABA反應(yīng)的蛋白”和“ABA信號成分”可以互換使用。所述術(shù)語是指參與激素脫落酸的信號傳導(dǎo)途徑的分子。類似地，與本發(fā)明的分析方法相關(guān)，“信號成分”是指參與激素信號傳導(dǎo)途徑的分子。本發(fā)明的蛋白可用于篩選檢測蛋白-蛋白相互作用。具體地講，所述蛋白可用于篩選一種信號傳導(dǎo)途徑的其它成員。一種合適的方法是所謂的雙雜交系統(tǒng)，其中，GAL4蛋白的DNA結(jié)合域融合在本發(fā)明的蛋白上。構(gòu)建第二種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包括與被研究的蛋白(或肽或多肽)融合的GAL4蛋白的激活域。本發(fā)明蛋白和被研究蛋白的相互作用會導(dǎo)致報導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄激活，如通過GAL1-lacZ融合基因的表達檢測。因此，本發(fā)明還提供了包括本發(fā)明蛋白的融合蛋白，同樣包括含有本發(fā)明蛋白的蛋白／核酸復(fù)合體。本發(fā)明的蛋白和／或核酸還可以與諸如將編碼所述蛋白的核酸導(dǎo)向到細(xì)胞膜上的序列的導(dǎo)向序列結(jié)合。因此，本發(fā)明還提供了一種檢測能與本發(fā)明蛋白相互作用的蛋白的方法。用所述篩選方法發(fā)現(xiàn)的相互作用的蛋白也是本發(fā)明的主題。例如，我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的SYR蛋白(見下文)和克隆4(見表1)存在相互作用，克隆4被鑒定為具有磷酸酶抑制劑域。本發(fā)明還包括源于上述蛋白的截短的蛋白。通常，所述截短的蛋白能夠在ABA信號途徑中與未截短的蛋白競爭，和／或能夠產(chǎn)生抗未截短的蛋白的抗體。所述截短的蛋白的例子包括含有序列2的115-127號氨基酸的Sp1，和含有序列2的1-179號氨基酸的Sp2。因此，本發(fā)明還包括生產(chǎn)免疫球蛋白的方法，該方法包括給諸如兔子或人的哺乳動物服用本發(fā)明的蛋白，并視需要分離所產(chǎn)生的免疫球蛋白。本發(fā)明還提供了編碼本發(fā)明蛋白的核酸。具體地講，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了包括序列1所示18-917號位置或序列3所示77-991號位置的序列的核酸。本發(fā)明還包括與本發(fā)明序列有同源性的DNA。通常，同源性是指有50％或更多的核苷酸相同，更通常具有60％或65％的同源性，優(yōu)選70％，更優(yōu)選75％，進一步優(yōu)選80％或85％，特別優(yōu)選90％、95％、98％或99％或更高的同源性。本發(fā)明還包括能與本發(fā)明DNA雜交的DNA。所述DNA優(yōu)選編碼ABA信號成分的至少一部分。本發(fā)明還包括互補于本文所述本發(fā)明序列的核苷酸序列，或任何衍生物、片段或其衍生物。如果所述序列互補于它的一個片段，則該序列可用作探針鑒定其它生物中的類似編碼序列。本發(fā)明還包括與互補于本文所述序列的序列雜交的核苷酸序列，或任何衍生物、片段或其衍生物。術(shù)語“互補”還包括能夠與所述編碼序列的核苷酸序列雜交的核酸序列。術(shù)語“變體”還包括互補于能夠與本文所述核苷酸序列雜交的序列的序列。所述雜交優(yōu)選是在低嚴(yán)格條件或高嚴(yán)格條件或介于兩者之間進行的。一般來說，低嚴(yán)格條件可以定義為3×SSC，大約為環(huán)境溫度至大約65℃，而高嚴(yán)格條件為0．1×SSC，大約為65℃。SSC是指由0．15M氯化鈉、0．015M檸檬酸三鈉組成的緩沖液，3×SSC是指濃度比SSC高三倍，依此類推。本發(fā)明還包括用源于本發(fā)明序列的引物通過PCR技術(shù)獲得的序列。本發(fā)明的DNA可以是分離形式的cDNA或DNA。本發(fā)明還包括由于本發(fā)明的DNA發(fā)生遺傳密碼簡并而產(chǎn)生的DNA，該DNA編碼一種能夠影響ABA反應(yīng)，和／或?qū)BA作出反應(yīng)的蛋白。本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明核酸的載體，用本發(fā)明載體進行遺傳工程改造的宿主細(xì)胞，和通過重組技術(shù)生產(chǎn)本發(fā)明的蛋白。所述系統(tǒng)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。術(shù)語“載體”包括表達載體和轉(zhuǎn)化載體。術(shù)語“表達載體”是指能夠進行體內(nèi)或體外表達的結(jié)構(gòu)。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選為植物、種子、真菌或哺乳動物細(xì)胞。為了消除懷疑，真菌包括酵母。因此，本發(fā)明還提供了適當(dāng)轉(zhuǎn)化過的植物、種子、真菌和哺乳動物。因此，本發(fā)明提供了根據(jù)本發(fā)明的可操作地連接于啟動子上的核酸。有人建議可將該系統(tǒng)用于篩選能夠影響植物對脅迫的反應(yīng)的化合物的方法。所述方法可以包括篩選結(jié)合表達的ABA信號成分的化合物，并選擇具有所述結(jié)合能力的化合物。本發(fā)明還提供了用所述篩選方法選擇的化合物，特別是將其用作農(nóng)藥。農(nóng)藥配方是已知的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地配制出含有有效量的該農(nóng)藥的可以接受的組合物。本發(fā)明的一個特別優(yōu)選的特征是用本發(fā)明核酸轉(zhuǎn)化過的植物或種子，以便本發(fā)明的ABA信號成分在所述植物或種子中表達或超量表達。在這種情況下，所述啟動子可以是誘導(dǎo)型啟動子。使用該系統(tǒng)的優(yōu)點是可以控制表達。所述轉(zhuǎn)化過的植物(可以是單子葉和雙子葉植物)與未轉(zhuǎn)化過的植物相比具有改進的生長和發(fā)育。所述改進可以包括減弱的芽的超前生長和對諸如干旱、高鹽度、低溫和霜凍的不利環(huán)境條件的改進的保護／承受能力。一種特定的特征可以是改進的對水脅迫的抗性?？梢宰C明這一點的是水損失的減少?？梢灶A(yù)計植物具有減弱的枯萎變化。所述轉(zhuǎn)化的種子與野生型種子相比，可以具有改進的胚胎發(fā)生和更好的種子儲存蛋白形成能力。它們還可以具有減弱的超前發(fā)芽和生長作用。對本發(fā)明來說，用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法并不是特別重要，可以使用適合于靶宿主的任何方法。例如，轉(zhuǎn)基因植物是通過由轉(zhuǎn)化的細(xì)胞再生而獲得的。文獻中披露了多種轉(zhuǎn)化技術(shù)，如用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或其Ti質(zhì)粒進行的農(nóng)桿菌感染，電穿孔，植物細(xì)胞和原生質(zhì)體的顯微注射，和微粒轟擊轉(zhuǎn)化。對本發(fā)明來說，待插入所述序列的植物種不是特別重要?？梢赞D(zhuǎn)化雙子葉和單子葉植物。本發(fā)明可應(yīng)用于能用轉(zhuǎn)化技術(shù)轉(zhuǎn)化的任何植物。因此，本發(fā)明可用于各種植物，包括諸如canola、向日葵、煙草、甜菜和棉花的大田作物；諸如小麥、大麥、稻、玉米和高粱的禾谷類；水果和蔬菜。本發(fā)明還適合于各種組織，包括根、葉、莖和繁殖性組織。源于植物的所述序列的哺乳動物同系物可用于治療，特別是用于基因治療。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了含有本發(fā)明蛋白和核酸以及可以藥用的稀釋劑、賦形劑、載體或佐劑的藥用組合物。所述藥用組合物可以是人或動物使用的。通常，醫(yī)生可以確定最適合于受治對象的實際劑量，該劑量因特定個體的年齡、體重和反應(yīng)而不同。所述組合物可以選擇性地含有可以藥用的載體、稀釋劑、佐劑或賦形劑?？梢愿鶕?jù)預(yù)期的服用途徑和標(biāo)準(zhǔn)藥理學(xué)實踐選擇藥用載體、賦形劑、佐劑或稀釋劑。所述藥用組合物可以含有-或添加-除所述載體、賦形劑、佐劑或稀釋劑以外的任何合適的粘接劑、潤滑劑、懸浮劑、包衣劑、增溶劑、及其它有助于輸送的載體。如果合適的話，所述藥用組合物可以通過下述方法中的任一種或幾種服用吸入、栓劑或陰道藥形式，以洗液、溶液、霜劑、軟膏或干粉形式外用，使用皮膚膏，以含有諸如淀粉或乳糖的賦形劑的片劑形式口服或為單獨的或與賦形劑混合的膠囊或小丸形式，或為含有芳香劑或著色劑的酏劑、溶液或懸浮液形式，或可以通過腸胃外途徑注射，例如，肺內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射或皮下注射。對于腸胃外服用來說，所述組合物最好以無菌水溶液形式使用，該溶液可以含有其它物質(zhì)，例如，足夠的鹽或單糖，以便使得該溶液與血液等滲。對于口腔或舌下服用來說，所述組合物可以片劑或錠劑形式服用，這種制劑可用常規(guī)方法制備。本發(fā)明還提供了反義序列，而宿主細(xì)胞還包括本發(fā)明核酸的反義序列。所述序列同樣可用于篩選方法。下面將結(jié)合附圖通過非限定性實施例的形式對本發(fā)明的各種其它優(yōu)選特征和實施方案作進一步說明，其中圖1是證實ABA和信號中間產(chǎn)物對向內(nèi)K+通道的影響示意圖。實心箭頭表示由IP3釋放的Ca2+的增加?？招募^表示抑制作用。加斜線的箭頭表示由ABA導(dǎo)致的胞質(zhì)Ca2+含量的增加是可變的。圖2A是預(yù)期的植物ABA信號成分與卵母細(xì)胞內(nèi)源信號成分的聯(lián)系的示意圖。將ABA線性反應(yīng)用作在RNA注射的卵母細(xì)胞中ABA信號成分表達的分析。圖2B是用于分離功能性ABAcDNA克隆的克隆方法的示意圖。圖3表示第9號克隆(rek-Nt)的推測氨基酸序列與不同植物序列的相關(guān)受體激酶蛋白序列的比較。同源受體激酶是源于甘藍(Brassicaoleracea)的SRK4(S39911，Kumar和Trick，1993)；源于蕓苔(Brassicacampestris)的SRK9(D30049)或源于Ipomoeatrifida(U20948)的IRK1。A．N-末端根據(jù)用T7引物獲得的核苷酸序列推測B．C-末端根據(jù)用M13(f)引物獲得的核苷酸序列推測。圖4A表示構(gòu)建表達文庫的步驟；圖4B是用于克隆所述cDNA文庫pSPORT1表達載體的圖譜。圖5表示三種沒有明顯同源性的蛋白的親水性曲線和推測的疏水性結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列是根據(jù)2號克隆(A)、8號克隆(B)和12號克隆(C)推測的。親水性曲線和疏水性區(qū)是用Kyte-Doolittle算法推測的。大小水平方向20個氨基酸；垂直方向1個單位(Kyte-Doolittle)。圖6表示15號克隆(smG-Nt)的推測氨基酸序列與源于其它植物種的相關(guān)的小的RabG-蛋白的比較GRM1源于大豆(S47101，Borg和Poulsen，1994)；RAB11G源于日本百脈根(L．japonicus)(Z73955，Borg等1997)，ARA-4和RAB11均源于擬南芥(P28187，Anai等，1994和Y08904，Lin和Lin，1997)；煙草的另一種小的GTP結(jié)合蛋白NT-RAB11E(L29272，Haizel等1995)。圖7表示19號克隆(Cal-Nt)的推測氨基酸序列與擬南芥的相關(guān)的鈣視網(wǎng)膜蛋白序列CRT1的比較(U66243，Nelson，1997)。A．根據(jù)用T7引物獲得的核苷酸序列推測的cal-Nt的N-末端的比較。方框疏水性前導(dǎo)序列B．根據(jù)用M13(f)引物獲得的核苷酸序列推測的cal-Nt的C-末端的比較。方框HDEL保守域。圖8是在小泡?？亢腿诤喜襟E期間在主要成分之間蛋白-蛋白相互作用的示意圖。圖9A表示syr基因的核苷酸序列和推測的氨基酸序列；圖9B表示所述序列反應(yīng)的重疊群。圖11表示SYR-Nt(煙草)的氨基酸序列與KNOLLE-At(擬南芥Lukowitz等，1996)和人突觸融合蛋白家族的兩個不同成員SYNIA-HUM(Bennett等，1992)和SYN1B-HUM(保藏號R08740)的比較。黑色實心方框表示4種序列之間的相似性；空心方框表示SYR和KNOLLE之間(偶爾也與SNY1A或SNY1B進行比較)的相同性；雙線條方框是上皮形成素模式，在所述突觸融合蛋白之間是高度保守的；加引線的方框是疏水性-有可能跨膜-區(qū)，而星號表示僅存在于SYR上的核苷酸結(jié)合位點的特征。圖11表示突觸融合蛋白家族的代表性成員的系統(tǒng)樹。圖12表示在煙草中SYR表達的Northern分析。A．mRNA是從莖(泳道1和3)和葉(泳道2和4)中分離的。泳道1和2的植物生長條件為潮濕(接近100％的濕度)，而對泳道3和4來說為干燥條件(溫室條件)。B．從葉片中分離mRNA。從左到右的植物條件為100％濕度(對照，c)，干旱脅迫(dr)并用ABA處理1小時、24小時、48小時。C．從葉片中分離總RNA。植物是在高度潮濕的條件下生長，從左至右為對照c，用ABA處理30分鐘(1／2)、1小時、3小時、6小時、9小時、24小時和48小時、并用IAA處理30分鐘(IAA)。D．用于C中的凝膠用EtBr染色的核糖體帶在紫外線照射下的照片。圖13A表示卵母細(xì)胞電壓控制時的裝置的照片；圖13B表示所述腔室的關(guān)閉照片。圖14是用在卵母細(xì)胞膜上的電壓控制電路的示意圖。Vm自由膜電勢；Vcommand指令電壓；Im通過膜電壓調(diào)節(jié)的與指令電壓相應(yīng)的電流。圖15表示由Cl-攜帶的向外調(diào)整的卵母細(xì)胞電流，該電流依賴于鈣離子Ca2+。每一幅圖表示來自一個卵母細(xì)胞的數(shù)據(jù)電壓循環(huán)方案和相應(yīng)的控制電流與時間。卵母細(xì)胞電流被記錄為90mM[Cl]o或30mM[Cl]o。電壓控制循環(huán)(上)前脈沖，-60mV；8個測試脈沖，從-180mV至+40mV；后脈沖-60。B．在正常Ringer’s緩沖液中向外調(diào)整電流的反向電勢。電壓控制循環(huán)(左)調(diào)整脈沖，+50mV；實驗脈沖從-160mV到+30mV。箭頭表示電流是反向的(在-3mV和-34mV實驗脈沖之間)。C．用不同[Ca2+]o記錄的[Cl-]電流。電壓控制回路(上)前脈沖-60mV；實驗脈沖從-180mV到+40mV；后脈沖-60mV。大小水平方向，500nA；水平方向，500ns。圖16表示mRNA注射的卵母細(xì)胞的ABA反應(yīng)。A．在接觸ABA之前(圓形)、接觸ABA之后20秒(方形)和5分鐘(三角形)之后記錄的典型mRNA注射細(xì)胞的電流軌跡。電壓控制循環(huán)(上)前脈沖和后脈沖，-120mV；8個實驗脈沖在-180mV至+60mV之間。大小垂直方向1μA；水平方向1秒。B．從在實驗脈沖結(jié)束時的電流獲得的穩(wěn)態(tài)電流-電壓關(guān)系。符號與A交叉引用。C．在正常Ringer’s緩沖液中在ABA反應(yīng)期間測定的一種mRNA注射的卵母細(xì)胞的向外調(diào)整電流的反向電勢。電壓控制循環(huán)(上)調(diào)節(jié)脈沖，+20mV；實驗脈沖從-180mV到+20mV。箭頭表示放電反向(在-15mV和-35mV實驗脈沖之間)。大小垂直方向500nA；水平方向500ms。圖17表示ABA-誘導(dǎo)的電流的穩(wěn)態(tài)電流-電壓關(guān)系。穩(wěn)態(tài)電流是在實驗電壓脈沖結(jié)束時，在接觸ABA之前和期間記錄的。ABA-誘導(dǎo)的電流是通過從ABA處理頭1分鐘記錄到的反應(yīng)穩(wěn)態(tài)電流中減去背景穩(wěn)態(tài)電流(在ABA之前)而計算的。每一個點分別是mRNA注射的細(xì)胞的平均值±SE，所述細(xì)胞具有類似于圖16所示的ABA反應(yīng)(n=3)。圖18表示蔗糖梯度的某些組分和源于所述文庫的cRNA瓊脂糖凝膠照片。泳道1-6分別是1-6種蔗糖梯度組分，泳道7是RNA分子標(biāo)記。泳道8來自所述文庫的2000個克隆的cRNA。圖19表示用不同的蔗糖梯度mRNA收集物注射的卵母細(xì)胞將膜電壓控制在+60mV條件下ABA誘導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)電流的平均值±SE。圖20表示在添加ABA之前和之后用來自下面的含有20000，2000，200或20個轉(zhuǎn)錄物的陽性文庫的cRNA注射過的卵母細(xì)胞的控制電流軌跡。電壓控制方案顯示在該圖的上部。前、后脈沖，-120mV；8個測試脈沖為-180mV至+60mV。大小垂直方向500nA；水平方向，1秒。圖21平均值±SE弦導(dǎo)作為每個文庫的轉(zhuǎn)錄物的絕對量的函數(shù)的半對數(shù)曲線。圖22表示當(dāng)表達SYR的卵母細(xì)胞膜被控制在+60mV時測定的電流。測定是在刺穿細(xì)胞之后以所標(biāo)明的間隔進行的。前后脈沖為-120mV。大小垂直方向500nA；水平方向500ms。圖23表示表達SYR的卵母細(xì)胞的向外調(diào)整電流。A．電流軌跡是在含有2．5mMK+的正常Ringer緩沖液或在含有25mMK+的改進的Ringer緩沖液中記錄的。條件為電壓控制方案前脈沖和后脈沖為-120mV，8個測試脈沖為-160mV至+60mV。大小垂直方向1μA；水平方向1秒。B．瞬時的(圓形)和時間依賴型(三角形)分量的電流-電壓關(guān)系。2．5mMK+；和25mMK+。圖24表示在2．5mMK+；和25mMK+中進行的源于表達SYR的卵母細(xì)胞的向外調(diào)整電流的尾電流分析。電壓控制循環(huán)(下左)調(diào)節(jié)脈沖為+50mV；測試脈沖為-160mV至+30mV。箭頭表示放電反向。大小垂直方向1μA；水平方向1秒。圖25表示證實各種毒素、TEA、Ba2+、和niflumicacid的作用的電流軌跡，與對照(無毒素)進行比較。電壓方案前后脈沖為-120mV，8個測試脈沖為-160mV至+60mV。大小垂直方向μA；水平方向1秒。0圖26表示pQES，克隆在pQE-30表達載體上的SYR親水性片段。所述載體含有氨芐青霉素抗性基因，一個強啟動子-操縱子元件(噬菌體T5啟動子和兩個lac操縱子序列)，一個合成核糖體結(jié)合位點(RBS)，SYR基因前面有6個框內(nèi)組胺酸殘基，隨后是一個終止密碼子，以及兩個強終止子(源于λ噬菌體的t0和源于大腸桿菌的T1)。復(fù)制起點(ori)是ColE1。圖27表示作為BotN／C的模板所需要的序列基序。A．裂解位點；B．SYR的識別基序X1和X2左面主要是疏水性的(對于X1來說為34，41和37；對于X2來說為175，182和178)；右面主要是帶負(fù)電荷的(對于X1為35，39和36；對X2來說為176，180和177)。圖28表示在不同處理條件下，ABA對N.benthamiana的典型的保衛(wèi)細(xì)胞的陰離子電流的影響的電流軌跡。電壓控制循環(huán)(上)8個測試脈沖為-230mV至30mV。左沒有ABA，右有ABA。大小垂直方向100μA／cm2，水平方向2秒。A．對照細(xì)胞，不進行處理B．用BotC處理的細(xì)胞C．用BotD處理的細(xì)胞。圖29表示根據(jù)圖28中的電流軌跡推測的瞬時(左)和穩(wěn)態(tài)(右)電流的電流電壓關(guān)系。圓形沒有ABA，三角形有ABA。A．對照細(xì)胞，不進行處理B．用BotN／C處理的細(xì)胞C．用BotN／D處理的細(xì)胞。圖30表示瞬時陰離子電流的正交最大增加。示出了對照細(xì)胞的三個細(xì)胞，BotN／C的6個細(xì)胞和BotN／D的處理細(xì)胞的2個細(xì)胞的平均值。將在-200mV下的值與添加ABA之前的陰離子電流的大小校正。圖31表示在不同處理條件下，ABA對N.benthamiana的典型的保衛(wèi)細(xì)胞的[IK]in的影響的電流軌跡。電壓控制循環(huán)(上)調(diào)節(jié)脈沖在-100mV下1秒；4個測試脈沖為在-230mV和-130mV之間4秒。左沒有ABA，右有ABA。大小垂直方向100μA／cm2，水平方向1秒。A．對照細(xì)胞，不進行處理B．用BotC處理的細(xì)胞C．用BotD處理的細(xì)胞。圖32表示從圖31所示電流軌跡推測的穩(wěn)態(tài)電流的電流電壓關(guān)系，并進行漏電調(diào)節(jié)，圓形沒有ABA，三角形有ABA。A．對照細(xì)胞，不進行處理B．用BotN／C處理的細(xì)胞C．用BotN／D處理的細(xì)胞。圖33表示在-200mV的電壓下由ABA介導(dǎo)的IK，in值以在添加ABA之前電流值校正。示出了5個對照細(xì)胞，4個用BotN／C處理的細(xì)胞，和3個用BotN／D處理的細(xì)胞的平均值±SE。圖34表示在-200mV的電壓下由ABA介導(dǎo)的Ik，in值以在添加ABA之前的電流值校正。示出了3個BotN／C處理細(xì)胞的平均值(圓形)，僅記錄對照細(xì)胞的1個值(三角形)。圖35表示A．SDSPAGE的考馬斯染色泳道1和泳道2在用IPTG誘導(dǎo)之前(用泳道1)和之后(泳道2)的大腸桿菌M15[pREP14][pQES]的總蛋白提取物。泳道3在Ni2+樹脂結(jié)合之后洗滌。泳道4純化的SP2。B．用免疫前血清(泳道1和2)和SYR抗體(泳道3和4)雜交的5ng(泳道1和3)純肽和50ng(泳道2和4)純肽的Western印跡。圖36表示A．用免疫前(泳道1和2)和抗SYR抗體血清(泳道3和4)進行的Western雜交。泳道1和3W303-1A泳道2和4W303-1A(SYR)2。B．用肉毒桿菌毒素處理之后用抗SYR抗體作為探針?biāo)龅腤303-1A(SYR)膜蛋白提取物的Western印跡。泳道1W303-1A(SYR)對照；泳道2W303-1A(SYR)+BotN／C；泳道3W303-1A(SYR)+BotN／D；泳道4分子量標(biāo)準(zhǔn)。圖37表示Southern印跡。DNA印跡來自N．benthamiana(泳道1和2)，和煙草(泳道3和4)。DNA用EcoRI(泳道1和3)或HindIII(泳道2和4)消化。圖38表示在含有半乳糖的培養(yǎng)基(A)和缺少半乳糖的培養(yǎng)基(B)上酵母菌株的生長。使用了三種菌株。WT野生型釀酒酵母(S.cerevisiae)，H440(Aalto等，1993)，和H440(SYR)表達SYR基因的H440菌株。C．酵母菌株H440的膜蛋白提取物的Western印跡。泳道1和3H440；泳道2和4H440(SYR)。所使用的探針是免疫前血清(泳道1和2)和抗SYR血清(泳道3和4)。圖39表示擬南芥DNA的Southern雜交。將用EcoRI消化過的DNA與EST、P16862(左側(cè)泳道)和SYR(右側(cè)泳道)雜交。圖40(或序列5)表示克隆在pG3SA上的反義cDNASYR；圖41表示Nt-Syr蛋白的疏水性、比較和表達分析。(A)Nt-Syr的重要特征包括推測的Ca2+-結(jié)合(EF手)和核苷酸結(jié)合(NBS)位點，部分保守的兩親性X1和X2域(*)供BotN／C毒素識別和裂解，以及3個推測的卷曲螺旋域(H1-H3)。在上皮形成素模式域(=H3)和C-末端疏水尾上發(fā)現(xiàn)了與擬南芥的Knolle(15)和人突觸融合蛋白-1A(Syn1A)(3)之間的高度氨基酸保守性。相當(dāng)于頭279個氨基酸的截短的蛋白(Sp2)是N-His-標(biāo)記的，并被用于制備抗體。圖42表示神經(jīng)毒素BotN／C而不是BotN／D在煙草的保衛(wèi)細(xì)胞中尋找Nt-Syr并阻斷ABA有反應(yīng)的離子通道。(A)微粒體蛋白部分是從煙草葉片中分離的，用或者不用1mMAPT預(yù)處理，并與BotN／C和BotN／D溫育。通過SDS-PAGE分離蛋白，并用抗-Sp2抗血清通過Western印跡分析進行測定。每個泳道加樣6克蛋白。(B)在有和沒有BotN／C的條件下在保衛(wèi)細(xì)胞中對20MABA的Cl-通道反應(yīng)的電壓控制分析。電壓控制步驟(上)調(diào)節(jié)電壓(5秒)，+30mV(未示出)；測試電壓(6個循環(huán))，-160到+30mV。測定在15mMTEA-Cl和15mMCsCl中進行，以消除K+通道電流。電流軌跡來自加載0．1MBotN／C、添加20MABA之前和之后8分鐘的1個保衛(wèi)細(xì)胞。來自ABA中的第二個細(xì)胞的數(shù)據(jù)作為比較。加載和未加載毒素的細(xì)胞在無ABA時觀察的電流特征未見明顯差異。大小垂直100Acm-2，水平2秒。(C)BotN／C和BotN／D加載(n5)和未加載(對照)細(xì)胞的Cl-電流(ICI，上)和向內(nèi)調(diào)整K+電流(IK，in，下)的ABA反應(yīng)的平均值+／-SE。數(shù)據(jù)在-200mV時記錄，校正成ABA處理前的相應(yīng)測定值。(D)(B)中符號交叉引用的瞬時電流的電流-電壓關(guān)系。圖43表示截短的Nt-Syr蛋白(Sp2)在煙草保衛(wèi)細(xì)胞中是如何阻斷ABA的離子通道反應(yīng)。(A)在保衛(wèi)細(xì)胞中對20MABA的K+通道反應(yīng)的電壓控制分析。電壓控制步驟(上)調(diào)節(jié)電壓，-100mV；測試電壓(16個循環(huán))，-250mV至+30mV；尾電壓，-100mV。測定是在10mMKCl中進行的。電流軌跡是來自加載20MSp2、加入20MABA之前和之后10分鐘的保衛(wèi)細(xì)胞。示出了第二個細(xì)胞在ABA中的細(xì)胞的數(shù)據(jù)，以便比較。在沒有ABA的條件下，在非加載的細(xì)胞和加載Sp2蛋白的細(xì)胞之間在電流特征方面沒有明顯差別。大小垂直方向100Acm-2，水平方向1秒。(B)在非加載的(對照)和Sp2加載的細(xì)胞中在添加ABA之前和之后10分鐘的平均值+／-SE。數(shù)據(jù)是在添加ABA之前和之后10分鐘向內(nèi)調(diào)整(IK，IN，空心向下的棒)和向外調(diào)整(IK，OUT，空心向上的棒)K+電流和Cl-電流(ICl，陰影向下的棒)。電流是在-200mV(IK，in)，+30mV(IK，OUT)，和-100mV(ICl)的電壓下在穩(wěn)態(tài)狀態(tài)下記錄的。以上三種電流在特定電壓下的穩(wěn)態(tài)幅度如下IK，in(-200mV，向下的棒)，IK，out(向上的棒)和ICl(灰色的棒)。(C)來自圖A的穩(wěn)態(tài)電流的電流-電壓關(guān)系。電流值是從總的穩(wěn)態(tài)電流中減去泄露的瞬時電流的結(jié)果。在A中符號是交叉引用的。表達克隆脫落酸信號成分的方法為了分離脫落酸信號成分蛋白，選擇異源爪蟾卵母細(xì)胞表達系統(tǒng)。選擇該系統(tǒng)的原因有三個。但沒有有關(guān)受體分子結(jié)構(gòu)或受體DNA或蛋白序列的有關(guān)資料，并且在受體位點上(膜結(jié)合或胞質(zhì)性的)沒有共有序列。(2)有確切的證據(jù)表明，Ca2+在ABA信號途徑中起著第二信使的作用，因此，當(dāng)ABA感受蛋白在卵母細(xì)胞中表達時，所述激素應(yīng)當(dāng)能夠誘導(dǎo)卵母細(xì)胞Cl-電流。ABA信號傳導(dǎo)和內(nèi)源Ca2+依賴型Cl-通道的結(jié)合可以在該途徑的任何步驟上進行。(3)在爪蟾卵母細(xì)胞中表達植物膜蛋白業(yè)已得到成功地再現(xiàn)。我們使用的是類似于由Julius等(1988)披露的方法(科學(xué)241558-564)，做了某些改進。最初，該方法需要用富含poly(A)+mRNA注射卵母細(xì)胞，所述mRNA是從幼小的煙草葉片中純化的。篩選是通過常規(guī)電生理學(xué)進行的，分析爪蟾Ca2+依賴型Cl-通道的活化(圖2A)。用諸如乙酸鉀的弱酸作為負(fù)對照證實所述反應(yīng)的專一性。還可以進行其它對照，以便用未注射的和用水注射的卵母細(xì)胞證實ABA反應(yīng)的mRNA專一性。一旦證實了卵母細(xì)胞Cl-通道對ABA的反應(yīng)，即可進行目的在于分離活性轉(zhuǎn)錄物的實驗。可以用蔗糖梯度根據(jù)大小將mRNA分離成若干組分，可以分別注射每一種組分。然后將產(chǎn)生陽性ABA反應(yīng)的組分用作模板構(gòu)建cDNA文庫。為了進行表達分析，將cDNA不定向地克隆在表達載體pSPORT上，其中，在插入片段的旁側(cè)是RNA聚合酶T7和SP6的啟動子。在制備質(zhì)粒DNA和線性化之后，來自所述克隆文庫的亞組分的cDNA模板用T7RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄，并且在該合成步驟中對RNA加上mGpppG分子帽，以便產(chǎn)生所述cDNA插入片段的功能性cRNA拷貝。用該cRNA注射爪蟾卵母細(xì)胞，并按上述方法分析ABA對Cl-通道的激活作用。這樣，產(chǎn)生陽性反應(yīng)的cDNA克隆文庫將總是包括完全實現(xiàn)ABA感受的最低完整需求。該組合可以逐漸細(xì)分成較小的文庫(同胞選擇)，直到獲得最小的陽性組分(圖2B)。分子克隆和生物化學(xué)方法到目前為止尚未得到一種編碼可能的ABA受體的基因。篩選ABA受體的主要困難如下通過生理學(xué)分析有理由相信可能存在多種ABA受體，每一種起著不同的作用。ABA信號被證實在不同的分子水平上針對不同的目標(biāo)。一方面，ABA在細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面介導(dǎo)快速生理學(xué)調(diào)節(jié)，包括在保衛(wèi)細(xì)胞膜上控制轉(zhuǎn)運蛋白，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉。另一方面，ABA能在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上引起多種較慢的反應(yīng)，導(dǎo)致發(fā)育和營養(yǎng)脅迫抗性所必須的ABA效應(yīng)基因的表達的改變。在ABA受體的細(xì)胞定位(細(xì)胞質(zhì)或膜結(jié)合)方面有很少的共同性。即使在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的體內(nèi)穩(wěn)態(tài)轉(zhuǎn)運控制情況下也是如此。另外，不同的細(xì)胞對高含量的ABA產(chǎn)生不同的反應(yīng)，例如，葉綠素細(xì)胞與保衛(wèi)細(xì)胞。盡管所述對ABA的各種反應(yīng)在一定程度上取決于與每一種反應(yīng)相關(guān)的因子的差別，有關(guān)發(fā)現(xiàn)還表明存在多種ABA受體，并且難于預(yù)測其細(xì)胞定位。為了克隆ABA信號成分，我們采用了另一種技術(shù)，利用使用爪蟾卵母細(xì)胞的表達克隆方法。用該方法克隆ABA信號成分的優(yōu)點是沒有必要預(yù)測其分子結(jié)構(gòu)。人們所關(guān)心的是，以前在植物上尚未證實的將信號成分結(jié)合到卵母細(xì)胞信號途徑上的能力。盡管不希望受任何理論的限制，但我們相信ABA刺激位于爪蟾卵母細(xì)胞信號途徑之上，因為有共同的第二信使，無細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度。第一個步驟是證實來自爪蟾卵母細(xì)胞的Cl-通道對Ca2+的依賴性。然后，在通過異源表達克隆ABA信號成分之前，我們分析了所述卵母細(xì)胞將表達的煙草mRNA轉(zhuǎn)錄物通過Ca2+與其內(nèi)源通道結(jié)合的效力，該分析是通過測定Cl-電流對ABA的反應(yīng)而進行的。將爪蟾卵母細(xì)胞用作異源表達系統(tǒng)爪蟾及其卵母細(xì)胞爪蟾是源于南非的有爪蟾蜍。爪蟾的卵子發(fā)生是一種連續(xù)的、不同期的過程，而且，在雌性動物的成年生命的所有時間，卵母細(xì)胞在發(fā)育的所有階段都存在于卵巢中。完全長成的不成熟的卵母細(xì)胞(第Ⅵ期，見下文)的產(chǎn)生需要5-7周時間。卵母細(xì)胞發(fā)育分成六個階段，第Ⅰ階段包括小的(50-100微米)無色卵母細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)是透明的，其大型細(xì)胞核和線粒體在完整的卵母細(xì)胞中清晰可見。第Ⅱ階段的卵母細(xì)胞其直徑達450微米，并且出現(xiàn)白色和不透明性。第Ⅰ和第Ⅱ階段都是卵黃生成前期。色素和卵黃積累(卵黃生成)始于第Ⅲ階段。卵黃生成持續(xù)到第Ⅳ階段(600-1000微米)，卵母細(xì)胞迅速生長，并且動物(棕色)和植物(黃色)半球開始分化，到第Ⅴ階段(1000-1200微米)，卵母細(xì)胞已接近其最大體積，并且卵黃積累逐漸停止。第Ⅵ階段卵母細(xì)胞的特征是必須的無色赤道帶的出現(xiàn)。其大小為1200-1300微米，此時處于卵黃生成的后期，并做好了排卵和成熟的準(zhǔn)備。完全長成的卵母細(xì)胞(第Ⅵ階段)包圍著下列各層(從最里邊一層開始)。所述細(xì)胞有一個連續(xù)的卵黃磷蛋白膜包圍，該膜是非細(xì)胞纖維狀層。在它上面有一層卵泡細(xì)胞。所述細(xì)胞通過間隙連接與卵母細(xì)胞結(jié)合，它能容許高達1kD的分子自由通過，并提供電傳導(dǎo)。包圍卵泡細(xì)胞的teca是一種結(jié)締組織層，其中，埋有平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)纖維、和毛細(xì)管。最后，最外面的一層是上皮細(xì)胞層，它形成連續(xù)的卵細(xì)胞壁。除了卵黃磷蛋白膜之外，所有外層通常都被稱為‘卵泡層’，并可以用膠原酶通過酶促方法除去。爪蟾卵母細(xì)胞的第二信使和電特性卵母細(xì)胞中的Ca2+信號傳導(dǎo)。Ca2+介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑包括通過G-蛋白和肌醇-1，4，5-三磷酸(IP3)合成介導(dǎo)的途徑，業(yè)已通過分析卵母細(xì)胞受精和通過引入新的受體在卵母細(xì)胞中對其進行了分析。與爪蟾卵母細(xì)胞受精相伴的是Ca2+的釋放波和膜去極化作用，而該過程被認(rèn)為是由IP3引起的。業(yè)已證實注射IP3能在成熟的爪蟾卵母細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca釋放。無細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度([Ca2+]i)對細(xì)胞膜上的電流活性，特別是Ca2+依賴型Cl-通道有影響(見下文)。卵母細(xì)胞Ca2+依賴型Cl-通道。在八十年代初期，電生理學(xué)家描述了在爪蟾卵母細(xì)胞膜中由電壓激活的Ca2+依賴型Cl-電流(Icl(ca))。在將卵母細(xì)胞膜從-120mV的滯留電勢去極化至更偏向于正電壓的-20mV時，引起了瞬時向外電流。所述向外電流的大小在卵母細(xì)胞中是高度可變的，在大部分卵母細(xì)胞中，在正常生理狀態(tài)下該電流是不可檢測的，而在某些場合下其峰值在100nA范圍內(nèi)。所述電流取決于外部Cl-，而不是K+或Na+。并具有大約-25-大約30mV的反向電勢，該值接近Cl-的平衡電勢(Ecl)。另外，所述電流對諸如四乙銨(TEA)的典型的K+通道抑制劑無反應(yīng)，但會受到一種Cl-通道抑制劑niflumicacid的破壞。以上結(jié)果可以導(dǎo)致這樣的結(jié)論，向外的電流主要是由進入細(xì)胞的Cl-流入量攜帶的。[注意，向外的調(diào)整電流取決于帶正電荷的陽離子的流出量或帶負(fù)電荷的陰離子的流入量]。Ca2+依賴性最初是通過離子取代和通過改變外部Ca2+濃度而測定的。通過用Mg2+或Sr2+取代外部Ca2+消除所述電流。相反，提高外部Ca2+濃度([Ca2+]o)可以提高向外電流的大小。最近，業(yè)已了解到存在兩種具有不同動力學(xué)的Ca2+激活的Cl-電流，首先，發(fā)現(xiàn)注射IP3會對膜電勢的去極化作用產(chǎn)生迅速的刺激和瞬時向外Cl-電流(ICl-1)。在30秒之后達到最大電流(2-4μA)，并在1．5分鐘內(nèi)降低到接近基線。這種早期誘導(dǎo)的電流具有接近Ecl的反向電勢，并表現(xiàn)出兩種動力學(xué)分量。一種分量是具有線性電流-電壓(IV)關(guān)系的瞬時電流。第二個分量包括時間依賴型電流，該電流增加得更慢一些，在20mV的電壓下其半衰期為250ms。第二種電流Icl-2在IP3注射之后3分鐘緩慢形成1／2最大反應(yīng)，達到1-2μA的最大峰值，并穩(wěn)定至少15分鐘。Icl-2也具有接近Ecl的反向電勢，并同樣包括兩個分量一個時間獨立型Icl-2I和時間依賴型Icl-2D分量。瞬時電流Icl-2I的電流-電壓關(guān)系是線性的，而對于Icl-2D的電流電壓關(guān)系是高度向外調(diào)整的。Cl-電流Icl-1和Icl-2是Ca2+激活的，因為在用Ca2+螯合劑BAPTA注射細(xì)胞時可以破壞IP3誘導(dǎo)的兩種電流。以上兩種電流取決于不同來源的Ca2+。Icl-1取決于從內(nèi)部儲存來源釋放的Ca2+和Ca2+流入量。不過，Icl-2D取決于外部Ca2+的流入量，因為當(dāng)消除外部Ca2+或阻止外部Ca2+進入細(xì)胞(通過添加Ca2+通道抑制劑如Mn2+)，可以消除電流Icl-2D。在相同條件下，ICl-1保持不變。其它卵母細(xì)胞通道如上文所述，爪蟾卵母細(xì)胞具有在其膜中具有電壓控制的Ca2+通道，并預(yù)期能造成Ca2+流入以便激活Cl-電流。所述Ca2+通道是其它二價陽離子可以滲透的。用40mM外部Ba2+消除Cl-電流的干擾，因為它不會通過改變內(nèi)部Ba2+濃度而被激活。采用40mM的外部Ba2+，在用比-30mV更偏向陽性的電壓對膜進行去極化時，檢測到向內(nèi)的電流。該電流受諸如Co2+和Cd2+的典型的Ca2+通道抑制劑的抑制。以上結(jié)果表明，所觀察到的電流是由Ba2+通過電壓依賴型Ca2+通道攜帶的。假設(shè)Ba2+和Ca2+的滲透性相似，Ca2+電流被計算為1nA，因此，低于在生理條件下的分辨極限(2mM外部[Ca2+]0)。在使用Ca2+通道抑制劑以便消除背景Cl-電流時，觀察到小的(30-40nA)向外調(diào)整K+電流，表明存在Ca2+-不敏感K+通道。該電流的反向電勢受外部K+濃度的影響，并隨K+的平衡電勢而變化，表明該電流主要是由K+攜帶的。該電流對典型的K通道抑制劑TEA(四乙銨)敏感。由Na+攜帶的最終電流在該細(xì)胞中是已知的。在對細(xì)胞膜進行長時間的去極化作用(以分鐘計)時，由電壓啟動的Na+通道被打開。該通道在卵母細(xì)胞中的生物學(xué)功能尚不清楚?？梢岳斫獾氖牵琋a+再極化電流可能在防止過度的膜去極化和在卵母細(xì)胞成熟和受精期間提供平衡的向內(nèi)和向外的電流方面起著作用。它們可能是存在于受精卵中的通道的前體?？傊畬β涯讣?xì)胞的詳細(xì)分析業(yè)已發(fā)現(xiàn)了多種具有電壓依賴型和[細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外]Ca2+依賴型的典型特征的電流。所有電流可以通過離子選擇性和動力學(xué)特征鑒定。哺乳動物受體在爪蟾卵母細(xì)胞中的表達和克隆異源表達的效率和準(zhǔn)確性業(yè)已對爪蟾卵母細(xì)胞進行了生理學(xué)和電生理學(xué)方面的詳細(xì)鑒定，并被反復(fù)用于表達通過注射純化的mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA引入的離子通道和膜受體的異源哺乳動物基因。所述卵母細(xì)胞是自我容納的系統(tǒng)，不僅能夠翻譯外源mRNA，而且能進行翻譯后修飾。所述修飾對于受體表達來說可能是重要的，并包括磷酸化、糖基化和亞基組裝，以及將該分子插入細(xì)胞膜的能力。蛋白被定向于任何其它預(yù)定的亞細(xì)胞區(qū)室而且分泌蛋白被外泌。G-蛋白結(jié)合受體的功能性表達G-蛋白結(jié)合的受體屬于一個特征在于7個膜區(qū)段的跨膜受體家族(7TMS)。7TMS受體可以在爪蟾卵母細(xì)胞中功能性表達，并成功地連接于內(nèi)源信號傳導(dǎo)成分上。有證據(jù)表明外源7TMS受體可以連接到卵母細(xì)胞所固有的G蛋白和磷酸酶C(PLC)上。因此，當(dāng)用乙酰膽堿刺激表達毒蠅堿性受體的卵母細(xì)胞時會發(fā)生IP3誘導(dǎo)的Ca2+移動。通過細(xì)胞內(nèi)Ca2+將TMS受體結(jié)合于內(nèi)源通道上的方法是已知的。最近，業(yè)已證實一種腺苷酸環(huán)化酶結(jié)合的受體也可以在卵母細(xì)胞中功能性表達，并結(jié)合于內(nèi)源G蛋白上。在這種情況下，發(fā)現(xiàn)EP2和IP前列腺素類受體的激動劑通過刺激腺苷酸環(huán)化酶提高細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，能夠激活一種cAMP-依賴型Cl-通道，即共表達的囊性纖維化跨膜導(dǎo)電調(diào)節(jié)物。圖2歸納了從以上有關(guān)研究中獲得的有關(guān)表達和結(jié)合的一般模式。將全面表達的和功能性的受體插入卵母細(xì)胞膜中，并連接于卵母細(xì)胞內(nèi)源G蛋白上。在通過合適的配體刺激之后，會發(fā)生PLC的活化。磷肌醇二磷酸(PIP2)水解會導(dǎo)致IP3和二酰甘油(DAG)的合成，IP3能刺激Ca2+從內(nèi)部來源中釋放。細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加會激活內(nèi)源Ca2+依賴型Cl-通道。事實上，任何最終會導(dǎo)致[Ca2+]結(jié)合的途徑都會促進天然Cl-電流。另外，G蛋白可以激活腺苷酸環(huán)化酶，導(dǎo)致cAMP的產(chǎn)生，并刺激異源cAMP-依賴型Cl-通道。受體的表達克隆業(yè)已證實，從哺乳動物大腦中提取poly(A)+RNA并注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，可以導(dǎo)致功能性離子通道的合成和結(jié)合，該通道隨后可以通過電壓或通過神經(jīng)遞質(zhì)藥物激活。該表達系統(tǒng)還可用于部分克隆神經(jīng)遞質(zhì)受體和電壓操縱的通道的方法。因此，該系統(tǒng)的作用可被用于分離并分析膜轉(zhuǎn)運蛋白和受體。在用煙草mRNA注射時，爪蟾卵母細(xì)胞的內(nèi)源Cl-電流可以由ABA誘導(dǎo)。我們業(yè)已發(fā)現(xiàn)從植物組織中分離的或用cDNA克隆作模板在體外合成的植物mRNA在注射到爪蟾卵母細(xì)胞之后也可以翻譯。首先對未注射過的爪蟾的未注射的脫卵泡卵母細(xì)胞進行電壓控制記錄。在細(xì)胞上測定的具有波動電流的向外調(diào)整電流是由Cl-攜帶的，并且包括兩個分量，一個是瞬時性的，另一個是時間依賴型的。該電流的大小是[Ca2+]i依賴型的。當(dāng)外側(cè)[Ca2+]o提高時，Cl-電流增加到500nA的最大值，它在40mV電壓下在4分鐘之后出現(xiàn)t1／2為300ms的激活，然后在5分鐘之內(nèi)降低到背景水平。所述Ca2+刺激最有可能是由于Ca2+通過電壓依賴型通道進入細(xì)胞所導(dǎo)致的，這一結(jié)果與上述以前觀察到的結(jié)果一致。將煙草poly(A)+RNA注射到卵母細(xì)胞中并進行功能性表達。通過注射mRNA，卵母細(xì)胞能夠識別ABA。測定的針對ABA的很強的向外調(diào)整Cl-電流很有可能是通過細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]的提高誘導(dǎo)的，并在5分鐘之內(nèi)減弱。在60mV電壓下測定的3．1μA的最大電流和t1／2100ms的動力學(xué)與在文獻中披露的Icl-1電流分析的結(jié)果相當(dāng)(在20mV電壓下，2．5μA，t1／2250ms)。ABA-卵母細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑的結(jié)合通過注射煙草mRNA將這種特定的ABA反應(yīng)移植到卵母細(xì)胞中，業(yè)已在上游植物激素感受成分和下游卵母細(xì)胞信號成分之間建立了聯(lián)系。這種聯(lián)系是由電流反應(yīng)的專一性暗示的。只有當(dāng)ABA施加到mRNA注射過的卵母細(xì)胞上時才記錄到信號。如果取消或取代ABA或者mRNA注射都不會記錄到信號。(1)乙酸鉀，一種像ABA那樣的弱酸不能在mRNA注射的卵母細(xì)胞中引起ABA信號。(2)水注射的卵母細(xì)胞對ABA沒有反應(yīng)。在植物和卵母細(xì)胞ABA反應(yīng)之間的最終的平行表明在每一種情況下具有相似的上游調(diào)節(jié)成分。當(dāng)獲得有說服力的ABA反應(yīng)時，就再也不可能用ABA再一次重新誘導(dǎo)向外的調(diào)整電流(對兩個陽性細(xì)胞進行過測定)。這表明激素感受分子的脫敏作用。脫敏是通過負(fù)反饋獲得的，并且通常是通過受體分子上氨基酸殘基的磷酸化而完成的。以上實驗證實在源于植物的激素感受蛋白和爪蟾卵母細(xì)胞的更下游一些的傳導(dǎo)成分之間形成了聯(lián)系。這種聯(lián)系使得在異源卵母細(xì)胞中檢測并分析ABA專一性反應(yīng)成為可能。只有當(dāng)ABA感受所必需的植物成分得到表達時，ABA才能在卵母細(xì)胞中刺激電壓依賴型向外調(diào)整的Cl-電流。現(xiàn)在，轉(zhuǎn)錄物特定性和ABA誘導(dǎo)的向外調(diào)整電流可以在該方法中連續(xù)使用，以便富集并克隆該聯(lián)系所必需的基因。到目前為止，業(yè)已涉及到轉(zhuǎn)錄物的總的混合物，正是在這一階段我們試圖富集并確定所述候選材料，以便分離更重要的成分。用于克隆的方法基于由Julius等(1988，同上)披露的方法，進行了某些改進，包括分離mRNA，并隨后構(gòu)建cDNA文庫，以便制備同胞選擇方法，分離在卵母細(xì)胞中決定ABA敏感性的克隆。根據(jù)大小在連續(xù)的蔗糖梯度上將mRNA分成10種組分。用pSPORT1表達載體將一個陽性組分克隆到cDNA文庫中。將來自20，000克隆的質(zhì)粒DNA的體外轉(zhuǎn)錄的cRNA注射到卵母細(xì)胞中，并且在體內(nèi)翻譯之后觀察到小的但是明顯的ABA反應(yīng)，即向外調(diào)整Cl-電流的瞬時增加。同胞選擇會導(dǎo)致以2，000∶200的比例分離陽性文庫，最后有20種轉(zhuǎn)錄物在每一種情況下能引起相似的ABA反應(yīng)。隨著文庫規(guī)模的降低，有關(guān)信號增強，這與活性轉(zhuǎn)錄物的純化一致。為了制備所述文庫，將一種質(zhì)粒用作載體，并將大腸桿菌用作細(xì)菌宿主。選擇使用pSPORT1載體的BRLSuperscript質(zhì)粒試劑盒。在將轉(zhuǎn)錄物安排到cDNA文庫中之前，在連續(xù)的蔗糖梯度上分離mRNA。通過同胞選擇，分離到含有編碼可能的ABA信號成分的基因的20個cDNA克隆。在爪蟾卵母細(xì)胞中表達互補于所述基因的cRNA轉(zhuǎn)錄物，并產(chǎn)生ABA信號，導(dǎo)致內(nèi)源Cl-通道的激活。對該文庫進行細(xì)分的努力沒有成功，就是說不可能用單一的克隆或少于20個克隆的文庫在表達cRNA的卵母細(xì)胞中恢復(fù)ABA信號，即當(dāng)將20個克隆的文庫分成更小的克隆組時，不能記錄到ABA信號。對所有20種cDNA的核苷酸序列進行分析，以便了解哪一個克隆可能是ABA信號成分的候選者，哪些克隆被從進一步研究中明確排除。將由該核苷酸序列推測的所有可能的氨基酸序列與蛋白數(shù)據(jù)庫進行比較。相似性表明某些基因相當(dāng)于具有與信號無關(guān)或不可能有關(guān)系的功能的酶或蛋白，其它基因?qū)υ摂?shù)據(jù)庫中的任何東西都沒有相似性，但被認(rèn)為是有意義的，因為它們含有若干推測的跨膜區(qū)。最后，最干興趣的幾個基因與已知在信號傳導(dǎo)中具有明確功能的蛋白具有同源性。其中，包括小的G-蛋白(smG-Nt)、鈣視網(wǎng)膜蛋白(cal-Nt)、受體激酶(rek-Nt)和突觸融合蛋白樣(syr)蛋白。僅僅是在這一部分中，通過NCBI提供的序列相似性結(jié)果給出了評分和可能性。當(dāng)?shù)梅指哂?0時，其相似性是高度可能的，正如在大多數(shù)情況下看到的(表1)。當(dāng)?shù)梅值陀?0時，則認(rèn)為相似性不很明顯。對于5號克隆(轉(zhuǎn)錄因子)、8號(可能的表面蛋白)和9號(rek-Nt)來說情況如此。5號克隆的低的得分可能是由于這里的相似性存在于植物和爪蟾序列之間。不再對該克隆作進一步研究，因為在爪蟾卵母細(xì)胞中可能已經(jīng)存在同源性。8號克隆與該數(shù)據(jù)庫中的任何序列都沒有明顯的同源性，但與推測的表面蛋白的低同源性是有趣的，因為其序列包含著推測的跨膜區(qū)。9號克隆是受體激酶樣基因，在其5’末端表現(xiàn)出與甘藍的受體激酶蛋白(表2)具有相似性，其高達151的高得分是顯著的。在3’末端(65)的低得分也表現(xiàn)出重要性，因為較大的DNA片段與受體激酶的一部分非常吻合(圖3)。其可能性同樣與得分負(fù)相關(guān)。在頭300bp上，序列資料的總體準(zhǔn)確率估計＞99％。對序列誤差的作用所作分析表明，所述誤差不會明顯降低通過BLAST檢索鑒定所述DNA序列的可能性。另外，沒有用完整長度的序列進行比較，因為這可能導(dǎo)致僅有同源區(qū)而不是完整的序列同源性。只是將末端區(qū)(5’和／或3’)用于BLASTX檢索，不過它們占總的cDNA插入片段長度的50％以上，因此可以提供有關(guān)基因序列相似性的正確信息。對11號克隆(沒有ORF)、13號克隆(人類的信號識別顆粒)和20號克隆(甲基轉(zhuǎn)移酶)進行的序列測定低于50％。因為不可能用包括少于20個樣品的文庫再現(xiàn)ABA信號，用一種不同方法來揭示20種單一克隆的功能。對20個克隆的cDNA插入片段進行部分或全部測序，以便確認(rèn)哪些基因有可能參與ABA信號傳導(dǎo)，哪些基因可以被排除(表1)。首先，用Not1-EcoR1限制性內(nèi)切核酸酶消化所述克隆，然后在瓊脂糖上估計所述插入片段的大小。10號和17號克隆所含的插入片段小于200bp。對這兩個克隆不再作進一步研究。用Taq聚合酶PCR-序列反應(yīng)和ABIPRISM310遺傳學(xué)分析儀獲得所有其它克隆的核苷酸序列。用T7引物完成PCR反應(yīng)。T7啟動子序列位于SPORT1載體上，位于cDNA插入片段的5’末端(圖4)，對于大于900bp的插入片段來說，進行兩次測序反應(yīng)，5號、11號和20號克隆除外。所述第二次反應(yīng)是用M13(f)引物進行的。M13(f)互補序列位于pSPORT1載體上，位于cDNA插入片段的3’末端。每一次反應(yīng)獲得大約700bp的序列。對序列進行人工編輯(EDITSEQ程序)，以便消除位于所述序列5’末端的載體和poly(T)序列，并辨別不能由自動測序儀確認(rèn)的模棱兩可的序列。通過該方法產(chǎn)生的平均序列大約為400bp長。將cDNA核苷酸序列的6個可能的推測氨基酸序列與非豐余蛋白數(shù)據(jù)庫進行比較，使用由NCBI提供的BLASTXe-mail服務(wù)器。所述BLASTX檢索的結(jié)果歸納在表1中，在表中給出了最高評分的同源性以及該同源性的得分和可能性特征。一般，所述得分是從來自具有最高相似性的序列區(qū)域的排列氨基酸的整數(shù)值的總和確定的。對這一部分來說，只有當(dāng)?shù)梅指哂?0時，才認(rèn)為所述cDNA和已知序列之間的序列同源性顯著。所給出的每一個序列同源性的可能性P(N)表示在數(shù)據(jù)庫檢索中一個序列預(yù)期出現(xiàn)的次數(shù)。該值越接近零，該檢索就越可靠。該值越接近1，其相似性就越不顯著?？赡苄灾等Q于多種因素，包括采用哪一種評分方案，查詢序列的殘基組成，一種典型數(shù)據(jù)庫序列的假設(shè)殘基組成，查詢序列的長度，和該數(shù)據(jù)庫的總長度。表1來自陽性文庫的20個克隆BLASTX結(jié)果最有可能參與信號傳導(dǎo)的克隆。<tablesid="table1"num="001"><table>nr大小T7aM13a可能的功能P(N)D得分D保藏號1750*-----2850*-----3900-**-PAR-病原體相關(guān)蛋白(煙草)PAR-病原體相關(guān)蛋白(煙草)8．3e-511．4e-16386136S57419S5741941100*-*無機磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(馬鈴薯)無機磷酸轉(zhuǎn)運蛋白(馬鈴薯)3．9e-1131．4e-33850267X98890X9889051000*-磷酸酶抑制劑(兔)Rubisco活化酶(煙草)0．0365061100*--*Rubisco活化酶(煙草)病原體相關(guān)pr4B-蛋白(煙草)6．0e-533．9e-43239348S25483S254837750*-推測的表面蛋白(紫苜蓿)8．3e-98480S2380081300*--9．9e-0573U28149-*S受體激酶K4(甘藍)---91200*--*受體激酶(I．trifida)3．7e-403．2e-0515165S39911U2094810---未發(fā)現(xiàn)ORF---111250*-----122100*------*信號識別顆粒受體(人)---131300*-突觸融合蛋白相關(guān)蛋白(擬南芥)3．9e-16167W68942141250*-突觸融合蛋白相關(guān)蛋白(擬南芥)7．3e-38180U39452-*小G蛋白(rab)(日本百脈根)1．0e-32141U3945215750*-未發(fā)現(xiàn)ORF3．2e-59333Z7395516500*-----17200--碳酸酐酶(煙草)---</table></tables><tablesid="table2"num="002"><table>181000*-碳酸酐酶(煙草)1．4e-117765M94135-*鈣網(wǎng)蛋白(擬南芥)2．0e-61430M94135192500*-鈣網(wǎng)蛋白(擬南芥)2．1e-62495U27698-*SAM甲基轉(zhuǎn)移酶(大豆)8．3e-09131U27698201200*--2．6e-61267U43683</table></tables>a．*表示在測序反應(yīng)中是使用T7或M13(f)引物。b．有關(guān)BLASTX結(jié)果的得分和可能性P(N)的詳細(xì)解釋在正文中給出。表1中還給出了由所述cDNA插入片段所編碼的20種蛋白的可能的功能。10號和17號克隆是“空”的克隆，其插入片段可能太小以至于不能編碼功能性蛋白。另外，11號和16號兩個克隆似乎不包含ORFs(開放讀框)。3、4、5、6、7、13、18和20多個克隆與業(yè)已鑒定的具有明顯與信號傳導(dǎo)無關(guān)的功能的序列同源。事實上，所述基因的大部分具有與信號感覺系統(tǒng)完全不同的酶促功能。另外，用BLASTX檢索時1號克隆未表現(xiàn)出任何相似性。不過，在與包含短的測序模式(Prosite13，Lasergene，DNA*，Madison，美國)的數(shù)據(jù)庫進行比較時，所述基因表現(xiàn)出精確率為100％的多銅氧化酶特征。與該模式的同源性表明，由1號基因編碼的該蛋白屬銅結(jié)合氧化鎂家族。具有所示功能的克隆(表1)可能因為不同的原因而引人關(guān)注。對2號、8號和12號克隆進行的BLASTX檢索未能將這些序列與數(shù)據(jù)庫中保存的任何已知序列對上號。有趣的是，這些克隆都具有跨膜區(qū)。所述基因的部分推測的氨基酸序列的親水性曲線在圖5中示出，同時示出了可能的跨膜域?？赡艿目缒^(qū)是由具有20或更多個疏水性氨基酸殘基的序列識別的。(1)2號蛋白在頭109個氨基酸序列中含有4個疏水性區(qū)，隨后是一個高度親水性區(qū)(圖5A)。(2)8號蛋白在所述序列的5’末端表現(xiàn)出與推測的表面蛋白具有某種相似性，不過該相似性的得分低于80為73，這表明同源性的顯著程度較低。推測的表面蛋白源于紫苜蓿(MedicagoSativa)，對此沒有進一步的資料。用T7引物在5’末端和M13(f)在3’末端進行的兩個序列片段的退火的疏水性曲線表明可能有3個不同的疏水域，每個區(qū)域為20或更多個氨基酸，并且一個區(qū)域接近20個氨基酸殘基(圖5B)。(3)最后，12號蛋白頭130個氨基酸的疏水性曲線表現(xiàn)出長度至少為20個氨基酸的3個疏水性域(圖5C)。小G-蛋白所述克隆之一，即15號可能編碼Rab／Ypt型小G-蛋白。盡管它有可能不是一種受體，但它可能參與比最初的感受過程更靠下游一些的信號途徑。相似性檢索是用從煙草(SMG-Nt2)(圖6)中分離的cDNA(15)的109個氨基酸序列進行的，最高相同性(74．2％)是用從大豆(Glycinemax)，GRM1中分離的組成型表達的Rab／Ypt相關(guān)序列是檢測到的。其它高度同源的小G蛋白源于日本百脈根，RAB11G或源于擬南芥(ARA-4，RAB11)。另外，SMG-Nt2表現(xiàn)出與煙草的另一種小的GTP結(jié)合蛋白NT-RAB11E具有70．2％的同源性。小GTP結(jié)合蛋白能夠特異性結(jié)合并隨后水解鳥嘌呤核苷酸，用GTP／GDP循環(huán)作為分子開關(guān)，其中，激活／失活狀態(tài)分別取決于GTP或GDP的結(jié)合。小GTP結(jié)合蛋白可以分成5個家族，即Ras、Rho、Rab／Ypt、Crf、和Ran。業(yè)已證實Rab／Ypt家族的smG-Nt成員參與了小泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運和分泌。業(yè)已證實Rab／Ypt通過C-末端半胱氨酸基序，通過脂肪酸與膜結(jié)合，該基序主要是修飾過的異戊烯部分。鈣視網(wǎng)膜蛋白圖7表示19號克隆cal-Nt與擬南芥鈣視網(wǎng)膜蛋白的比較。5’末端的178個氨基酸片段的比較得到63．1％的相似性，而3’末端的86個氨基酸的比較在兩個序列之間得出48．8％的相似性。鈣視網(wǎng)膜蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的鈣結(jié)合蛋白，并具有作為分子伴侶蛋白的確定作用。還提出它們可能在信號傳導(dǎo)中起作用，特別是在鈣分配中起作用。某些報導(dǎo)支持鈣視網(wǎng)膜蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外起特殊作用，如與類固醇激素受體的相互作用。所述序列在鈣蛋白的N-末端位點具有一個疏水性前導(dǎo)序列，而一個HDEL基序表明其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中(圖7)。受體激酶9號克隆rek-Nt似乎與源于甘藍或蕓苔或Ipomoeatrifida的受體激酶型蛋白同源。圖3表示兩個分別測序的氨基酸鏈的比較。發(fā)現(xiàn)N-末端序列之間的相似性高于C-末端的相似性(大約60％)(圖3B)，它表現(xiàn)出與源于其它植物種的受體激酶具有大約40％的同源性。源于甘藍的受體激酶位于S基因座上。該基因座編碼參與所述植物的自身不相容性系統(tǒng)的蛋白，該蛋白能抑制花粉在柱頭表面的萌發(fā)和生長，該柱頭表面表達匹配的S等位基因。該受體激酶是一種跨膜蛋白，具有細(xì)胞外受體樣結(jié)構(gòu)域和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，它具有絲氨酸／蘇氨酸激酶活性。不過，在進行表達分析時，發(fā)現(xiàn)所述受體激酶存在于營養(yǎng)組織中，這表明這些受體激酶具有其它細(xì)胞-細(xì)胞信號作用，如植物激素信號傳導(dǎo)。突觸融合蛋白相關(guān)蛋白實驗證據(jù)表明，14號克隆syr與擬南芥的突觸融合蛋白相關(guān)基因具有同源性，該克隆特別有價值。上述結(jié)果之一是通過觀察當(dāng)該蛋白在卵母細(xì)胞中表達時的電流而得到的。通過同胞選擇方法分離的一個克隆psyr當(dāng)過量表達時在卵母細(xì)胞中產(chǎn)生電流。BLASTX檢索發(fā)現(xiàn)了與擬南芥蛋白KNOLLE(該蛋白是突觸融合蛋白樣蛋白)具有同源性。突觸融合蛋白是一個大家族的成員，并被認(rèn)為起著轉(zhuǎn)運小泡的受體的作用，以該家族的不同同種型定位于有關(guān)細(xì)胞的各種膜上。Syntaxin(突觸融合蛋白)是希臘文，其含義是“按順序排列在一起”。小泡停靠和融合分子在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間的定向運動取決于將小泡轉(zhuǎn)運到特定膜區(qū)室的精確定向。分子研究業(yè)已發(fā)現(xiàn)了在源于酵母的分泌系統(tǒng)與神經(jīng)元之間存在顯著的相似性。組成型和調(diào)節(jié)型分泌的分子機構(gòu)基于源于供體(小泡)和受體膜(質(zhì)膜)的蛋白之間的動態(tài)相互作用。小泡?？亢团c靶膜的融合的分子水平的機制被普遍接受。兩種區(qū)室之間的融合是通過細(xì)胞質(zhì)蛋白NSF(N-乙基馬來酰-敏感型融合蛋白)和SNAPs(可溶性NSF結(jié)合蛋白)的蛋白復(fù)合物介導(dǎo)的，它能與三種突觸蛋白SNARE(SNAP受體)蛋白、SNAP25(突觸小體相關(guān)蛋白25k蛋白)、VAMP(小泡相關(guān)膜蛋白或小突觸泡蛋白)和突觸融合蛋白相互作用。以上三種SNARE蛋白包括?？亢腿诤蠙C構(gòu)的最低核心蛋白。VAMP駐留在小泡膜上，并且被稱為v-SNARE(小泡相關(guān)SANRE)。突觸融合蛋白和SANP-25位于質(zhì)膜上，并且被稱為t-SNARE(靶-膜SANRE)?！甋ANRE假說’提出小泡定向和融合及其專一性是由v-SNARE和t-SNARE之間的相互作用控制的。可溶性NSF起著分子開關(guān)的作用(通過ATP水解)并且驅(qū)動SNARE復(fù)合體的分離，釋放突觸融合蛋白，SNAP-25和VAMP，并導(dǎo)致膜融合(圖8)。最近，所述‘SANRE假說’受到挑戰(zhàn)，而且業(yè)已披露了突觸融合蛋白和VAMP在果蠅的停靠下游在小泡融合中是如何起作用的。突觸融合蛋白，t-SNARE復(fù)合體的主要成分突觸融合蛋白似乎可能在胞吐作用中起著重要作用。突觸融合蛋白家族(突觸融合蛋白1-6)似乎仍在擴大。所有突觸融合蛋白具有共同的結(jié)構(gòu)特征在羧基末端具有一個疏水性跨膜域，而氨基末端域位于細(xì)胞質(zhì)中。所述細(xì)胞質(zhì)域含有具有形成螺旋卷曲結(jié)構(gòu)的很高可能性的不連續(xù)區(qū)域。一種同種型突觸蛋白1A含量非常豐富，并且在進化關(guān)系上很遠的生物中，如果蠅和酵母中是高度保守的。最初的突觸融合蛋白1A是從腦膜中分離的。它與幾種相關(guān)的小泡或質(zhì)膜蛋白相關(guān)，包括VAMP和SANP-25和胞質(zhì)蛋白NSF以及兩種形式的SANPs。作為t-SNARE的突觸融合蛋白1A在‘SANRE假說’中具有兩種推測的功能。第一種功能是作為靶蛋白存在于質(zhì)膜中，所述質(zhì)膜與位于接近小泡(VAMP或v-SNARE)上的配體相互作用，以確保停靠過程的專一性。另一種功能是作為可溶性SNAPs的受體，這可能是導(dǎo)致融合的途徑中的一個必要步驟。后來發(fā)現(xiàn)，突觸融合蛋白還可能與參與所述分泌系統(tǒng)的其它蛋白相關(guān)。業(yè)已證實突觸融合蛋白與Munc13和Munc18(又被稱為n-sec1，rop，或rbsec1)蛋白相互作用。所述蛋白的功能尚不完全了解，它們可能是在小泡融合過程中形成的核心復(fù)合體的調(diào)節(jié)物[注只有這兩種類型的蛋白(Munc13和Munc18)是對結(jié)合來說重要的突觸融合蛋白分子的N-末端區(qū)，所有其它突觸融合蛋白結(jié)合蛋白結(jié)合在預(yù)測的螺旋卷曲域上，緊靠氨基末端疏水域的上游]。還證實突觸融合蛋白與結(jié)合蛋白相互作用。突觸結(jié)合蛋白是結(jié)合在小泡膜上的胞吐Ca2+傳感器。隨著Ca2+升高，突觸結(jié)合蛋白形成二聚體，這些二聚體與突觸融合蛋白相互作用，并引發(fā)胞吐作用。突觸融合蛋白、SNAP-25和突觸結(jié)合蛋白以Ca2+依賴型方式結(jié)合電壓控制的N-型Ca2+通道。突觸融合蛋白與N-型Ca2+通道在爪蟾卵母細(xì)胞中的共表達降低了Ca2+電流強度，并改變了控制特征。突觸融合蛋白的C-末端的缺失破壞了對Ca2+通道的作用，這表明所述相互作用位于跨膜區(qū)上。以上實驗表明突觸融合蛋白影響Ca2+流入的速度，并在Ca2+調(diào)節(jié)和小泡融合之間建立了聯(lián)系。參與所述各種復(fù)合體的能力使得突觸融合蛋白1A成為一種可能的候選蛋白，它與其鄰居的相互作用能夠控制不同機制的重要方面。突觸融合蛋白的其它可能功能業(yè)已確定了突觸融合蛋白的其它功能。就在最近有人提出突觸融合蛋白1A能夠在果蠅發(fā)育過程中介導(dǎo)膜組裝過程。有趣的是，最初是報導(dǎo)源于大鼠的突觸融合蛋白1B能夠起著谷氨酸受體的作用。突觸融合蛋白是通過用抗谷氨酸結(jié)合蛋白的抗體篩選而挑選的。當(dāng)突觸融合蛋白在爪蟾卵母細(xì)胞中表達時，它形成谷氨酸活化的離子通道。這表明所述蛋白的氨基末端親水性部分的某一些位于細(xì)胞外，正如通過抗體篩選所證實的。有人提出融合蛋白在作為metabotropic谷氨酸受體時，能夠調(diào)節(jié)從突觸末端釋放谷氨酸。植物突觸融合蛋白相關(guān)基因業(yè)已披露了擬南芥中的兩種突觸融合蛋白相關(guān)的克隆。第一個克隆KNOLLE是通過擬南芥屬突變型篩選分離到的基因。當(dāng)對KNOLLE基因進行剔除時，所述植物的細(xì)胞分離受到破壞，其作用方式類似于用咖啡因處理植物。有人認(rèn)為所述蛋白在新形成的細(xì)胞平板上小泡的融合中起作用。所克隆的第二個基因被稱為aPep12，并可能功能性地與酵母pep12突變型互補。APEP12是一種突觸融合蛋白同系物，它在將小泡從跨高爾基體網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)運到液泡中的小泡轉(zhuǎn)運中起作用。序列比較和分析核苷酸序列和測序方法圖9A表示syr克隆的cDNA插入片段的核苷酸序列。其衍生的氨基酸序列表示的是開放讀框，始于17位上的ATG序列，并止于920位上的TGA終止密碼子。所述氨基酸序列的長度為300個氨基酸。圖9B表示在測序中所使用的方法。在所述cDNA插入片段的任一個末端形成兩個缺失。為了使該基因的3’末端缺失，用BglII和BamHI限制酶消化psyr，并對剩余鏈進行再連接。將這種新的結(jié)構(gòu)psyrbb用作模板用于采用M13(f)引物的測序反應(yīng)。通過用SacI和EcoRI消化psyr克隆時另一個5’末端缺失，用T4聚合酶將突出的單鏈DNA末端補平，然后對該載體進行再連接。將這種新的結(jié)構(gòu)psyrse用作模板用于采用T7引物的測序反應(yīng)。將位于BglII和SacI限制酶之間的cDNA的中間部分克隆到pBluescript載體上，以便該插入片段的旁側(cè)是兩個M13引物正向M13(f)和反向M13(r)引物，將其用于結(jié)構(gòu)psyr2的兩個測序反應(yīng)中。通過將上述反應(yīng)的序列合并成一個重疊群(圖9B)，可以分辨所有不確定的核苷酸序列，并獲得突觸融合蛋白相關(guān)基因的完整長度的序列(圖9A)。序列比較和蛋白結(jié)構(gòu)將SYR氨基酸序列與源于擬南芥的KNOLLE突觸融合蛋白樣蛋白和突觸融合蛋白家族的兩種蛋白即源于人類的突觸融合蛋白A和B進行比較(圖10)。該蛋白序列包含三個主要部分。(1)疏水性C-末端，它可能是一個跨膜域。(2)一個位于所述疏水域上游的區(qū)域，包括一個上皮形成素模式，與Posite數(shù)據(jù)庫(Lasergene，DNA*，Madison，美國)的‘框’進行比較。(3)該蛋白序列的N-末端是親水性的并且不包括與已知序列特征的顯著同源性。(1)對于突觸融合蛋白家族的所有成員來說，總體上的疏水性特征是相同的。C末端所存在的21-24個疏水性氨基酸的序列可能代表一種跨膜區(qū)。(2)上皮形成素模式在突觸融合蛋白之間是高度保守的，在氨基酸水平上大鼠和人類突觸融合蛋白A和B蛋白之間的相同性＞80％。煙草SYR蛋白在該上皮形成素模式區(qū)的最高氨基酸相同性水平與KNOLLE比較為64．1％，與果蠅的突觸融合蛋白A比較為53．8％，與人和大鼠的突觸融合蛋白A和B相比為51．3％。該上皮形成素模式具有一個螺旋區(qū)，這表明在突觸融合蛋白家族中蛋白-蛋白相互作用是普遍的。(3)N-末端是差別最大的區(qū)域，煙草的SYR蛋白的頭62個氨基酸與KNOLLE蛋白相比僅具有17．7％的相同性，而頭209個氨基酸與KNOLLE有34％的相同性，不過，該N-末端親水區(qū)與所有其它哺乳動物突觸融合蛋白的差別更大，最高相同性得分是與人類突觸融合蛋白A和大鼠突觸融合蛋白B的相同性為17．3％。不過，在人類和大鼠的突觸融合蛋白A和B之間具有較高的同源性。對上皮形式素模式來說檢測到相似的相同性得分，該相同性高于77％。另外，在SYR蛋白中觀察到一個有趣的結(jié)構(gòu)域，即核苷酸結(jié)合位點(NBS)，該位點在KNOLLE基因(擬南芥)或任何其它突觸融合蛋白中都沒有，該結(jié)構(gòu)域的序列已被公開。該NBS結(jié)構(gòu)域和N-末端親水區(qū)的總體不同性表明SYR蛋白與迄今所鑒定的突觸融合蛋白家族的成員相比具有不同的調(diào)控。業(yè)已將該家族的其它基因克隆到植物中，即pep12，源于擬南芥的突觸融合蛋白樣蛋白。不過，SYR煙草蛋白與該蛋白的同源性很低，僅有18．3％的總體氨基酸相同性，蛋白PEP12位于高爾基體后區(qū)室，它具有與突觸融合蛋白1A或1B蛋白不同的功能，后者位于質(zhì)膜中。為了從總體上進行比較，在圖11中用系統(tǒng)樹表示突觸融合蛋白家族的成員。該系統(tǒng)樹基于完整氨基酸序列的比較。更具體地講，對轉(zhuǎn)錄物cDNA進行的測序表明，它包括一個編碼突觸融合蛋白-(t-SNARE-)相關(guān)蛋白(Nt-Syr)的開放讀框，該蛋白具有300個氨基酸，預(yù)測的分子量為34．01kD，等電點為7．95。通過Clustal方法用Megalign(DNAstar，Madison，美國)對Nt-Syr蛋白進行的比較證實與源于植物的另一種突觸融合蛋白樣蛋白(在擬南芥中鑒定的Knolle基因產(chǎn)物)具有37．7％的相同性，與其由人類突觸融合蛋白基因SYN-1A編碼的最接近的哺乳動物同系物具有低的但是顯著的同源性(22．8％的氨基酸相同性)。對Nt-Syr進行的結(jié)構(gòu)和原位分析發(fā)現(xiàn)了突觸融合蛋白共同的特征(圖41)，包括位于其C-末端的單一的推測跨膜(疏水性)結(jié)構(gòu)域，和三個很可能在蛋白-蛋白相互作用中形成卷曲螺旋結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)域(H1-H3)。在所述推測的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中，靠近推測的跨膜區(qū)的第三個結(jié)構(gòu)域與哺乳動物突觸融合蛋白-1A的上皮形成素共有序列具有84％的相同性(92％的同源性)。Nt-Syr還在三個分散的位點上具有部分保守性，這三個位點是肉毒桿菌型C毒素(BotN／C；圖41)結(jié)合和裂解所述蛋白所必需的。不過，與迄今為止的其它突觸融合蛋白的特征不同，發(fā)現(xiàn)Nt-Syr包括一個EF手共有序列，位于16號和18號氨基酸之間，以及一個位于114號和119號殘基之間的推測的核苷酸結(jié)合位點。新的篩選所述20個克隆的文庫不能夠細(xì)分，或者說該文庫的一部分不能檢測ABA反應(yīng)信號。Syr基因只能在卵母細(xì)胞中表達，導(dǎo)致記錄到加強的向外調(diào)整K+電流的記錄，和ABA信號的喪失。誘導(dǎo)K+電流SYR蛋白是一種突觸融合蛋白相關(guān)蛋白，它在卵母細(xì)胞中表達時產(chǎn)生隨時間加強的向外的調(diào)整電流。突觸融合蛋白同樣與Ca2+通道(N-類型)相互作用。不過，由SYR蛋白產(chǎn)生的電流對ω-芋螺毒素不敏感，該毒素是特異性抑制N型Ca2+通道的毒素。相反，在SYR表達卵母細(xì)胞上觀察到的電流似乎是由K+攜帶的，其特征是具有反向電勢和各種毒素(TGA和Ba2+)。以上實驗以及在未注射的卵母細(xì)胞中檢測到相似的電流表明，當(dāng)SYR以較大量在卵母細(xì)胞中表達時，它與卵母細(xì)胞內(nèi)源性電壓依賴型K+通道相關(guān)。這樣，SYR蛋白起著預(yù)先存在的靜息通道復(fù)合體的調(diào)節(jié)亞基的作用，而不是形成通道。在刺穿表達SYR的卵母細(xì)胞之后，會隨時間推移誘導(dǎo)向外的調(diào)整電流。下面提供的實驗是為了揭示SYR蛋白在植物中的功能。第一種實驗包括通過特殊的毒素(肉毒桿菌毒素)消除Nicotianabenthamiana和蠶豆(Viciafaba)中的突觸融合蛋白樣蛋白，導(dǎo)致保衛(wèi)細(xì)胞中ABA反應(yīng)的喪失。所述剔除SYR蛋白的實驗使用肉毒桿菌毒素，該毒素能非常專一地消化SNARE蛋白。肉毒桿菌毒素家族是由肉毒桿菌產(chǎn)生的神經(jīng)毒素，并能通過抑制神經(jīng)遞質(zhì)的釋放導(dǎo)致神經(jīng)麻痹綜合征。有7種不同類型的肉毒桿菌毒素，并且它們都包括兩個二硫鍵多肽鏈。較大的亞基決定識別和細(xì)胞穿透。在細(xì)胞質(zhì)中減少較小鏈的釋放，在這里它表現(xiàn)出對胞吐裝置的成分專一的鋅內(nèi)肽酶活性。肉毒桿菌毒素B、D、F和G能特異識別VAMP。肉毒桿菌毒素A和E能特異識別SNAP-25。肉毒桿菌C型神經(jīng)毒素能裂解突觸融合蛋白(有關(guān)綜述可參見Montecucco和Giampietro(1995))。在保衛(wèi)細(xì)胞上實驗這種突觸融合蛋白特異性肉毒桿菌毒素C(BotN／C)的作用，將肉毒桿菌D毒素(BotN／D)用作對照。肉毒桿菌毒素BotN／C能在保衛(wèi)細(xì)胞中破壞ABA反應(yīng)在正常情況下，ABA作用于Nicotianabenthamiana保衛(wèi)細(xì)胞，導(dǎo)致陰離子電流的加強和向內(nèi)調(diào)整的K+電流的減弱。當(dāng)對保衛(wèi)細(xì)胞施加BotN／C時，破壞了保衛(wèi)細(xì)胞膜中的對以上兩種電流的拮抗作用，確保了所述消除實驗的可靠性。有趣的是，我們注意到BotN／C毒素在所述保衛(wèi)細(xì)胞中對電流本身未表現(xiàn)出任何直接反應(yīng)，只有在用ABA刺激該細(xì)胞時才表現(xiàn)出BotN／C的作用。以上結(jié)果特別表明，受BotN／C抑制的突觸融合蛋白樣蛋白在保衛(wèi)細(xì)胞的ABA信號反應(yīng)途徑中起作用。另外，通過消除ABA在蠶豆的Ikin中的抑制作用證實了BotN／C的作用。以上結(jié)果表明，BotN／C在所有植物中普遍起作用。通過將另一種內(nèi)肽酶BotN／D作為對照實驗其作用進一步證實了BotN／C毒素的專一性。在用BotN／D處理之后在N．benthamiana的保衛(wèi)細(xì)胞中每一種電流(陰離子和K+)的ABA反應(yīng)不受影響。其它分析得到了有關(guān)SYR在煙草中的功能的更多的信息。檢查了在受到脅迫或ABA處理時基因表達的模式。在煙草中和Nicotianabenthamiana以及擬南芥中分析了基因組構(gòu)，以便檢驗存在于不同植物中的SYR基因是否是在像哺乳動物世界中那樣是一個密切相關(guān)的家族的成員。另外，對在其突觸融合蛋白樣基因上發(fā)生突變的酵母菌株中進行轉(zhuǎn)化，以便表達SYR蛋白。煙草的SYR蛋白被證實功能上不能便與酵母類似物互換。我們使用BotN／C毒素在植物中使Nt-Syr(又稱為SYR)蛋白失效。BotN／C毒素能特異性裂解人類突觸融合蛋白-1A和含有必需的識別和裂解位點的相關(guān)突觸融合蛋白，從而破壞分泌。Nt-Syr包括BotN／C識別所必需的X1和X2識別位點的同系物，并且在上皮形成素模式共有序列和C-末端跨膜域之間BotN／C裂解位點具有部分保守性(圖41)。對煙草葉片微粒體蛋白進行的Western印跡分析表明，Nt--Syr能由BotN／C毒素特異性識別和裂解，而Nt-Syr不受BotN／D毒素的影響(圖42A)，毒素針對v-SNARE蛋白小突觸泡蛋白。在用BotN／C分析時蛋白裂解(30kD)帶的喪失可能與裂解產(chǎn)物的不穩(wěn)定性和其隨后被內(nèi)源蛋白酶降解有關(guān)。不過，只有當(dāng)用ATP對蛋白提取物進行預(yù)處理時才觀察到裂解的事實證實了BotN／C作用的專一性(圖42A)。突觸融合蛋白對BotN／C的易感性取決于突觸蛋白-SNARE復(fù)合體的分離，這一過程是由NSFATPase促成的。根據(jù)以上結(jié)果，以及在葉片蛋白提取物中觀察到的Sp2抗體與高分子量帶(51kD和＞120kD，未示出)的結(jié)合，似乎有可能Nt-Syr在活體內(nèi)參與了相似的復(fù)合體。我們在煙草和蠶豆中實驗了BotN／C和BotN／D毒素對ABA介導(dǎo)的保衛(wèi)細(xì)胞K+和Cl-通道的控制的影響。用含有0．1M的一種或另一種毒素的微電極進行穿刺，或者在對照實驗中用僅含有正常乙酸鉀電解質(zhì)的微電極穿刺之后對完整保衛(wèi)細(xì)胞施加。在保衛(wèi)細(xì)胞中，ABA處理通常會導(dǎo)致顯性的、向內(nèi)調(diào)整的K+通道電流的40-60％的激發(fā)，和對通過C1-通道電流的2-4倍的激發(fā)。圖42B-D歸納了來自煙草的資料，獲得了在記錄蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞時所得到的類似結(jié)果(未示出)。在對照實驗中，以及在施加BotN／D毒素的保衛(wèi)細(xì)胞中，ABA處理會導(dǎo)致特有的K+和Cl-通道反應(yīng)。對于在圖42B和D中示出的數(shù)據(jù)來說，測定是在有15mM氯化銫和15mMTEA-Cl的條件下進行的，以便消除K+電流背景，而Cl-電流是在將電壓調(diào)整到+50mV以便激活該電流的預(yù)調(diào)節(jié)步驟之后將電壓調(diào)整到+30mV和-200mV之間的步驟中測定的。添加20MABA，會導(dǎo)致Cl-電流大小增加3倍(圖41B，D，-ABA；，+ABA)，并導(dǎo)致與對照相比(圖41B，見上文)，該電流在負(fù)電壓(圖41B，見下文)下釋放的特有的變慢。相反，在施加BotN／C毒素電壓控制之后記錄表明完全喪失了對ABA的敏感性(圖41B，中以及圖41D，)。在用BotN／C處理之后，同樣觀察到向內(nèi)調(diào)整的K+通道對ABA的敏感性的喪失，以上結(jié)果與有關(guān)Cl-通道的資料一起歸納在圖42C中。在獨立的實驗中，我們使用截短的Nt-Syr(Sp2)蛋白(見圖41A)，以便在植物中“毒殺”Nt-Syr的功能。我們認(rèn)為，如果SNARE樣復(fù)合體和Nt-Syr為傳導(dǎo)ABA刺激所必需，添加截短的Nt-Syr(包括推測的蛋白-蛋白相互作用域，但缺少C-末端膜錨定物)會與其天然蛋白競爭配偶體，并因此阻止功能性復(fù)合體的形成。另外，在這種情況下，在穿刺之后用含有20或100M的Sp2蛋白的微電極對完整的保衛(wèi)細(xì)胞加樣。圖43A、C表示來自一組實驗的兩種K+電流的結(jié)果，而其它數(shù)據(jù)，包括Cl-通道電流的測定歸納在圖43B中，對于在圖43A和C中示出的數(shù)據(jù)來說，測定是在10mM外部K+的條件下進行的，而K+通道電流是在將電壓調(diào)整到-100mV的預(yù)調(diào)整步驟(圖43A，上)以便使該電流失活之后在將電壓調(diào)整到+30mV和-250mV之間的步驟中測定的。在所述條件下，向外調(diào)整的K+通道的激活表現(xiàn)為在-50mV的控制電壓下正電流的S形增加，而向內(nèi)調(diào)整的K+通道的激活以在接近-150mV的控制電壓下負(fù)電流的單向增加為特征(圖43A，上)。添加20MABA會導(dǎo)致向外調(diào)整的電流增加大約二倍，而在-200mV電壓下，向內(nèi)調(diào)整的電流比對照降低24％(圖43A，C，-ABA；，+ABA)。ABA處理還會造成向內(nèi)調(diào)整的K+通道的電壓敏感性的明顯變化(圖43C，插入)，與ABA-刺激的[Ca2+]i的增加和所述K+通道對[Ca2+]i的敏感性一致。不過，在施加Sp2蛋白之后，電壓控制記錄表明，完全失去了對ABA的敏感性(圖43A，中和圖41C，)。在用Sp2蛋白處理之后觀察到Cl-通道對ABA的敏感性的相似的喪失，以上結(jié)果與有關(guān)K+通道的結(jié)果一起歸納在圖43B中。以上結(jié)果表明，Nt-Syr在ABA信號傳導(dǎo)和對水脅迫的適應(yīng)中起著重要作用，并且在刺激感受和傳導(dǎo)的早期步驟中與其它蛋白因子密切相互作用。在第一種情況下，我們的數(shù)據(jù)表明，Nt-Syr作為與其它蛋白的功能性異源多聚體復(fù)合物的一部分。SYR是由ABA上調(diào)的Northern分析表明，在煙草葉片中SYR是由干旱脅迫和ABA上調(diào)的。用ABA進行的兩個獨立的Northern實驗都發(fā)現(xiàn)了SYR的瞬時誘導(dǎo)。SYR不是來自大的家族，但存在于不同植物種中通過用哺乳動物突觸融合蛋白的分析研究，并由于某些基因在擬南芥中是已知的(KNOLLE和PEP12)，人們會預(yù)計在煙草中存在一個突觸融合蛋白樣蛋白家族。用煙草的DNA和SYR作探針進行的Southern分析意外地表明，只有少數(shù)的帶表明SYR不是同源克隆的大家族的成員，并且僅存在一個或兩個拷貝的SYR。如果SYR是基因家族的一部分，它與其它成員的序列同源性預(yù)計低于70％。在其它植物種N．benthamiana和擬南芥中發(fā)現(xiàn)了煙草SYR的同源基因。另外，在所述植物中似乎存在一個或兩個拷貝。農(nóng)桿菌屬介導(dǎo)的瞬時表達。為了分析syr的功能，通過將一個反義結(jié)構(gòu)導(dǎo)入該植物從煙草葉片中剔除該基因。將反義cDNA導(dǎo)入葉片細(xì)胞的基因組中是通過使用根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的瞬時表達系統(tǒng)進行的。根癌農(nóng)桿菌是一種植物病原體細(xì)菌，它能將確定的DNA片段，即轉(zhuǎn)化DNA(T-DNA)輸入植物細(xì)胞。以上結(jié)果表明，當(dāng)通過反義方法剔除syr基因時，葉片組織對干旱條件的蒸騰適應(yīng)能力受到損害，換句話說，氣孔閉合調(diào)節(jié)可能受到損害，這實際上正是ABA的“任務(wù)”。以上結(jié)果表明，syr在體內(nèi)參與植物脅迫相關(guān)激素脫落酸的信號傳導(dǎo)途徑。例1從煙草葉片中分離poly(A)+加尾的RNA植物生長條件在溫室中，在浸水土壤上使煙草種子發(fā)芽，所述土壤上覆蓋有塑料薄膜，以便盡可能的保持最大濕度。用Osram400W鈉燈作為光源施加12∶12小時晝-夜周期，溫度保持在25-28℃。在一周之后，當(dāng)種子萌發(fā)之后去掉所述塑料薄膜。在5-6周之后，用解剖刀收獲嫩葉，并馬上稱重，并在液氮中冷凍。將冷凍的組織保存在-70℃下待用。制備poly(A)+加尾的RNA所使用的所有水溶液是用DEPC(0．001％)預(yù)處理過的，將該化合物加入所述溶液中，在室溫下溫育過夜，并在120℃和1巴壓力下高壓滅菌20分鐘。不能用DEPC處理的Tris溶液是用DEPC處理過的水制備的，并按上述方法高壓滅菌。所使用的所有塑料材料直接購自生產(chǎn)商，并且僅僅用一次性手套處理。用研缽和研棒在液氮中對20克冷凍的植物材料進行充分研磨，直到獲得細(xì)末?？梢允褂?0克植物組織，并將所有必需的溶液分成兩份，以便所有過程都相同。將所述粉末懸浮在100ml提取緩沖液(0．1M氯化鈉，0．01MEDTA，2％SDS和0．05MTris-HCl，pH9)，在45℃預(yù)熱，并在使用之前添加20毫克蛋白酶K。在45℃的水浴中劇烈震蕩所述懸浮液10分鐘。加入50ml苯酚，并將該混合物轉(zhuǎn)移到一個離心管中，并在20℃下在GSA轉(zhuǎn)子中以6000g(6000rpm)的速度離心。將上部水相轉(zhuǎn)移到新的離心管中，并用50ml苯酚加50ml氯仿重復(fù)以上提取過程，第三次提取用100ml氯仿。一旦澄清，在確定其體積之后將水相放到冰上。加入10％的氯化鈉(5M母液)(v／v)，并將該混合物放在冰上20分鐘，然后，在4℃下在GSA轉(zhuǎn)子中以23500g(12000rpm)的速度離心10分鐘，棄上清液，并放在冰上。通過寡脫氧胸苷酸層析純化mRNA。在這一步驟中，通過在一個新的50ml的塑料管中用30ml0．1MNaOH洗滌對0．5克寡脫氧胸苷酸纖維素(BoehringerMannheim)進行預(yù)處理。通過以1500rpm的速度離心5分鐘使寡脫氧胸苷酸纖維素沉淀。在所述預(yù)處理之后，用水進行兩次類似的洗滌，并用結(jié)合緩沖液(0．4MNaCl，0．2％SDS，0．01MTris-HCl，pH7．5)洗滌兩次。將寡脫氧胸苷酸纖維素均分到兩個50ml試管中，每個試管中總共加入10ml結(jié)合緩沖液，并將植物提取物加入兩個試管中。通過在室溫下上下轉(zhuǎn)動所述試管30分鐘對所述懸浮液進行輕微震蕩，以便讓轉(zhuǎn)錄物的poly(A)+鏈與結(jié)合在纖維素上的寡脫氧胸苷酸雜交。然后以1500rpm的速度對所述試管進行離心5分鐘，棄上清液，并用結(jié)合緩沖液洗滌所述纖維素兩次，用洗滌緩沖液(0．1MNaCl，0．01MTris-HCl，pH7．5)洗滌兩次。將所述纖維素懸浮在每只試管中的45ml洗滌緩沖液中，并轉(zhuǎn)移到一個塑料柱(直徑1厘米，長度10厘米，BioRad)，在這里用洗滌緩沖液(≈100ml)繼續(xù)洗滌，直到在通過分光光度計測定(A260=0)洗脫液中不含RNA為止。保留在纖維素上的poly(A)+加尾的RNA用預(yù)熱到55℃的洗脫緩沖液(0．01MTris-HCl，pH7．5)洗脫。將1ml洗脫緩沖液注入所述柱，并且每次收集1ml洗脫液，分別收集在10個獨立的微量離心管中。通過斑點試驗法(見下文)估計所述試管中的RNA量。通過加入10％的NaCl(5M母液)(v／v)和2．5倍體積的冷卻(-20℃)乙醇對含有RNA的式樣(通常為第三和第四號微量離心管)進行乙醇沉淀。將所述溶液在-20℃下冷卻至少1小時，以便使RNA沉淀。將RNA儲存在乙醇中數(shù)周。如果需要，在一臺離心機上以可能達到的最大速度對poly(A)+加尾的RNA進行離心20分鐘，并用70％的冷卻(-20℃)乙醇洗滌所產(chǎn)生的沉淀物。將所述沉淀溶解在適量的DEPC處理過的水中，達到大約1μg／μl的濃度。斑點試驗通過與具有已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品比較對低濃度的RNA樣品進行定量。所述標(biāo)準(zhǔn)樣品可以從商業(yè)渠道購買，或者是通過分光光度法測定過其濃度的未使用的RNA樣品。對于具有1μg／μl的合適濃度的標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品來說，通過將10μl該溶液稀釋在990μl水中進行稀釋，并在260nm的波長下測定OD，并用以下轉(zhuǎn)換系數(shù)測定其濃度1．0的A260=40μg／mlRNA。一旦了解其濃度，就將該標(biāo)準(zhǔn)RNA樣品稀釋到10ng／μl的濃度。用一個稱量舟皿制備一系列標(biāo)準(zhǔn)物液滴，在用UV燈檢測之前最后加入溴化乙錠(EtBr10μg／ml)，其方案如下<tablesid="table3"num="003"><table>RNA(ng)0102030405060708090RNA(μl)0123456789H20(μl)9876543210EtBr(μl)1111111111</table></tables>同時，將2μl的未知樣品加注到獨立的液滴中，用8μl水稀釋，并添加1μlEtBr。將所述稱量舟皿放在UV燈上，通過比較發(fā)光強度測定RNA濃度。例2爪蟾卵母細(xì)胞及其制備爪蟾卵母細(xì)胞的維持源于南美的雌性爪蟾是從英國的BladesBiologicals購買的。將這些爪蟾放養(yǎng)在18-20℃溫度下的裝有大約10厘米深的脫氯水(通過空氣蒸發(fā)過夜獲得)的大水箱中，給予10∶12小時晝／夜周期，使這些動物可以不受限制的到達表面。每周用碎牛肉或切碎的心臟(脂肪＜5％)飼喂所述蟾蜍三次。在飼喂之后大約3-4小時清洗所述水箱。為了識別，用編碼的異頻雷達收發(fā)機(Animalcare有限公司，York，英國)對每一只蟾蜍進行皮下標(biāo)記。制備注射用卵母細(xì)胞在冰上麻醉3小時之后，通過外科手術(shù)從爪蟾體內(nèi)取出卵母細(xì)胞。用解剖手術(shù)刀在蟾蜍腹部下面1／3處形成一個小的切口(大約1厘米)，該切口透過松弛的皮膚和體腔壁。卵巢葉容易識別，并用鑷子輕輕地取出。切除所述卵巢葉并放入Barth’s溶液的培養(yǎng)皿(88mM氯化鈉；1mM氯化鉀；0．33mM硝酸鈣；0．4mM氯化鈣；0．82mM硫酸鎂；2．4mM碳酸氫鈉和10mMHepes，pH7．5，通過高壓滅菌消毒，并添加硫酸慶大霉素(0．1mg／ml)和青霉素鈉(0．05mg／ml))。用腸線(p1ain3／0，26nm切段，75厘米長，W250，Ethicon，愛丁堡，英國)縫合所述切口，縫了兩針，穿過外層表皮和內(nèi)部體壁。然后將爪蟾轉(zhuǎn)移到裝有2-3毫米深蒸餾水的隔離水箱中，讓其恢復(fù)。一旦恢復(fù)完全的運動能力將爪蟾送回其主水箱。為了制備卵母細(xì)胞，將卵巢葉剝開，以便得到大約5-10個卵母細(xì)胞的小塊。在添加了1mg／ml胰蛋白酶抑制劑的含有2mg／ml膠原酶的Barth’s溶液中通過酶促方法去掉包圍卵母細(xì)胞的卵泡細(xì)胞層，同時在20℃下在定軌搖床上震蕩(0．5轉(zhuǎn)／秒)1小時。通過用Barth’s溶液洗滌卵母細(xì)胞若干次結(jié)束所述處理。最后通過人工清除殘留的卵泡層釋放卵母細(xì)胞。重要的是篩選未受損傷的存活的卵母細(xì)胞。將充分生長的，V-VI期的未成熟卵母細(xì)胞用于表達實驗。健康的卵母細(xì)胞具有清晰的動物(黑色)和植物(淺色)半球極和一個清晰的赤道帶。將在動物極上具有淺斑或斑點外觀的卵母細(xì)胞去掉。用巴斯德移液管截斷處理卵母細(xì)胞，以便形成大約3-4毫米的孔，在火焰上使該管墊平。注射選擇的卵母細(xì)胞用濃度為1μg／μl的RNA注射V-VI期的選擇的卵母細(xì)胞(直徑大約1．2毫米)。注射是在外科手術(shù)之后24小時用一個用玻璃毛細(xì)管制成的微量移液管完成的，該管的壁厚為0．3毫米，截面直徑為1．8毫米(Kimax51，Kimble產(chǎn)品，美國)。用水平拉伸機(P-D5，Narashige科學(xué)研究所，日本)將所述毛細(xì)管拉伸成大約1厘米長的棒。斷開該微量移液管的頂端，以便得到頂端直徑為大約10微米的孔。將該微量移液管安裝在微操作器上，并連接在一個氣動微型泵(世界精密儀器，Sarasota，美國)，該泵是由惰性氮氣驅(qū)動的，該泵可以調(diào)整其控制壓力，以便微量移液管中的溶液不會因為毛細(xì)作用力而流動。它還可以調(diào)節(jié)注射壓力，通過腳踏開關(guān)控制，并且注射體積是綜合設(shè)定注射壓力和注射時間的脈沖次數(shù)而決定的。注射體積是通過用1μlDEPC處理過的水在一片石蠟?zāi)ど项A(yù)校正注射移液管而設(shè)定的。通過消除保持壓力，利用毛細(xì)作用力將所述溶液吸入移液管中。然后對該移液管進行校正，以便以15-20個注射脈沖釋放相同體積對該移液管進行校正，因為卵母細(xì)胞可以最大75nl的量注射。然后將1μlRNA溶液加在石蠟?zāi)さ谋砻?，并通過毛細(xì)作用力吸入移液管中，消除保持壓力。將20個卵母細(xì)胞在顯微鏡載玻片上排成一排，該載玻片放在培養(yǎng)皿蓋上，添加最少量的Barth’s緩沖液，以防止所述細(xì)胞干燥。通過將移液管插入所述細(xì)胞中然后施加注射脈沖將RNA注射到每一個卵母細(xì)胞中。在注射之后，馬上將這些卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)移到裝有足夠的新鮮Barth’s溶液的新的培養(yǎng)皿中。在20℃下培養(yǎng)卵母細(xì)胞兩天，每天更換Barth’s溶液。例3電壓控制方法實驗設(shè)置所有電壓控制實驗是在Faraday籠中進行的，以確保電絕緣(圖13A)。測定是通過將卵母細(xì)胞保持在特別設(shè)計的腔室中進行的，容許微電極進入和連續(xù)的緩沖液流動。為了進行電學(xué)測定，用兩個微電極刺穿所述細(xì)胞，并測定電流和電壓。微電極是通過Ag／AgCl半電池電連接到一對高阻抗放大器(μP12系統(tǒng)，WyeScience，WyeKent)上。將計算機(Compuadd，C466D，Austin，Texas，美國)控制的μLab程序(WyeScience，WyeKent，英國)用于產(chǎn)生指令電壓，在電壓控制測定期間記錄膜電流和電壓。電壓控制測定是通過兩個常規(guī)的電極電路進行的，其中電壓信號是通過一個放大器調(diào)整的，然后在以電流形式送回所述細(xì)胞之前通過另一個高差分放大器(WyeScience，WyeKent，英國)與所述指令電壓進行比較。所有信號都在示波器上監(jiān)測(示波器(DSO)400，Gould電子有限公司，Ilford，Essex，UK)，并且還將膜電壓記錄在記錄儀(BD112型，Kipp&amp;Zonen，荷蘭)，用6極Bessel過濾器(fc=0．3或1kHz)過濾所述電流信號，并在2kHz下將所述電流和電壓信號數(shù)字化(WyeScience，WyeKent，英國)，并以二元代碼形式保存在磁盤上。腔室設(shè)計和超級融合腔室是由2毫米厚的有機玻璃元件制成，通過在中心開3個相互連接的槽，并在其底部用一個蓋板封閉(圖13B)。將單個的卵母細(xì)胞放入中間槽中，以便兩個微電極能夠從一側(cè)刺穿而不會移動所述細(xì)胞。將所述腔室加滿，并用一個放在第一個孔中的注射器針頭保持固定的Ringer’s緩沖液流，用一個巴斯德移液管從第三個槽中清除多余的溶液，該移液管通過一個真空長頸瓶與一個泵連接。將裝有在所述實驗中使用的溶液的吸瓶安裝在位于所述Saraday籠上方的外殼中，并通過重力輸送實現(xiàn)灌流。每一個吸瓶與一個通向六路開關(guān)，然后再通向一個四路開關(guān)，通向所述腔室或廢物燒杯。用最少的時間實現(xiàn)有效的溶液交換，讓新的溶液到達所述腔室和細(xì)胞。在所述水浴中的溶液交換是通過記錄頂端電勢的變化而測定的。將電極放在中央孔中進行的測定表現(xiàn)出在新的溶液到達所述腔室之前來自溶液交換的40-45秒的延遲，而交換的半衰期為5-6秒。微電極和半電池微電極是用具有內(nèi)部細(xì)絲(GC150TF-10，克拉克電子醫(yī)學(xué)儀器，雷丁，英國)的圓形薄壁玻璃管(截面直徑1．5毫米，壁厚0．3毫米)制成的。用一個垂直拉伸機(PP83，Narishige，日本)拉出具有5微米直徑的尖頭，并用2毫升注射器和針頭向所述電極中填充3M氯化鉀。半電池是用銀線(直徑1毫米)制成的，將銀線焊接在標(biāo)準(zhǔn)2毫米有插銷的接線板上，插入一片(3-5平方毫米)的硅橡膠中，并插入塑料移液管部分。通過用新鮮次氯酸鹽填充所述移液管過夜用氯化銀涂敷所述銀絲。然后漂洗所述半電池數(shù)次，填充3M氯化鉀。在測定期間每天重復(fù)所述過夜涂敷過程。用牙科蠟(Kerr壓印化合物，Kerr生產(chǎn)商，美國)固定微電極。在進行電壓控制的穿刺中使用兩個微電極和半電池。用第三個電極作為參考，并將其連接到電路基礎(chǔ)上，在這種情況下與水浴的接觸是通過一個玻璃毛細(xì)管(截面直徑1．5毫米，克拉克電子醫(yī)學(xué)儀器，雷丁，英國)，該毛細(xì)管彎成45的鉤，并填充存在于2％瓊脂糖中的3M氯化鉀，按上述方法將其連接到半電池上。電壓控制測定用單個的(未注射)注射的卵母細(xì)胞進行全細(xì)胞電壓控制，以便記錄在電壓控制下達到膜電勢Vm所需要的電流Im。使用兩個電極控制。因此，將兩個獨立的電極插入所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，一個電極是電壓記錄電極，將其用于監(jiān)測膜電勢Vm。保持所述電勢穩(wěn)定，即使當(dāng)所述膜的導(dǎo)電性改變時也保持穩(wěn)定所需要的電流Im，是通過能通電流的第二個電極注射的。圖14表示簡化的電壓控制電路。膜電勢Vm是用一個放大器記錄的，并隨后與由控制放大器產(chǎn)生的指令電壓進行比較。將兩個電壓信號之間的差顛倒，通過第二個放大器和電流通過微電極送回所述細(xì)胞。這樣，將膜電壓控制在實驗控制之下。在進行電壓控制時必須考慮的一個因素是水浴誤差電勢。按上述方法用一個接地電極將所述水浴溶液接地。所有測定都是相對該基礎(chǔ)的，假設(shè)所述水浴均勻地接地。當(dāng)控制電流大到足于(10μA)導(dǎo)致通過所述水浴的電阻有明顯的電壓下降時，該假設(shè)不成立。這意味著通過電壓記錄電極所測定的電壓實際上是膜電勢Vm和水浴電勢的總和。在本文所述實驗中，在3．5μA的電流下最大誤差為7mV，該誤差是可以忽略的。當(dāng)表面積為106μm2時，卵母細(xì)胞的膜容量很高，并有必須充電的大量的膜，以便控制所述細(xì)胞。電壓控制的快速反應(yīng)時間是必要的，以便分析電壓控制通道的動力學(xué)。在這種情況下的快速控制時間(＜5ms，達到電壓穩(wěn)定)是通過減小注射微電極電流的電阻(大約1M)而實現(xiàn)的。例4爪蟾卵母細(xì)胞的外向Cl-電流是Ca2+依賴型的卵母細(xì)胞中的內(nèi)源外向調(diào)整電流在第一個實施方案中，在控制電壓下檢查未注射的卵母細(xì)胞，以便鑒定和分析內(nèi)源Ca2+依賴型Cl-通道。在大部分細(xì)胞中觀察到很低的導(dǎo)電性，同時在正常Ringer’s溶液中控制膜電壓。電流活性與爪蟾相關(guān)。某些爪蟾產(chǎn)生非常“緊湊的”卵母細(xì)胞，沒有可見的時間依賴型電流，并且在正常Ringer’s溶液中的背景很低(gm范圍為0．01-0．05μS)。來自其它爪蟾的卵母細(xì)胞不能用于表達分析，因為其在背景電流幅度或背景導(dǎo)電性方面的差別很大(＞0．4μS)。表現(xiàn)出波動的電流的卵母細(xì)胞被用于用新的電壓控制設(shè)置在實驗中鑒定內(nèi)源電流。如圖15A所示，外向調(diào)整電流在正常Ringer(87．5mMCl-)中是可檢測的。所采用的電壓控制方案是標(biāo)準(zhǔn)的控制電勢為60mV，以便設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)水平進行比較，接下來是8個電壓測試脈沖中的一個，其范圍為-180mV至+40mV，每一次1000ms長，以便恢復(fù)到-60mV的控制電勢。為了簡化圖形，通過不同循環(huán)的電流的重疊顯示其軌跡。在將所述膜從保持電勢(-60mV)去極化至更偏向正電壓的-10mV時，激活了較強的向外調(diào)整電流。該電流表現(xiàn)出兩個分量，一個瞬時增加，隨后是一個緩慢發(fā)展的向外的電流，其t1／2大約為300ms，+40mV。所述電流的向外的分量在水浴中的Cl-濃度降低到30mMCl-時大大降低(Cl-被SO42-所取代)，與通過所述膜的對Cl-的驅(qū)動力的偏移吻合。該作用是可逆的，當(dāng)用正常Ringer(87．5mMCl-)再填充時，所述外向電流恢復(fù)。這是第一次表明所述外向電流是由流入細(xì)胞的Cl-流攜帶的1。外向調(diào)整電流是由帶正電荷的陽離子外流或帶負(fù)電荷的陰離子向內(nèi)流所產(chǎn)生的。向內(nèi)的電流是由陽離子的流入或陰離子的流出導(dǎo)致的。Cl-電流的反向電勢為了確定攜帶電流的離子，對所述反向電勢進行實驗測定，并與理論計算的特定離子的平衡電勢進行比較。平衡電勢是平衡擴散力的電力，該擴散力取決于位于所述膜的任一側(cè)的離子濃度。為了簡化擴散方案并測定活性的單位系數(shù)，S離子的平衡電勢是通過Nernst方程確定的，內(nèi)側(cè)[S]i和外側(cè)[S]o離子濃度是可變的；Es=RT／zsFln([S]o／[S]i)(I)其中，R是氣體常數(shù)，T是溫度，Zs是離子的電荷而F是法拉第常數(shù)。在25℃下，RT／F是25．69mV。卵母細(xì)胞的[Cl-]i是大約30mM，而在正常Ringer’s溶液中的[C1-]o是87．5mM。因此，根據(jù)方程1，Cl-的平衡電勢Ecl=-28mV。為了測定實驗反向電勢，在前脈沖將所述細(xì)胞控制在+50mV500ms，以便激活所述電流。隨后逐漸將膜電壓范圍調(diào)整到-160mV到+30mV。在+60mV到-3mV的電壓下，電流釋放(拖尾)為負(fù)走向，而在-34到-160mV的電壓下，電流釋放為正走向。由于所述放電是活化電流失活的后果，在其平衡電勢上預(yù)計不會記錄到電流的變化。在該電勢的正電壓和負(fù)電壓下，所述放電的特征相反。反向電勢是在電流被改變方向時的電勢，并測定其為-10到-30mV之間，與預(yù)計的Ecl吻合(-28mV)。所述電流可能是由Cl-攜帶的(圖15B，箭頭)。在未注射的卵母細(xì)胞的實驗中觀察到的另一種相關(guān)性是Cl-電流隨時間而下降。在任一批卵母細(xì)胞中，都會出現(xiàn)自主的Cl-電流，這在操作之后若干天通常會逐漸成為“沉默的”。Cl-電流的Ca2+依賴性圖15C中的最后一幅圖表示外部[Ca2+]o對向外的Cl-電流的影響。在該實驗中，當(dāng)在正常Ringer’s緩沖液中控制1mM的Ca2+濃度時所述卵母細(xì)胞不會出現(xiàn)太多的電流。不過，當(dāng)Ca2+濃度增加到10mM，-而保持[Cl-]o為87．5mM時-在經(jīng)過4分鐘的時間延遲之后，記錄到去極化的電流激活作用，將改變所述腔室中溶液的時間計算在內(nèi)。所述反應(yīng)是瞬時的，并在最大高峰電流之后5分鐘時間內(nèi)降低到背景電流水平。所述誘導(dǎo)電流也是由Cl-攜帶的，正如通過尾電流分析所證實的(未顯示)。在所述反應(yīng)中4分鐘時間的延遲可能是由于Ca2+必須首先通過Ca2+通道進入細(xì)胞所致，因為所述Cl-通道取決于細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i濃度。例5ABA在注射煙草純化mRNA的卵母細(xì)胞上的反應(yīng)純化煙草的poly(A)+RNA在營養(yǎng)組織中，葉片是脫落酸的一個主要目標(biāo)。將葉片器官用作ABA受體克隆工程的原始材料。選擇煙草SR1作為原型植物。poly(A)+RNA是直接從源于不同植物的植物組織庫中分離的，在用苯酚和氯仿提取之后用寡脫氧胸苷酸纖維素分離。用另一個步驟純化poly(A)+RNA(乙醇沉淀)，在通過斑點試驗測定其濃度之后，將其溶解在DEPC處理過的水中，得到終濃度為1μg／μl的溶液。典型mRNA注射的卵母細(xì)胞的ABA反應(yīng)。用50-75μl的1μg／μlpoly(A)+RNA懸浮液注射卵母細(xì)胞，并在轉(zhuǎn)錄表達之后2天用單個細(xì)胞進行電壓控制測定。圖16表示典型的mRNA注射細(xì)胞對ABA的電學(xué)反應(yīng)。采用Cl-電流分析的標(biāo)準(zhǔn)電壓方案在為期500ms的調(diào)節(jié)時間之后將膜的控制電勢從-120mV逐漸調(diào)整到-180mV到+60mV的范圍內(nèi)，保持1秒，然后再恢復(fù)到控制電勢。該循環(huán)重復(fù)8次，以便電勢均勻分布在-180mV到+60mV之間。不同電壓循環(huán)的電流重疊顯示在圖16A中。在正常Ringer’s緩沖液中，在任何電壓下都沒有記錄到明顯的時間依賴型電流。當(dāng)ABA(20μM)加入正常Ringer’s溶液中之后，在控制電勢從-120mV逐漸調(diào)整到更偏向正的電勢的-10mV時檢測到時間依賴型向外調(diào)整的電流。所述電流在25mV電壓下產(chǎn)生200ms的t1／2，并隨著重新極化到-100mV以大體上單一的指數(shù)方式失活(t1／2為100ms)(圖16A，中)。ABA的刺激是瞬時的，并且電流減弱在5分鐘內(nèi)完成(圖16A，右)。還觀察到自由運行膜電勢的去極化作用，這與電流的增加吻合。圖16B表示按上述方法記錄到的全細(xì)胞穩(wěn)態(tài)電流，以及在ABA處理期間的兩個時間點上的電流(20秒和5分鐘)。在這種情況下，所述穩(wěn)態(tài)電流來自在每一個測試脈沖結(jié)束時的電流，并且以控制電壓的函數(shù)形式給出。很明顯，ABA能引起一種電流，該電流在大約-160mV時激活。在+60mV下，超過3μA的增加清晰可見。按上述方法測定ABA引起的電流的反向電勢(Cl-電流的反向電勢)。在+20mV的電壓下施加調(diào)節(jié)脈沖，以便激活所述電流，接下來是在-180mV到+20mV之間的8個測試脈沖之間的一個。對于高于-10mV的電壓來說由所述測試脈沖產(chǎn)生的放電是負(fù)走向的(而對于低于-35mV的電勢來說是正走向的)。所述反向電勢是電流反向時的電壓(為-15mV到-35mV)，相當(dāng)于Ecl(圖16C)。所述ABA反應(yīng)是在3個細(xì)胞中記錄的，一共試驗了5個細(xì)胞。在所述3個ABA反應(yīng)細(xì)胞中的兩個，再一次使用ABA。在任何情況下，都沒檢測到2次反應(yīng)。在該特定mRNA制劑中，ABA引起的電流類似于在未注射的卵母細(xì)胞中觀察到的電流，此時使用了10mM的外部Ca2+(圖15C)。ABA反應(yīng)的統(tǒng)計學(xué)分析在圖17中示出了3個陽性細(xì)胞的誘導(dǎo)穩(wěn)態(tài)電流的平均值。所述ABA誘導(dǎo)電流的穩(wěn)態(tài)是通過從由ABA激活的電流中減去在添加ABA之前記錄的卵母細(xì)胞背景電流而計算的。將誘導(dǎo)的穩(wěn)態(tài)電流作為控制膜電壓的函數(shù)作圖。用于mRNA純化的植物有足夠的水分。相反，在另一種實施方案中，植物受到干旱脅迫或用20μMABA溶液處理1小時(將該溶液噴灑在葉片上，有關(guān)詳情參見第8章)。當(dāng)從所述后一種植物中純化的mRNA在卵母細(xì)胞中表達時，在所有試驗的細(xì)胞中都記錄到ABA反應(yīng)(當(dāng)使用源于干旱脅迫植物的mRNA時n=3，而對于ABA處理的植物的mRNA來說n=1)。另外，卵母細(xì)胞的批次具有可變性，因為當(dāng)將源于干旱脅迫植物的陽性mRNA樣品注射到另一批卵母細(xì)胞中時，所述ABA反應(yīng)可能不會再現(xiàn)(n=3)。陰性控制證實ABA專一性陰性控制證實，所述信號對ABA和mRNA注射的卵母細(xì)胞是專一的。被注射的卵母細(xì)胞不會對所述植物激素產(chǎn)生反應(yīng)。在添加ABA之前和之后在電壓控制期間在自由膜電勢或電流之間沒有發(fā)現(xiàn)差別(n=8，分布在不同卵母細(xì)胞批次之間)。另外，通過在所述實驗的過程中注射的20個不同RNA文庫證實了一般來說特定轉(zhuǎn)錄物的專一性而不是RNA的專一性(ntotal=78，參見下文)。還考慮了弱酸影響。脫落酸是一種弱酸(pKa4．8)，而且在pH7．5(Ringer’s緩沖液的pH)下，將主要為離子化ABA-形式，但會存在某些質(zhì)子化ABAH。由于該分子不再帶電，它可以分布在卵母細(xì)胞質(zhì)膜上。不過，很少有弱酸捕獲，因為細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)pH大體上相等(pH7．5)，所以細(xì)胞內(nèi)pH不會有明顯變化。然而，由弱酸ABA導(dǎo)入的緩沖能力的增加會影響pH的改變，并因此影響[Ca2+]I的變化。為了證實這不是卵母細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)緩沖能力的增加，該能力會促進向外Cl-電流的活性，還進行了負(fù)對照，在不同的試驗中用20μM乙酸鉀(pKa4．8)取代ABA。在每一種情況下，當(dāng)添加乙酸鉀時，沒有觀察到反應(yīng)。因此，可以得出這樣的結(jié)論，ABA是由卵母細(xì)胞特異性識別的，但只有當(dāng)注射植物mRNA時才能識別，而且這種識別會導(dǎo)致內(nèi)源向外調(diào)整Ca2+依賴型Cl-通道的誘導(dǎo)。例6蔗糖梯度分離mRNA分離是用蔗糖梯度完成的。為了制備蔗糖梯度，制備了兩種母液一種溶液含有30％蔗糖，其中含有10mMTris-HCl(pH7．5)，1mMEDTA(pH8)和0．1％LDS(十二烷基硫酸鋰)，另一種溶液包括相同的成分，所不同的是缺少蔗糖。以不同比例混合以上兩種緩沖液，以便得到蔗糖百分比為30％、26％、22％、18％、14％和10％的溶液。用DEPC清洗體積為4ml的聚苯乙烯試管，并徹底漂洗，因為這種試管是不能進行高壓滅菌的。將所述試管放入超速離心機轉(zhuǎn)子TST60(Solvay)上的吊桶中。首先用650μl30％的蔗糖混合物填充不含RNase的離心管-確認(rèn)所有液體都裝在所述試管的底部-并在-70℃下靜置20分鐘。在冷凍以后，加入650μl26％的溶液，并用相同方法再次冷凍。用22％、18％和14％的蔗糖混合物重復(fù)以上過程。最后將蔗糖梯度儲存在4℃下，并在使用之前在上面覆蓋650μl10％的蔗糖溶液。通過在4℃下溫育至少12-14小時制成連續(xù)的梯度。在65℃下將mRNA(以1μg／μl的最終濃度溶解)變性5分鐘，并在冰上冷卻。將50μlmRNA溶液小心加在蔗糖梯度的頂部，并在TST60轉(zhuǎn)子(Solvay)中以34，000rpm的速度離心該梯度15小時。用移液管從頂部取400μl組分，并轉(zhuǎn)移到放在冰上的微量離心管中。為了除去蔗糖，通過乙醇沉淀純化RNA加入1／10體積的乙酸鈉(3M)和2．5倍體積的乙醇，并在-20℃下溫育該混合物過夜，在臺式微量離心機上以最大速度離心15分鐘，用70％的冰鎮(zhèn)乙醇洗滌，在冰上干燥并溶解在水中。例7互補DNA表達文庫制備用GibcoBRLSuperscript質(zhì)粒系統(tǒng)制備cDNA文庫(其概述參見圖4A)。雙鏈cDNA合成用mRNA(1-5μg)作為模板制備第一股cDNA鏈。用于該反應(yīng)的引物是NotI引物-含有15dT殘基的接頭。混合引物(1μg)和mRNA，并加熱到70℃保持10分鐘，在冰上快速冷卻。加入緩沖液(50mMTris-HCl(pH8．3)，75mM氯化鉀，3mM氯化鎂，10mMDTT)和dNTP混合物(終濃度為0．5mM的dATP、dCTP、dGTP、dTTP)，逆轉(zhuǎn)錄酶SuperscriptIIRT(200-1000單位，取決于RNA的量)同時加入，并用0．05μCi的[-32P]dCTP作為標(biāo)記在該過程中對cDNA進行示蹤。該反應(yīng)混合物在37℃下溫育1小時。第二股鏈的合成是用大腸桿菌DNA聚合酶I和大腸桿菌RNaseH和DNA連接酶同時催化的。該反應(yīng)的最終組合物為20μl第一股鏈反應(yīng)混合物加上25mMTris-HCl(pH7．5)，100mM氯化鉀，5mM氯化鎂，10mM硫酸銨，0．15mMNAD+，dNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP)各250μM，1．2mMDTT，65U／mlDNA連接酶，250U／mlDNA聚合酶I，13U／mlRNaseH，最終體積為150μl。在16℃下溫育該混合物2小時。然后加入聚合酶4在相同溫度下再溫育5分鐘。此時，用10μl0．5MEDTA提取，并用150μl苯酚和氯仿(50／50v／v)溶液提取。加入70μl7．5M乙酸銨和0．5ml預(yù)冷卻(-20℃)的乙醇到水溶液中使cDNA沉淀，并離心該混合物20分鐘。在70％的乙醇中洗滌沉淀，離心2分鐘，最后在蒸發(fā)掉剩余的乙醇之后，溶解在25μl水中。通過平端連接將接頭加到雙鏈cDNA上，反應(yīng)混合物中含有50mMTris-HCl(pH7．6)，10mM氯化鉀，1mMATP，5％(w／v)PEG8000，1mMDTT，200μg／mlSalI接頭和100U／mlT4DNA連接酶。所述接頭的自由末端包括4個堿基的5’延長，相當(dāng)于由SalI限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端。在用NotI(50mMTris-HCl(pH8．0)，10mM氯化鎂，100mM氯化鈉，和1200U／mlNotI)消化之后，按上述方法通過苯酚氯仿提取和乙醇沉淀純化DNA。插入片段的柱純化將DNA溶解在100μlTEN緩沖液中10mMTris-HCl(pH7．5)，0．1mMEDTA，25mM氯化鈉。將預(yù)先調(diào)整的柱安裝在分離cDNA的系統(tǒng)上。首先用0．8mlTEN緩沖液洗滌所述柱4次進行制備。讓cDNA和另外的100μlTEN緩沖液流過該柱。加入剩余的100μlTEN緩沖液，并將單一的洗脫液(大約35μl)收集在獨立的微量離心管中，該收集過程持續(xù)到另外3個100μlTEN試樣。通過在閃爍記數(shù)器上檢測放射性標(biāo)記檢測DNA的組分，取所述組分的3μl樣品在凝膠上電泳，以確定其大小。所得組分的雙鏈cDNA能產(chǎn)生與原始mRNA大小一致的寬的帶。插入片段的連接將所述cDNA連接到用NotI-SalI線性化的pSPORT1表達載體上(參見下文和圖4B)。連接混合物包括50mMTris-HCl(pH7．6)，10mM氯化鎂，1mMATP，5％(w／v)PEG8000，1mMDTT，2．5μg／ml質(zhì)粒pSPORT1，NotI-SalI-酶，0．5μg／mlcDNA和50U／mlT4DNA連接酶。將該混合物加入cDNA中。在室溫下溫育連接混合物3小時。為了通過電穿孔將DNA導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，必須通過用乙醇沉淀將連接混合物脫鹽。向20μl連接混合物中加入5μl酵母tRNA(1μg／ml)，12．5μl乙酸銨(7．5M)，和70μl無水乙醇(-20℃)。到所述混合物進行渦旋攪拌，并馬上以14，000g的速度離心2分鐘。棄上清液，并在37℃下干燥沉淀10分鐘。將cDNA溶解在6μl水中，并進行4次電穿孔反應(yīng)。每一次將1．5μl的連接混合物加入40μl的電穿孔細(xì)胞中(ElectroMAXDH10B細(xì)胞，BRL)，在冰上溫育1-3分鐘，并轉(zhuǎn)移到電穿孔樣品池(BioRad)中。電穿孔是用為200的脈沖控制器(BioRad)和設(shè)定為25μF和2．5V的基因脈沖器(BioRad)進行的。加入1mlSOC培養(yǎng)基，并在37℃下培養(yǎng)所述細(xì)胞1小時。將所述文庫的一部分鋪平板到含有LBamp(氨芐青霉素)的培養(yǎng)皿(2000個轉(zhuǎn)化體的10倍)上，所述文庫的其余部分保存在液體LB或SOC培養(yǎng)基中，在-70℃下作為40％(v／v)甘油母液保存。為了測定自身連接的百分比，將一部分轉(zhuǎn)化體鋪平板到含有Lbamp的平板上，該平板含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基N-乙酰-D-半乳糖酰胺40μg／5ml，Sigma)和IPTG(異丙基硫代半乳糖苷，40μg／5ml，Sigma)在37℃下溫育過夜，含有重組克隆的菌落由于質(zhì)粒中所含的半乳糖苷酶基因的失活而呈白色(參見下一段)。含有再環(huán)化載體的菌落是蘭色的。PSPORT1載體的特征PSPORT1載體(圖4B)包括4109個堿基對，并包括位于多克隆位點(MCS)一端的lacP啟動子。其它的lac操縱因子(lacO和-lacZ基因(lacZ’)的因子)為MCS中斷。該載體的特征還在于具有一個lacI抑制基因，因此所述啟動子對cDNA插入片段的轉(zhuǎn)錄受到有效抑制，除非加入1mMIPTG到生長培養(yǎng)基中。除非特別需要表達，文庫不在誘導(dǎo)條件下鋪平板?？梢杂肧P6和T7RNA聚合酶啟動子體外合成RNA，使用純化的質(zhì)粒DNA和SP6或T7RNA聚合酶。所述啟動子彼此相反，并抑制MCS，以便每一股cDNA鏈可以拷貝成cRNA(參見下面的體外轉(zhuǎn)錄段落)。將所述質(zhì)粒上的f1基因間片段(IG)用于合成單鏈形式的質(zhì)粒。復(fù)制的質(zhì)粒起始位點(ori)屬于colE1家族。所述載體含有一個氨芐青霉素抗性基因，以便篩選含有pSPORT1的菌株。例8DNA和RNA操作和體外轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒制備和DNA消化源于大腸桿菌菌落的質(zhì)粒DNA是用購自Quiagen的Quiaprepspin質(zhì)粒試劑盒制備的，該試劑盒含有所需要的柱和緩沖液。通過在臺式BR401離心機(Denley)上以4500g的速度離心10分鐘使來自過夜LB培養(yǎng)物的5ml制備細(xì)菌或直接從含有LB的瓊脂平板上收集的細(xì)胞沉淀。將細(xì)菌沉淀物溶解在250μl緩沖液P1和100μg／mlRNase中，然后加入250μl緩沖液P2，混合該溶液然后添加350μlN3。以10000g(13000rpm，在臺式離心機上)的速度離心該混合物10分鐘。將上清液傾倒到Qiaprep柱上，并以相同的速度離心1分鐘。用750μl緩沖液PE洗滌該柱，并再次離心1分鐘。為了稀釋DNA，將50μlTris-HCl(10mM，pH=8．5)加至所述柱上，并在室溫下溫育1分鐘，然后按上述方法離心1分鐘，將洗脫液收集到新的試管中。在-20℃下保存DNA。為了對DNA進行限制性消化和修飾，使用購自新英格蘭生物實驗室的NEB酶系統(tǒng)。使用由該公司提供的所有NEB緩沖液和反應(yīng)條件。用DNA瓊脂糖凝膠電泳分離并分析一部分DNA。將0．8-1％的瓊脂糖溶解在1×TAE(40mMTris-HCl乙酸，1mMEDTA中。將購自BioRad的凝膠系統(tǒng)和電源(1000／500型)用于電泳。將樣品加樣到1×加樣緩沖液(10×加樣緩沖液母液0．4％溴酚蘭，0．4％二甲苯青FF，25％Ficoll，400型)中。一旦電泳，將所述凝膠放在0．5-1％溴化乙錠溶液中染色30分鐘，用水清洗，并在紫外線透射儀上觀察DNA。作為標(biāo)準(zhǔn)物，使用GibcoBRL的1KBDNA梯。通過與在相同凝膠上電泳的該標(biāo)準(zhǔn)物比較估計DNA的大小和濃度。消化之后的DNA純化是通過苯酚氯仿(50／50，v／v)提取接著進行沉淀而完成的。因此，將1／10乙酸鈉(3M)和二倍體積的預(yù)冷卻的乙醇加入并將該混合物放在-20℃下冷卻至少15分鐘，然后通過在可能達到的最大速度下離心使DNA沉淀。在用70％的乙醇洗滌之后，讓DNA沉淀物干燥，并溶解在適量的水中。體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)是用BoehringerMannheim的T7Cap-Scribe包進行的，該試劑包包括T7RNA聚合酶和10倍濃度的緩沖液。該緩沖液含有優(yōu)化濃度的核糖核苷三磷酸和帽-核苷酸mGpppG，由它確保合成加帽的mRNA。所述反應(yīng)是用0．5μg線性化DNA作為模板進行的，并且與1×的緩沖液和40單位的T7聚合酶在37℃下溫育1小時。在該反應(yīng)之后用1單位的不含RNase的DNase(Promega)進行DNase處理15分鐘。用0．5μgDNA模板通常能得到10μgcRNA。RNA凝膠電泳將1．2克瓊脂糖放入80ml水中，在微波爐中熔化，并冷卻到65℃。加入10ml10×MOPS緩沖母液(10×MOPS緩沖液，0．4MMOPS，6mMEDTA(pH8)，50mM乙酸鈉，最終pH7)，并加入17．5ml甲醛。充分混合該混合物，并注入凝膠成型裝置(BioRad)中，冷卻使瓊脂糖聚合并形成凝膠。RNA樣品的加樣混合物包括100μl10×MOPS，350μl甲醛，1ml甲酰胺，200μl加樣染料(50mg溴酚蘭和5克Sicoll，在20ml水中混合)。將RNA樣品溶解在1-8μl的體積中，與16．5μl的加樣混合物和2μlEtBr混合(0．5mg／ml)，并加熱到65℃保持10分鐘，然后在冰上冷卻，并加樣到所述凝膠上，讓所述凝膠在1×MOPS緩沖液中以100-150V的電壓電泳4-5小時。在紫外線透射儀上觀察RNA。通過與0．24-9．5KBRNA梯(GibcoBRL)比較估計RNA片段的大小。例9通過大小分離富集決定轉(zhuǎn)錄物的RNA為了減少轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量，在連續(xù)的蔗糖梯度上根據(jù)大小將總的煙草葉片mRNA分離成不同部分。將ABA反應(yīng)樣品的100μg變性mRNA加樣到兩種梯度中，并離心15小時。從位于所述梯度頂部的含有最小片段的部分開始收集10個組分，每個組分有大約10μgRNA。用含有甲醛的瓊脂糖凝膠分析每個組分的1／10的樣品，用溴化乙錠染色以便觀察RNA(圖18)。根據(jù)凝膠上的DNA條帶可以清楚地看出通過大小進行的分離，所述條帶的大小隨著不同的組分而增加。所述組分的RNA濃度通過斑點試驗測定，參見例1，并在通過苯酚／氯仿純化和乙醇沉淀之后將每一個組分調(diào)整到最終濃度為1μg／μl。我們認(rèn)為1-3號組分含有的RNA太小，以至于不能編碼受體類型的蛋白，而10號組分不含有可以注射的足夠數(shù)量的RNA。將4-9號組分注入爪蟾卵母細(xì)胞中(每個卵母細(xì)胞大約±50ng)。在蛋白合成2天之后檢測所述卵母細(xì)胞對ABA的敏感性。按第三章所披露的方法對總mRNA進行電壓控制測定。用來自4、5、7、8和9號組分的mRNA注射的卵母細(xì)胞不能針對ABA產(chǎn)生可檢測的電流變化(每個組分平均3個或3個以上卵母細(xì)胞，表2)。表達6號組分的轉(zhuǎn)錄物的卵母細(xì)胞在添加ABA時5個細(xì)胞中的3個表現(xiàn)出獨特的信號。在對所述膜去極化，使控制電勢從-120mV變成高于-10mV的電壓時檢測到向外調(diào)整電流的升高，并在施加ABA之后在幾分鐘(5分鐘)之內(nèi)電流減弱到原始電流水平。用6號組分的mRNA注射的卵母細(xì)胞的瞬時ABA反應(yīng)類似于在總mRNA注射的卵母細(xì)胞上記錄到的Ca2+依賴型向外Cl-通道(參見段落3．4．2)。在圖19中示出了每一個注射組分在+60mV電壓下誘導(dǎo)ABA電流的平均值。在+60mV的電壓測試脈沖結(jié)束時記錄在ABA處理期間檢測到的穩(wěn)態(tài)電流，并通過扣除在添加ABA之前記錄到的在相同控制電壓下穩(wěn)態(tài)電流進行調(diào)整。在注射來自6號組分的RNA的3個陽性細(xì)胞中檢測到針對ABA的顯著的電流強度的增加。通過比較，其它蔗糖梯度組分的誘導(dǎo)電流平均值在0左右波動。陰性組分的平均值是用所有測定的細(xì)胞計算的(4號組分，n=6；5、7和9號組分，n=4；和8號組分，n=3)。能產(chǎn)生所述陽性ABA信號的mRNA組分在瓊脂糖凝膠上的堆積帶為1．5-2kb(圖18)，并且將它用于進一步的克隆和同胞選擇。例10cDNA文庫克隆將能在卵母細(xì)胞中引起ABA反應(yīng)的6號mRNA組分用作模板，構(gòu)建cDNA表達文庫。采用用于cDNA合成和質(zhì)?？寺〉腂RLSuperscript質(zhì)粒系統(tǒng)(其略圖參見圖4)。在制備cDNA第一股鏈的反應(yīng)中使用4μgmRNA。用于該反應(yīng)的引物-接頭包括15dT殘基，它可以與mRNA的poly(A)+尾雜交，并結(jié)合到NotI限制性識別位點上。所述反應(yīng)是用逆轉(zhuǎn)錄酶(SuperscriptIIRT)進行的，該酶是Moloney鼠白血病病毒(MMLV)的衍生物，并缺乏RNaseH活性，以便提高完整長度cDNA的產(chǎn)量。用第一股cDNA鏈作為模板再生mRNA的一級序列，作為第二股DNA鏈。該系統(tǒng)使用缺口翻譯取代mRNA合成第二股cDNA。第二股鏈的合成是由大腸桿菌DNA聚合酶I與大腸桿菌RNaseH組合催化的，以便在mRNA和DNA連接酶上形成缺口。業(yè)已證實該組合能夠改善由較長的mRNA(±2kb)(GibcoBRL)合成的雙鏈cDNA的克隆。用T4聚合酶處理第二股鏈合成的產(chǎn)物，以確保所述cDNA鏈含有平端?？寺〉亩ㄏ蚴峭ㄟ^在cDNA的末端引入不對稱性而獲得的，通常通過在所述末端引入兩個不同的限制性內(nèi)切酶位點(圖4)。為了提高所述載體的連接效率，通過在所述插入片段上添加接頭將所述cDNA的平端轉(zhuǎn)化成含有5’延長的末端。所使用的接頭是短的雙鏈寡聚體，具有一個平的末端，并在另一個末端具有4-堿，5’延長，相當(dāng)于通過SalI限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端。所述接頭的平端連接是由于接頭的過量而啟動的。實現(xiàn)定向克隆所需要的不對稱性因子是在第一股cDNA鏈合成期間通過引物-接頭導(dǎo)入cDNA的NotI限制位點。在連接SalI接頭之后，用NotI消化DNA。所得到的cDNA的NotI末端相當(dāng)于mRNA的3’末端，而另一個末端SalI相當(dāng)于mRNA的5’末端。在實際連接到所述載體上之前，根據(jù)大小在與試劑盒一起提供的柱上分離cDNA。這樣做是重要的，因為存在以大的摩爾比超出的殘余接頭，并可能通過連接于預(yù)先消化的載體的SalI末端上而妨礙載體接到cDNA。另外，通過NotI消化從所述cDNA上釋放的片段在其一端具有SalI末端，而在其另一端具有NotI末端，并有可能用表現(xiàn)為‘空的’克隆污染所述克隆，這會增加篩選的負(fù)擔(dān)。大小分離還有可能減少含有完整的cDNA的較小插入片段在所述文庫中占主要地位的傾向。最后，將柱純化的大小合適的13ng的cDNA(在瓊脂糖凝膠上證實為1．3-3kb)連接到50ng預(yù)先消化(NotI-SalI)的pSPORT1表達載體上，以便所述基因被克隆在T7RNA聚合酶啟動子的下游。所述菌株的轉(zhuǎn)化是通過用購自BRL的ElectroMAXDH10D細(xì)胞通過電穿孔完成的。一共獲得了4×105個克隆，其中有10％是自身連接的。為了儲存，將所述轉(zhuǎn)化體稀釋在液體LB培養(yǎng)基(1×104細(xì)胞／毫升LB)，使甘油的最終濃度為40％，并在-70℃下保存。例11同胞選擇20000個集落，所述文庫的代表將大約20000個集落均勻分散在裝有含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基的10LB培養(yǎng)皿上進行生長，以便篩選pSPORT1轉(zhuǎn)化的集落。用消毒的濾紙將具有2000集落的每一個平板復(fù)制兩個到其它的平板上。同胞選擇如表2所示。用玻璃移液管將一個拷貝的細(xì)菌菌落劃線到培養(yǎng)基上，并將每一個平板分別溶解在10毫升水中，并將所述文庫編號為1-10。通過在臺式離心機BR401(Denley)上以4500g的速度離心10分鐘收集細(xì)胞。制備質(zhì)粒DNA，并通過NotI限制性消化線性化。在體外轉(zhuǎn)錄之后分3次收集cRNA，其中兩份含有大約6000個轉(zhuǎn)錄物(文庫1+2+3和文庫4+5+6)，而第三個文庫含有大約8000個菌落(文庫7+8+9+10)。作為對照，在圖11中示出了來自1號文庫的含有2000個克隆的cRNA的代表。將以上三種文庫注射到爪蟾卵母細(xì)胞中，并在表達兩天之后進行電壓控制方案，并檢測對ABA的反應(yīng)。電壓控制方案是標(biāo)準(zhǔn)的，并在整個同胞選擇過程中使用。在設(shè)定脈沖之前將Cl-通道活性設(shè)定為最低基線的調(diào)節(jié)電勢設(shè)定為-120mV，8個測試脈沖在-180mV到+60mV之間，隨后是--120mV的后脈沖電壓。示出了具有6000個克隆的文庫(1+2+3)，在添加外部ABA時4個測試細(xì)胞中兩個有反應(yīng)。當(dāng)膜電壓被控制在從-120mV的控制電勢到+60mV的脈沖時，在有ABA的條件下產(chǎn)生時間決定型電流。不過，瞬時ABA誘導(dǎo)的電流強度是很小的，在100nA范圍內(nèi)(參見表2)。對于第一個近似值來說，所述電流與所披露的mRNA注射的卵母細(xì)胞的Cl-電流吻合。相反，用來自其它文庫，文庫6000(4+5+6)和文庫8000(7+8+9+10)的cRNA注射卵母細(xì)胞在添加ABA時不會出現(xiàn)控制電流的任何變化(試驗的細(xì)胞數(shù)n=4／文庫)(參見表2)。將所述20000文庫代表細(xì)分成2000和200個組分通過縮小單一轉(zhuǎn)錄物的文庫分離控制ABA敏感性的克隆。將2000個集落的3個文庫(1、2和3)的cRNA(是6000個克隆的活性文庫的部分(1+2+3))分別注射到卵母細(xì)胞中。ABA試驗在2000個克隆的文庫中的一個(1號文庫)中產(chǎn)生信號。在使用標(biāo)準(zhǔn)電壓控制方案時，用1號文庫注射的卵母細(xì)胞在高的正電壓(+60mV)下表現(xiàn)出ABA引起的電流增加，大約為20-50nA(表2，圖20)。檢驗了3個細(xì)胞，所有3個細(xì)胞都表現(xiàn)出ABA誘導(dǎo)的電流，這表明了所述小的但明顯的信號的高度再現(xiàn)性。當(dāng)2號和3號文庫在卵母細(xì)胞中表達時，不會產(chǎn)生針對ABA的信號(2號文庫，n=5；3號文庫，n=6)。另一個同胞選擇步驟是通過將有活性的包括2000個克隆的文庫分成具有大約200-250個克隆的8個文庫。這一目的是通過將含有1號文庫的2000個克隆的復(fù)制LB平板的培養(yǎng)基切成8塊而完成的。將每一塊培養(yǎng)基上的克隆刮去，并溶解在10毫升水中。制備DNA，并用NotI限制酶使其線性化，并在體外合成cRNA，再將其注射到卵母細(xì)胞中，一個具有200個克隆的文庫表現(xiàn)出對ABA的反應(yīng)信號，不過這在某些批次的卵母細(xì)胞中是不固定的在一種情況下從5個細(xì)胞中得到一個陽性細(xì)胞，而在另一批卵母細(xì)胞中從3個細(xì)胞中獲得一個陽性細(xì)胞。不過，該文庫在第三批卵母細(xì)胞中在所試驗過的5個細(xì)胞中有3個表現(xiàn)出非常有說服力的由于ABA的作用而使得瞬時電流量增加。在采用標(biāo)準(zhǔn)電壓控制方案期間，當(dāng)控制膜使前脈沖的-120mV改變到+60mV時，ABA誘導(dǎo)的電流強度為300nA。與以前用cRNA注射的卵母細(xì)胞相比，由ABA引起的電流強度的增加至少增加了兩倍(圖20，圖21)。因此，有理由認(rèn)為獲得了卵母細(xì)胞中功能性ABA信號途徑所必需的轉(zhuǎn)錄物的富集。源于所述陽性2000文庫的所有其它7個小的文庫都是陰性的(表2，每個文庫試驗了3到4個細(xì)胞)。在繼續(xù)進行之前，重復(fù)這一階段的測定，以避免由于不同批次的卵母細(xì)胞差別所產(chǎn)生的問題。將所有陽性文庫分別注射到同一批次的卵母細(xì)胞中。這里所進行的ABA試驗證實，在整個同胞選擇過程中，瞬時向外的電流是小的，但對于陽性選擇的文庫來說是顯著的(圖20)。表2歸納了所測試的細(xì)胞。在具有20000個克隆的文庫中得到2個陽性細(xì)胞，測定這2個細(xì)胞所得到的平均誘導(dǎo)電流為150nA；在具有2000個克隆的文庫中從3個注射的卵母細(xì)胞產(chǎn)生一個ABA反應(yīng)細(xì)胞，所產(chǎn)生的誘導(dǎo)電流為150nA。200個克隆的文庫在4個卵母細(xì)胞中產(chǎn)生2個陽性細(xì)胞，所產(chǎn)生的誘導(dǎo)電流為200nA。源于原始cDNA文庫的另一個具有6×104個轉(zhuǎn)錄物的文庫對ABA沒有反應(yīng)。證實了所述信號對這種特定轉(zhuǎn)錄物的專一性(n=3)。20種困難的生長候選物挑取(用無菌牙簽)活性200文庫的單個菌落，并復(fù)制到新的LB培養(yǎng)皿上。分別操作3次，以便細(xì)分并測定陽性ABA反應(yīng)。最初，在具有50個轉(zhuǎn)錄物的4個子文庫中在注射之后沒有一個能產(chǎn)生對ABA的反應(yīng)。只是在做第三次嘗試時，當(dāng)收集到20個克隆特定小組并且當(dāng)其cRNA在卵母細(xì)胞中表達時，才回收到所述信號(圖20和表2)。將該文庫與在復(fù)制之后生長緩慢的所有大腸桿菌轉(zhuǎn)化體合并。用所述20文庫注射2個獨立批次的卵母細(xì)胞，并且在一批卵母細(xì)胞中5個細(xì)胞中有4個，而在另一批細(xì)胞中2個細(xì)胞中有1個表現(xiàn)出陽性ABA反應(yīng)。不過，當(dāng)用3個其它的200-文庫-衍生的子文庫(n=3-4／60個克隆的文庫)注射時，添加ABA卵母細(xì)胞沒有反應(yīng)。與以前注射2000或20000轉(zhuǎn)錄物的卵母細(xì)胞中檢測到的ABA信號相比，所述20文庫的ABA誘導(dǎo)電流的強度也有所增強。在一個細(xì)胞中，在60mV電壓下，ABA引起的電流達到500nA，表明信號的增強幅度超過了用陽性200文庫的cRNA注射的卵母細(xì)胞(圖20，表2)。在20文庫中ABA測定的平均幅度(270nA)超過200文庫的幅度(140nA)。作為候選物的可能性越小，導(dǎo)電性越大計算在每一個文庫(20000-6000-2000-200-20)中ABA在卵母細(xì)胞中能誘導(dǎo)陽性反應(yīng)的細(xì)胞的弦導(dǎo)電性(g)。所述弦導(dǎo)電性表示代入Cl-Ecl平衡電勢和在+60mV下ABA誘導(dǎo)電流的曲線的斜率。所述誘導(dǎo)電流是由ABA誘導(dǎo)的電流減去在添加ABA之前存在于卵母細(xì)胞中的背景電流而得到的。將所述弦導(dǎo)電性的平均值±SE對在所述代表性文庫中的轉(zhuǎn)錄物的量進行半對數(shù)規(guī)模的作圖。所述曲線的發(fā)展表現(xiàn)出在ABA反應(yīng)中導(dǎo)電性隨著所述文庫中不相同的轉(zhuǎn)錄物的數(shù)量而呈反比例增加。這表明ABA感受信使的增加。表2注射卵母細(xì)胞一攬，在所述克隆方法和同胞選擇期間檢測向外電流的ABA瞬時增加。最有希望的文庫是陽性的，并用于進一步的同胞選擇。<tablesid="table4"num="004"><table>文庫號轉(zhuǎn)錄物數(shù)爪蟾號日期IABAa(nA)Posbnb1陽性文庫6000130-4／1-5-9550，100242陰性文庫6000130-4／1-5-950043陰性文庫8000515／17-5-950041陰性文庫2000515／17-5-950052陰性文庫2000515／17-5-95006</table></tables><tablesid="table5"num="005"><table>3陽性文庫2000515／17-5-9530，40221陽性文庫200612／13-6-95100151陽性文庫200520／22-12-95250，200，150，120451陽性文庫200527／28-2-96100132陰性文庫250612／13-6-950043陰性文庫250612／13-6-950044陰性文庫250612／13-6-950035陰性文庫250612／13-6-950046陰性文庫250612／13-6-950037陰性文庫250612／13-6-950038陰性文庫250612／13-6-95004陰性文庫6×528／30-8-95003104528／30-8-95100，20223陽性文庫20000528／30-8-95150131陽性文庫2000528／30-8-95100，10024陽性文庫2001陽性文庫20612／14-3-96500，300，150，150451陽性文庫2073／4-6-96250132陰性文庫60612／14-3-960033陰性文庫60612／14-3-960044陰性文庫60612／14-3-96003</table></tables>aIABA是在每一個細(xì)胞上分別測定的在+60mV下的ABA誘導(dǎo)電流B在通過電壓控制測試的注射細(xì)胞的總數(shù)量中對ABA有反應(yīng)的卵母細(xì)胞的數(shù)量(Pos)。下面所使用的涉及DNA和RNA操作以及在爪蟾卵母細(xì)胞中進行表達分析的方法是按上文所述方法進行。例12DNA測序為了進行DNA測序，使用ABIPRISMTM310遺傳學(xué)分析儀(應(yīng)用生物系統(tǒng)，PerkinElmer，F(xiàn)oster市，CA)。采用‘染料終止子’方法，該方法使用了用螢光素標(biāo)記物標(biāo)記過的ddNTP’s(雙脫氧-核糖-核苷三磷酸)。ddNTP’s能防止DNA聚合酶延長DNA的復(fù)制。以正確比例使用ddNTP’s和正常的dNTP’s，以便其插入模板DNA拷貝的隨機位點上，并得到不同長度的DNA鏈。每一個DNA鏈的末端由一個螢光ddNTP標(biāo)記。將所述反應(yīng)物加樣到由2微升凝膠裝在毛細(xì)管(直徑75微米)中構(gòu)成的柱上。通過激光束檢測ddNTP’s，并在不同波長下讀每一種ddNTP(ddATP、ddNCTP’s、ddGTP’s、或ddTTP’s)。模板DNA是用購自Quiagen的Qiaprepspin質(zhì)粒試劑盒制備的質(zhì)粒DNA。為了制備所述樣品，用Taq聚合酶進行PCR反應(yīng)。所述反應(yīng)混合物含有4．0微升終止子反應(yīng)混合物，0．5微克模板雙鏈質(zhì)粒DNA，3．0pmol引物，并添加水使總體積為10微升。在下列條件下在GeneAmpPCR系統(tǒng)2400(PerkinElmer，F(xiàn)oster市，CA)上擴增所述模板。1．快速加熱到96℃。2．在96℃下保持10秒。3．快速調(diào)整溫度到50℃。4．在50℃下保持5秒。5．快速調(diào)整溫度到60℃。6．在60℃下保持2分鐘。7．重復(fù)1-625輪次。8．快速調(diào)整溫度到4℃。純化所述反應(yīng)混合物，然后上柱。為了除去所有多余的標(biāo)記物，純化是必要的。每一個試管裝有10微升乙酸鈉(3M)和80微升水。將所述溶液轉(zhuǎn)移到裝有250微升95％的乙醇的0．5毫升的微量離心管中。將該溶液放置在冰上保持10分鐘，然后在實驗室臺式微量離心機上以最大速度離心20分鐘。小心除去所有乙醇，并用250微升乙醇(70％)漂洗沉淀物。再次將所有乙醇除去。通過重復(fù)渦旋攪拌所述試管將沉淀物重新懸浮在12．5微升模板抑制劑(PerkinElmer，F(xiàn)oster市，CA)中，在95℃下加熱該反應(yīng)混合物2分鐘，并再次渦旋攪拌。將所述溶液進行簡單地離心沉淀，然后即可將所述試管中的反應(yīng)物加樣到所述遺傳學(xué)分析儀的柱上。引物T7引物是二十聚體5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’M13(f)序列引物(十七聚體)5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’例13測序分析將購自DNA*(Madison，美國)的Lasergene軟件與ABIViewV1．0(PerkinElmer，F(xiàn)oster市，CA，DavidH．Klatte版權(quán)，1996)用于分析序列。ABIView是一種程序，它可以展示直接從所述遺傳學(xué)分析儀上記錄的序列的未編輯的痕跡。將平面序列拷貝到Lasergene的子程序EDITSEQ中，在這里對序列進行編輯和翻譯。一旦所述序列被保存為EDITSEQ文件，就可以進入Lasergene的所有下列子程序。將SEQMAN用于從重疊序列產(chǎn)生重疊群。將MAPDRAW用于測定開放讀框，并確認(rèn)限制性內(nèi)切酶位點。將MEGALLIGN用于在核苷酸和氨基酸水平上與不同的已知序列進行比較，并計算它們之間的相似性百分比。相似性是根據(jù)相同的氨基酸數(shù)量在兩個蛋白序列的總長度所占比例計算出來的。用PROTEAN在結(jié)構(gòu)水平上分析預(yù)測的蛋白序列，包括疏水性曲線，并在測序水平上包括鑒定可能的保守功能域。序列同源性檢索是用由NCBI(國家生物技術(shù)信息中心，http／／www．ncbi．nlm．nih．gov／)提供的BLAST序列相似性服務(wù)器完成的。例14在20個克隆的文庫中ABA信號喪失從所有20個單一菌落中制備質(zhì)粒DNA。通過將等量的DNA收集在一起形成各有4個克隆的5個文庫，并在體外合成cRNA。將cRNA樣品注射到卵母細(xì)胞中。在表達之后，按上述方法測定卵母細(xì)胞對ABA的反應(yīng)。在所述5個文庫中的4個的總共9個細(xì)胞中沒有發(fā)現(xiàn)明顯的ABA反應(yīng)。有一個文庫在該文庫的試驗過的3個細(xì)胞中有2個表現(xiàn)出與向外調(diào)整的電流(低于50nA)的波動相關(guān)，但ABA專一性不確切。為了檢驗所述電流的顯著性，將所述最后一個文庫克隆的4個單一的cRNA注射到卵母細(xì)胞中。同樣未檢測到ABA反應(yīng)(n=每個克隆2個細(xì)胞)。不過，所述cRNA樣品之一產(chǎn)生顯著的電流，盡管該電流不取決于ABA。例16綜合所述克隆不能恢復(fù)所述信號以1(smG-Nt)∶1(cal-Nt)∶0．1(syr)的相對濃度比在卵母細(xì)胞中表達smG-Nt(小的G-蛋白-樣)和cal-Nt(鈣視網(wǎng)膜蛋白-樣)與syr突觸融合蛋白樣克隆的cRNA組合物。檢測到與所述突觸融合蛋白樣克隆相關(guān)的某些電流波動，但未記錄到對ABA的可檢測的反應(yīng)。用不同批次的卵母細(xì)胞重復(fù)以上過程兩次，ntotal=7。另外，當(dāng)以(1(2)∶1(8)∶1(12)∶0．1(syr))的比例在卵母細(xì)胞中共表達2號、8號和12號克隆的三種未知膜蛋白和突觸融合蛋白樣蛋白時，沒有記錄到ABA信號。另外進行了兩次所述測定，ntotal=4。在本章中與電生理學(xué)記錄和DNA測序相關(guān)的所有試驗方法均如上文所述。例17亞克隆連接使用上述DNA操作，在瓊脂糖凝膠上電泳，然后用購自Boehringermannheim的‘瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒’純化所述片段和載體，該試劑盒使用了特殊處理過的能結(jié)合核酸的硅基質(zhì)，洗去污染物，最后獲得由50微升10mMTris-HCl(pH8)溶液洗脫的DNA。用T4DNA連接酶(Boehringermannheim)將DNA片段連接到質(zhì)粒上。連接緩沖液含有50mMTris-HCl(pH7．5)，10mM氯化鎂，10mMDTT，1mMATP和25μg／mlBSA。將含有5×摩爾數(shù)的插入片段和載體的反應(yīng)物在17℃下溫育過夜。轉(zhuǎn)化將所述連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌電感受態(tài)細(xì)胞中。所述電感受態(tài)細(xì)胞是由大腸桿菌菌株DH12S制備的。挑取一個菌落并在37℃下在10mlSOB-Mg培養(yǎng)過夜。用所述過夜培養(yǎng)物接種500mlSOB-Mg，并在37℃下生長細(xì)菌，直到OD550達到0．75。在GSA轉(zhuǎn)子離心機(SORVAL)上以4000g的速度離心使細(xì)胞沉淀。在400ml冰鎮(zhèn)10％甘油中洗滌沉淀物兩次，并重新懸浮在2ml10％甘油中。在液氮中快速冷卻所述試管，然后以100微升的體積將高度濃縮的溶液在-70℃下保存在微量離心管中。為了在大腸桿菌中進行電穿孔，必須將所述連接混合物脫鹽。用0．7ml的管制備一個小的柱，在其底部開孔。在所述管的底部填充玻璃球(用水平衡)，并在該管的其余部分填充SepharoseCL6B(用水平衡)。將所述管放入無底1．5ml微量離心管中，以700g的速度離心2分鐘，(2000K，在臺式離心機DenleyBR401上，放置在10ml支撐管中。用一個新管取代所述無底管，并將連接混合物小心加樣到Sepharose的頂部。按上述方法離心所述管2分鐘。洗脫液中含有純化的DNA。將所述連接混合物一半的體積加入40微升電感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，在冰上溫育1-3分鐘，并轉(zhuǎn)移到一個電穿孔樣品池中(BioRad)。電穿孔是用為200的脈沖控制器(BioRad)和設(shè)定為25μF和2．5V的基因脈沖器(BioRad)進行的。加入1mlSOC培養(yǎng)基，并在37℃下培養(yǎng)所述細(xì)胞1小時。將所述懸浮液鋪平板到含有合適抗生素的LB培養(yǎng)基上。對于pBLUESCRIPT載體來說，自身連接的檢驗是通過將轉(zhuǎn)化體鋪平板到LB培養(yǎng)基上進行的，該培養(yǎng)基含有X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基N-乙酰-D-半乳糖酰胺40μg／5ml，Sigma)和IPTG(異丙基硫代半乳糖苷，40μg／5ml，Sigma)。在37℃下培養(yǎng)過夜，然后含有重組克隆的菌落由于質(zhì)粒中所含的半乳糖苷酶基因的失活而呈白色。含有再環(huán)化載體的菌落是蘭色的。載體和引物所使用的結(jié)構(gòu)<tablesid="table6"num="006"><table>載體特征參考pBluescrSK(+)，ampr，colE1復(fù)制起點，f1(+)Stratageneipts在pSPORT1(NotI-SalI)中文庫克隆本研究psyrpsyrBglII-BamHI本研究psyrbbpsyrSacI-EcoRI本研究psyrse將psyr的BhlII-SacI片段克隆到本研究psyr2pBluescript引物特征參考M13(f)5’-GTAAAACGACGGCCAGT-3’StratageneM13(r)5’-GGAAACAGCTATGACCATG-3’Stratagene</table></tables>例18對爪蟾卵母細(xì)胞進行第二次篩選如上文所述，一個單一的克隆psyr當(dāng)其蛋白表達到卵母細(xì)胞中會產(chǎn)生電流。該psyr電流與當(dāng)注射煙草葉片的mRNA或陽性20文庫的cRNA時觀察到的電流的一個重要區(qū)別是在正常Ringer溶液中ABA存在的獨立性。用兩個微電極刺穿注射了50ngcRNA并表達SYR蛋白的卵母細(xì)胞。以大約5分鐘的間隔記錄電壓控制循環(huán)。電壓控制方案包括前脈沖和后脈沖的-120mV的電勢500ms，和8個1500ms的測試脈沖，其范圍為-160mV到+60mV。在緩慢穿刺之后，當(dāng)將所述膜控制在高于-50mV的電壓時，記錄到向外調(diào)整電流。在所述第一個電壓控制周期中測定的電流是最低的，不過在隨后的電壓控制循環(huán)中所記錄到的電流隨著時間而加強。所述向外調(diào)整電流的加強在將膜控制在+60mV時觀察得最清楚，并且在所有測試的細(xì)胞中都記錄到該電流(n=10，使用3個不同批次的卵母細(xì)胞)。在圖22中示出了在穿刺之后一個卵母細(xì)胞在+60mV下電流隨時間的變化。電流的增加表現(xiàn)出平均為20分鐘的估計1／2時間，并且所記錄的最大值為3μA。所述電流似乎存在兩個分量，一個為時間依賴型(在+60mV下t1／2大約為200ms)，和一個瞬時分量。這兩個分量在穿刺以后隨時間而加強。ABA依賴性是明確的，因為所述電流是波動的，并且有時該電流能穩(wěn)定幾分鐘，然后再次開始加強。因此，不可能得出所述電流是ABA依賴型的結(jié)論。為了避免這一問題，對syrcRNA進行稀釋，并注射到卵母細(xì)胞中。將所述cRNA(1μg／μl)稀釋10倍，以大約5ng的量注射到卵母細(xì)胞中。所述卵母細(xì)胞的電壓控制分析表明，仍然出現(xiàn)與注射50ng的量時的相同的電流，但向外調(diào)整電流的增加變慢(再也測定不到t1／2，因為當(dāng)該試驗結(jié)束時電流仍在加強)，在+60mV下記錄到的最大值為1．5μA(ntotal=4)。電流的波動仍然太大，以至于不能記錄到有關(guān)ABA依賴性的結(jié)論性數(shù)據(jù)。同樣注射進一步稀釋(1／100)的syrcRNA(大約0．5ng)，但同樣可以觀察到所述電流，不過在+60mV下的最大值不超過1μA(ntotal=5)。未檢測到ABA依賴性。為了研究SYR蛋白是否與所述20文庫的其它蛋白相互作用，進行了若干共注射。兩種組合如上文所述。一方面，共注射syr的cRNA(1／10)和smG-Nt和cal-Nt的cRNA，另一方面，將syr的cRNA(1／10)與三種未鑒定的蛋白組合。兩種共表達試驗都沒有發(fā)現(xiàn)有關(guān)ABA依賴性的結(jié)論性數(shù)據(jù)，這主要是由于syr注射卵母細(xì)胞中通常見到的背景電流。最后一個組合是用源于最后的ABA反應(yīng)型文庫的所有20個候選物的子文庫進行的。注射20個陽性克隆文庫的5個子文庫，各自與syr基因的cRNA組合。對每個子文庫的至少3個細(xì)胞進行ABA依賴型信號檢測，不過由SYR蛋白表達引起的波動同樣使得其結(jié)論不明確。例18電流特征表明在SYR表達卵母細(xì)胞中激活了內(nèi)源K+通道。為了揭示當(dāng)卵母細(xì)胞表達SYR蛋白時出現(xiàn)的電流加強的性質(zhì)，使用了兩種不同方法。首先分析改變外部離子濃度所導(dǎo)致的平衡電勢變化，另外用毒素抑制特異的離子通道。反向電勢和對外部K+濃度的敏感性第一種方法表示電流和反向電勢對外部離子濃度改變的依賴性。用兩個電極對表達SYR蛋白的卵母細(xì)胞進行穿刺，同時其腔室中填充有正常Ringer緩沖液。在穿刺之后30分鐘，所述電流變得更加穩(wěn)定，而且電流的波動變得更小。此時，采用標(biāo)準(zhǔn)的電壓控制循環(huán)(前脈沖和后脈沖電勢為-120mV，1秒，8個測試脈沖為-160mV到+60mV，3秒)。圖23A表示在[K+]o為2．5mM的正常Ringer緩沖液中進行的標(biāo)準(zhǔn)電壓控制循環(huán)時的電流軌跡。然后將所述水浴溶液中[K]o提高10倍達到25mM。在圖23A中還示出了根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)電壓控制方案的電流軌跡。所述電流對外部[K+]的敏感。時間決定型電流的變化不明顯，但瞬時分量顯著增加，在+60mV下超過兩倍。當(dāng)顯示總的穩(wěn)態(tài)電流的Iv-曲線時這一結(jié)果最為清楚(圖23B)。所述電流增加是可逆的。當(dāng)水浴溶液被改變成正常Ringer時，電流減弱到原始水平。為了確認(rèn)攜帶所述電流的離子，對所述反向電勢進行試驗測定，并與理論計算的K+的平衡電勢進行比較。用Nernst方程(公式3．1)確定的卵母細(xì)胞在正常Ringer溶液中的K+的平衡電勢為-95mV。當(dāng)外部水浴中K+的濃度為25mM時，Ek=-35mV。如圖23B所示，當(dāng)[K+]o從2．5mM改變成25mM時，出現(xiàn)了EK變化的最初跡象。在固定電壓下通過代表性電流值的代入IV-曲線與平衡電勢下的X-軸相交。在正常Ringer條件下的數(shù)據(jù)點的代入IV-曲線與大約-90mV的X-軸相交。在25mVK+中的數(shù)據(jù)點的代入曲線發(fā)生了偏移，因此與X軸線的相交位于大約-40mV處。以上值與在類似條件下計算的相應(yīng)的Ek吻合。為了更精確地測定所述試驗的反向電勢，將表達SYR蛋白的卵母細(xì)胞控制在+50mV的前脈沖電壓下1秒鐘，以便激活所述電流。然后將所述膜逐漸調(diào)整到-160mV到+30mV的電壓范圍內(nèi)。在正常Ringer條件(2．5mMK+)下，在+30mV到-65mV的電壓下所述電流的釋放呈負(fù)走向，而在從-97mV到-160mV的電壓下的所述電流的釋放(拖尾)呈正走向。所述電流在反向電勢下改變方向(參見段落3．3．1)，測定該電勢為-80mV到--97mV(圖24)，與預(yù)測的Ek(-95mV)一致。在[K+]o為25mM的條件下重復(fù)相同的電壓控制方案。在+30mV到-3mV的電壓下所述電流為負(fù)走向，而在-65mV到-160mV的電壓下所述電流為正走向。在-35mV的電壓下，未觀察到明確的放電，因此，所述反向電勢被確定為大約-35mV(圖24)，與預(yù)測的Ek的偏移一致(-35mV)。通過在卵母細(xì)胞中表達SYR蛋白所產(chǎn)生的電流主要是由K+攜帶的。例19抑制電流的毒素用于分析未知電流的方法之一采用了能抑制特異性取決于離子的電流的毒素，所述離子是攜帶電流的。所使用的電流及其有效濃度在表3中示出。表3通道抑制劑<tablesid="table7"num="007"><table>毒素專一性有效濃度來源TEA非常專一的K+通道抑制劑30mMSigmaBa2+可能有副作用的K+通道抑制劑，因為它可能取代Ca2+1mMBaCl3；SigmaNiflumic陰離子通道抑制劑，很不專1mMSigmaacid一，可以部分抑制K+通道Ca2+(N型)通道抑制劑1Alomone實驗室ω-芋螺毒素(耶路撒冷，以色列)</table></tables>藥理學(xué)資料支持以上發(fā)現(xiàn)，即在表達SYR的卵母細(xì)胞中檢測到的電流主要是由K+攜帶的。將各自具有不同專一性的若干種毒素加入水浴中的Ringer溶液中，同時用上文所述的標(biāo)準(zhǔn)電壓控制循環(huán)控制卵母細(xì)胞的膜。記錄電流軌跡的改變，并在圖25中示出。(1)首先將30mM的四乙銨(TEA)加入Ringer溶液中，僅僅改變Na+的濃度。TEA是一種毒素，它能特異性抑制K+通道。所述時間依賴型分量和瞬時分量都降低50％。TEA的作用是可逆的。(2)Ba2+也是一種典型的K+通道抑制劑，但它可能具有某種并發(fā)癥，因為它還能通過取代Ca2+影響Ca2+通道的特征。Ba2+的作用會導(dǎo)致將瞬時分量轉(zhuǎn)化成時間依賴型分量。當(dāng)洗去Ba2+時，可以檢測到完全恢復(fù)。以前業(yè)已披露了來自釀酒酵母(S．cereviciae)的K+通道TOK1的類似現(xiàn)象。當(dāng)在爪蟾卵母細(xì)胞中表達時，TOK1電流顯著向外調(diào)整，并且該電流包括兩個動力學(xué)分量。當(dāng)使用Ba2+時，瞬時分量受到抑制而時間依賴型分量得到加強。(3)所使用的另一種毒素是niflumicacid。這種毒素相當(dāng)?shù)牟粚Ｒ?，它能抑制陰離子通道和K+通道。該毒素還能幾乎100％的破壞在表達SYR的卵母細(xì)胞中檢測到的電流。在將niflumicacid洗去之后，所述減弱可以完全恢復(fù)。(4)在該試驗中所使用的最后一種毒素是ω-芋螺毒素，一種專一性Ca2+通道抑制劑。以前業(yè)已證實，哺乳動物細(xì)胞的突觸融合蛋白與N型Ca2+通道相關(guān)。因此，我們檢驗了該電流是否能被典型的N-型Ca2+通道抑制劑破壞。不過，沒有檢測到其作用，所記錄到的電流與Ca2+通道無關(guān)，這表明哺乳動物細(xì)胞的突觸融合蛋白與煙草的SYR基因具有不同的調(diào)節(jié)。水注射的卵母細(xì)胞為了證實未注射的卵母細(xì)胞是否能夠出現(xiàn)所述電流，在水浴中使用25mM的K+濃度。所產(chǎn)生的電流是瞬時的，未發(fā)現(xiàn)時間依賴型分量。該電流能被niflumicacid破壞。Ba2+具有上文所述的類似作用，能消除所述瞬時電流，并產(chǎn)生時間依賴型電流。TEA的作用不可見，因為電流太小。改變K的濃度和毒素的作用小但明顯，這表明至少瞬時分量對卵母細(xì)胞來說是內(nèi)源電流。另一方面，時間依賴型分量似乎對SYR注射的卵母細(xì)胞專一。這似乎表明，SYR蛋白通過與內(nèi)源K+通道的結(jié)合不僅增強了所述電流的強度，而且改變其動力學(xué)。例20缺失為了避免ABA反應(yīng)喪失問題，用另一種方法檢驗了SYR的作用。進行下面的缺失試驗的目的是為了在從轉(zhuǎn)錄物的文庫中消除SYR基因之后實現(xiàn)ABA反應(yīng)的喪失，所述文庫最初在卵母細(xì)胞中表達時能產(chǎn)生陽性ABA反應(yīng)。通過混合18個克隆的質(zhì)粒DNA重新構(gòu)建20個克隆的最后一個文庫(表1，省略10號和17號)。在另一種制備物中，混合17個克隆的DNA，除了syr基因之外，這些克隆是與以前相同的克隆。用分別被稱為18+S和17-S的新構(gòu)建的類型體外合成cRNA，并注射到卵母細(xì)胞中。在表達之后，進行電壓控制分析，以便檢測ABA反應(yīng)。表達17-S的卵母細(xì)胞未表現(xiàn)電流或膜電壓波動，無論在水浴溶液中有或沒有ABA。表達18+S的卵母細(xì)胞不能像以前那樣表現(xiàn)ABA引發(fā)的信號。再次出現(xiàn)了由SYR引起的電流波動，這一次比較微弱，并延續(xù)幾分鐘，并且在100％的細(xì)胞中都不能檢測到，但僅在4個測定的細(xì)胞中的2個中檢測到，4個細(xì)胞中的3個表現(xiàn)出對ABA的某種反應(yīng)。該反應(yīng)在電壓控制循環(huán)期間在所述電流軌跡中不可見，但對自由流動的膜電勢有弱的去極化作用。該去極化作用在0．5-2mV之間，該電勢是小的，但它是可以再現(xiàn)的，并且對18+S文庫專一。因此，SYR蛋白似乎是傳遞ABA信號所必需的。例21保衛(wèi)細(xì)胞電壓控制保衛(wèi)細(xì)胞的電壓控制技術(shù)的基礎(chǔ)與爪蟾卵母細(xì)胞電壓控制(見上文)的基礎(chǔ)相同。下面將說明有關(guān)腔室和微電極方面的主要技術(shù)差別。將組織安裝在專門設(shè)計的腔室上用于保衛(wèi)細(xì)胞電壓控制試驗的植物是蠶豆或N．benthamiana。蠶豆的生長條件為18℃，并將其生長在蛭石上，給以12∶12的晝夜周期。N．benthamiana植物在20℃下生長給以12∶12小時的晝夜周期，該植物生長在塑料大棚里的土壤上，以便保持高濕度。用4-6周齡植物的幼小葉片制備表皮條。所述條取自葉片的遠軸表面，并安裝在所述腔室上，在腔室上涂有壓敏型硅粘接劑(No．355醫(yī)用粘接劑，DowCorning，Midland，MI，美國)。讓所述膠干燥大約15分鐘，粘接所述表皮條，使外表面向下貼在所述腔室底部。所述腔室底部包括一片顯微鏡載玻片(大約0．5mm厚×7mm寬×40mm長)，具有兩決不銹鋼板連接在每一端。立即用溶解在5mMCa2+MES中的0．1mM氯化鉀覆蓋所述條，并將一塊蓋玻片放在所述溶液的頂部，由所述兩個鋼板支撐。通過用巴斯德移液管將溶液吸到一個小點上實現(xiàn)溶液的流入和抽吸。所使用的標(biāo)準(zhǔn)溶液是5mMCa2+MES和10mM氯化鉀。通過穿越所述鋼板之一的一個孔施加裝在一個管中的瓊脂(2％)鹽(1M氯化鉀)橋，并起著水浴電極的作用。所使用的顯微鏡是ZeissIM倒置顯微鏡(Zeiss，Oberochen，F(xiàn)RG)。微電極電極是用具有三角形截面的毛細(xì)管硼硅玻璃拉制而成，其壁厚為0．25mm，總體截面直徑為1．2mm(Dial玻璃制品，Stourbridge，WestMidlands，英國)。用水平拉伸儀拉伸所述電極(Narashige科學(xué)儀器實驗室，東京，日本)。通過加熱大約30秒時兩個毛細(xì)管軟化，然后就可以通過360℃纏繞。為了拉伸融合的毛細(xì)管，施加最初的弱的傳感拉伸力，直到毛細(xì)管被拉伸到預(yù)定的長度為止，接著進行第二次較強烈的最終拉伸。此時關(guān)閉用于加熱線圈的電流，讓玻璃在拉伸狀態(tài)下冷卻。用200mM乙酸鉀(pH7．55)填充該電極的導(dǎo)電和電壓記錄管。使用與所述卵母細(xì)胞電壓控制相似的半電池，不過在這種電池中填充的是1M氯化鉀。C和D型肉毒桿菌毒素為了檢測肉毒桿菌C毒素的作用，在所述保衛(wèi)細(xì)胞內(nèi)添加毒素(BotN／C或BotN／D作為對照)內(nèi)肽酶(Sigma)。所述毒素包含在所述電流注射電極的填充溶液中，并讓該溶液在刺穿細(xì)胞之后擴散20分鐘時間進入細(xì)胞。然后，檢測該細(xì)胞的ABA反應(yīng)，同時控制其膜處于不同的電壓。BotN／C和BotN／D使用100nM的標(biāo)準(zhǔn)濃度。例22Southern雜交DNA制備用按上述方法生長的煙草，在20℃下生長在土壤上、晝夜周期為1212的N．benthamiana，和在22℃下生長在土壤上、晝夜周期為168的擬南芥制備DNA。植物DNA制劑是用5克重量的新鮮組織制備的，用研棒和研缽充分磨碎所述組織，同時在液氮中冷凍。將粉碎的組織轉(zhuǎn)移到裝有15ml提取緩沖液(100mMTris-HCl，pH8．0，50mMEDTA，pH8．0，500mM氯化鈉，10mM巰基乙醇)的30ml體積的異丙烯管中。加入1．2ml的20％SDS，在充分混合之后將所述試管放在65℃下保持10分鐘。加入5ml的5M乙酸鉀，并輕輕搖動所述試管，在冰上溫育20分鐘。大部分蛋白和多糖以與不可溶的十二烷基鉀的沉淀物的復(fù)合體形式被除去。在SS34轉(zhuǎn)子(12000g，Sorvall)上以10，000rpm的速度對所述試管進行離心，并用Mirecloth濾膜過濾上清液。為了澄清上清液，在一個新的試管(50ml)中加入10ml異丙醇。可以用一個灼燒過的巴斯德移液管纏繞沉淀的DNA。讓DNA在巴斯德管上干燥，并將沉淀溶解在3ml水中。添加20μlRNase(10mg／ml)，在37℃下溫育DNA30分鐘。通過用1．5ml苯酚和1．5ml氯仿提取進一步純化所述DNA。以5000g的速度離心15分鐘，然后除去水相，并按上述方法用3ml氯仿提取。用0．8×體積的異丙醇和0．2×體積的3M乙酸鈉使DNA沉淀。再次將DNA纏繞在巴斯德移液管上，在70％乙醇中洗滌，干燥并溶解在100μl體積中。通過將10μlDNA溶液稀釋在990μl水中并在260nm波長下測定0D值確定DNA濃度。使用以下?lián)Q算系數(shù)計算DNA濃度1．0的A260=50μg／mlDNA。將DNA吸印到濾膜上用合適的限制性內(nèi)切酶消化待檢測的DNA，并通過在瓊脂糖凝膠上電泳分離。一旦在紫外線透射儀上對所述凝膠進行照相，即可將多余的凝膠切掉，將DNA吸印到膜上。通過切掉所述凝膠的左下角對凝膠進行定向。首先通過在0．25MHCl中處理15分鐘對瓊脂糖凝膠中的DNA進行脫嘌呤，并在水中漂洗。吸印裝置包括具有200ml0．4MNaOH的水浴，用玻璃板覆蓋。切割兩個預(yù)先濕潤的3MM濾紙(Whatmann)，并掛在所述玻璃板的邊緣，浸入所述溶液中，并起著吸紙的作用。將所述凝膠放置(上面向下)到所述吸紙上，確保在里面沒有氣泡，因為氣泡會妨礙DNA的轉(zhuǎn)移。將具有凝膠大小的一片尼龍膜(吸印薄膜，BDH)放在凝膠表面，并通過用玻璃移液管滾壓除去氣泡。所述吸紙的沒有被凝膠覆蓋的部位用塑料膜密封。將兩張預(yù)先浸泡的3MM紙切成凝膠的大小，并放在所述濾膜底部，接下來是5-10cm高的吸水紙巾，一塊玻璃板和500克的重物。讓所述轉(zhuǎn)移進行移液。將脫水的凝膠和濾膜小心翻轉(zhuǎn)，并使凝膠一側(cè)向上，以便用鉛筆標(biāo)記吸印在濾膜上的槽的位置。用2×SSC(1×SSC=0．15MNaCl，0．015M檸檬酸三鈉)洗滌所述濾膜，并在3MM紙上風(fēng)干1小時。然后將所述濾膜包裝在塑料薄膜中，并通過將所述濾膜放置在紫外線透射儀上使DNA與所述薄膜交聯(lián)，使DNA一側(cè)向下，2-3分鐘。探針標(biāo)記用作模板的DNA片段是用Boehringermannheim“瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒”(第六章)從瓊脂糖凝膠中純化的。將50ng片段溶解在34μl水中，并通過煮沸5分鐘變性，并在冰上快速冷卻。向所述DNA中添加10μl試劑混合物(PharmaciaOligo標(biāo)記試劑盒)、1μlKlenow酶(PharmaciaOligo標(biāo)記試劑盒)和5μl32PdCTP(Amersham)。在37℃下溫育該反應(yīng)混合物1小時。然后，從游離標(biāo)記物中純化所述探針，所述柱是用0．7ml的管制備的，在其底部開有一個孔。用玻璃珠填充所述管的底部(用水平衡，并用SepharoseCL6B(Pharmacia)填充所述管的其余部分。同樣用水平衡。將所述管放在一個無底的1．5ml微量離心管中，并以700g的速度離心2分鐘(在臺式離心機DenleyBR401上，2000rpm，將所述管放在10ml管中以便支撐)。用一個新的試管代替所述無底管并將所述探針混合物小心加樣到Sepharose的頂部。按上述方法對所述管進行離心2分鐘。洗脫液含有純化的DNA探針。然后通過煮沸5分鐘并在冰上快速冷卻使探針變性。雜交用于雜交的濾膜首先在65℃下預(yù)雜交2小時(預(yù)雜交緩沖液包括6×SSC，5×Denhardt’s(起著抑制劑的作用)和0．1％SDS+100μg／ml變性精子DNA。在預(yù)雜交之后，棄緩沖液，并添加新的雜交緩沖液6×SSC，0．1％SDS，5×Denhardt’s+變性的探針，雜交在65℃下進行至少16小時，除非另有說明。然后洗滌所述濾膜，以便消除背景。洗滌在65℃下用2×SSC進行兩次10分鐘(除非另有說明)。然后在-70℃下在一個裝有增感屏(杜邦Cronexlightingplus，或富士高速X)的盒中讓所述濾膜對X-光膠片(柯達XAR-5；IB165-1678)曝光。曝光時間取決于用一個小型監(jiān)測儀測定的所述濾膜上的放射性強度。在所述估計的時間(通常為12小時至5天)之后，對所述X-光膠片進行顯影。例23Northern雜交用于Northern吸印的RNA是按上述方法純化的mRNA或按下述方法純化的總RNA。所使用的所有水溶液都是用DEPC預(yù)處理過的(0．001％)，將其加入所述溶液中，在室溫下溫育過夜，并在120℃和1巴壓力下高壓滅菌20分鐘。不能用DEPC處理的Tris溶液是用DEPC處理過的水制備的，并按上述方法高壓滅菌。所使用的所有塑料材料直接購自生產(chǎn)商，并僅僅用一次性手套操作。用研缽和研棒將5克新鮮組織重復(fù)勻漿，并在液氮中保持冷凍。將所述粉末轉(zhuǎn)移到裝有15ml提取緩沖液(100mMTris-HCl，pH9．0，200mMNaCl，5mMDTT，1％十二烷基肌氨酸鈉，20mMEDTA)的新的50ml一次性試管中，并搖動直到所述粉末解凍并懸浮為止。將7ml苯酚和7ml氯仿加入該混合物中，倒轉(zhuǎn)該試管幾分鐘，并在一個臺式離心機(DenleyBR401)上以3000rpm(4000g)的速度離心10分鐘。測定水相的體積，并以2M的終濃度添加氯化鋰(母液為10M的氯化鋰)，混合該溶液，并在一個用石蠟?zāi)じ采w的cotlex管中在4℃下溫育過夜。然后在SS34轉(zhuǎn)子(Sorvall)上在4℃下以10000rpm(12000g)的速度離心10分鐘。除去上清液，并用2ml的2M氯化鋰洗滌沉淀兩次，并按上述方法離心。將RNA最終溶解在不含RNase的水中。通過將10μl的RNA溶解在990μl水中，并通過在260nm波長下測定OD值確定RNA的濃度。所述濃度是用下列轉(zhuǎn)換系數(shù)計算的1．0的A260=50μg／mlRNA。將RNA從甲醛凝膠上轉(zhuǎn)移到濾膜上將待檢測的RNA加樣到含有甲醛的凝膠中，所述凝膠是用1．2克瓊脂糖制備的，將所述瓊脂糖在微波爐中熔化于75ml水中。當(dāng)所述溶液冷卻到大約50℃時，將50ml10×MOPS(10×MOPS0．4MMOPS，0．5MEDTApH8，50mM乙酸鈉)和15ml甲醛加入。攪拌該混合物并注入凝膠盤中。與此同時制備加樣樣品將16μl加樣染料(100μlMOPS，350μl甲醛，1ml甲酰胺，200μl加樣混合物(加樣混合物50mg溴酚蘭，5gficoll400，溶解在20ml體積中)加入200μgmRNA和15μg總RNA中，并在65℃下讓所述RNA變性10分鐘。然后讓所述樣品冷卻，并加樣到所述凝膠上。電泳之后，通過在紫外線透射儀上對所述凝膠照相和切掉凝膠上的空閑泳道和左下腳用于制備吸印的凝膠。在2×SSC中漂洗所述凝膠，并按照Southern吸印方法將RNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜(吸印膜BDH)上，所不同的是用于Northern吸印(RNA)的轉(zhuǎn)移緩沖液是10×SSC。在轉(zhuǎn)移過夜之后，在2×SSC中漂洗濾膜，并在3MM紙上風(fēng)干1小時。然后將所述濾膜包裝在塑料膜中，并通過將所述濾膜放在紫外線透射儀上讓RNA與所述膜交聯(lián)，使RNA一側(cè)向下，2-3分鐘。所述濾膜可用于雜交。探針的標(biāo)記和雜交條件與Southern雜交的相同。例24Western雜交肽的選擇第一個肽SP1包括SYR氨基酸序列的13個氨基酸長度抗原性片段。因為該肽的體形較小，將其綴合在匙孔嘁血藍蛋白(KLH)上。KLH通常被用作肽載體蛋白，并且基本上沒有抗原性。所述肽綴合物是從Pacemaker(Exeter，英國)訂購的。肽KLH-CGPGSSSDRTRTS為了純化第二種肽SP2，選擇Quiagen的Qiaexpress系統(tǒng)。所述肽純化機制包括三個主要步驟(1)將一個核苷酸序列片段克隆到所述表達載體上，(2)表達所述肽和(3)純化所述肽。(1)通過PCR純化SYR的親水性部分。制備兩個引物。第一個引物是STX1，它是為了在轉(zhuǎn)錄位點對SYR的反義鏈進行退火而專門設(shè)計的，其前面是BamHI限制性消化識別位點。第二個引物是STX2，它是為了在所述SYR序列的親水性部分的C-末端區(qū)對SYR序列的有義鏈退火而專門設(shè)計的，其后面是一個終止密碼子TAA和一個EcoRI識別位點。PCR條件是標(biāo)準(zhǔn)的，PCR反應(yīng)緩沖液5mM氯化鎂，100mM氯化鈉，10mMTris-HCl(pH8．4)(Biolabs)，添加每一種引物20μM，每一種dNTP各0．25mM，和2單位的TaqI(Biolabs)。所使用的模板是1ng／μlpsyr(質(zhì)粒制備)。反應(yīng)條件為96℃30秒，然后是96℃30秒，55℃30秒和72℃1．5分30輪次，接著最后一步是在72℃下5分鐘。對PCR片段進行凝膠純化(Boehringermannheim“瓊脂糖凝膠DNA提取試劑盒”)，并用BamHI和EcoRI消化產(chǎn)生粘性末端。在sepharoseCL6B柱上純化所述片段(與探針純化相同)，然后即可將所述片段連接到預(yù)先用BamHI和EcoRI消化過的表達載體pQE-30(氨芐青霉素抗性)上(連接和轉(zhuǎn)化是按上述方法進行的)，得到新的結(jié)構(gòu)pQES(圖7．1)。因此，pQES載體在SYR片段前面的讀框內(nèi)含有編碼6個組氨酸殘基的密碼子，在克隆片段的上游是T5啟動子，該啟動子可以用IPTG誘導(dǎo)。還存在兩個lac操縱子序列，該序列能加強lac抑制阻遏物結(jié)合并確保在沒有IPTG的條件下有效抑制T5啟動子。在克隆片段的下游是導(dǎo)入的翻譯終止密碼子和兩個強的轉(zhuǎn)錄終止子t0和T1，以便避免連讀轉(zhuǎn)錄并確保所述表達結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。用所述結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株M15[pREP4]。該菌株含有具有l(wèi)ac阻遏物的質(zhì)粒pREP4(卡那霉素抗性)，以便調(diào)節(jié)并抑制T5啟動子。選擇大腸桿菌菌株M15菌株是為了進行蛋白的高水平表達。(2)為了表達所述蛋白，用M15[Rep4][pQES]接種10mlLBAmp(100μg／ml)、Km(25μg／ml)，并在37℃下溫育過夜。將10ml稀釋到預(yù)熱的500mlLBAmpKm中，并且在37℃下溫育4小時之后加入2mMIPTG。在4小時之后通過離心收集細(xì)胞。(3)為了純化所述肽，首先裂解細(xì)胞，然后讓可溶性組分通過Ni2+柱，以便分離所述肽。將沉淀物溶解在14ml(4ml／g濕重)超聲緩沖液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，pH8)中。將所述樣品在-20℃下冷凍過夜。在冷水中讓所述樣品解凍，然后在冰上用SONIPREP150(MSE，Leicestershire，英國)進行超聲處理5次，每次1分鐘，波長為20微米，直到細(xì)胞被裂解。為了降低該溶液的粘度，通過用針頭抽吸和排出沖洗的方式將RNA和DNA斷開。在SS34轉(zhuǎn)子(Sorvall)上在4℃下以9500rpm(10000g)的速度離心該懸浮液20分鐘。將上清液收集在一個新的試管中。同時用超聲緩沖液平衡Ni2+-樹脂。通過在臺式離心機(DenleyBR401)上以500-600rpm的速度離心1-2分鐘收集4mlNi2+-樹脂。傾出上清液，并用4ml水洗滌3次，用4ml超聲緩沖液洗滌3次。將用4ml超聲緩沖液平衡的樹脂加入所述裂解物中，并在冰上輕搖1小時。收集Ni2+-樹脂和結(jié)合的肽，并總共用100ml洗滌緩沖液(50mM磷酸二氫鈉，300mM氯化鈉，10％甘油，pH8)充分洗滌，直到A280低于0．01。將所述樹脂注入一根柱中(直徑1cm，5ml聚丙烯一次性柱，Qiagen)，并用梯度洗脫緩沖液洗脫所述肽洗滌緩沖液為pH6到pH4．25。收集1ml的組分，并在SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)上檢測。將購買的(SP1)和純化的(SP2)肽分別注射到UKC動物飼養(yǎng)場的兩只兔子體內(nèi)(肯特大學(xué)，Canterbury)，4周以后采集血清，并對所述兔子進行第二次注射。2-3周之后第二次采血，然后對所述兔子第三次注射，并在2周之后將所述兔子宰殺同時收集血液。SDS-PAGE和Western印跡用SDS-PAGE分析蛋白。凝膠是用Mini-proteanII電泳儀(BioRad，Hertfordshire，英國)制備的。該系統(tǒng)提供有說明書。所述凝膠包括兩個部分，分離凝膠和堆積凝膠，該凝膠是在用1mm厚的墊片隔開的兩個玻璃板之間制備的。先注入分離凝膠(12％丙烯酰胺，0．375MTris-HCl(pH8．8)，0．1％SDS，0．1％APS(過硫酸銨)和0．04％TEMED)，并在凝固之后注入堆積凝膠(5％丙烯酰胺，0．125MTris-HCl(pH6．8)，0．1％SDS，0．1％APS(過硫酸銨)和0．1％TEMED)，在其頂部放置一個梳于以便形成槽。將所述樣品溶解在50μlSDS凝膠加樣染料(50mMTris-HCl(pH6．8)，2％巰基乙醇，1％SDS，0．05％溴酚蘭，5％甘油)中煮沸5分鐘并加樣。電泳是在電泳緩沖液(25mMTris-HCl，250mM甘氨酸和0．1％SDS)中在100V的恒定電壓下進行大約45分鐘。當(dāng)所述凝膠不是用于Western雜交時，用考馬斯蘭染色溶液(0．1％考馬斯蘭R-250(BioRad)，溶解在40％甲醇和10％乙酸中)固定染色30分鐘。在用40％的甲醇和10％的乙酸脫色之后所述蛋白帶變得可見。將所述凝膠放在兩個cellophane板之間干燥，首先在10％甘油中與所述凝膠一起平衡，然后固定在一個支架上。為了將蛋白從凝膠上吸印到硝酸纖維素膜上進行Western雜交，在電泳之后，將所述凝膠和膜一起浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液(25mMTris-HCl，192mM甘氨酸和20％甲醇)中15分鐘，然后將兩張3MM濾紙剪成凝膠的大小。吸印是用Mini電轉(zhuǎn)移印跡槽(BioRad)進行的。將所述凝膠擠入盒式固定裝置中，讓預(yù)先浸泡過的膜緊挨著它，在每一面放置一張3MM的濾紙，最后在外面放置預(yù)先浸泡過的纖維墊。通過以100V的電壓電泳1小時將蛋白從凝膠上轉(zhuǎn)移到所述膜上。通過用麗春紅(BioRad)對所述膜進行染色檢測所述蛋白印跡，所述染料能夠?qū)Φ鞍走M行染色。用自來水洗滌所述印跡。Western雜交在與抗體雜交之前，用1×TBS(0．15M氯化鈉，3mM氯化鉀，25mMTrispH7．4)和5％Marvel(奶粉)封閉所述膜1小時?？贵w雜交是在添加了0．1％Tween和0．1％疊氮化物的相同緩沖液(1×TBS，5％Marvel)中進行的，并與用兔子制備的抗體雜交過夜，該抗體的估計濃度為1ng／μl。然后將抗體溶液傾出，并保存在冰箱中直到使用。用1×TBS和0．1％Tween溶液洗滌三次，添加與堿性磷酸酶(Sigma)綴合的第二種抗體(抗兔山羊抗體)，以便與第一種雜交。第二次雜交是在1×TBS，5％Marvel和0．1％Tween中進行2小時。將抗體溶液傾出，并用1×TBS和0．1％Tween洗滌三次。通過在顯影溶液(10mMTris-HClpH9，25mM氯化鎂，2mM氯化鈉，200μg／mlNBT(氮蘭四唑)和200μg／mlBCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚))中對所述膜進行染色觀察第二種抗體。顯影一直進行到所述帶出現(xiàn)，然后用水徹底洗滌所述膜。例25酵母轉(zhuǎn)化酵母轉(zhuǎn)化是用已知技術(shù)進行的。在28℃下讓0．5ml的培養(yǎng)基生長過夜，并在微量離心管中離心10秒讓細(xì)胞沉淀。將上清液傾出并將1μg的轉(zhuǎn)化DNA加入沉淀中。對該混合物進行渦旋攪拌，加入0．5mlPEG／乙酸鋰／TE(40％PEG4000，0．1M乙酸鋰，10mMTris-HClpH7．5，1mMEDTA)并再次渦旋攪拌。在室溫下溫育該混合物過夜，并將50μl混合物直接鋪展在選擇平板上。用于酵母的培養(yǎng)基是YPG(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％半乳糖)，YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨和2％葡萄糖)和SG(有半乳糖的合成基礎(chǔ)培養(yǎng)基0．67％酵母氮堿，2％半乳糖)，有或沒有尿嘧啶(20μg／ml)、腺嘌呤(20μg／ml)、色氨酸(20μg／ml)、組氨酸(20μg／ml)或亮氨酸(30μg／ml)。所使用的載體是pMAT1，它是含有啟動子PGK1(磷酸甘油酸激酶)并含有LEU2選擇基因的高拷貝表達質(zhì)粒。例26從酵母中提取膜蛋白將釀酒酵母菌株接種到2ml加富YPG培養(yǎng)基中，并在28℃下培養(yǎng)過夜。將該培養(yǎng)物的200μl樣品稀釋到100mlYPG中，并在28℃下再次培養(yǎng)至少20小時。以1000g的速度離心5秒鐘(2500rpm，Denley臺式離心機)使所述細(xì)胞離心沉淀，并將沉淀物溶解在蛋白提取緩沖液(10mMEDTA，100mMTris(pH8)，400μMPMSF)中，并放在冰上。加入等體積的玻璃珠(直徑0．5mm)，并渦旋攪拌該混合物3次，每次1分鐘，間隔1分鐘。裂解所述細(xì)胞后，用10mlGTED20(20％甘油，1mMEDTA，1mMDTT，10mMTris(pH7．6))稀釋粘稠的溶液。在4℃下以1000g的速度離心10秒鐘(2500rpm，Denley臺式離心機)使所述玻璃珠和細(xì)胞碎片沉淀。小心將上清液傾出，并通過在4℃下以16000rpm的速度離心(SamIg，SS-34，Sorvall上)使所述膜沉淀。在處理了上清液之后，將膜沉淀溶解在0．5mlGTED20中，確保蛋白濃度大約為5μg／μl。將蛋白提取物于-20℃下保存。例27肉毒桿菌C毒素減弱保衛(wèi)細(xì)胞中的ABA信號為了測定突觸融合蛋白相關(guān)蛋白與植物中ABA信號反應(yīng)途徑的關(guān)系，用肉毒桿菌C毒素(BotN／C)剔除所述蛋白。BotN／C裂解位點在突觸融合蛋白1蛋白中是非常保守的，它存在于靠近疏水性C-末端的5個氨基酸上(圖27)。BotN／C能通過另外兩個結(jié)構(gòu)域X1和X2識別突觸融合蛋白，這兩個結(jié)構(gòu)域位于所述氨基酸序列的上游。X1和X2基序包括9個氨基酸，構(gòu)成一種螺旋型結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生一個具有3個負(fù)電荷的表面，該表面與由疏水性殘基構(gòu)成的表面相鄰(圖27)。由于X1、X2的保守性和所述裂解位點的部分保守性以及總體保守的三級結(jié)構(gòu)(圖27)，肉毒桿菌C毒素很可能切入SYR蛋白。BotN／D能消化VAMP，而不能消化突觸融合蛋白1A型分子，用它作為對照。在添加ABA時保衛(wèi)細(xì)胞關(guān)閉，而在其它過程中保衛(wèi)細(xì)胞的關(guān)閉是通過增加陰離子的流出和K+流入抑制而介導(dǎo)的。在有ABA的條件下，并且有或沒有BotN／C和BotN／D的條件下研究了這兩種特征的修飾性反應(yīng)。用膜電壓控制分析BotN／C和BotN／D的作用。該試驗是用N．benthamiana的保衛(wèi)細(xì)胞進行的，并且還用蠶豆檢驗了ABA對向內(nèi)調(diào)整的K+的減弱作用。在使用BotN／C時，ABA不能增強N．benthamiana中的陰離子電流刺穿N．benthamiana的保衛(wèi)細(xì)胞，以便分析ABA反應(yīng)。為了測定陰離子電流，在Ca-MES緩沖液中用15mMTEA-Cl和15mM氯化銫以化學(xué)方法消除K+電流。圖28表示在對保衛(wèi)細(xì)胞進行電壓控制將膜的電壓控制在-230mV到+30mV之間7秒鐘時記錄到的電流軌跡。在測試脈沖之前是一個+30mV5秒鐘的調(diào)節(jié)脈沖(在圖中未示出)。未處理的(對照)細(xì)胞在ABA的作用下表現(xiàn)出瞬時陰離子電流的較大增加。不過，所述電流的穩(wěn)態(tài)也會改變，該圖中更難于分析(圖28)。當(dāng)將BotN／C注射到所述細(xì)胞中時ABA不起作用，在ABA處理的至少6分鐘時間內(nèi)沒有記錄到陰離子電流的改變(圖28)。不過，當(dāng)用BotN／D注射細(xì)胞時檢測到ABA對瞬時電流的增強(圖28)。在圖29中示出的IV曲線比較了在用或不用肉毒桿菌毒素處理所述細(xì)胞時ABA對陰離子電流的瞬時點(左)或穩(wěn)態(tài)點(右)的影響。瞬時IV曲線源于在圖28中測試脈沖開始時的點。在-170mV電壓下，ABA對對照細(xì)胞的瞬時IV曲線的影響使電流增加4倍(圖29A，左)。選擇用于繪制穩(wěn)態(tài)陰離子電流的IV曲線的電流點是選擇圖28中7秒時間的測試脈沖結(jié)束時。對照細(xì)胞表現(xiàn)出由ABA導(dǎo)致的電流增強(圖29A，右)。在0mV左右和高于0mV電壓下測定的電流的傾斜的導(dǎo)電性有所增強。在低于-50mV電壓下在不同細(xì)胞之間的電流波動很大。穩(wěn)態(tài)電流的這種ABA作用與ABA誘導(dǎo)的瞬時相關(guān)。與未處理過的細(xì)胞相比，BotN／C處理過的細(xì)胞，ABA對瞬時或穩(wěn)態(tài)陰離子電流不會產(chǎn)生任何影響(圖29B)。BotN／D處理過的細(xì)胞表現(xiàn)出ABA對瞬時陰離子電流的影響，在-170mV下的電流比對照細(xì)胞增加了4倍(圖29C左)。ABA對BotN／D處理過的細(xì)胞的作用在所述陰離子電流的穩(wěn)態(tài)階段也可以觀察到。在0mV和高于0mV電壓下記錄到所述傾斜導(dǎo)電性的增強(圖29右)。統(tǒng)計分析表明，通過注射BotN／C而不是BotN／D一般可以減弱ABA對保衛(wèi)細(xì)胞的影響。選擇-170mV下的瞬時電流值進行分析。在ABA誘導(dǎo)電流加強之后的最大值對在添加ABA之前由電壓控制周期測定的電流值進行校正。所測定的所述細(xì)胞的平均的最大增加在圖30中示出。當(dāng)所述細(xì)胞不用肉毒桿菌毒素處理時，ABA誘導(dǎo)的電流增加3．5倍(n=3)。BotN／C能破壞對瞬時陰離子電流的加強，導(dǎo)致無(1倍)加強(n=6)。當(dāng)用BotN／D注射保衛(wèi)細(xì)胞時，所述加強作用與對照細(xì)胞(n=2)相當(dāng)(3倍)。在N．benthamiana中BotN／C破壞由ABA介導(dǎo)的IK，in抑制用雙管電極刺穿N．benthamiana的保衛(wèi)細(xì)胞，以便在標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(5mMCa2+MES和10mM氯化鉀)中進行膜的電壓控制。為了測定向內(nèi)調(diào)整的K電流，電壓控制方案包括1秒鐘的-100mV的前脈沖，和8個4秒鐘的測試脈沖，其范圍為-230mV到+30mV。圖31表示該方案的4個最低測試電壓的電流軌跡。在未處理過的對照細(xì)胞中，在-120mV更偏負(fù)一些的電壓下記錄到的向內(nèi)調(diào)整的K+電流受ABA的抑制。不過，當(dāng)把BotN／C注射到所述細(xì)胞中時，在6分鐘內(nèi)沒有觀察到由ABA導(dǎo)致的向內(nèi)調(diào)整電流的差別。不過，當(dāng)使用BotN／D時，向內(nèi)調(diào)整的電流能對ABA做出正常反應(yīng)，導(dǎo)致電流的抑制。分析了所述向內(nèi)調(diào)整器的穩(wěn)態(tài)電流，并在圖32中示出。所述穩(wěn)態(tài)是在測試脈沖結(jié)束時選擇的，并通過扣除在即將開始步進脈沖之前記錄到的瞬時電流調(diào)整其泄露。在正常對照細(xì)胞中，向內(nèi)的時間和電壓依賴型K+電流在-230mV下由于ABA的作用能受到大約40％的抑制(圖32A)。不過，用BotN／C處理過的細(xì)胞對添加ABA沒有反應(yīng)。在沒有和有ABA的條件下IK，in的IV曲線實際上相同(圖32B)。用BotN／D處理過的細(xì)胞的IV曲線表現(xiàn)出與對照細(xì)胞的IV曲線的相似的抑制作用。當(dāng)使用ABA時，在-230mV下記錄到IK，in的抑制作用大約為30％(圖32C)。在圖33中示出了IK，in的最大抑制的統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)字表示在-200mV下的向內(nèi)K+電流的ABA誘導(dǎo)值的平均值±SE以在添加ABA之前的IK，in校正。在未處理過的細(xì)胞中由ABA造成的平均IK，in抑制值大約為原始電流的46％(n=5)。對于BotN／C處理的細(xì)胞(n=7)來說所述抑制作用不顯著(95％)。對于BotN／D處理的細(xì)胞(n=3)和對照細(xì)胞來說，電流的抑制在標(biāo)準(zhǔn)誤(45％)之內(nèi)是相同的。在蠶豆中BotN／C破壞由ABA介導(dǎo)的IK，in抑制在蠶豆上重復(fù)測定BotN／C對IK，in的ABA敏感性的作用。用與上述方法相同的方案對保衛(wèi)細(xì)胞的膜進行電壓控制，以便測定向內(nèi)調(diào)整的K+電流前脈沖-100mV1秒，8個4秒的測試脈沖在-230mV到+30mV之間。通過扣除所述測試脈沖的瞬時電流對在-200mV下的穩(wěn)態(tài)電流值進行泄露電流調(diào)整。將ABA中的電流以在添加ABA之前相同電壓的穩(wěn)態(tài)電流進行校正。在圖34中將校正值與添加ABA之后的時間作圖，同時對來自對照細(xì)胞的數(shù)據(jù)作圖(同樣參見Blatt，1990和Thiel，1992)。在300秒之后對照細(xì)胞表現(xiàn)出大約80％的抑制作用。在添加ABA之后BotN／C處理過的細(xì)胞的平均值沒有出現(xiàn)顯著變化。以上結(jié)果表明BotN／C在所有植物中普遍起作用。例28抗體為了檢測BotN／C毒素對細(xì)胞膜的作用是否是由BotN／C裂解SYR蛋白所致，必須制備抗體以便在Western印跡上檢測SYR?？贵w最初通過兩種肽制備的(如上文所述)。用合成肽SP1進行的Western印跡肽SP1是從SYR蛋白中選擇的115-127號氨基酸。預(yù)計該片段具有高度的抗原性和親水性，并且具有很高的表面可能性，該預(yù)測是用Lasergene(DNA*)的PORTEAN程序完成的。將SP1與KHL蛋白的綴合物注射到兩只兔子體內(nèi)(肯特大學(xué)，Canterbury，英國)。在第一次、第二次和第三次SP1-KHL注射2-3周之后從每一只兔子上采集血清樣品，檢測其對肽SP1-KHL的識別和SYR蛋白在酵母中的表達(參見下文)。用SP1-KHL和SYR都沒有檢測到反應(yīng)，因此，抗體是針對第二種肽產(chǎn)生的。純化SP2通過PCR擴增編碼SYR蛋白的完整親水性部分的DNA序列。由此在該片段的末端產(chǎn)生兩個限制性內(nèi)切酶識別位點BamHI和EcoRI，以便能夠?qū)⑵淇寺〉奖磉_載體pQE30(Quiagen)上，位于強IPTG誘導(dǎo)型啟動子(T5)的后面，得到pQES，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株M15[pREP4](圖26)。當(dāng)在含有所述肽的前6個組氨酸殘基的液體LB培養(yǎng)物中生長時，IPTG能表達SYR肽SP2，這使得所述肽能結(jié)合到用于純化該肽的Ni2+的樹脂上，通過將所有其它蛋白洗去進行純化。從所述樹脂上洗脫純化的SP2。將在表達和純化期間來自所有不同組分的樣品加樣到SDSPAGE上。并用考馬斯蘭染料染色(圖35A)。含有SP2的樣品仍然含有某些污染性的大腸桿菌蛋白(在圖35A中為弱的蘭色帶)，有可能產(chǎn)生針對這些蛋白的抗體，不過由于是將抗體混合物用于酵母，所述抗體不可能產(chǎn)生影響。將SP2樣品注射到位于UKC的兩只兔子體內(nèi)。SP2的Western印跡在SDSPAGE上對兩種濃度(5ng和50ng)的肽SP2重復(fù)進行變性，并吸印到硝酸纖維素濾膜上。然后讓所述濾膜與所述兩只兔子的免疫前的血清、第一次取得血、第二次取得血和最后一次取得血雜交。免疫前的血清絕不會出現(xiàn)與肽SP2的任何交叉反應(yīng)(圖35B)。在第一次注射SP2到兩只兔子中之后的所有血樣都與所述肽發(fā)生交叉反應(yīng)。圖10B表示當(dāng)SP2與所述兔子之一的第二個血樣雜交時可以觀察到的帶。所述帶的強度與肽SP2的濃度相關(guān)，在50ng下的雜交比在5ng下的雜交強，這表明所述抗體的專一性。例29在體外BotN／C不能消化SYR為了檢驗BotN／C是否能裂解SYR蛋白，設(shè)計了一種生化反應(yīng)。用超量表達SYR的WT釀酒酵母菌株(W303-1A)制備膜蛋白提取物(Rothstein，1983)。在實際裂解反應(yīng)之前，在37℃下在10mMDTT中對肉毒桿菌毒素進行減毒30分鐘，必須用該步驟來使兩條鏈解開。在體外試驗中，負(fù)責(zé)穿透細(xì)胞的較大的鏈不重要。是所釋放的現(xiàn)在有活性的小的鏈?zhǔn)沟盟龆舅乜捎糜谕挥|融合蛋白的裂解。如果在體外BotN／C毒素能消化SYR蛋白，在Western印跡上將會出現(xiàn)SYR帶從34kD改變成30kD。反應(yīng)條件的制備與前面報導(dǎo)的體外BotN／C試驗相似。所述條件為15mM氯化鈉，5mM氯化鎂，5mM硫酸鋅，1mMDTT，1mMEDTA和10mMTrispH7．6，以及100nM的毒素BotN／C和BotN／D。所述反應(yīng)在37℃進行4小時。在SDSPAGE上分離大約20微克蛋白，吸印到一個濾膜上，并與抗SYR抗體雜交。圖36B表示該Western印跡。沒有出現(xiàn)預(yù)期的一條SYR蛋白帶，而是當(dāng)SYR在酵母菌株W303-1A中表達時檢測到4條帶。不過，所有4條帶都與SYR相關(guān)，因為這4條帶沒有一個出現(xiàn)在沒有SYR表達質(zhì)粒的相同菌株的蛋白膜提取物中，或者沒有一個是由免疫前的血清識別的，如該圖的圖A(圖36A)所示。所述4條帶中的最小的一條與SYR蛋白的預(yù)測大小相當(dāng)(34kD)。其它的較大的帶有可能具有某些修飾。如圖36B所示，在所使用的條件下，BotN／C不能夠裂解SYR，因為沒有檢測到4條帶中任一條的改變。正如所預(yù)料的，BotN／D也不能消化SYR蛋白。例30SYR同樣存在于N．benthamiana由于用肉毒桿菌毒素進行的保衛(wèi)細(xì)胞電壓控制試驗是用N．benthamiana植物來做的，檢查該植物中是否存在煙草SYR基因。通過Southern雜交證實相同的或高度同源的基因的存在。從煙草和N．benthamiana中制備DNA。用EcoRI和HandIII消化20微克DNA過夜。在瓊脂糖凝膠上分離DNA片段，并吸印到一個膜上。用于檢測的模板包括完整的SYRcDNA插入片段，該片段是用EcoRI和NotI從psyr中分離的，并通過凝膠電泳純化。用放射性標(biāo)記SYRcDNA，并在65℃下與DNA濾膜在雜交緩沖液中雜交一夜。在65℃用2×SSC和0．1％SDS洗滌所述濾膜2次。用所述膜對X光膠片曝光96小時。通過對所述膠片顯影發(fā)現(xiàn)了與SYR同源序列相關(guān)的某些帶(圖37)。在二倍體物種N．benthamiana中，在用EcoRI消化的DNA的泳道中檢測到兩個主要的帶為大約12kb和4．7kb，一個弱的帶(10kb)。HandIII消化的DNA僅出現(xiàn)了一個強的帶(10kb)，和一個弱的帶(大約20kb)。以上結(jié)果表明，在N．benthamiana中存在一個相同的SYR基因，并且還有可能存在另一個同源性較低的基因。在EcoRI消化的泳道中檢測到兩個主要的帶為8kb和6kb，其中的一條似乎是重復(fù)的。另外，檢測到一個大約3kb的弱的帶。HandIII的圖譜比較復(fù)雜，可以在12kb、1kb和兩個彼此接近的5kb處檢測到4個較強的帶。在同一泳道中還可以看到3個較弱的帶。用較低嚴(yán)格的條件進行相同的Southern雜交在相同的雜交緩沖液中，但在52℃下雜交過夜，接下來僅僅在2×SSC和0．1％SDS中洗滌一次。結(jié)果與在65℃下雜交的結(jié)果相同，沒有出現(xiàn)其它的帶。例31表達分析為了分析SYR的表達形式，進行了Northern分析。在不同條件下從煙草葉片或莖制備RNA。在該Northern試驗中所使用的探針都相同，并且源于SYRcDNA插入片段。雜交條件是標(biāo)準(zhǔn)的在雜交緩沖液(6×SSC和5×Denhardt’s，和0．1％SDS)中在65℃下雜交過夜。洗滌條件包括用2×SSC，0．1％SDS緩沖液洗滌濾膜一次或二次。SYR在葉片和莖中的表達第一個試驗表示從生長在兩種不同條件下的煙草的葉片和莖中分離mRNA。mRNA是從分別生長在濕度接近100％或生長在溫室條件(濕度大約60％)下的葉片和莖中分離的。將2．5微克mRNA加樣到含有甲醛的瓊脂糖凝膠上，并吸印到一個膜上。在圖12A中示出了與該膜的SYR探針的雜交結(jié)果。鑒定了葉片與莖的不同的SYR表達形式。在100％濕度的條件下，SYR基因的轉(zhuǎn)錄物存在于莖中，但似乎不存在于葉片中。不過，當(dāng)植物的生長條件比較干燥(溫室條件)時，SYR轉(zhuǎn)錄物同時存在于葉片和莖中。總之，SYR轉(zhuǎn)錄物不局限于葉片中，而存在于潮濕或干燥條件下的莖中，但當(dāng)植物生長在極潮濕的環(huán)境中時不存在于葉片中。脅迫或ABA誘導(dǎo)的SYR表達從煙草葉片中分離mRNA。煙草植物是在非常潮濕的條件下在加蓋的托盤中生長的。通過噴灑葉片和給土壤澆水的方式用由自來水配置的20μMABA處理6周齡植物。在用ABA處理之前(作為對照)、處理之后1小時、24小時或48小時收集葉片用于制備mRNA。通過將植物從潮濕條件下取出并將其放置在環(huán)境空氣條件下對某些植物進行干旱脅迫，不提供水。在72小時之后當(dāng)葉片開始枯萎時收集用于制備mRNA的葉片。在圖12B中示出了印跡的SYR探針雜交的放射性照片，每一個泳道含有2．5微克mRNA。當(dāng)用ABA處理葉片或者當(dāng)植物受到干旱脅迫時SYR的轉(zhuǎn)錄物含量增加。在開始ABA處理之后的增加被迅速誘導(dǎo)(1小時)，其水平的增加一直持續(xù)到停止處理之后24小時，并在48小時之后略有減弱。轉(zhuǎn)錄物的誘導(dǎo)似乎是緩慢短暫的。為了證實以上結(jié)果，他們還用生長在塑料箱中的高濕度條件下的其它煙草植物重復(fù)了以上試驗。按上述方法用ABA處理6周齡植物，并在30分鐘、1小時、3小時、6小時、12小時、48小時之后收集葉片。從所述葉片中制備總RNA，并將15微克RNA放在瓊脂糖凝膠上通過電泳組構(gòu)，并吸印到膜上。在圖12C中(左)示出了表示與SYR探針雜交的結(jié)果的X光膠片。證實了SYR轉(zhuǎn)錄物的瞬時誘導(dǎo)。不過，在該試驗中，其時間順序不同于上述試驗。轉(zhuǎn)錄物的含量在開始ABA處理之后30分鐘達到最高，并在該最大值之后減少，在3小時時接近原始對照水平，并在24小時之后再次緩慢增加。另外，還試驗了用生長素(IAA)對煙草植物進行30分鐘處理而產(chǎn)生的SYR誘導(dǎo)。盡管Northern分析再一次證實了在ABA處理植物30分鐘之后產(chǎn)生的SYR誘導(dǎo)，但在用IAA處理之后30分鐘SYR的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有增加(圖12C右)。將等量的RNA加樣到每一塊凝膠上，正如由溴化乙錠染色的核糖體RNA帶的照片所證實的(圖12D)。例32酵母互補所述釀酒酵母菌株含有兩個突觸融合蛋白基因SS01和SS02，這兩個基因彼此密切相關(guān)，并且在功能上可以相互交換。將這兩個基因作為酵母突變的阻遏物克隆，所述突變型缺乏其分泌途徑。破壞酵母中的兩個基因是致死性的。由以上兩個基因制備菌株H440，將SS01和SS02從野生型酵母菌株W301-1A中去掉，但該菌株能存活，因為它含有一個具有SS01基因的質(zhì)粒，該基因受半乳糖誘導(dǎo)型啟動子(GAL1)的控制。結(jié)果，H440僅能夠在含有半乳糖的培養(yǎng)基上生長。將源于煙草的SYR基因克隆到酵母表達載體上，使其受一個強啟動子的控制。將該結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入酵母菌株H440，得到H440(SYR)，并在葡萄糖培養(yǎng)基和半乳糖培養(yǎng)基上生長。正如所預(yù)料的，菌株H440和H440(SYR)在含有半乳糖的培養(yǎng)基上生長良好，因為SS01基因得到表達(圖38A)。當(dāng)H440被接種到?jīng)]有半乳糖的培養(yǎng)基上時，沒有觀察到生長，因為消除了SS01的表達。SYR基因不能抑制這種突變。當(dāng)H440(SYR)菌株生長在半乳糖缺陷型培養(yǎng)基上時，所述菌株不能回收(圖38B)。作為對照，還接種了野生型釀酒酵母菌株，并且在每一種培養(yǎng)基上都生長良好。SYR在H440(SYR)中的表達用新制備的抗SYR抗體檢測SYR蛋白在新構(gòu)建的菌株H440(SYR)中的存在。制備酵母菌株H440和H440(SYR)的膜的蛋白提取物。通過電泳在凝膠上進行分離，并吸印到濾膜上?？筍YR抗體能識別存在于SYR表達菌株中的提取物，但在H440本身中不能(圖38C)。該蛋白不能與同一只兔子免疫前的樣品雜交證實了其專一性。這表明獲得了SYR的表達，所以SS01和SS02突變互補的失敗不是由于SYR轉(zhuǎn)錄的缺乏。例33擬南芥屬EST和Southern由于擬南芥在分子生物學(xué)中被用作模型系統(tǒng)，并且它的很多基因至少被部分測序，因此進行一項檢索，以便發(fā)現(xiàn)與煙草SYR基因‘相同的’基因。BLASTN檢索是在NCBI網(wǎng)站上用dbEST數(shù)據(jù)庫完成的。EST’s是表達的序列標(biāo)記，源于擬南芥cDNA克隆的部分序列。除了KNOLLE序列之外，通過該檢索發(fā)現(xiàn)了一種新的序列。EST，P16862在核苷酸水平上表現(xiàn)出70％的相同性，而在氨基酸水平表現(xiàn)出62．6％的相同性。為了檢查該序列或其它序列是否與SYR相關(guān)，用通過EcoRI限制性內(nèi)切酶消化過的擬南芥DNA進行Southern印跡，并在瓊脂糖凝膠上電泳之后吸印到尼龍膜上。雜交條件是標(biāo)準(zhǔn)的，在65℃下在雜交溶液中過夜，然后在65℃下用2×SSC，1％SDS洗滌二次。圖39B表示該試驗的放射性照片。右側(cè)的泳道表示當(dāng)SYR探針雜交時的結(jié)果。而左側(cè)泳道表示當(dāng)使用EST，P16862時的結(jié)果。在每一種情況下，在每一個泳道中檢測到一條帶，但具有不同的大小。SYR探針能識別4．7kb的DNA帶，而EST，P16862探針能識別3．8kb的帶。這表明在擬南芥中存在一個與SYR高度相同的基因，但該基因不能用EST代表。例34-syr的表達將syr基因克隆到pG3．3載體上。pG3．3(14．92kb)載體包括編碼β-葡糖醛酸酶(GUS)的報導(dǎo)基因uidA，該基因位于35S啟動子后面，位于T-DNA的兩臂之間。T-DNA還含有卡那霉素(Km)抗性基因。所述載體攜帶另一個35S啟動子。隨后是一些單一的限制性位點，以便將外源基因克隆在該35S啟動子的控制之下。35S啟動子源于花椰菜花葉病毒，并且在煙草中以組成型方式表達。沿兩種不同的方向?qū)yr基因插入pG3．3載體位于35S啟動子后面。獲得了兩種新的結(jié)構(gòu)pGSS(syr基因沿有義方向插入35S啟動子后面)和pGSA(syr基因沿反義方向插入35S啟動子后面)。將pG3．3、pGSS和pGSA轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，該菌株被用于轉(zhuǎn)化煙草，并含有利福平(Rif)抗性基因。將所述載體從大腸桿菌中轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌中是通過三親交配完成的，使用pRK2013作為輔助質(zhì)粒。在28℃下在含有Km(20微克／毫升)和Rif(25微克／毫升)的20毫升LB中生長含有pG3．3、pGSS或pGSA結(jié)構(gòu)的農(nóng)桿菌菌株。然后通過離心使細(xì)菌培養(yǎng)物沉淀，并重新懸浮在添加了Km(20微克／毫升)的200毫升誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)培養(yǎng)基含有10．5g／l磷酸氫二鉀，4．5g／l磷酸二氫鉀，1g／l硫酸銨，0．5g／l檸檬酸鈉·2H2O，1mM硫酸鎂·H2O，0．2％葡萄糖，0．5％甘油，50μM3’，5’-二甲氧基-4’-羥基乙酰苯(Aldrich)和10mMN-嗎啉代-乙磺酸(MES)，pH5．6。在28℃下培養(yǎng)過夜。然后通過離心使細(xì)菌沉淀，并用含有10mMMESpH5．6的Murashige和Skoog’s培養(yǎng)基(MS，Sigma)洗滌，并重新懸浮在100mlMS-MES培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基含有150μM3’，5’-二甲氧基-4’-羥基乙酰苯(Aldrich)和0．05％Silwet(Vac-in-Stuff，Lehleseeds，RoundRock，TX，美國)。該細(xì)菌懸浮液可用于轉(zhuǎn)化。將4-6周齡的煙草植物用于瞬時表達。在轉(zhuǎn)化之前的最后3天，將植物轉(zhuǎn)移到100％的濕度中。為了進行浸滲，將完整植株連同土壤一起轉(zhuǎn)移到一個真空箱中，同時用塑料膜對土壤進行密封。將一個幼小的但完全展開的葉片輕輕插入裝有根癌農(nóng)桿菌細(xì)菌懸浮液的燒杯中。用真空泵抽真空，直到真空箱中大氣壓力低于0．1毫巴，保持?jǐn)?shù)分鐘，直到細(xì)菌溶液完全沸騰，然后迅速解除真空。在所述幼小葉片中可以看到溶液的浸滲，從葉片的頂端擴散到整個葉片的大約2／3部位。在23℃下在100％的濕度中培養(yǎng)所述植物72小時，給以12小時光照／12小時黑暗的周期。通過測定浸滲植物葉片中GUS的活性控制基因表達，所述活性容易通過組織化學(xué)染色測定。將所述組織在37℃下在GUS染色溶液中培養(yǎng)過夜50mM磷酸鈉緩沖液pH7，0．5mM鈉亞鐵／鐵氰化物，0．05％TritonX-100和0．5mg／ml5-溴-4-氯-3-吲哚--D-葡糖醛酸，0．1mg／ml氯霉素。在染色之后用乙醇對所述組織進行若干次洗滌。開始用pGSA浸滲三種不同植物的三種不同葉片，該結(jié)構(gòu)含有syr的反義cDNA(圖40；序列3)，該基因受35S啟動子的控制。在23℃下在100％的濕度中培養(yǎng)3天，然后檢測所述植物葉片上的不同的枯萎表型。將所述植物連同土壤一起從100％濕度的環(huán)境中轉(zhuǎn)移到干燥部位，位于180W燈泡下30厘米，用pGSA轉(zhuǎn)化的葉片似乎比對照未浸滲過的葉片更快的枯萎。這意味著在大約5分鐘之后，轉(zhuǎn)化葉片的頂端和邊緣(在這些部位浸滲了pGSA)開始下垂并枯萎，而其它葉片在轉(zhuǎn)移之后大約10分鐘才開始脫水。在3個植株中的2個上記錄到這種表型。檢測這兩種轉(zhuǎn)化葉片的GUS活性。蘭色的染色是GUS活性的結(jié)果，并且在浸滲部位的細(xì)胞中大約有10％能檢測到，這表明在所述植物細(xì)胞中發(fā)生了由35S啟動子導(dǎo)致的基因表達。在所檢測的兩種對照葉片中沒有檢測到GUS活性。當(dāng)把第三個植物從100％的濕度轉(zhuǎn)移到環(huán)境空氣條件中時仍然具有含水豐富的土壤，這樣能更好的記錄到枯萎表型。16小時之后(過夜)，浸滲的葉片表現(xiàn)出雙重表型。葉片的基礎(chǔ)部分保持直立與正常情況一樣(野生型)，但朝向頂端的由農(nóng)桿菌屬浸滲的葉片部位下垂并具有枯萎表型。所有其它葉片看上去都健康。此時，將浸滲的葉片用于測定氣孔開孔。氣孔的關(guān)閉是通過充實壓力的減弱調(diào)節(jié)的，由環(huán)繞氣孔的保衛(wèi)細(xì)胞中的ABA導(dǎo)致。在干燥條件下，為了防止水分的蒸騰損失氣孔會關(guān)閉。如果缺少信號傳導(dǎo)成分，保衛(wèi)細(xì)胞就不能再對ABA作出反應(yīng)，并因此使氣孔保持開放，甚至在干燥條件下也是如此。從所述葉片的兩個不同部位，枯萎的和健康的部位取表皮條。所述氣孔孔度的平均值是用20個不同氣孔測定的?？菸课坏臍饪卓锥?3．2μM±0．32)比健康部位的氣孔孔度(1．6μM±0．17)更大一些。例35轉(zhuǎn)化植物以便超量表達SYR蛋白將SYR基因克隆到轉(zhuǎn)化載體pSLJ75516上35S啟動子的后面(參見瞬時轉(zhuǎn)化方法)，得到pTSS。pTSS是四環(huán)素(Tc)抗性的，它含有有義方向的SYR基因，位于強的組成型35S啟動子后面，該基因后面是終止子nos。pTSS的tDNA還含有能產(chǎn)生對膦絲菌素(PPT)的抗性的BASTA抗性基因，該基因能夠選擇tDNA轉(zhuǎn)化的煙草植物。將質(zhì)粒pTSS轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404中，該菌株是利福平(rif)抗性的，并且適用于轉(zhuǎn)化煙草。轉(zhuǎn)化是通過三親轉(zhuǎn)化進行的，使用pRK2013作為輔助質(zhì)粒。通過在70％乙醇中處理1分鐘對煙草種子進行消毒，然后在無菌水中洗滌1分鐘并在含有0．1％(v／v)Tween的50％家用漂白劑中培養(yǎng)3分鐘，然后在無菌水中洗滌5次5分鐘。讓所述種子在發(fā)芽培養(yǎng)基上發(fā)芽1×MS(MurashigeandSkoog)鹽，20g／l蔗糖和0．05％(w／v)MES緩沖液pH5．7(用1MKOH調(diào)節(jié))，將所述培養(yǎng)基煮沸然后添加0．3％(w／v)的植物凝膠。在25℃下培養(yǎng)裝有所述種子的培養(yǎng)皿，給以16小時光照和8小時黑暗的周期。在選擇條件下將含有pTTS的農(nóng)桿菌菌株生長過夜(Tc(10mg／l)和rif(25mg／l))。通過離心(3000rpm，在臺式離心機DenleyBR401)20分鐘收集農(nóng)桿菌細(xì)胞，并重新懸浮在0．85％(w／v)氯化鈉中。在3-4周之后選擇成熟的但完全綠色的健康煙草植物葉片，并切一塊大約1平方厘米的小塊進行轉(zhuǎn)化，對所述組織進行創(chuàng)傷并倒放在裝有植物再生培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿上(1×MS鹽，20g／l蔗糖，0．05％(w／v)MES緩沖液pH5．7(用1MKOH調(diào)節(jié))，0．3％植物凝膠，并且在對該培養(yǎng)基進行高壓滅菌之后，添加來自1000倍母液的植物激素0．2mg／l萘乙酸(NAA)和2mg／l芐基氨基嘌呤(BA))。將所述葉片浸入農(nóng)桿菌屬溶液(同時避免過分的浸泡)中，然后吸印到濾紙上，并重新轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上，進行選擇2mg／l林絲菌素(PPT)(用于選擇含有pTTS的TDNA的轉(zhuǎn)化體)和100mg／l奧格門汀(用于殺死農(nóng)桿菌)。處于該階段的組織在25℃下培養(yǎng)，給以16小時光照和8小時黑暗的周期，直到產(chǎn)生芽。將所述芽轉(zhuǎn)移到根誘導(dǎo)培養(yǎng)基(1×MS鹽，0．05％(w／v)，10g／l蔗糖，MESpH5．7(用1MKOH調(diào)節(jié))和1mg／lPPT，用于避免缺少了芽再生階段而長根)上，并再次在25℃下培養(yǎng)并給予16小時光照和8小時黑暗的周期。當(dāng)根現(xiàn)出(大約1厘米)時，將小植株盡快地轉(zhuǎn)移到土壤中，并在溫室條件下的高濕度中生長。培養(yǎng)基發(fā)芽培養(yǎng)基1×MS(MurashigeandSkoog)鹽20g／l蔗糖0．05％(w／v)MES緩沖液pH5．7(用1MKOH調(diào)節(jié))，將培養(yǎng)基煮沸然后添加0．3％(w／v)植物凝膠再生培養(yǎng)基1×MS鹽20g／l蔗糖0．05％(w／v)MES緩沖液pH5．7(用1MKOH調(diào)節(jié))在對所述培養(yǎng)基進行高壓滅菌之后添加0．3％的植物凝膠，添加來自1000×母液的植物激素0．2mg／l萘乙酸(NAA)和2mg／l芐基氨基嘌呤(BA)。根誘導(dǎo)1×MS鹽10g／l蔗糖0．05％(w／v)MESpH5．7(用1MKOH調(diào)節(jié))，1mg／lPPT轉(zhuǎn)化的植物通過Western印跡分析證實，超量表達有義植物中的Nt-SYR含量得到提高。超量表達能加強對ABA的敏感性(能夠?qū)χT如突然的霜凍或周期性的干旱脅迫的短期脅迫提供保護)。優(yōu)選是定向的。反義植物表現(xiàn)出多效表型，在轉(zhuǎn)化體中的大約10％中觀察到該表型。由于用有義結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的成功率(分離到超過兩打獨立的轉(zhuǎn)化體)高于反義轉(zhuǎn)化體的(≥20個植物，但它們都源于兩個獨立的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象)，我們懷疑大多數(shù)的反義轉(zhuǎn)化是致死型的，并且僅有最不嚴(yán)重的(和／或不穩(wěn)定的)形式能存活。在放大鏡水平上通過葉片形態(tài)的總體變形對反義植物的鑒定表型進行鑒定，包括組織的總體厚度和葉片膨脹的嚴(yán)重減弱，植物的矮化和不育性。在極端情況下，葉片看上去像深綠色的條，具有縱脈而沒有葉片的橫向膨脹。在顯微鏡水平上，葉綠素表現(xiàn)出較差的分化，在某些部位具有異常的膨脹，而在其它部位過度生長。在保衛(wèi)細(xì)胞的表層和表皮細(xì)胞中出現(xiàn)了處于各種階段的異常發(fā)育。經(jīng)常會出現(xiàn)單個的保衛(wèi)細(xì)胞而不是成對的(在正常情況下有成對的保衛(wèi)細(xì)胞環(huán)繞氣孔)。很多保衛(wèi)細(xì)胞表現(xiàn)出異常膨脹，對于準(zhǔn)正常的保衛(wèi)細(xì)胞來說，大約比野生型大50％。對這些細(xì)胞的分離通道的電學(xué)分析證實對ABA敏感性的不同程度的喪失(大約為正常反應(yīng)的40％對完全喪失敏感性)。不過，由于形態(tài)特征的改變，我們在此時不能確定后一種結(jié)果是否是異常發(fā)育程序的結(jié)果而不是生理學(xué)變化。根據(jù)BotN／C和Sp2試驗懷疑有一種直接的生理學(xué)作用，并且我們希望通過用正在制備中的誘導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)化體進行的研究證實上述結(jié)論(見下文)。誘導(dǎo)方法還可以為我們提供對超量表達效應(yīng)的控制。通過免疫金標(biāo)記定位還在電子顯微鏡水平上用抗Nt-SYR的多克隆抗血清(在兔子體內(nèi)用Sp2肽制備)，和純化的抗體(純化是用Sp2-親和素完成的)分析了Nt-SYR的定位。在對照試驗中，使用了同一只兔子的預(yù)先免疫的血清(血清取自在對兔子注射Sp2之前)。另一個對照試驗包括在標(biāo)記之前通過抗原(Sp2)對抗血清或抗體進行預(yù)吸收。這樣，從組織部分滴定了特定的抗體-抗原相互作用。固定野生型和超量表達煙草植物的葉片，并用LRWhite或環(huán)氧樹脂包埋。用兩種樹脂觀察到了相似的圖象，不過用環(huán)氧樹脂可以檢測到較低的背景和更詳細(xì)的分析。大部分的超薄切片是用切片機在金網(wǎng)格上切成的，將所述網(wǎng)格用于預(yù)雜交(2％BSA)30分鐘，在4℃下與1／200的血清或1／5的純化抗體雜交過夜。第二次雜交是用市售與金顆粒(10nm)綴合的抗兔血清的抗體進行的。用一臺電子顯微鏡可以檢測所述金顆粒的電子密集點。最終的結(jié)果表現(xiàn)出所述抗體與質(zhì)膜的相關(guān)性，因為在用抗原對抗血清或抗體進行預(yù)吸收時所述斑點消失。在與免疫前血清雜交的樣品中，在質(zhì)膜區(qū)統(tǒng)計到較少的點，不過在諸如細(xì)胞質(zhì)和葉綠體的其它部位仍然具有某些標(biāo)記。來自有義植物的切片在標(biāo)記物含量方面與野生型有較大的提高在質(zhì)膜中，在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中。質(zhì)膜中點的數(shù)量大約為野生型切片中質(zhì)膜中點的兩倍。誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)化體用三種系統(tǒng)制備結(jié)構(gòu)。兩種誘導(dǎo)型啟動子基于哺乳動物地塞米松-敏感型啟動子，該啟動子在接觸地塞米松時被激活。其中之一獲自N．-H．Chua(植物雜志(1997)11605)。第二種包括位于地塞米松啟動子后面的多個四環(huán)素抑制因子，因此在啟動之后可以通過四環(huán)素關(guān)閉該啟動子。該結(jié)構(gòu)獲自ChristianeGatz(Goettiegen植物雜志(1992)2397)。另一種啟動子獲自AndyGreenland(Zeneca)，該啟動子是由乙醇激活的(自然生物技術(shù)(1998)16177)。所述結(jié)構(gòu)都是被設(shè)計用于表達下列物質(zhì)之一的(1)截短的蛋白Sp2，(2)反義序列，和(3)完整的Nt-Syr蛋白。(1)和(2)能夠控制Nt-Syr功能的消除。很明顯，(3)可導(dǎo)致對過量表達的控制。序列表(1)一般資料(ⅰ)申請人(A)名稱PLANTBIOSCIENCELIMITED(B)街道COLNEYLANE(C)城市NORWICH(D)州NORFOLK(E)國家英國(F)郵編NR47UH(ⅱ)發(fā)明名稱參與脫落酸信號過程的蛋白質(zhì)(ⅲ)序列數(shù)5(ⅳ)計算機可讀形式(A)媒體類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS／MS-DOS(D)軟件PatentInRelease#1．0，Version#1．25(EPO)(2)序列1資料(ⅰ)序列特征(A)長度1205個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱／鍵CDS(B)位置18．．917(ⅹⅰ)序列描述序列1CCAAATCCCATCTCAAAATGAATGATCTATTTTCAGGATCTTTCTCTCGT50MetAsnAspLeuPheSeRGlySerPheSerArg1510TTCAGAGCTGACGATCAATCGGACTCTCACGCCATAGAAATGGGAGAC98PheArgAlaAspAspGlnSerAspSerHisAlaIleGluMetGlyAsp152025ATTACTGGCGGAGTCAATCTCGACAAATTCTTCGAAGATGTTGAAGCC146IleThrGlyGlyValAsnLeuAspLysPhePheGluAspValGluAla303540ATTAAAGACGAACTCAAAGGCCTCGAGAAAATCTATTCCCAACTCCAA194IleLysAspGluLeuLysGlyLeuGluLysIleTyrSerGlnLeuGln455055TCTTCCCATGAAAAAAGCAAGACTCTTCACAACGCTAAAGCCGTTAAA242SerSerHisGluLysSerLysThrLeuHisAsnAlaLysAlaValLys60657075GATCTAAGATCCAACATGGATAATGACGTTTCCATGGCATTGAAGAAA290AapLeuArgSerAsnMetAspAsnAspValSerMetAlaLeuLysLys808590GCCAAATTCATCAAAGTTCGTCTCGAAGCCTTAGACAGATCAAATGCA338AlaLysPheIleLysValArgLeuGluAlaLeuAspArgSerASnAla95100105GCGAATCGAAGCCTCCCTGGATGTGGACCCGGAAGTTCATCTGACAGG386AlaAsnArgSerLeuProGlyCysGlyProGlySerSerSerAspArg110115120ACGAGAACTTCAGTTGTGAACGGATTAAGGAAGAAACTTCAAGAGTCA434ThrArgThrSerValValAsnGlyLeuArgLysLysLeuGlnGluSer125130135ATGAATCAGTTCAACGAGCTAAGGCAAAAGATGGCATCTGAATATAGG482MetAsnGlnPheAsnGluLeuArgGlnLysMetAlaSerGluTyrArg140145150155GAAACAGTTCAACGACGATATTATACCGTCACAGGAGAAAATCCTGAT530GluThrValGlnArgArgTyrTyrThrValThrGlyGluAsnProAsp160165170GAAGCAGTTCTTGATACACTCATATCTACAGGTCAAAGTGAGACGTTC578GluAlaValLeuAspThrLeuIleSerThrGlyGlnSerGluThrPhe175180185TTGCAAAAGGCAATTCAAGAGCAAGGGAGAGGACAAGTGATGGATACA626LeuGlnLysAlaIleGlnGluGlnGlyArgGlyGlnValMetAspThr190195200GTTATGGAAATTCAAGAAAGGCATGAAGCTGTGAAGGAATTGGAGAGG674ValMetGluIleGlnGluArgHisGluAlaValLysGluLeuGluArg205210215AATTTGAAAGAATTGCATCAAGTATTCTTGGACATGGCTGTTTTGGTT722AsnLeuLysGluLeuHisGlnValPheLeuAspMetAlaValLeuVal220225230235GAAAGTCAAGGAGCTCAACTTGATGATATTGAGAGCCAAGTGAATAGG770GluSerGlnGlyAlaGlnLeuAspAspIleGluSerGlnValAsnArg240245250GCTAATTCCTTCGTTAGAGGGGGTGCTCAGCAACTGCAAGTGGCAAGG818AlaAsnSerPheValArgGlyGlyAlaGlnGlnLeuGlnValAlaArg255260265AAGCACCAGAAGAACACTAGAAAATGGACTTGTTTTGCTATTATTCTT866LysHisGlnLysAsnThrArgLysTrpThrCysPheAlaIleIleLeu270275280CTGCTTATCATCATTTTGGTGGTGGTTCTTTCTATTCAGCCATGGAAA914LeuLeuIleIleIleLeuValValValLeuSerIleGlnProTrpLys285290295AAATGAGAATTTGTCTATGGTCAAAGGTCTTCTGGTGGACCCCTTCAATGTTT967Lys300TGAATATTCTAAATTTTTATATTTTATTATTTTAGCCATGCTTATTATTTTGTGTTATTT1027TGGATTTTTTTTTTGTTTTTAATGTGGGGAAGAGTAAACTGGATGGGGGTCCATGTGCTA1087TTTAGAGAAATACTTGGGAGTTCTCTTTTTGTAATTATTGCTGTATTTAGAGTATAATTC1147TTTTTCTATATTGTTGGCAGGTTAATTTGTTTGTTTGATTATATTCTCATTTAGATTT1205(2)序列2資料(ⅰ)序列特征(A)長度300個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述序列2MetAsnAspLeuPheSerGlySerPheSerArgPheArgAlaAspAsp15101GlnSerAspSerHisAlaIleGluMetGlyAspIleThrGlyGlyVal202530AsnLeuAspLysPhePheGluAspValGluAlaIleLysAspGluLeu354045LysGlyLeuGluLysIleTyrSerGlnLeuGlnSerSerHisGluLys505560SerLysThrLeuHisAsnAlaLysAlaValLysAspLeuArgSerAsn65707580MetAspAsnAspValSerMetAlaLeuLysLysAlaLysPheIleLys859095ValArgLeuGluAlaLeuAspArgSerAsnAlaAlaAsnArgSerLeu100105110ProGlyCysGlyProGlySerSerSerAspArgThrArgThrSerVal115120125ValAsnGlyLeuArgLysLysLeuGlnGluSerMetAsnGlnPheAsn130135140GluLeuArgGlnLysMetAlaSerGluTyrArgGluThrValGlnArg145150155160ArgTyrTyrThrValThrGlyGluAsnProAspGluAlaValLeuAsp165170175ThrLeuIleSerThrGlyGlnSerGluThrPheLeuGlnLysAlaIle180185190GlnGluGlnGlyArgGlyGlnValMetAspThrValMetGluIleGln195200205GluArgHisGluAlaValLysGluLeuGluArgAsnLeuLysGluLeu210215220HisGlnValPheLeuAspMetAlaValLeuValGluSerGlnGlyAla225230235240GlnLeuAspAspIleGluSerGlnValAsnArgAlaAsnSerPheVal245250255ArgGlyGlyAlaGlnGlnLeuGlnValAlaArgLysHisGlnLysAsn260265270ThrArgLysTrpThrCysPheAlalleIleLeuLeuLeuIleIleIle275280285LeuValValValLeuSerIleGlnProTrpLysLys290295300(2)序列3資料(ⅰ)序列特征(A)長度1334個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型cDNA(ⅸ)特征(A)名稱／鍵CDS(B)位置77．．991(ⅹⅰ)序列描述序列3GAATTCCTCGAGCTACGTCAGGGATTCATTCCGATCTGAAATCTCTCTCTAGATTTCTCT60ATTTTTCGAATTTTAAATGAACGATTTGTTTTCCAGCTCATTCTCTCGC109MetAsnAspLeuPheSerSerSerPheSerArg1510TTCCGCAGCGGAGAACCATCCCCTCGCCGAGACGTTGCCGGCGGTGGC157PheArgSerGlyGluProSerProArgArgAspValAlaGlyGlyGly152025GACGGAGTTCAGATGGCGAATCCCGCGGGATCAACCGGTGGTGTGAAC205AspGlyValGlnMetAlaAsnProAlaGlySerThrGlyGlyValAsn303540CTCGACAAGTTCTTCGAAGATGTTGAATCTGTGAAAGAAGAGCTAAAG253LeuAspLysPhePheGluAspValGluSerValLysGluGluLeuLys455055GAGCTAGATCGGCTCAACGAAACACTCTCTTCATGTCACGAGCAGAGC301GluLeuAspArgLeuAsnGluThrLeuSerSerCysHisGluGlnSer60657075AAGACGCTTCACAATGCTAAAGCCGTTAAAGATCTCCGGTCTAAAATG349LysThrLeuHisAsnAlaLysAlaValLysAspLeuArgSerLysMet808590GACGGTGACGTTGGAGTCGCGTTGAAGAAGGCGAAGATGATTAAAGTT397AspGlyAspValGlyValAlaLeuLysLysAlaLysMetIleLysVal95100105AAACTCGAGGCGCTAGATCGTGCCAATGCTGCTAATCGGAGTCTCCCT445LysLeuGluAlaLeuAspArgAlaAsnAlaAlaAsnArgSerLeuPro110115120GGCTGTGGACCTGGTTCTTCCTCCGATCGAACCAGGACCTCTGTCCTC493GlyCysGlyProGlySerSerSerAspArgThrArgThrSerValLeu125130135AATGGTCTCAGGAAGAAATTGATGGACTCTATGGATAGTTTCAACCGA541AsnGlyLeuArgLysLysLeuMetAspSerMetAspSerPheAsnArg140145150155TTGAGGGAGCTTATCTCGTCCGAGTATAGAGAAACTGTACAGAGGAGG589LeuArgGluLeuIleSerSerGluTyrArgGluThrValGlnArgArg160165170TACTTCACCGTCACCGGCGAGAATCCGGATGAACGAACCCTAGATCGA637TyrPheThrValThrGlyGluAsnProAspGluArgThrLeuAspArg175180185CTGATTTCCACTGGAGAGAGTGAGAGATTCTTGCAGAAAGCAATACAA685LeuIleSerThrGlyGluSerGluArgPheLeuGlnLysAlaIleGln190195200GAACAAGGAAGAGGAAGGGTGTTAGACACCATTAACGAGATTCAAGAA733GluGlnGlyArgGlyArgValLeuAspThrIleAsnGluIleGlnGlu205210215AGGCATGATGCGGTTAAAGACATTGAGAAGAATCTCAGGGAGCTTCAC781ArgHisAspAlaValLysAspIleGluLysAsnLeuArgGluLeuHis220225230235CAGGTGTTTCTAGACATGGCCGTGCTGGTAGAGCACCAGGGAGCTCAG829GlnValPheLeuAspMetAlaValLeuValGluHisGlnGlyAlaGln240245250CTTGATGACATCGAGAGTCATGTGGGTCGAGCTAGCTCCTTTATCAGA877LeuAspAspIleGluSerHisValGlyArgAlaSerSerPheIleArg255260265GGCGGAACTGACCAGCTACAAACCGCTCGGGTTTACCAGAAGAACACG925GlyGlyThrAspGlnLeuGlnThrAlaArgValTyrGlnLysAsnThr270275280CGAAAATGGACATGTATTGCCATTATTATTCTCATCATCATCATAACT973ArgLysTrpThrCysIleAlaIleIleIleLeuIleIleIleIleThr285290295GTTGTGGTTCTTGCTGTTTTAAAACCGTGGAACAACAGCAGTGGCGGC1021ValValValLeuAlaVal300305GGCGGCGGTGGTGGTGGTGGGGGTACCACTGGAGGAAGTCAACCAAATTCAGGGACACCA1081CCAAATCCTCCTCAGGCAAGGCGTCTATTGCGTTGAAGTTGAAGTTGAAGTTGAGTTTCG1141TTATTTGCATATATATTCTTTCTTTGAAAAACCTTATTATCAAACCAGCTTTGTGTTACT1201ACTTTCTACTGCTGGTTTGTTGTTAATCTCCCGTTTATTTGGTTTTTGTGAAAGAATTTA1261AAATGTGGGTTAGATGAGAAAATTAGTACAACATTCTCTTGTATCTATGTTTGCTACCCT1321GACGTAGCTCGAG1334(2)序列4資料(ⅰ)序列特征(A)長度305個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線形(ⅱ)分子類型蛋白(ⅹⅰ)序列描述序列4MetAsnAspLeuPheSerSerSerPheSerArgPheArgSerGlyGlu151015ProSerProArgArgAspValAlaGlyGlyGlyAspGlyValGlnMet202530AlaAsnProAlaGlySerThrGlyGlyValAsnLeuAspLysPhePhe354045GluAspValGluSerValLysGluGluLeuLysGluLeuAspArgLeu505560AsnGluThrLeuSerSerCysHisGluGlnSerLysThrLeuHisAsn65707580AlaLysAlaValLysAspLeuArgSerLysMetAspGlyAspValGly859095ValAlaLeuLysLysAlaLysMetIleLysValLysLeuGluAlaLeu100105110AspArgAlaAsnAlaAlaAsnArgSerLeuProGlyCysGlyProGly115120125SerSerSerAspArgThrArgThrSerValLeuAsnGlyLeuArgLys130135140LysLeuMetAspSerMetAspSerPheAsnArgLeuArgGluLeuIle145150155160SerSerGluTyrArgGluThrValGlnArgArgTyrPheThrValThr165170175GlyGluAsnProAspGluArgThrLeuAspArgLeuIleSerThrGly180185190GluSerGluArgPheLeuGlnLysAlaIleGlnGluGlnGlyArgGly195200205ArgValLeuAspThrIleAsnGluIleGlnGluArgHisAspAlaVal210215220LysAspIleGluLysAsnLeuArgGluLeuHisGlnValPheLeuAsp225230235240MetAlaValLeuValGluHisGlnGlyAlaGlnTeuAspAspIleGlu245250255SerHisValGlyArgAlaSerSerPheIleArgGlyGlyThrAspGln260265270LeuGlnThrAlaArgValTyrGlnLysAsnThrArgLysTrpThrCys275280285IleAlaIleIleIleLeuIleIleIleIleThrValValValLeuAla290295300Val305序列5TTTAGATTTACTCTTATATTAGTTTGTTTGTTTAATTGGACGGTTGTTATATCTTTTTCTTAATATGAGATTTATGTCGTTATTAATGTTTTTCTCTTGAGGGTTCATAAAGAGATTTATCGTGTACCTGGGGGTAGGTCAAATGAGAAGGGGTGTAATTTTTGTTTTTTTTTTAGGTTTTATTGTGTTTTATTATTCGTACCGATTTTATTATTTTATATTTTTAAATCTTATAAGTTTTGTAACTTCCCCAGGTGGTCTTCTGGAAACTGGTATCTGTTTAAGAGTAAAAAAGGTACCGACTTATCTTTCTTGGTGGTGGTTTTACTACTATTCGTCTTCTTATTATCGTTTTGTTCAGGTAAAAGATCACAAGAAGACCACGAAGGAACGGTGAACGTCAACGACTCGTGGGGGAGATTGCTTCCTTAATCGGGATAAGTGAACCGAGAGTTATAGTAGTTCAACTCGAGGAACTGAAAGTTGGTTTTGTCGGTACAGGTTCTTATGAACTACGTTAAGAAAGTTTAAGGAGAGGTTAAGGAAGTGTCGAAGTACGGAAAGAACTTAAAGGTATTGACATAGGTAGTGAACAGGAGAGGGAACGAGAACTTAACGGAAAACGTTCTTGCAGAGTGAAACTGGACATCTATACTCACATAGTTCTTGACGAAGTAGTCCTAAAAGAGGACACTGCCATATTATAGCAGCAACTTGACAAAGGGATATAAGTCTACGGTAGAAAACGGAATCGAGCAACTTGACTAAGTAACTGAGAACTTCAAAGAAGGAATTAGGCAAGTGTTGACTTCAAGAGCAGGACAGTCTACTTGAAGGCCCAGGTGTAGGTCCCTCCGAAGCTAAGCGACGTAAACTAGACAGATTCCGAAGCTCTGCTTGAAACTACTTAAACCGAAAGAAGTTACGGTACCTTTGCAGTAATAGGTACAACCTAGAATCTAGAAATTGCCGAAATCGCAACACTTCTCAGAACGAAAAAAGTACCCTTCTAACCTCAACCCTTATCTAAAAGAGCTCCGGAAACTCAAGCAGAAATTACCGAAGTTGTAGAAGCTTCTTAAACAGCTCTAACTGAGGCGGTCATTACAGAGGGTAAAGATACCGCACTCTCAGGCTAACTAGCAGTCGAGACTTTGCTCTCTTTCTAGGACTTTTATCTAGTAAGTAAAACTCTACCCTAAACC權(quán)利要求1．一種能夠影響ABA反應(yīng)并包括下列一個或幾個部分的蛋白(ⅰ)一個疏水性C-末端；(ⅱ)至少一個卷曲螺旋區(qū)；(ⅲ)一個EF手共有序列；(ⅳ)一個核苷酸結(jié)合位點；(ⅴ)和一個親水性N-末端；或其變體。2．如權(quán)利要求1的蛋白，它能夠被肉毒桿菌C毒素裂解。3．如權(quán)利要求1或2的蛋白，包括(ⅰ)-(ⅳ)，并選擇性的包括(ⅴ)，它能夠被肉毒桿菌C毒素裂解。4．如權(quán)利要求1-3的蛋白，其中，所述疏水性C-末端包括序列2所示氨基酸序列的從282到296號位置上的序列。5．如權(quán)利要求4的蛋白，其中，所述疏水性C-末端包括序列2所示氨基酸序列的從280到294號位置上的序列。6．如權(quán)利要求1-5的蛋白，其中，所述至少一個卷曲螺旋區(qū)包括序列2所示氨基酸序列的從210到247號位置上的序列。7．如權(quán)利要求6的蛋白，其中，所述至少一個卷曲螺旋區(qū)包括序列2所示氨基酸序列的從216到240號位置上的序列。8．如權(quán)利要求1-7的蛋白，其中，所述親水性N-末端包括序列2所示氨基酸序列的從1到280號位置上的序列。9．如權(quán)利要求8的蛋白，其中，所述親水性N-末端包括序列2所示氨基酸序列的從1到279號位置上的序列。10．如權(quán)利要求1-9的蛋白，其中，所述核苷酸結(jié)合位點包括序列2所示氨基酸序列的從114到119號位置上的序列。11．如權(quán)利要求1-9的蛋白，其中，所述核苷酸結(jié)合位點包括序列2所示氨基酸序列的116、118和120號位置上的序列。12．如權(quán)利要求1-11的蛋白，其中，所述EF手共有序列包括序列2所示氨基酸序列的16-28號位置上的序列。13．如權(quán)利要求1-12的蛋白，其中，所述疏水性C-末端包括一個跨膜區(qū)。14．如權(quán)利要求1-13的蛋白，其中，有三個卷曲螺旋區(qū)。15．如權(quán)利要求1-14的蛋白，其中，至少一個卷曲螺旋區(qū)相當(dāng)于一個表皮形式素模式。16．如權(quán)利要求6或7的蛋白，其中，所述卷曲螺旋區(qū)相當(dāng)于一個表皮形式素模式。17．如上述權(quán)利要求中任一項的蛋白，可源于植物或哺乳動物。18．一種包括序列2或3所示氨基酸序列的蛋白或其變體。19．一種篩選蛋白-蛋白相互作用的方法，包括使用上述權(quán)利要求中任一項的蛋白，并選擇能抑制所述相互作用的化合物。20．一種用權(quán)利要求19的方法篩選的蛋白。21．編碼權(quán)利要求1到18中任一項或20的蛋白的核酸。22．包括序列1所示18-917號位置的序列或序列3所示從77到991號位置的序列的核酸。23．編碼能夠影響ABA反應(yīng)的蛋白的核酸序列，其中，所述蛋白包括下列部分中的一個或幾個(ⅰ)一個疏水性C-末端；(ⅱ)至少一個卷曲螺旋區(qū)；(ⅲ)一個EF手共有序列；(ⅳ)一個核苷酸結(jié)合位點；(ⅴ)和一個親水性N-末端；或其變體。24．如權(quán)利要求23的核酸序列，其中，所述蛋白能夠被肉毒桿菌C毒素裂解。25．如權(quán)利要求23或24的核酸序列，包括序列1所示18-917位的序列或序列31所示77到991位的序列。26．一種由權(quán)利要求22-25中任一項的核酸編碼的蛋白。27．一種表達載體，包括可操作地連接于一個啟動子上的權(quán)利要求21-25中任一項所述的核酸。28．一種用權(quán)利要求27的表達載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。29．如權(quán)利要求28的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是植物、真菌或哺乳動物細(xì)胞。30．一種含有權(quán)利要求28的表達載體的植物、真菌或哺乳動物。31．一種選擇能夠影響植物對脅迫的反應(yīng)的化合物的方法，包括篩選能結(jié)合權(quán)利要求1-18中任一項或20的蛋白的化合物，并選擇具有所述結(jié)合能力的化合物。32．一種用權(quán)利要求31的方法篩選的化合物。33．一種含有權(quán)利要求32的化合物的農(nóng)用組合物。34．含有序列5所示序列的核酸。35．一種細(xì)胞，包括權(quán)利要求21-25中任一項的核酸的反義序列。36．如權(quán)利要求35的細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞是植物、真菌或哺乳動物細(xì)胞。37．一種包括權(quán)利要求21-25中任一項的核酸的反義序列的植物、真菌或哺乳動物。38．如權(quán)利要求36或37的細(xì)胞、植物、真菌或哺乳動物，其中，所述反義序列包括序列5所示序列。39．一種用于篩選非動物信號成分與配體的相互作用的分析方法，該方法包括讓含有非動物信號成分的動物細(xì)胞接觸一種配體；并觀察由所述非動物信號成分與所述配體的相互作用所導(dǎo)致的任何生理學(xué)效應(yīng)；其中如果所述非動物信號成分與所述配體相互作用，觀察第一種可檢測的生理學(xué)效應(yīng)。40．如權(quán)利要求39的分析方法，其中，所述非動物信號成分是植物信號成分。41．如權(quán)利要求39或40的分析方法，其中，所述動物細(xì)胞是卵母細(xì)胞。42．如權(quán)利要求39-41中任一項的分析方法，其中，所述動物細(xì)胞源于爪蟾。43．如權(quán)利要求39-42的分析方法，其中，所述信號成分與配體的相互作用導(dǎo)致所述細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子含量的提高。44．如權(quán)利要求39-43中任一項的分析方法，其中，所述第一種可檢測的生理學(xué)效應(yīng)是電信號。45．如權(quán)利要求39-44中任一項的分析方法，其中，所述信號成分是ABA信號成分。46．如權(quán)利要求39-45中任一項的分析方法，其中，包含在所述細(xì)胞內(nèi)的信號成分源于注入該細(xì)胞的一種或幾種核苷酸序列(例如mRNA)。47．如權(quán)利要求39-46中任一項的分析方法，其中，所述分析方法還包括觀察第二種可檢測效應(yīng)的步驟。48．如權(quán)利要求47的分析方法，其中，所述第二種可檢測效應(yīng)是在沒有第一種可檢測效應(yīng)的情況下觀察的。49．如權(quán)利要求47或48的分析方法，其中，所述第二種可檢測效應(yīng)是電信號。50．如權(quán)利要求39-49的分析方法，其中，如果觀察到第二種可檢測效應(yīng)，將所述植物核苷酸序列的組成與非植物核苷酸序列的組成加以比較，以便確定所述植物核苷酸序列是否至少與非植物核苷酸序列具有部分同源性。51．如權(quán)利要求50的分析方法，其中，如果所述植物核苷酸序列至少與非植物核苷酸序列具有部分同源性，該分析方法還包括測定所述非植物核苷酸序列或其表達產(chǎn)物是否是通過一種化合物實現(xiàn)的。52．一種方法，包括將通過權(quán)利要求51的分析方法鑒定的化合物導(dǎo)入植物、植物部分或細(xì)胞中。53．一種植物、植物部分或細(xì)胞，它含有通過權(quán)利要求51的分析方法鑒定的化合物。54．一種方法，包括將通過權(quán)利要求50的分析方法鑒定的至少與植物核苷酸序列具有部分同源性的非植物核苷酸序列導(dǎo)入植物、植物部分或細(xì)胞中。55．一種植物、植物部分或細(xì)胞，其中包含通過權(quán)利要求50的分析方法鑒定的至少與植物核苷酸序列具有部分同源性的非植物核苷酸序列。56．一種動物或其部分或細(xì)胞，其中包含通過權(quán)利要求50的分析方法鑒定的至少與植物核苷酸序列具有部分同源性的非植物核苷酸序列。全文摘要一種能夠影響ABA反應(yīng)的分離的蛋白,該蛋白包括下列一個或幾個部分:(i)疏水性C－末端;(ii)上皮形成素模式;(iii)親水性N－末端;和(iv)核苷酸結(jié)合位點;或其變體。文檔編號C12N15/09GK1280618SQ9881168公開日2001年1月17日申請日期1998年9月30日優(yōu)先權(quán)日1997年9月30日發(fā)明者M·布拉特,B·萊曼申請人:植物生物科學(xué)有限公司