專利名稱：在其乳中生產(chǎn)寡糖的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的制作方法
本申請是1994年3月9日申請的未決的美國專利申請系列第08/208,889號、1996年9月16日申請的未決的美國專利系列第08/715,259號(為1994年3月9日申請的放棄的美國專利申請系列第08/209,132號的繼續(xù))、1995年5月2日申請的未決的美國專利申請序列第08/434,151號(為1994年3月9日申請的未決的美國專利申請系列第08/209,132號的分案)和1995年5月2日申請的未決的美國專利申請系列第08/433,271號(為未決的美國專利申請系列第08/209,122號的分案)的部分繼續(xù)，所有這些專利申請均通過引用結(jié)合到本文中。
發(fā)明
背景技術(shù)：
領(lǐng)域本發(fā)明涉及產(chǎn)生在其乳中產(chǎn)生各種寡糖的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法。另外，本發(fā)明涉及所產(chǎn)生的哺乳動物、這些哺乳動物所產(chǎn)的乳、包含所述乳的組合物、所述乳的分級分離組分和所述純化的寡糖以及所述乳中存在的糖蛋白。
背景信息過去，已有數(shù)人達到在轉(zhuǎn)基因哺乳動物乳中表達初級基因產(chǎn)物(即蛋白質(zhì))(美國專利第5,322,775號，Wall等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 881696-1700(1991)和Krimpenfort，P.，Cancer Detection and Prevention 17(2)301-305(1993))。進行這種表達以在乳中產(chǎn)生大量的異源蛋白(Velander等，Sciencific American，1997年1月，第70-74頁)。
最近，也證明了次級轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物(例如寡糖、糖蛋白和糖脂)的表達事實上是可能的(Prieto等，Journal of Biological Chemistry 4929515-29519(1995))。Prieto等進行的實驗提出了這樣一個概念采用轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳腺作為生物反應(yīng)器，而非僅僅作為替代的蛋白合成系統(tǒng)。
在以上文章中引用的大多數(shù)實驗是通過表達異源轉(zhuǎn)基因進行的。這種表達的一個原因是，轉(zhuǎn)基因表達的同源基因由于與乳腺發(fā)育的內(nèi)部蛋白合成相沖突而可能引起困難(Burdon等，Mechanisms ofDevelopment3664-67(1991))。利用異源基因表達的另一原因是，已經(jīng)進行的大多數(shù)實驗設(shè)計用于產(chǎn)生人類生物制品。
諸如乳寡糖的次級基因產(chǎn)物的合成，主要取決于生乳期間糖基轉(zhuǎn)移酶的表達。另外，生產(chǎn)這種寡糖有許多益處。例如，在用于合成寡糖的轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)中，僅必需催化量的糖基轉(zhuǎn)移酶。此外，所述轉(zhuǎn)基因的來源可以不相關(guān)，只要一種或多種所述次級基因產(chǎn)物是一種或多種所需次級基因產(chǎn)物即可。
也必須注意到，非人類哺乳動物有具有人類酶所有組分成分中相應(yīng)物的多種糖基轉(zhuǎn)移酶(Thurin等，The Journal of Biological Chemistry265(12)7055-7061(1990))。這些轉(zhuǎn)移酶中的某些酶已經(jīng)從非人類哺乳動物(例如小鼠)組織中克隆出來(Larsen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA868227-8231(1989))。因此，同源糖基轉(zhuǎn)移酶在非人類哺乳動物乳腺中的轉(zhuǎn)基因表達，代表除用異源糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生寡糖外產(chǎn)生寡糖的一種方法。這兩種酶類型的表達以及由于這類酶的作用產(chǎn)生的寡糖以及與其相關(guān)的糖蛋白，被認(rèn)為屬于本發(fā)明的范圍。
將上述寡糖例如加入嬰兒配制食品中，使得所述配制食品喂養(yǎng)的嬰兒可以接受與母乳喂養(yǎng)嬰兒相同的益處。例如，所述寡糖可以提供對致病細(xì)菌的抗性，這是可能的(Prieto等，見上文)。另外，這類寡糖可以加入其它組合物中，諸如加入營養(yǎng)補充劑或藥物中。本發(fā)明的目標(biāo)是產(chǎn)生用或者同源酶或異源酶(包括例如糖基轉(zhuǎn)移酶)產(chǎn)生寡糖的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物。然后，由于這類寡糖的有益特性，可以將其加入各種組合物中。
另外，在轉(zhuǎn)基因動物乳中存在寡糖和其它糖綴合物，可能導(dǎo)致這種動物的子代獲得抵抗病毒、細(xì)菌或真菌感染或毒素的保護作用或抗性。
發(fā)明概述本發(fā)明包括通過在哺乳期間轉(zhuǎn)基因表達酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)而合成寡糖和糖蛋白的方法。此外，本發(fā)明也包括產(chǎn)生不存在于自然界的寡糖結(jié)構(gòu)。可以在哺乳動物中通過轉(zhuǎn)基因表達合適的目的真核或原核酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)，產(chǎn)生這類結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明使得能夠在轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳中產(chǎn)生同源、異源和新的結(jié)構(gòu)。
更具體地講，本發(fā)明包括產(chǎn)生其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞含有至少一個轉(zhuǎn)基因的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物。所述轉(zhuǎn)基因的表達導(dǎo)致在該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。該方法包括以下步驟(a)制備至少一種轉(zhuǎn)基因，(b)將所述轉(zhuǎn)基因引入非人類哺乳動物胚中，并將所得的胚轉(zhuǎn)移入雌性受體中，然后(c)鑒別至少一個雌性后代。所述轉(zhuǎn)基因的表達導(dǎo)致產(chǎn)生至少一種酶，這種酶然后催化該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。每種轉(zhuǎn)基因本身包括以可操作連接的至少一種在泌乳細(xì)胞中有功能的表達調(diào)節(jié)序列、編碼在泌乳細(xì)胞中有功能的信號序列的DNA序列和編碼一種酶的DNA序列。所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以例如是小鼠、大鼠、兔子、豬、山羊綿羊或乳牛。所述酶可以例如是糖基轉(zhuǎn)移酶，諸如巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、glucoronyl轉(zhuǎn)移酶、葡糖酸差向異構(gòu)酶(gluconylepimerase)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、β-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶或N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。另外，所述寡糖可以例如是半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖、2’巖藻糖乳糖、3’巖藻糖乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-巖藻五糖、乳糖-N-巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖II、乳糖-N-巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖III、乳糖-N-巖藻五糖III的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖IV、乳糖-N-巖藻五糖IV的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖V、乳糖-N-巖藻五糖V的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖I、乳糖-N-二巖藻五糖I的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖II、乳糖-N-二巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-己糖、乳糖-N-己糖的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖(tetrasaccharide)a、唾液酸四糖a的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖b、唾液酸四糖b的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖c或唾液酸四糖c的巖藻糖基化衍生物。
另外，本發(fā)明包括非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物。該哺乳動物的基因組包含至少一種操作性連接至乳腺特異性啟動子、編碼酶的DNA序列。所述DNA序列的表達導(dǎo)致在該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。所述哺乳動物、酶和寡糖可以是上述哺乳動物、酶和寡糖。
此外，本發(fā)明包括在非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物中產(chǎn)乳的方法。該方法包括(a)制備至少一種轉(zhuǎn)基因，(b)將所述轉(zhuǎn)基因插入所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物中，和(c)擠出所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳，以獲得所述乳。所述乳包含所述寡糖和糖蛋白。每種轉(zhuǎn)基因包含操作性連接的在泌乳細(xì)胞中有功能的啟動子和編碼酶的DNA序列。每種轉(zhuǎn)基因的表達導(dǎo)致在該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。所述哺乳動物、酶和寡糖可以是上述哺乳動物、酶和寡糖。
此外，本發(fā)明包括由非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物所產(chǎn)的乳。該非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的基因組包含至少一種編碼酶的DNA序列。所述DNA序列操作性地連接至啟動子。每種DNA序列的表達均導(dǎo)致最終產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。再者，所述哺乳動物、酶和寡糖可以是上述哺乳動物、酶和寡糖。
而且，本發(fā)明還包括上述乳的分級分離組分。該分級分離組分可以包括例如由于表達所述轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的一種或多種可溶性寡糖和/或糖蛋白。因此，所述乳的分級分離組分可以包含一種或多種上述組分(即寡糖或糖綴合物)或其任何組分。這種分級分離組分也可以包括在所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物乳中天然存在的寡糖和由于存在所述轉(zhuǎn)基因而產(chǎn)生的一種或多種寡糖和/或糖綴合物。
另外，本發(fā)明包括從上述乳中純化的寡糖或糖蛋白，以及包括含有所述乳、其分級分離組分、或所述寡糖和/或糖蛋白的營養(yǎng)制品，所有所述乳、分級分離組分、寡糖和糖蛋白已在上述進行了描述。該營養(yǎng)制品可以是或者液體或者固體形式的嬰兒配制食品。
本發(fā)明也包括為患者提供營養(yǎng)的方法。該方法包括給予所述患者上述的乳、其分級分離組分或寡糖或糖蛋白，其給予量足以實現(xiàn)所述營養(yǎng)。
附圖簡述

圖1-6涉及包括表達同源酶(即鼠UDP-Ga1β-D-α1，3-半乳糖基轉(zhuǎn)移酶)的方法。
圖1描述pWAP-GT構(gòu)成物的產(chǎn)生。
圖2描述半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖的層析分析，這是由本發(fā)明一種方法產(chǎn)生的一種新的寡糖。
圖3圖示半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖的熒光團輔助的糖類電泳分析(FACE)。
圖4圖示摻入半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖的小鼠乳的FACE分析。
圖5描述用Dionex方法2分析的陰性轉(zhuǎn)基因、陽性轉(zhuǎn)基因和陰性對照小鼠乳寡糖分布型的實例。于31-32分鐘洗脫出的大峰推測為所述三糖。
圖6圖示圖5所用樣品的FACE分析。具體地說，進行FACE分析，以證實圖5中檢測出的“新”峰為所述三糖。與G3淀粉水解物標(biāo)準(zhǔn)帶同時洗脫出的帶確實為所述三糖。
圖7-13涉及包括表達異源酶(即H-α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的方法。
圖7描述兩種兔乳樣品的高pH陰離子交換層析(HPAEC)的寡糖分布型。A板為由陰性轉(zhuǎn)基因動物對照獲得的樣品的乳寡糖分布型。該樣品含有乳糖和僅痕量的2’-巖藻糖乳糖(Fucα1-2Galβ1-4Glc)。B板為從其基因組含有編碼人H-α1-2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因的哺乳兔獲得的樣品的分布型。該樣品含有大量的2’-巖藻糖乳糖，其乳糖濃度低于非轉(zhuǎn)基因動物乳樣品中存在的乳糖濃度的1/10。C板為得自用于產(chǎn)生B板分布型的同一樣品的分布型，但C板的樣品摻入20mg/升2’-巖藻糖乳糖。
圖8圖示另一轉(zhuǎn)基因兔乳樣品的離子層析分布型。A板為對照乳，B板為2號轉(zhuǎn)基因樣品，C板為3號轉(zhuǎn)基因樣品，而D板為4號轉(zhuǎn)基因樣品。僅4號樣品(C板)含有大量的2’-巖藻糖乳糖(即＞50mg/L)。3號樣品(B板)表現(xiàn)出其乳糖濃度顯著降低。
圖9描述用來自以下樣品的α1-2巖藻糖乳糖消化前后乳寡糖的熒光團輔助糖類電泳(FACE)未處理的兔乳和酶控制的兔乳、轉(zhuǎn)基因兔乳和真正的標(biāo)準(zhǔn)品。具體地說，1道代表真正的2’-巖藻糖乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，2道代表未處理的5號轉(zhuǎn)基因樣品，3道代表巖藻糖苷酶處理的5號轉(zhuǎn)基因樣品，4道代表未處理的非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諛悠罚?道代表巖藻糖苷酶處理的對照樣品。6道代表一組直鏈葡萄糖聚合物標(biāo)準(zhǔn)品，其中G2代表2個葡萄糖單位，而G3代表3個葡萄糖單位。
圖10圖示其它轉(zhuǎn)基因兔樣品的FACE。具體地說，1道代表真正的2’-巖藻糖乳糖標(biāo)準(zhǔn)品，2道代表未處理的5號轉(zhuǎn)基因樣品，3道代表另一轉(zhuǎn)基因乳樣品，4道代表4號轉(zhuǎn)基因樣品，5道代表非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諛悠罚?道代表一組直鏈葡萄糖聚合物標(biāo)準(zhǔn)品，而7道代表3號轉(zhuǎn)基因樣品。
圖11描述轉(zhuǎn)基因兔乳蛋白和對照兔乳蛋白的Ulex Europaeus凝集素I(UEA-1)蛋白質(zhì)印跡。1道代表非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諛悠罚?道代表1號轉(zhuǎn)基因樣品，3道代表2號轉(zhuǎn)基因樣品，4道代表第二種非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡?br> 圖12圖示其它兔乳蛋白樣品的UEA-1蛋白質(zhì)印跡。1道來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ眨?道為4號轉(zhuǎn)基因樣品，3道為3號轉(zhuǎn)基因樣品，4道為非轉(zhuǎn)基因?qū)φ諛悠?，?道代表分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖13圖示分離兔乳蛋白的考馬斯染色的SDS電泳圖。1道顯示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ杖榈娜旧鞍祝?道為3號轉(zhuǎn)基因樣品，3道為4號轉(zhuǎn)基因樣品，4道為5號轉(zhuǎn)基因樣品，而5道顯示染色的分子量標(biāo)準(zhǔn)。
圖14-16涉及用異源生乳誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因表達來表達酶(即人類巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV)的方法。
圖14描述乳寡糖提取物的層析分布型。A板代表對照寡糖提取物，B板代表轉(zhuǎn)基因乳寡糖提取物，而C板代表摻料(即3-巖藻糖乳糖)轉(zhuǎn)基因乳寡糖提取物。
圖15描述用來分離熒光團標(biāo)記的寡糖的凝膠電泳的FACE結(jié)果。1道為用作分子量標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)記的淀粉水解物，2道為由非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談游锶楂@得的中性分布型，3道為真正的3-巖藻糖乳糖，4道為表達FucT-IV的轉(zhuǎn)基因動物的中性分布型，而5道為4道的同一樣品，但用特定的巖藻糖苷酶消化過。
圖16描述高pH陰離子交換層析后選自對照和轉(zhuǎn)基因乳寡糖提取物的流分的FACE。A板代表轉(zhuǎn)基因乳樣品，而B板代表非轉(zhuǎn)基因?qū)φ铡Ｔ撃z的1道代表染料，2道代表轉(zhuǎn)基因寡糖提取物(于19.5分鐘洗脫出的流分)，3道代表轉(zhuǎn)基因寡糖提取物(于20.0分鐘洗脫出的流分)，4道代表轉(zhuǎn)基因寡糖提取物(于20.5分鐘洗脫出的流分)，5道代表真正的3-巖藻糖乳糖，6道代表對照寡糖提取物(于20.0分鐘洗脫出的流分)，7道代表對照寡糖提取物(于20.5分分鐘洗脫出的流分)，而8道代表所述寡聚梯(oligo ladder)標(biāo)準(zhǔn)。
圖17和圖18涉及在小鼠中同時轉(zhuǎn)基因表達糖基轉(zhuǎn)移酶。
圖17為得自對照非轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳寡糖分布型的層析圖。
圖18為得自表達人類Fucα1-2-轉(zhuǎn)移酶和鼠Galα1-3轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳的層析圖。
圖19-21涉及在哺乳的小鼠乳腺中轉(zhuǎn)基因表達細(xì)菌糖基轉(zhuǎn)移酶的方法。
圖19顯示得自對照L細(xì)胞平板的酶活性測定的層析圖。
圖20和圖21顯示表達細(xì)菌N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)染L細(xì)胞合成的寡糖。
發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明涉及利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物乳中產(chǎn)生一種或多種寡糖和/或糖綴合物的方法?？梢杂帽景l(fā)明方法產(chǎn)生的一種寡糖(即半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖)具有新的結(jié)構(gòu)，從未作為游離的寡糖報道過。按照本發(fā)明產(chǎn)生的這種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生的寡糖和/或糖綴合物，可以加入嬰兒配制食品中，或加入給予老年人或無免疫應(yīng)答患者的藥用營養(yǎng)物(medical nutritional)中。目前描述的方法及其變化的方法的益處是，使得科學(xué)家可以常規(guī)設(shè)計轉(zhuǎn)基因動物的乳寡糖分布型。
簡而言之，為了產(chǎn)生所需的一種或多種乳寡糖，從特定的真核或原核物種中分離編碼特定目的酶的DNA的區(qū)段。該酶負(fù)責(zé)產(chǎn)生第二基因產(chǎn)物或乳寡糖。分離之后，將所述DNA區(qū)段插入含有各種遺傳組分的載體中，所述遺傳組分諸如多腺甘酸化信號和啟動子。然后將該載體含有所需組分的部分插入與分離所述DNA區(qū)段的哺乳動物相同或不同的哺乳動物物種的胚胎的原核中。然后將該胚胎移植到雌性受體中，讓其出生。來自所述后代的乳樣品含有一種或多種目的寡糖。也監(jiān)測后代所述一種或多種寡糖的產(chǎn)生，并由此將編碼一種或多種目的酶的一種或多種基因整合入該哺乳動物基因組中。應(yīng)該強調(diào)的是，可以將一種以上的轉(zhuǎn)基因引入所述胚胎中，由此導(dǎo)致產(chǎn)生一種以上的寡糖。因此，本發(fā)明的潛力是無限的。以下詳細(xì)描述本發(fā)明方法的每個步驟。所述酶最后表達的目的酶的選擇基于人們希望在所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物乳中產(chǎn)生的一種或多種寡糖。所述可以例如是糖基轉(zhuǎn)移酶。合適的糖基轉(zhuǎn)移酶包括諸如α-1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV或“H”巖藻糖α-1，2-轉(zhuǎn)移酶的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、諸如galα-1-3轉(zhuǎn)移酶的半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、glucoronyl轉(zhuǎn)移酶、葡糖基差向異構(gòu)酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、β-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。選擇的酶優(yōu)選半乳糖基轉(zhuǎn)移酶，更優(yōu)選UDP-Gal B-D-α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶或諸如FucT-III或FuvT-IV的α1-3/4巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶。
由所述轉(zhuǎn)基因編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶由信號序列引導(dǎo)，所述信號序列或者由cDNA或基因組DNA天然編碼，或者用標(biāo)準(zhǔn)遺傳工程技術(shù)加入所述轉(zhuǎn)基因。它們可以存在于所述轉(zhuǎn)基因哺乳動物生乳細(xì)胞中，可以或者錨定至生乳細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)膜區(qū)室(例如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或分泌小泡)，或作為游離的催化性多肽存在于這類區(qū)室的腔中。通過合適的胞內(nèi)定位，所述酶已經(jīng)接近由生乳的乳腺細(xì)胞天然合成的糖核苷酸或其它糖供體，或可以從該動物的血流達到接近這種細(xì)胞。這些供體優(yōu)選糖核苷酸。
所述糖基轉(zhuǎn)移酶具有催化單糖單位從糖供體轉(zhuǎn)移至諸如乳糖、其它寡糖、糖脂或糖蛋白的受體。所述糖基轉(zhuǎn)移酶對于供體和受體均具有有限的或足夠的特異性，可以通過將一個以上的單糖單位轉(zhuǎn)移至新生的或正在延長的糖綴合物。因此，通過所述糖基轉(zhuǎn)移酶的反復(fù)或迭代作用，可以合成較大的寡糖和/或多糖。所述糖基轉(zhuǎn)移酶本身可以是糖蛋白或非糖基化糖蛋白，或可以有或沒有額外的共翻譯或翻譯后修飾。
此外，重要的是注意到，根據(jù)導(dǎo)致產(chǎn)生選擇的寡糖和糖蛋白的一種或多種合適的酶的選擇，可以設(shè)計轉(zhuǎn)基因哺乳動物的寡糖分布型。
此外，也應(yīng)該注意到，本發(fā)明使得能夠同時表達兩種或兩種以上的酶和由此相應(yīng)的寡糖和糖蛋白。因此，潛在地，可以產(chǎn)生具有產(chǎn)生人乳中存在的許多寡糖的能力的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，例如乳牛。所述寡糖然后可以加入嬰兒配制食品中，例如由此為所述配制食品喂養(yǎng)的嬰兒提供母乳喂養(yǎng)嬰兒接受的得自所述寡糖的益處。然后可以讓諸如上述乳牛的哺乳動物交配(即雜交繁育)，以便獲得能夠在其乳中產(chǎn)生種類繁多的有價值寡糖的子代。
另外，本發(fā)明也包括來自無脊椎動物的酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)的生產(chǎn)。這類無脊椎動物包括例如曼氏裂體吸蟲(Schistosoma mansonii)或細(xì)菌，諸如奈瑟氏球菌屬(Neisseriae)的細(xì)菌。這些酶在生乳期間，可以在哺乳動物組織中以活性形式表達。所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物從中分離出編碼目的酶的cDNA的哺乳動物可以選自例如小鼠、大鼠、兔子、豬、山羊、綿羊、馬和乳牛。然而，可以利用任何哺乳動物，只要它具有將編碼目的酶的DNA整合入其基因組中即可。
根據(jù)是需要所述酶的異源表達還是需要同源表達，其中插入所述cDNA的胚胎可以對應(yīng)于或不對應(yīng)于初始從中分離所述DNA的相同物種。更具體地講，如果人們需要例如產(chǎn)生人類酶，該人類酶又導(dǎo)致在非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物乳中產(chǎn)生人類寡糖(即所述酶的異源表達)，則所用的轉(zhuǎn)基因哺乳動物為諸如豬或山羊的非人類哺乳動物。然而，如果人們希望例如產(chǎn)生山羊酶，而所述酶又導(dǎo)致在山羊乳中產(chǎn)生至少一種寡糖(即所述酶的同源表達)，則所用的轉(zhuǎn)基因哺乳動物為山羊。
關(guān)于同源表達，本發(fā)明使得人們可以合成不存在于自然界中的寡糖(諸如半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖)以及所有天然存在的寡糖。此外，本發(fā)明使得人們可以分析目的基因編碼的酶的合成效率。另外，由于所述酶對于該哺乳動物為“天然的”(即得自相同物種)，則降低了乳喂養(yǎng)的后代對所述酶的自身免疫反應(yīng)或耐受的潛力。另外，由于在某些物種發(fā)現(xiàn)某些酶(例如糖基轉(zhuǎn)移酶)，而在其它物種中沒有發(fā)現(xiàn)這些酶，因此，采用可利用的編碼同源酶的基因，可以擴大在乳中轉(zhuǎn)基因合成的潛在寡糖的范圍。
此外，關(guān)于同源表達，應(yīng)該注意到，例如可以從生乳的乳腺以外的組織獲得并克隆同源糖基轉(zhuǎn)移酶。例如，通常在肝臟和其它組織中表達、但不在小鼠生乳的乳腺中表達的鼠糖基轉(zhuǎn)移酶，可以通過生乳應(yīng)答啟動子的作用，在生乳期間表達。第二基因產(chǎn)物(即寡糖和糖綴合物)將存在于所述轉(zhuǎn)基因小鼠的乳中。因此，在以下實施例I中可明顯看出，合成通常不由給定哺乳動物生乳的乳腺合成的寡糖是可能的，只要正常在其它組織中表達的糖基轉(zhuǎn)移酶在生乳的乳腺中轉(zhuǎn)基因表達即可。載體最初插入所述cDNA(編碼所述酶)的實體稱為載體。所述載體可以例如為細(xì)菌質(zhì)粒(例如pBR322)。如果使用細(xì)菌質(zhì)粒，則它應(yīng)該含有至少一種最好在生乳期間指導(dǎo)基因表達和蛋白合成的編碼至少一種糖基轉(zhuǎn)移酶的重組DNA序列(或者為cDNA、基因或基因片段)和編碼正確的信使DNA加工所需的多腺甘酸化添加位點的DNA序列。或者，所述可以用其它質(zhì)粒、粘粒、噬菌體DNA、病毒以及酵母、植物、哺乳動物和其它合適宿主特有的其它載體來構(gòu)建。
調(diào)節(jié)編碼所述酶的cDNA、基因或基因片段表達、且操作性連接至所述cDNA、基因或基因片段的啟動子，可以例如為乳清蛋白、酪蛋白、乳清酸性蛋白(WAP)或另一生乳啟動子。
所述多腺甘酸化信號可以例如為哺乳動物或病毒信號，包括例如SV-40T抗原、卵清蛋白或牛生長激素(bGHpdyA)的poly-a信號。寡糖可以按照本發(fā)明方法產(chǎn)生的寡糖包括例如半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖、2’巖藻糖乳糖、3’巖藻糖乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖(例如α-乳糖-N-四糖)、乳糖-N-巖藻五糖I及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖II及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖III及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖IV及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖V及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖I及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖II及其唾液酸化衍生物、乳糖-N-己糖及其巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖a、b和c及其巖藻糖基化衍生物、其它人乳寡糖或非人乳寡糖。
在所述實施例中產(chǎn)生半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖和α1-2巖藻糖-乳糖。前一種化合物代表通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)合成的第一種新的未描述的第二基因產(chǎn)物。具體地說，半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖以前從未顯示作為游離的寡糖存在于自然界，直至本發(fā)明為止。人們認(rèn)為，該寡糖可以例如在諸如心臟、肝臟和腎臟的非人類動物器官異種移植之前，用作誘導(dǎo)人類對Galα1-3抗原耐受性的藥物。
必須注意到，本發(fā)明包括由非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物產(chǎn)生的含有一種或多種上述寡糖的乳。然而，另外，本發(fā)明也包括所述乳的分級分離組分以及從所述乳中分離或純化的寡糖和糖綴合物(例如糖蛋白)。這種分級分離組分可以包括例如奶粉、脫脂乳、來自已去除乳脂或脂質(zhì)的乳、可溶性糖類分級分離組分(即特定寡糖或特定寡糖結(jié)合哺乳動物天然產(chǎn)生的糖類)和/或特定的糖綴合物或數(shù)組糖綴合物。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如蒸發(fā)、凍干、結(jié)晶、超濾、透析或?qū)游?例如親和層析、陰離子交換層析或凝膠排阻層析)，可以獲得這類分級分離組分。
另外，本發(fā)明包括由于所述轉(zhuǎn)基因表達的酶作用而修飾的糖綴合物(例如人乳蛋白和人血清蛋白)。這種糖綴合物可以是內(nèi)源的或轉(zhuǎn)基因表達?？梢越?jīng)受修飾的人乳蛋白(例如糖蛋白)的實例包括分泌性免疫球蛋白、溶菌酶、乳鐵蛋白、κ-酪蛋白、α-乳清蛋白、β-乳清蛋白、乳過氧化物酶和膽鹽刺激的脂酶。所述酶可以例如向所述糖蛋白加入可能天然不存在于所述糖蛋白的一個鍵(參見Prieto等，Journal ofBiological Chemistry 27029515-29519(1995))。因此，所述糖蛋白用作所述酶的底物。
應(yīng)該注意到，或者同源或者異源的糖蛋白可以在已經(jīng)表達編碼糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因的哺乳動物中轉(zhuǎn)基因表達。因此，例如由于內(nèi)源以及轉(zhuǎn)基因表達的糖基轉(zhuǎn)移酶的作用，可以導(dǎo)致直接糖基化。
通過使用以下非限制性實施例，可以說明本發(fā)明以下試劑和設(shè)備需要用于實施例I中試劑1)500mM氫氧化鈉和200mM氫氧化鈉，RICCA ChemicalCompany(Arlington，TX)，無碳酸鹽，National Institute of Standards andTechnology(NIST)-可示蹤的(traceable)(Baxter Inc.，McGaw Park，IL)；2)乙酸鈉，ACS級(Sigma，St.Louis，MO)；3)FACE試劑盒(Glyko Inc.，Novato，CA)；4)Milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)；和5)硫酸Ultrex超純級(Baxter)。設(shè)備樣品干燥所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均用配有冷凍蒸汽捕獲器(trap)RVT4104(Savant，F(xiàn)armingdale，IL)的Speed Vac Plus SC210A干燥。實施例I鼠UDP-Galβ-D-α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的表達(同源表達)A.質(zhì)粒的制備和轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎的產(chǎn)生在俄亥俄大學(xué)的愛迪生生物技術(shù)研究所(Athens，Ohio)制備基因構(gòu)成物。將編碼鼠UDP-Galβ-D-α1，3半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA插入含有牛生長激素多腺甘酸化信號(bGHpolyA)和生乳應(yīng)答型乳清酸性蛋白(WAP)啟動子的質(zhì)粒中(參見圖1)。將EcoRI-BamHI片段微注射入小鼠胚胎的原核中。通過尾狹線印跡(tail slot blot)檢測到存在所述基因。收集哺乳雌鼠的乳，冷凍貯存于-70℃，直至運送至Ross Labs進行糖類分析。
B.A的寡糖的高效陰離子交換層析分析用配有以下裝置的Dionex Bio-LC系統(tǒng)，分析小鼠乳寡糖標(biāo)準(zhǔn)品泵 Dionex高級梯度泵(Advanced Gradient Pump)探測器 配有金工作電極和pH/參考電極的Dionex脈沖電化學(xué)檢測器自動加樣器 Spectrophysics Refrigerated AS3500柱 方法1上接一個護罩(4×50mm)的1根Dionex CarboPac PA1分析型柱(4×250mm)方法2上接一個護罩(4×50mm)的2根Dionex CarboPac PA1分析型柱(每根4×250mm，串聯(lián)連接)化學(xué)抑制Dionex AMMS-II Anion MicromembranceSuppression，(在檢測器后、但在分部收集器之前安裝，用來中和樣品)，用Dionex AutoRegenApparatus和陰離子再生柱(Anion RegenerateCartridge)通過0.15％硫酸再生分部收集器BioRad 2110型(BioRad Inc.，Hercules，CA)所有設(shè)備均購自Dionex，Inc.(Sunnyvale，CA)，除非另有說明。所用的洗脫劑為(A)Milli-Q水(或相當(dāng)物)、(B)500mM氫氧化鈉、(C)600mM乙酸鈉的100mM氫氧化鈉溶液和/或(D)200mM氫氧化鈉的組合，流速為1.0ml/min。以下表I有所用兩種方法的洗脫劑分布型。檢測器環(huán)境為以下表II所列的環(huán)境。注射體積為20μl。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的Dionex分析所有樣品和/或標(biāo)準(zhǔn)品均不進行進一步稀釋，按制備的進行分析。表I洗脫劑分布型方法1 方法2<


A＝Milli-Q水B＝500mM NaOHC＝600mM NaOAc/100mM NaOHD＝200mM NaOH表II檢測器環(huán)境<

<p>方法1方法2波形積分 波形 積分


C.熒光團輔助的糖類電泳(FACE)制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，用試劑盒(Glyko)并按照生產(chǎn)商提供的說明進行FACE。以下是建議的電泳條件。凝膠用FACE成象器(Glyko)成象。
將15毫摩爾(7.5μg)的合成Galα1-3Galβ1-4Glc標(biāo)準(zhǔn)品重懸浮于37.5μl水中，制備200ppm溶液。用36μl水稀釋4μl該溶液，并經(jīng)HPAEC分析(參見圖2，用方法1)。(將剩余的標(biāo)準(zhǔn)品母液分裝為5μl的等份，冷凍貯存以用于將來的分析)。收集流分(0.5ml)，合并相應(yīng)于標(biāo)準(zhǔn)品峰的流分，在Speed Vac中于室溫下過夜干燥。按照生產(chǎn)商的說明，將所得的干燥合并物于45℃標(biāo)記3小時并干燥。然后將樣品重懸浮于14μl水中，將2μl(105pmol)在2μl上樣緩沖液中稀釋，上樣至聚丙烯酰胺凝膠上。按生產(chǎn)商的說明進行凝膠電泳。凝膠的熒光圖象示于圖3中。
如附圖簡述一節(jié)中所述，圖5顯示用HPAEC方法2分析的陰性轉(zhuǎn)基因、陽性轉(zhuǎn)基因和陰性對照小鼠乳寡糖分布型的實例。于31-32分鐘洗脫出的大峰推測為所述三糖。HPAEC方法1產(chǎn)生一個非常接近所述三糖標(biāo)準(zhǔn)品洗脫出的小的人工產(chǎn)物峰(artifact peak)，該峰用方法2仍洗脫出，因此證實檢測出的“新”峰實際上為所述三糖，將來自這些樣品的寡糖提取物標(biāo)記，并通過FACE測試。將8μl所述寡糖提取物干燥，并按照試劑盒的說明進行標(biāo)記。將標(biāo)記的樣品重懸浮于10μl水中，將2μl上樣至凝膠上。先前標(biāo)記的所述三糖標(biāo)準(zhǔn)品冷凍樣品也進行電泳。該凝膠的圖象示于圖6。與G3淀粉水解物標(biāo)準(zhǔn)品帶的同時洗脫的帶為所述三糖。
D.小鼠乳的提取將貯存于-70℃的小鼠乳樣品于室溫解凍。將100μl用移液管加入500μl Eppendorf離心管中，用BioFuge 15(Baxter，McGaw Park，IL)以11000rpm離心20分鐘。小心地除去脂質(zhì)層，將中間層轉(zhuǎn)移至第二個500μl管中。加入2倍體積的冷(4℃)乙醇，將管制瓶渦旋混合，置于冰上至少20分鐘。然后如前將管制瓶離心。將透明的上清液轉(zhuǎn)移至第三個管制瓶中，將該提取物于中等熱量下在Speed Vac中過夜干燥。也將蛋白沉淀干燥，分析前貯存于-70℃。將干燥的寡糖提取物重懸浮于100μl水中，貯存于-70℃待分析用。由于可獲得的標(biāo)準(zhǔn)品的量少，因此不能完成這整個程序；然而，其它寡糖已經(jīng)過該提取方法，而沒有顯著的量的損失(數(shù)據(jù)未顯示)。
表III顯示測試的、根據(jù)建立者號分類的所有WAP/GT轉(zhuǎn)基因乳的總結(jié)。在所測試的23個“轉(zhuǎn)基因”樣品(其中“轉(zhuǎn)基因”用來定義在尾狹線印跡中測試為多個拷貝所述轉(zhuǎn)基因陽性的小鼠)中，10只動物，即相關(guān)種系中所有動物的44％為所述三糖合成陽性。(請注意鑒別為“建立者B6SJL”的樣品為陰性對照/非轉(zhuǎn)基因小鼠。)
表III

請注意，在表III中，來自同一建立者的乳樣品可能是或可能不是所述三糖合成陽性；在該DNA中具有一個拷貝(或多個拷貝)的所述轉(zhuǎn)基因不能保證所述小鼠能夠合成所述三糖。(例如，參見來自與建立者109相關(guān)的不同動物的乳的結(jié)果)?？赡苓@些樣品含有所述三糖；然而，它的產(chǎn)生低于該方法的檢測極限(約10ppm)。
E.將三糖標(biāo)準(zhǔn)品摻入對照小鼠乳中將1852pmol的三糖標(biāo)準(zhǔn)品在500μl eppendorf離心管中干燥。加入100μl對照(非轉(zhuǎn)基因)小鼠乳(mouse mile)，將管制瓶的內(nèi)容物充分混合。然后，將該摻料的乳樣品如上所述脫脂和去蛋白。回收45μl乙醇提取物，將其中20μl(理論上含有820pmol三糖)干燥，并于45℃標(biāo)記3小時用于寡糖分析(Glyko)。干燥后，將樣品重懸浮于10μl水中，將2μl上樣至FACE凝膠上。圖4為其圖象。也分析未摻料的對照乳樣品用于比較。
C和D中的所有樣品和/或標(biāo)準(zhǔn)品均不進一步稀釋，按所制備的用HPAEC分析。實施例II人類α1，2-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶在兔子中的表達(異源表達)與俄亥俄州Athens的俄亥俄大學(xué)的愛迪生生物技術(shù)研究所的John Kopchick博士及其同事以及波蘭Balice的Zootechnics Institute的Zdizislaw Smorage合作，實現(xiàn)轉(zhuǎn)基因胚胎的產(chǎn)生。所用的90％的兔子為新澤西培育的，其余10％為加州培育的。
A.轉(zhuǎn)基因合子的制備從4-6月齡超排卵雌兔收集合子。通過標(biāo)準(zhǔn)方法，即采用肌內(nèi)注射的50-100i.u.受孕母馬血清促性腺激素(PMSG)，PMSG注射后72小時，靜脈注射50-100i.u.人絨毛膜促性腺激素(HCG)，實現(xiàn)超排卵。HCG注射后，立即使超排卵雌兔交配或用得自5月齡雄兔的新鮮或冷凍的精液受精。受精或交配后20-22小時，屠宰雌兔，通過補充PBS的輸卵管沖洗液收集合子。沖洗后1-2小時，用配有Namarski光學(xué)鏡片的倒置顯微鏡以及與Da Venbrine或Leitz顯微操作器連接的微量加液器，向合子微注射2-6ng/ml編碼2’-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的DNA(即從前述質(zhì)粒(Prieto等，Journal of Biological Chemistry 27029515-29519(1995)切下的線性DNA片段，該DNA片段含有包括鼠乳清酸性蛋白啟動子在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、編碼人H-α1-2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA和編碼牛生長激素多腺苷酸化信號的序列)。
B.轉(zhuǎn)基因合子的移植和乳的收集微注射后1小時，將合子經(jīng)手術(shù)轉(zhuǎn)移到5-6月齡同步假受孕受體的輸卵管中。表IV給出了受精計劃的進展報告。通過斑點印跡分析，分析所產(chǎn)幼畜所述DNA的成功轉(zhuǎn)錄。收集并分析來自其中兩只這些動物的乳以及來自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏娜椤?br> 表IV受精進展報告

離心10分鐘。去除乙醇層，置于潔凈的管制瓶中用于寡糖分析，將沉淀冷凍用于未來的蛋白分析。
D.寡糖分布型分析將50μl每種乙醇提取物用50μl水稀釋。稀釋液通過預(yù)沖洗的30,000 MWCO濾器(Microcon，Amico，Inc.，Berverly，MA)過濾，用HPAEC方法1(參見該實施例結(jié)尾的附錄I)進行分析。通過用48μl水和2μl 1000ppm 2’-巖藻糖乳糖稀釋50μl樣品，并如前過濾，制備每種對照之一的摻料樣品和轉(zhuǎn)基因樣品。也分析這些樣品。第二組乳樣品不進一步稀釋，按接收的乳樣品分析。
在其余的乙醇提取物中，將240μl在Speed Vac(Savant，Inc.，F(xiàn)armingdale，IL)中干燥。然后用7％IPA將提取物重懸浮至一定體積，并如前通過Microcon 30,000 MWCO過濾。將來自組1的20μl每種樣品和來自組2的50μl每種樣品干燥，并按照生產(chǎn)商的說明(Glyko，Inc.，Novato，CA)標(biāo)記過夜。然后按照生產(chǎn)商的說明(Glyko，Inc.)將其標(biāo)記過夜。將標(biāo)記樣品重懸浮于10μl水中。將2μl每種樣品上樣至寡糖凝膠并電泳。
E.巖藻糖苷酶處理在2個單獨的管制瓶中，將來自組1的25μl過濾的IPA稀釋液與2個等份1000ppm的2’-巖藻糖乳糖(2’-FL)一起干燥。將樣品重懸浮于25μl 1×PBS pH8.5中。將來自Arthrobacter oxidans的200mUα1，2-巖藻糖苷酶(Tekara-Panvera，Madison，WI)的PBS溶液加至每一個管制瓶中。將相同體積煮沸(失活)的酶加入第二個管制瓶中。將樣品于37℃、甲苯氛圍下溫育過夜。將它們通過沖洗的Centricon 10,000MWCO濾器(Dionex)過濾，用950μl水沖洗。然后使濾液通過強陰離子交換柱On-Guard A(Amicon)，該柱按照生產(chǎn)商的說明進行制備。用200μl水沖洗所述樣品。將收集的濾液冷凍、干燥并過夜標(biāo)記用于FACE分析(Glyko)。將樣品在10μl水中稀釋，將2μl等份的該物質(zhì)電泳和成象。
F.糖蛋白SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡將蛋白沉淀解凍至室溫，用冷68％乙醇洗滌2次并干燥。將它們重懸浮于2×SDS變性緩沖液中。樣品在沸水中加熱5分鐘，以使蛋白變性，將其冷卻。用1×SDS緩沖液制備稀釋液。將樣品和預(yù)染的低分子量標(biāo)準(zhǔn)(Sigma，St.Louis，MO)上樣至聚丙烯酰胺凝膠(Novex，Inc.，San Diego，CA)，并在Xcell II Mini Cell系統(tǒng)(也得自Novex)中電泳。將由此獲得的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用Ulex europaeus凝集素I(UEA I)(過氧化物酶標(biāo)記的，Sigma)過夜探測。用TBS-Tween 20洗滌后，用DAB-過氧化氫染色溶液(Sigma)使凝膠顯色。用普通的300dpi計算機掃描儀掃描干燥凝膠，并將其數(shù)字化結(jié)果如下圖7有以下兔乳樣品的層析寡糖分布型對照非轉(zhuǎn)基因兔乳樣品、陽性轉(zhuǎn)基因兔乳樣品和得自一種樣品的摻料陽性轉(zhuǎn)基因兔乳樣品。1號轉(zhuǎn)基因樣品含有2’-FL，這是通過摻料分布型證實的事實。注意到對照樣品和轉(zhuǎn)基因樣品之間乳糖濃度的大的差異。未顯示第二個轉(zhuǎn)基因樣品(2號)，發(fā)現(xiàn)它為陰性(不含2’-FL)。在圖9中發(fā)現(xiàn)的分布型中，4號樣品(C板)和5號(D板)含有用該方法可檢測量的2’-FL。該樣品表現(xiàn)出乳糖濃度的顯著降低，而3號樣品(B板)沒有可檢測量的乳糖。
為了進一步證實存在于得自轉(zhuǎn)基因動物的乳樣品中的寡糖的本質(zhì)，將來自對照非轉(zhuǎn)基因乳和轉(zhuǎn)基因乳的寡糖用α1-2巖藻糖苷酶水解。該酶僅水解巖藻糖1-2鍵。結(jié)果示于圖9。真正的2’-巖藻糖乳糖(2’-FL)示于1道，而未處理的得自轉(zhuǎn)基因樣品的寡糖示于2道。3道顯示2道的同一樣品，但經(jīng)巖藻糖苷酶處理。與真正的2’-FL一起遷移的帶在2道中明顯可見。該帶在巖藻糖苷酶處理后消失，進一步支持在所述轉(zhuǎn)基因乳樣品中存在2’FL。來自對照非轉(zhuǎn)基因樣品的寡糖在巖藻糖苷酶處理后大致沒有變化(參見4道和5道)。
其它乳樣品的FACE寡糖分布型示于圖10。該圖的2道顯示自5號樣品乳分離的標(biāo)記寡糖。3道顯示另一轉(zhuǎn)基因乳樣品的寡糖。4道顯示4號樣品的寡糖。5道為來自對照非轉(zhuǎn)基因動物的分布型，而7道為3號樣品。這些結(jié)果證實了圖8的層析分布型，并進一步支持某些轉(zhuǎn)基因乳樣品無乳糖的觀念。
圖11比較了用UEA-I探測的1號和2號乳蛋白樣品的蛋白質(zhì)印跡。陽性帶僅在其中一個陽性轉(zhuǎn)基因樣品2道見到。2號樣品和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站缓驭?，2鍵用巖藻糖糖基化的蛋白。其它樣品的蛋白質(zhì)印跡示于圖12。正如預(yù)期的，4號樣品含有在α-1，2位巖藻糖基化的蛋白。然而，3號樣品也含有相似修飾的蛋白。該結(jié)果是預(yù)料之外的，因為該樣品缺乏其它兩種方法未檢測到的可檢測的2’-FL。迄今分析的所有其它樣品(包括來自小鼠的樣品)均至少含有巖藻糖基化的蛋白。與圖12中所發(fā)現(xiàn)的相同的凝膠的考馬斯染色如圖13所示。該圖說明，盡管通過UEA-I在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袥]有檢測到蛋白，但在該樣品中存在許多蛋白。作為對比，將3號樣品和4號樣品中發(fā)現(xiàn)的總蛋白與UEA-I印跡中檢測的帶進行比較。盡管它們以幾乎不可檢測量的存在，但用所述凝集素強烈地檢測到它們。
***附錄I層析條件經(jīng)高壓陰離子交換層析的寡糖分析用配有一個脈沖電化學(xué)檢測器的Dionex Bio-LC系統(tǒng)，用帶有護罩的單根分析型CarboPac PA-1柱，分析樣品。條件如下靈敏度0.200C洗脫時間45分鐘峰寬8.0秒峰閾值25.00峰面積剔除值1000樣品體積20L梯度程序0-12分鐘 100mM NaOH12.1-20分鐘42mM NaOAc的100mM NaOH溶液20.1-27分鐘60mM NaOAc的100mM NaOH溶液27.1-32分鐘300mM NaOAc的100mM NaOH溶液32.1-45分鐘100mM NaOHPED程序波形 積分時間(sec)電勢(V)開始(sec)結(jié)束(sec)0.00 0.05 0.20 0.400.40 0.050.41 0.750.60 0.750.61-0.151.00-0.15實施例III人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV在小鼠中的表達(異源表達)先前已經(jīng)在小鼠生乳的乳腺中表達了人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(即“H”巖藻糖α1-2-轉(zhuǎn)移酶)(Prieto等，Journal of Biological Chemistry，27029515-19(1995))。其表達導(dǎo)致產(chǎn)生由該酶合成的寡糖和糖蛋白。為了證明將該系統(tǒng)生產(chǎn)第二基因產(chǎn)物的潛在、廣泛應(yīng)用，本發(fā)明人決定在小鼠中轉(zhuǎn)基因表達非人H-巖藻糖α1-2轉(zhuǎn)移酶的糖基轉(zhuǎn)移酶。一種這種酶為巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV(Kukosawa-Latallo等，Genes andDevelopment 41288-1303(1989))。該酶存在于某些人乳樣品中(Serenella等，Glycoconjugate Journal 6101-114(1989))，具有特殊價值，因此它負(fù)責(zé)某些血液群抗原的合成(Legault等，The Journal of BiologicalChemistry 27020987-20996和Ginsburg等，Immunology of the Erythrocyt，Alan R.Liss，Inc.，New York，New York)。這些血液群抗原非常重要，因為它們在存在癌時水平升高(Orntof等，The Journal of BiologicalChemistry 27132260-32268(1996))，并且與諸如炎癥的胞粘連現(xiàn)象有關(guān)(Lowe等，The Journal of Biological Chemistry 26617467-17477))。人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶IV的表達和3-巖藻糖乳糖的合成如下進行使用以下試劑·500mM氫氧化鈉和200mM氫氧化鈉，RICCA ChemicalCompany(Arlington，TX)，無碳酸鹽·可示蹤的NIST(Baxter Inc.，McGaw Park，IL)·乙酸鈉，ACS級(Sigma，St.Louis，MO.)·FACE試劑盒(Glyko Inc.，Novato，CA)·Milli-Q水(Millipore，Bedford，MA)·硫酸Ultrex超純級(Baxter)樣品干燥所有樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均用配有冷凍蒸汽捕獲器RVT4104(Savant，F(xiàn)armingdale，IL)的Speed Vac Plus SC210A干燥。A.質(zhì)粒的制備和轉(zhuǎn)基因胚胎的產(chǎn)生在俄亥俄大學(xué)的愛迪生生物技術(shù)研究所(Athens，Ohio)制備基因構(gòu)成物。將編碼人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(IV)的cDNA(即從前述質(zhì)粒(Prieto等，Journal of Biological Chemistry 27029515-29519(1995))切下的線性DNA片段，該DNA片段含有包括所述乳清酸性蛋白啟動子在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)、編碼人H-α1-2巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的cDNA和編碼牛生長激素多腺苷酸化信號的序列)插入含有牛生長激素多腺甘酸化信號(bGHpolyA)和生乳應(yīng)答型鼠乳清酸性蛋白(WAP)啟動子的質(zhì)粒中。將EcoRI-BamHI片段微注射入小鼠胚胎的原核中。通過尾狹線印跡檢測到存在所述基因。收集哺乳雌鼠的乳，冷凍貯存于-70℃，直至運送至Ross Labs(Columbus，OH)進行糖類分析。獲得3只轉(zhuǎn)基因雌鼠。收集并分析得自其中2只雌鼠的乳。B.樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的HPAEC分析用配有以下裝置的Dionex Bio-LC系統(tǒng)，分析小鼠乳寡糖和寡糖標(biāo)準(zhǔn)品泵 Dionex高級梯度泵探測器 配有金工作電極和pH/參考電極的Dionex脈沖電化學(xué)檢測器自動加樣器 Spectrophysics Refrigerated AS3500柱 上接一個護罩(4×50mm)的2根DionexCarboPac PA1分析型柱(每根4×250mm，串聯(lián)連接)化學(xué)抑制Dionex AMMS-II Anion MicromembranceSuppression，(在檢測器后、但在分部收集器之前安裝，用來中和樣品)，用Dionex AutoRegenApparatus和陰離子再生柱通過0.15％硫酸再生分部收集器 BioRad 2110型(BioRad Inc.，Hercules，CA)所有設(shè)備均購自Dionex，Inc.(Sunnyvale，CA)，除非另有說明。所用的洗脫劑為(A)Milli-Q水(或相當(dāng)物)、(B)500mM氫氧化鈉、(C)600mM乙酸鈉的100mM氫氧化鈉溶液和/或(D)200mM氫氧化鈉的組合，流速為1.0ml/min。以下表V有所用兩種方法的洗脫劑分布型。檢測器環(huán)境為以下表VI所列的環(huán)境。注射體積為20μl。
所有樣品和/或標(biāo)準(zhǔn)品均不進行進一步稀釋，按制備的進行分析。當(dāng)認(rèn)為必需進一步表征時，收集流分(每個流分0.5分鐘)并在其收集管中干燥。然后將這些樣品標(biāo)記，用于FACE分析?？赡軙r，獲得轉(zhuǎn)基因動物和對照動物的層析圖。作為初步表征步驟，將等份樣品摻入3-巖藻糖乳糖真正的標(biāo)準(zhǔn)品。以該方式證明新寡糖與真正的3-巖藻糖乳糖其同洗脫出。
表V洗脫劑分布型A＝Milli-Q水B＝500mM NaOHC＝600mM NaOAc/100mM NaOHD＝200mM NaOH方法

表VI檢測器環(huán)境

方法波形積分

C.熒光團輔助的糖類電泳(FACE)制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，用試劑盒并按照生產(chǎn)商提供的說明(Glyko，Novalto，CA)進行FACE。以下是建議的電泳條件。凝膠用FACE成象器(Glyko)成象。
如前所述，將乳寡糖提取物樣品(10μl)干燥，并于45℃標(biāo)記3小時用于寡糖分析(Glyko)。干燥后，將樣品重懸浮于10μl水中，將2μl上樣至聚丙烯酰胺寡糖分離膠上。用Glyko Face Imager獲得電泳圖的成象。
D.小鼠乳的提取將貯存于-70℃的小鼠乳樣品于室溫解凍，并渦旋混合。將50μl吸移至500μl Eppendorf管中，加入100μl冷的無水乙醇。將所得混合物渦旋混合，并用BioFuge 15(Baxter，McGaw Park，IL)于4℃以1100rpm離心15分鐘。離心后，將85μl透明的上清液轉(zhuǎn)移至另一500μl離心管中，加入199μl蒸餾的去離子水。將所得混合物充分混合，將50μl轉(zhuǎn)移至自動加液器管制瓶中，用水1∶1稀釋，并上樣至高pH陰離子交換層析(HPAEC)。這最后一種溶液被認(rèn)為是所述乳樣品的寡糖提取物。
E.將直正的3-巖藻糖乳糖摻入對照小鼠乳中將50mg/升3-巖藻糖乳糖Galβ1-4[Fucα1-3]Glc溶液加入50μl上述寡糖提取物中，并充分混合。然后將該摻料的乳樣品直接上樣層析，并與用1倍體積的水稀釋的寡糖提取物比較。
F.外切糖苷酶處理得自棒狀桿菌屬菌種(Corynehacterium sp.)和鏈霉菌屬菌種(Streptomyces sp.)的巖藻糖苷酶(α1-3/4特異性的)購自Takara Panvera(Madison WI)。用大腸桿菌(E.coli)和所用的其它化學(xué)藥品為可得到的最高純度，均購自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)，除非另有說明。
G.中性和帶電荷寡糖的分離將寡糖提取物(200μl等份)分離為中性組分和帶電荷組分，以有利于由于所述轉(zhuǎn)基因編碼的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的作用而合成的新寡糖的檢測和鑒別。
通過使約20倍體積的0.002M pH5.4乙酸吡啶緩沖液通過一根DE-52柱(二乙基氨基乙基纖維素，Whatman，Maidstone，英格蘭)，使該柱在所述緩沖液中平衡。將所述寡糖提取物等份樣品上樣至該柱，使其滲透到樹脂中，靜置5-10分鐘。然后，通過用6倍體積的同一緩沖液洗脫，洗脫出中性寡糖。將由此獲得的組分干燥，并制備用于標(biāo)記和熒光團輔助的糖類電泳。隨后，通過用5倍體積的0.2M乙酸吡啶緩沖液沖洗該柱，洗脫出帶電荷組分。
以上方法的結(jié)果如下圖14顯示對照和轉(zhuǎn)基因的乳寡糖提取物的電泳圖(分別為A板和B板)?？梢郧宄赜^察到，由用巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FucT-IV轉(zhuǎn)染的動物獲得的乳產(chǎn)生一個峰信號，而在非轉(zhuǎn)移對照動物乳中僅有痕量信號。另外，B板所示的物質(zhì)摻有真正的3-巖藻糖乳糖，以確定轉(zhuǎn)基因動物乳中存在的新寡糖是否確實是3-巖藻糖乳糖(C板)。該糖的洗脫進一步與B板中箭頭所示的真正的3-巖藻糖乳糖單獨洗脫一致。
另外，將來自對照和轉(zhuǎn)基因動物的寡糖提取物分離為中性寡糖和唾液酸寡糖或帶負(fù)電寡糖結(jié)構(gòu)。當(dāng)標(biāo)記的寡糖經(jīng)凝膠電泳分離時，這使得可以更加簡單地成象。圖15為用來分離標(biāo)記的中性寡糖的凝膠的圖象。(1道為標(biāo)記的淀粉水解物，用作分子量標(biāo)準(zhǔn)，2道為得自非轉(zhuǎn)基因?qū)φ談游锶榈闹行苑植紙D，3道為真正的3巖藻糖乳糖，4道為表達FucT-IV的轉(zhuǎn)基因動物的中性分布圖，而5道為4道的同一物質(zhì)，但經(jīng)特異性的巖藻糖苷酶消化)。與真正的3巖藻糖乳糖共同遷移的帶僅在得自轉(zhuǎn)基因樣品的分布圖中清晰可見，當(dāng)用特異性3-巖藻糖苷酶處理時該帶消失。另外，該物質(zhì)不易被α1-2-巖藻糖苷酶水解。
為了進一步特征鑒定所述新寡糖，直接從層析流出液中收集組分。將寡糖提取物如上所述進行HPAEC，分部收集流出液。每種組分為0.5分鐘的流出液。在圖16的A板中，用括號顯示轉(zhuǎn)基因乳樣品的收集組分，而B板用括號表示非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏氖占M分。將這些組分標(biāo)記并經(jīng)FACE，如圖16電泳象的泳道鑒別說明所示。
HPAEC和FACE均表明，非轉(zhuǎn)基因動物僅有痕量的與真正的3巖藻糖乳糖共同遷移的寡糖(5道)。然而，由得自轉(zhuǎn)基因動物乳樣品的寡糖提取物得到的組分產(chǎn)生清晰的與3-巖藻糖乳糖共同遷移的信號。該進一步支持3-巖藻糖乳糖是通過所述轉(zhuǎn)基因表達而合成的觀念。實施例IV通過兩種先前建立的鼠轉(zhuǎn)基因系的品種間雜交同時表達兩種轉(zhuǎn)基因巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶讓由生乳啟動于驅(qū)動表達人巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶“H”的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系(Prieto等，Journal of Biological Chemistry，27029515-29519(1995))的雌性小鼠，與也由生乳啟動子驅(qū)動表達鼠Galα1-3轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因系的雄性小鼠交配(參見實施例I)。
利用尾部活檢并用合適的雜交探針探測，評估所得后代其基因組中所述轉(zhuǎn)基因的存在。將確定為兩種轉(zhuǎn)基因陽性的雌鼠進一步交配，使其受孕至足月。由這些雌鼠之一獲得乳，如實施例I和實施例II所述，通過高pH陰離子交換層析(HPAEC)確定糖類分布型。
如圖17和圖18觀察到的，可以于2’-巖藻糖乳糖的洗脫時間觀察到一個主要信號，而準(zhǔn)確地于合成的三糖Galα1-3 Galβ1-4Glc的洗脫時間觀察到一個次要信號。顯示了真正標(biāo)準(zhǔn)品的洗脫位置。
具體地說，上述結(jié)果表明，為了獲得產(chǎn)生含復(fù)雜寡糖和糖蛋白分布型的乳的轉(zhuǎn)基因動物，不必從頭開始并隨后給小鼠胚胎注射新的糖基轉(zhuǎn)移酶編碼構(gòu)成物。表達不同糖基轉(zhuǎn)移酶的轉(zhuǎn)基因動物的品種間雜交將產(chǎn)生由其親代按照孟德爾遺傳學(xué)遺傳轉(zhuǎn)移酶的動物。該又將導(dǎo)致相關(guān)第二基因產(chǎn)物的合成。實施例V在小鼠生乳乳腺中轉(zhuǎn)基因表達細(xì)菌糖基轉(zhuǎn)移酶(即UDP-GlcNAcGalβ1-4)使用得自多糖奈瑟氏球菌(Neisseria polysaccharea)的GlcNAc轉(zhuǎn)移酶。改變編碼該酶的基因的密碼子偏倚，以有利于在哺乳動物基因中常見的密碼子使用?！爸仄小钡幕蛴脕磙D(zhuǎn)染通常用作鼠培養(yǎng)細(xì)胞系的鼠“L”細(xì)胞。一旦在這些哺乳動物細(xì)胞中證明活性，則將所得的編碼所述GlcNAc轉(zhuǎn)移酶的DNA用來制備適于在小鼠生乳期間轉(zhuǎn)基因表達的構(gòu)成物。
通過液相合成測定評估GlcNAc轉(zhuǎn)移酶活性。小鼠“L”細(xì)胞(即來自一個培養(yǎng)皿的沉淀)重懸浮于含1mM CaCl2、20mM乳糖和20mMUDP-GlcNAC的磷酸緩沖鹽緩沖液中。將所得的混合物超聲處理5分鐘，于37℃溫育過夜。然后使所得的溫育混合物通過microcon(Amicon，Beverly，MA)centricon(10,000 AMU，MW截留值)過濾器過濾，將濾液稀釋用于HPAEC分析。
如實施例I所報道的制備寡糖提取物。圖19-21清楚地表明，該細(xì)菌酶成功地在哺乳動物組織中表達。
由于N-乙酰-葡糖胺轉(zhuǎn)移酶的表達，所述轉(zhuǎn)基因動物乳可以含有四糖乳糖-N-新四糖(NnnT)。
權(quán)利要求
1.產(chǎn)生其體細(xì)胞和生殖細(xì)胞含有至少一種轉(zhuǎn)基因的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法，其中所述至少一種轉(zhuǎn)基因的表達導(dǎo)致在該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白，該方法包括以下步驟(a)制備至少一種轉(zhuǎn)基因，所述至少一種轉(zhuǎn)基因包含以可操作連接的1)至少一種在泌乳細(xì)胞中有功能的表達調(diào)節(jié)序列，2)編碼在泌乳細(xì)胞中有功能的信號序列的DNA序列，和3)編碼酶的DNA序列；(b)將所述至少一種轉(zhuǎn)基因引入非人類哺乳動物胚中，并將所得的胚轉(zhuǎn)移入雌性受體中；(c)鑒別至少一個雌性后代，其中所述至少一種轉(zhuǎn)基因的表達導(dǎo)致產(chǎn)生至少一種酶，這種酶然后催化該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔子、豬、山羊、綿羊和乳牛。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述至少一種酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、glucoronyl轉(zhuǎn)移酶、葡糖酸差向異構(gòu)酶(gluconylepimerase)、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、β-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述寡糖選自半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖、2’巖藻糖乳糖、3’巖藻糖乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-巖藻五糖、乳糖-N-巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖II、乳糖-N-巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖III、乳糖-N-巖藻五糖III的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖IV、乳糖-N-巖藻五糖IV的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖V、乳糖-N-巖藻五糖V的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖I、乳糖-N-二巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖II、乳糖-N-二巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-己糖、乳糖-N-己糖的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖(tetrasaccharide)a、唾液酸四糖a的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖b、唾液酸四糖b的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖c和唾液酸四糖c的巖藻糖基化衍生物。
6.非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中該哺乳動物的基因組包含至少一種操作性連接至乳腺特異性啟動子、編碼酶的DNA序列，其中所述至少一種DNA序列的表達導(dǎo)致在該哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。
7.權(quán)利要求6的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述非人類哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔子、豬、山羊、綿羊和乳牛。
8.權(quán)利要求6的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。
9.權(quán)利要求8的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乙?；D(zhuǎn)移酶、glucoronyl轉(zhuǎn)移酶、葡糖酸差向異構(gòu)酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、β-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。
10.權(quán)利要求6的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物，其中所述寡糖選自半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖、2’巖藻糖乳糖、3’巖藻糖乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-巖藻五糖、乳糖-N-巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖II、乳糖-N-巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖III、乳糖-N-巖藻五糖III的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖IV、乳糖-N-巖藻五糖IV的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖V、乳糖-N-巖藻五糖V的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖I、乳糖-N-二巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖II、乳糖-N-二巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-己糖、乳糖-N-己糖的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖a、唾液酸四糖a的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖b、唾液酸四糖b的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖c和唾液酸四糖c的巖藻糖基化衍生物。
11.在非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物中產(chǎn)乳的方法，該方法包括以下步驟(a)制備至少一種轉(zhuǎn)基因，所述至少一種轉(zhuǎn)基因包含以可操作連接的1)在泌乳細(xì)胞中有功能的啟動子，2)編碼酶的DNA序列，其中所述至少一種轉(zhuǎn)基因的表達導(dǎo)致在所述哺乳動物乳中產(chǎn)生寡糖和糖蛋白；(b)將所述至少一種轉(zhuǎn)基因插入所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物中；(c)擠出所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的乳，以獲得所述乳，其中所述乳包含所述寡糖和糖蛋白。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔子、豬、山羊、綿羊和乳牛。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、glucoronyl轉(zhuǎn)移酶、葡糖酸差向異構(gòu)酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、β-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶或N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。
15.權(quán)利要求11的方法，其中所述寡糖選自半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖、2’巖藻糖乳糖、3’巖藻糖乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-巖藻五糖、乳糖-N-巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖II、乳糖-N-巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖III、乳糖-N-巖藻五糖III的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖IV、乳糖-N-巖藻五糖IV的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖V、乳糖-N-巖藻五糖V的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖I、乳糖-N-二巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖II、乳糖-N-二巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-己糖、乳糖-N-己糖的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖a、唾液酸四糖a的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖b、唾液酸四糖b的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖c和唾液酸四糖c的巖藻糖基化衍生物。
16.由非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物所產(chǎn)的乳，其中該非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的基因組包含至少一種編碼酶的DNA序列，所述DNA序列操作性地連接至啟動子，其中所述至少一種DNA序列的表達導(dǎo)致產(chǎn)生寡糖和糖蛋白。
17.權(quán)利要求16的乳，其中所述非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物選自小鼠、大鼠、兔子、豬、山羊、綿羊和乳牛。
18.權(quán)利要求17的乳，其中所述酶為糖基轉(zhuǎn)移酶。
19.權(quán)利要求18的乳，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶選自巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶、半乳糖基轉(zhuǎn)移酶、乙酰基轉(zhuǎn)移酶、glucoronyl轉(zhuǎn)移酶、葡糖酸差向異構(gòu)酶、唾液酸轉(zhuǎn)移酶、甘露糖基轉(zhuǎn)移酶、磺基轉(zhuǎn)移酶、β-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶和N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶。
20.權(quán)利要求17的乳，其中所述寡糖選自半乳糖α1-3半乳糖β1-4葡萄糖、2’巖藻糖乳糖、3’巖藻糖乳糖、乳糖-N-新四糖、乳糖-N-四糖、乳糖-N-巖藻五糖、乳糖-N-巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖II、乳糖-N-巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖III、乳糖-N-巖藻五糖III的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖IV、乳糖-N-巖藻五糖IV的唾液酸化衍生物、乳糖-N-巖藻五糖V、乳糖-N-巖藻五糖V的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖I、乳糖-N-二巖藻五糖的唾液酸化衍生物、乳糖-N-二巖藻五糖II、乳糖-N-二巖藻五糖II的唾液酸化衍生物、乳糖-N-己糖、乳糖-N-己糖的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖a、唾液酸四糖a的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖b、唾液酸四糖b的巖藻糖基化衍生物、唾液酸四糖c和唾液酸四糖c的巖藻糖基化衍生物。
21.權(quán)利要求18的所述乳的組分，其中所述部分包含至少一種寡糖、至少一種糖蛋白或其組合。
22.由權(quán)利要求16的乳純化的寡糖或糖蛋白。
23.營養(yǎng)制品，包含權(quán)利要求18的所述乳、權(quán)利要求21的所述組分或權(quán)利要求22的所述寡糖或糖蛋白。
24.權(quán)利要求23的營養(yǎng)制品，其中所述制品為嬰兒配制食品。
25.權(quán)利要求24的營養(yǎng)制品，其中所述嬰兒配制食品為液體或固體形式。
26.給患者提供營養(yǎng)的方法，所述方法包括給予所述患者足以實現(xiàn)所述營養(yǎng)的量的權(quán)利要求18的所述乳、權(quán)利要求21的所述組分或權(quán)利要求22的所述寡糖或糖蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生在其乳中產(chǎn)生各種寡糖和糖綴合物的非人類轉(zhuǎn)基因哺乳動物的方法。另外,本發(fā)明涉及產(chǎn)生所述哺乳動物本身、所述哺乳動物所產(chǎn)的乳、包含所述乳的組合物、所述乳的組分和所述乳中存在的純化的寡糖以及糖綴合物。
文檔編號C12N15/85GK1273602SQ98808662
公開日2000年11月15日 申請日期1998年9月4日 優(yōu)先權(quán)日1997年9月5日
發(fā)明者P·A·普里托, J·J·科普奇克, R·D·庫明斯, J·M·皮爾斯, D·F·史密斯, K·W·莫雷門 申請人:艾博特公司, 俄亥俄州立大學(xué), 佐治亞州大學(xué)研究基金會有限公司