專利名稱：生產(chǎn)新的聚酮化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及合成新的聚酮化合物的方法，所述方法使用不能利用天然第一模件(module)起始物單元的修飾模件聚酮化合物合成酶(PKS)。
背景技術(shù)：
模件聚酮化合物合成酶的典型結(jié)構(gòu)是脫氧赤糖酸酐(deoxyerythronolide)B合成酶(DEBS)的結(jié)構(gòu)，這種酶產(chǎn)生β-deoxyerythronolide B(6-dEB)，它是廣譜抗生素紅霉素的前體大環(huán)內(nèi)酯。DEBS由3條大多肽組成，每條多肽具有約10個(gè)不同的活性位點(diǎn)。

圖1顯示了由3個(gè)基因eryAI，eryAII和eryAIII編碼的3個(gè)DEBS模件的特征。
已經(jīng)提出了多種對(duì)PKS進(jìn)行基因操作來產(chǎn)生新的聚酮化合物的方法。曾通過模件缺失產(chǎn)生新的聚酮化合物(Kao，C.M.等，J.Am.Chem.Soc.(1995)1179105-9106；Kao，C.M.等，J.Am.Chem.Soc.(1996)1189184-9185)。據(jù)報(bào)道，還原結(jié)構(gòu)域內(nèi)的失能誘變(Donadio，S.等，Science(1991)252675-679；Donadio，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)907119-7123；Bedford，D.等，Chem Biol.(1996)3827-831)，通過酰基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域的取代來改變起始或終止單元的特異性(Oliynyk，M.等，Chem.Biol.(1996)3833-839；Kuhstoss，S.等，Gene(1996)183231-236)，在已有模件中引入新的催化活性即增加功能的誘變(McDaniel，R.等，J.Am.Chem.Soc.(1997)即將出版)也能夠產(chǎn)生新的聚酮化合物。其中，有些報(bào)道指出，聚酮化合物路徑中的下游酶能加工非天然中間體。但是，這些生產(chǎn)新聚酮化合物的方法都有缺點(diǎn)需要克隆和DNA測(cè)序方面的投資，所用的系統(tǒng)局限于已經(jīng)能夠?qū)ζ溥M(jìn)行基因取代的生物生產(chǎn)者，引物和延伸單元只能來自可代謝CoA硫酯，只有少數(shù)輔助催化功能可被利用。
特別是DEBS系統(tǒng)，已知它接受非天然引物單元，例如乙酰和丁酰CoA(Wiesmann，KEH等，Chem.Biol.(1995)2583-589；Pieper，R.等，J.Am.Chem.Soc.(1995)11711373-11374)以及它們相應(yīng)二酮化合物(diketides)的N-乙酰半胱胺(NAC)硫酯(Pieper，R.等，Nature(1995)378263-266)。但是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，即使這些非天然底物可用，來自天然起始單元的競(jìng)爭(zhēng)使得率急遽降低。即使起始單元不是特意提供的，它們也能夠通過DEBS系統(tǒng)所用的甲基丙二?；由靻卧擊犬a(chǎn)生(Piper，R.等，Biochemistry(1996)352054-2060；Pieper，R.等，Biochemistry(1997)361846-1851)。
所以，提供一種不能利用天然起始單元的突變模件聚酮化合物合成系統(tǒng)將是十分有利的。這樣的系統(tǒng)可通過提供合適的二酮化合物，例如NAC硫酯或其他合適的硫酯而誘導(dǎo)產(chǎn)生新的聚酮化合物。目前已經(jīng)進(jìn)行過消除天然材料競(jìng)爭(zhēng)的突變(Daum，S.J.等，Ann.Rev.Microbiol.(1979)33241-265)。已經(jīng)用生產(chǎn)阿佛菌素的微生物的隨機(jī)突變株合成了新的阿佛菌素衍生物(Dutton，C.J.等，Tetrahedron Letters(1994)35327-330；Dutton，C.J.等，J.Antibiot.(1991)44357-365)。但是，這一方法不是普遍適用，因?yàn)檎T變和底物攝入的效率都不高。
所以，需要一種更有效的系統(tǒng)，通過對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性生成天然產(chǎn)物的抑制來制備新的聚酮化合物的。
本

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及用修飾后的模件聚酮化合物合成酶系統(tǒng)來制備新的聚酮化合物的方法，所述的修飾使得系統(tǒng)無法利用其天然起始材料。這樣，就可以越過起始模件，提供多種合適的二酮底物來合成新的聚酮化合物。
所以，一方面，本發(fā)明涉及制備新聚酮化合物的方法，該方法包括在底物能被模件PKS轉(zhuǎn)化為聚酮化合物產(chǎn)物的條件下，向具有至少兩個(gè)模件的模件PKS提供硫酯二酮底物，所述的PKS經(jīng)修飾而無法利用天然起始單元。另一方面，本發(fā)明涉及修飾模件PKS，它不能用天然起始底物來提供最初的兩個(gè)碳單元，還涉及經(jīng)修飾而含有這種失能PKS的細(xì)胞。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)修飾PKS的重組材料和由這種系統(tǒng)產(chǎn)生的新聚酮化合物。
附圖簡(jiǎn)述圖1代表DEBS模件PKS。
圖2A-2C顯示修飾DEBS結(jié)構(gòu)的產(chǎn)物，結(jié)構(gòu)中模件1的酮合成酶(KS)被滅活。
圖3顯示將6-dEB衍生物加工成紅霉素-D衍生物。
本發(fā)明的實(shí)施方式本發(fā)明提供了不能加載天然起始材料的模件PKS系統(tǒng)及其相應(yīng)的基因。在特別優(yōu)選的實(shí)施例中，模件1的酮合成酶(KS)失活，從而消除了來自天然起始單元的競(jìng)爭(zhēng)。類似的令PKS失能的其它方法涉及使模件1的?；D(zhuǎn)移酶(AT)或?；\(yùn)載蛋白(ACP)功能失活。
本發(fā)明的PKS必須包含至少2個(gè)模件，但也可以包含更多的模件，實(shí)際上，還可以相當(dāng)于完整的合成酶系統(tǒng)。雖然用DEBS PKS系統(tǒng)來說明本發(fā)明，其實(shí)各種模件PKS均可使用，例如產(chǎn)生阿佛菌素和雷帕霉素等的模件PKS?？赏ㄟ^已知的定點(diǎn)誘變引入合適的突變。
也可以使用其它微生物，例如酵母和細(xì)菌。當(dāng)使用正常情況下不產(chǎn)生聚酮化合物的宿主細(xì)胞時(shí)，例如細(xì)菌、酵母甚至哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞，可能需要改變宿主細(xì)胞以獲得PKS系統(tǒng)的翻譯后加工。具體地說，為了具有功能，必須進(jìn)行ACP活性的磷酸泛酰巰基乙胺化(phosphopantetheinylated)。無磷酸ACP向其活性形式的這種轉(zhuǎn)化由統(tǒng)稱為全ACP合成酶或PTT酶的酶完成。這些酶在脂肪酸合成路徑中的功能形式似乎不能在PKS簇內(nèi)提供全ACP功能。所以，如果是在非鏈霉菌的全細(xì)胞內(nèi)合成聚酮化合物，必須在合成系統(tǒng)中加入一種合適的合成酶。如果在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行合成，所用的PKS酶必須在有全ACP合成酶存在的條件下合成。
這樣就可以在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)合成聚酮化合物，例如鏈霉菌宿主，特別是經(jīng)修飾而缺失了自身PKS的鏈霉菌，或者經(jīng)修飾可根據(jù)需要產(chǎn)生合適的PTT酶的其它細(xì)胞。通過重組產(chǎn)生相關(guān)的PKS蛋白并使得它們分泌或裂解含有這些蛋白的細(xì)胞，可用無細(xì)胞系統(tǒng)合成聚酮化合物。典型的無細(xì)胞系統(tǒng)包括催化合成聚酮化合物所需的合適的功能性PKS，NADPH和合適的緩沖液和底物。為了生產(chǎn)新的聚酮化合物，延伸單元的硫酯和二酮化合物的硫酯一同使用。
修飾PKS簇產(chǎn)生的新聚酮化合物在終產(chǎn)物內(nèi)對(duì)應(yīng)于起始單元?dú)埢娜〈遣煌摹６?，因?yàn)槎虚g體被提供給修飾PKS簇，所以緊靠起始單元進(jìn)入的延伸單元的特征可能也不同。所以，用來制造本發(fā)明新聚酮化合物的二酮具有以下通式

其中的A活化二酮化合物，通常是巰基，例如后文的N-乙酰半胱胺硫酯，R1和R2中至少一個(gè)不是修飾PKS簇通常所加工的二酮化合物天然具有的取代基。通常，R1是取代或非取代、飽和或非飽和的烴基(1-15C)，所述的烴基可以含有一到兩個(gè)雜原子，特別是N、O或S，R2是取代或非取代、飽和或非飽和的烴基(1-4C)或者是OR、SR或NHR，其中R是取代或非取代、飽和或非飽和的1-4C烴基。但是，R1和R2不可以都是甲基，而且，如果R2是甲基，R1不能是乙基。
典型的取代基包括鹵素，OR3，SR3，NR2，-OOR3，-NHOCR3，R3CO-，R3COO-和R3CONH-，其中每個(gè)R3各自是H或(4-4C)低級(jí)烷基。
本發(fā)明還涉及具有通式(1)或(2)所示的二酮化合物的聚酮化合物，還涉及它們的糖基化形式。
以下實(shí)施例用來說明而不是限定本發(fā)明。
制劑A起始材料如WO95/08548所述構(gòu)建天藍(lán)色鏈霉菌CH999，通過基因工程處理去除天然PKS基因簇。該專利公開中還記述了用來在CH999中表達(dá)PKS基因的穿梭質(zhì)粒pRM5。該專利公開中還記載了含有完整DEBS模件系統(tǒng)的質(zhì)粒pCK7。
實(shí)施例1DEBS1+2+TE的制備稱為DEBS1+2+TE的修飾DEBS PKS系統(tǒng)只含有模件1和2和硫酯酶(TE)活性，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)誘變，即以丙氨酸取代簽名序列cys-ser-ser-ser-leu中的活性位點(diǎn)半胱氨酸殘基，由此滅活模件1KS。所得的表達(dá)質(zhì)粒pKAO179編碼一個(gè)2-模件PKS，它在合成天然產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)條件下，即丙?；?CoA、甲基丙二?；?CoA和NADPH存在下，沒有活性。構(gòu)建詳情參見Kao，C.M.等，Biochemistry(1996)3512363-12368。當(dāng)有二酮化合物硫酯(2S，3R)-2-甲基-3-羥基-戊?；?N-乙酰基半胱胺硫酯，甲基丙二酰基-CoA和NADPH存在時(shí)，將得到三酮化合物產(chǎn)物。
在上述條件下，當(dāng)PKS孵育在無細(xì)胞系統(tǒng)中時(shí)，可產(chǎn)生三酮產(chǎn)物，或者，提供合適的二酮硫酯類似物使得含有修飾表達(dá)質(zhì)粒的CH99活躍生長(zhǎng)，也可以在胞內(nèi)同樣獲得該產(chǎn)物。
形成天藍(lán)色鏈霉菌CH999/pKAO179培養(yǎng)物將孢子接種在200mL SMM培養(yǎng)基(5％PEG-800，0.06％MgSO4，0.2％(NH4)2SO4，25mM TES，pH7.02，25mM KH2SO4，1.6％葡萄糖，0.5％酪蛋白氨基酸，微量元素)中。培養(yǎng)物在30℃，325rpm振蕩培養(yǎng)。分三次加入總共1L的(2S，3R)-2-甲基-3-羥基-戊?；?N-乙酰基半胱胺硫酯(100mg)和4-戊炔酸(5mg)50小時(shí)后(400mL)；62小時(shí)后(300mL)；86小時(shí)后(300mL)?？偣?44小時(shí)后，離心去除培養(yǎng)物中的菌絲體。NaCl飽和發(fā)酵液，用乙酸乙酯(5×100mL)抽提。合并有機(jī)抽提液，用Na2SO4干燥，過濾，濃縮。經(jīng)硅膠層析得到(2R，3S，4S，5R)-2，4-二甲基-3，5-二羥基-正己酸δ內(nèi)酯。
實(shí)施例2由DEBS簇制備聚酮化合物質(zhì)粒pCK7具有eryAI(DEBS1基因)的活性位點(diǎn)發(fā)生了突變的模件1KS結(jié)構(gòu)域，該質(zhì)粒還含有eryAI，eryAII(DEBS2基因)和eryAIII(DEBS3基因)，它們位于actI啟動(dòng)子調(diào)控下。pJRJ2的表達(dá)產(chǎn)生適當(dāng)修飾的全長(zhǎng)PKS系統(tǒng)。(Kao，C.M.等，Science(1994)265409-512)。將pJRJ2轉(zhuǎn)化到CH999中，培養(yǎng)在R2YE培養(yǎng)基上。經(jīng)測(cè)定沒有6-dEB樣產(chǎn)物的生成。
更具體地說，將CH999/pJRJ2于30℃培養(yǎng)在含0.3mg/ml丙酸鈉的R2YE瓊脂培養(yǎng)板上。3天后，在每塊瓊脂板上鋪以1.5mL 20mM底物的9∶1水DMSO溶液。再過4天，將瓊脂培養(yǎng)基制成勻漿，用乙酸乙酯抽提3次。用硫酸鎂干燥溶劑并濃縮。用硅膠層析(乙酸乙酯的己烷梯度溶液)純化濃縮后的抽提液，得到產(chǎn)物。
但是，在系統(tǒng)中加入用Cane等，J.Am.Chem.Soc.(1993)115522-526；Cane等，J.Antibiol.(1995)48647-651所述的方法制備的底物2(天然二酮的NAC硫酯)時(shí)，見圖，大量產(chǎn)生正常產(chǎn)物6-dEB。在少量如上所述培養(yǎng)在培養(yǎng)板上的培養(yǎng)物(300ml)中添加100mg底物2時(shí)，將產(chǎn)生30mg 6-dEB，得率為18％。
實(shí)施例3新的聚酮化合物的產(chǎn)生然后在生長(zhǎng)于實(shí)施例2條件下的CH999/pJRJ2培養(yǎng)物中加入結(jié)構(gòu)如圖2所示，通式分別為3，4和5的二酮化合物。底物3和4的制備與底物2相同，只是在羥縮醛反應(yīng)中分別用戊醛和苯基乙醛代替丙醛。底物5的制備參見Yue，S.等，J.Am.Chem.Soc.(1987)1091253-1255。底物3和底物4分別產(chǎn)生55mg/L產(chǎn)物6和22mg/L產(chǎn)物7。底物5出人意料地產(chǎn)生25mg/L的16元內(nèi)酯8。
實(shí)施例4其它新聚酮化合物將結(jié)構(gòu)如圖2B和2C所示的二酮化合物，即化合物9-18加入生長(zhǎng)于實(shí)施例2條件下的CH999/pJRJ2培養(yǎng)物中。產(chǎn)物如圖2B和2C所示，即化合物19-28。
實(shí)施例5空間要求用與實(shí)施例2相同的系統(tǒng)，但以圖2A中通式2的三種非對(duì)映異構(gòu)體代替化合物2，經(jīng)測(cè)定都沒有聚酮化合物的合成。類似的，用2-位的對(duì)映異構(gòu)體代替化合物12，也沒有測(cè)得聚酮化合物的合成。
實(shí)施例6聚酮化合物產(chǎn)物的加工DEBS的“下游”模件對(duì)非天然中間體的成功加工促使人們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定紅霉素天然合成路徑中的后PKS酶是否也接受非天然底物。在天然微生物生產(chǎn)者saccharopolyspora erythrea中，6-dEB經(jīng)歷數(shù)次酶催化的轉(zhuǎn)化。C6位的氧化和C3及C5位的糖基化產(chǎn)生紅霉素D(圖3中的通式9)，此后的轉(zhuǎn)化產(chǎn)生紅霉素A、B和C。S.erythrea突變體(A34)(Weber，J.M.等，J.Bactiol.(1985)164425-433)不能合成6-dEB。該菌株生長(zhǎng)于R2YE培養(yǎng)板上時(shí)不生產(chǎn)紅霉素(根據(jù)提取物抑制紅霉素敏感菌蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)的能力來判斷)。但是，當(dāng)培養(yǎng)基中加入6-dEB(沒有抗生素活性)時(shí)，抽提物表現(xiàn)出強(qiáng)抗菌活性。
對(duì)該菌株轉(zhuǎn)化6-dEB衍生物6和7樣品進(jìn)行了測(cè)試。部分純化的抽提物抑制蠟狀芽孢桿菌的生長(zhǎng)，還用質(zhì)譜法鑒定出抽提物的主要成分是圖3中的通式10(來自衍生物6)和通式11(來自衍生物7)。
更具體地說，將純化的6和7(5mg溶于7.5ml 50％乙醇水溶液)鋪在R2YE培養(yǎng)板上(200ml培養(yǎng)基/試驗(yàn))，自然干燥。然后接種S.erythrea A34，任其生長(zhǎng)。7天后，將培養(yǎng)基制成勻漿，用98.5∶1.5的乙酸乙酯∶三乙胺抽提3次。將每次試驗(yàn)的抽提液合并，用硫酸鎂干燥，并濃縮。用硅膠層析(甲醇和三乙胺的氯仿梯度溶液)將抽提液部分純化。用TLC和質(zhì)譜檢查部分純化的抽提液。為了進(jìn)行抗生素活性試驗(yàn)，將濾片浸在紅霉素D，10和11，以及不加任何6-dEB類似物培養(yǎng)的S.erythrea A34濃縮抽提液的400μM乙醇溶液中。干燥濾片，蓋在新鮮的蠟狀芽孢桿菌培養(yǎng)板上。37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，除對(duì)照抽提液之外，所有化合物都抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種修飾的功能性模件聚酮化合物合成酶(PKS)，它包含至少兩個(gè)模件，所述的PKS經(jīng)修飾而不能利用所述模件PKS的天然起始單元，其中的模件1的酮合成酶(KS)催化結(jié)構(gòu)域失活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的修飾PKS，它是完整的PKS。
3.一種PKS基因簇，它編碼修飾PKS，所述的PKS經(jīng)修飾而不能利用所述模件PKS的天然起始單元，其中模件1的酮合成酶(KS)催化結(jié)構(gòu)域失活。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因簇，它編碼完整的PKS。
5.一種重組宿主細(xì)胞，它經(jīng)修飾而含有權(quán)利要求3所述的基因簇，還可含有生產(chǎn)全-ACP合成酶的重組表達(dá)系統(tǒng)，全-ACP合成酶能將產(chǎn)生的PKS的ACP區(qū)磷酸泛酰巰基乙胺化。
6.一種制備聚酮化合物的方法，該方法包括提供權(quán)利要求1所述的修飾PKS的硫酯二酮化合物底物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，它是在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，它是在無細(xì)胞系統(tǒng)中進(jìn)行的。
9.一種制備抗生素的方法，所述的方法包括用聚酮化合物糖基化酶處理權(quán)利要求6所產(chǎn)生的聚酮化合物。
10.一種新聚酮化合物，它具有圖2中通式6-8的結(jié)構(gòu)或圖2B和2C中通式19-28的結(jié)構(gòu)。
11.一種新的抗生素，它是權(quán)利要求10所述聚酮化合物的糖基化形式。
12.一種新的聚酮化合物，它由以下通式的二酮化合物通過權(quán)利要求6所述的方法得到
其中A活化二酮；R1和R2至少其一不是通常由修飾PKS簇加工的二酮中的天然取代基；而且，R1是取代或非取代、飽和或非飽和的烴基(1-15C)，所述的烴基可以含有一到兩個(gè)雜原子，特別是N、O或S，R2是取代或非取代、飽和或非飽和的烴基(1-4C)或者是OR、SR或NHR，其中R是取代或非取代、飽和或非飽和的1-4C烴基。但是，R1和R2不可以都是甲基，而且，如果R2是甲基，R1不能是乙基。
13.一種新的抗生素，它是權(quán)利要求12所述新聚酮化合物的糖基化形式。
全文摘要
本發(fā)明描述了修飾的PKS基因簇,它在宿主細(xì)胞或無細(xì)胞提取物中的有效系統(tǒng)內(nèi)產(chǎn)生新聚酮化合物。新的聚酮化合物通過通式(1)或(2)二酮化合物的進(jìn)入而產(chǎn)生的,其中A部分活化二酮,R
文檔編號(hào)C12P17/06GK1267332SQ98808367
公開日2000年9月20日 申請(qǐng)日期1998年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月17日
發(fā)明者C·科斯拉, R·皮珀, G·羅, D·E·凱恩 申請(qǐng)人:高山生物科學(xué)股份有限公司