專利名稱：抗污損化合物及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的海洋防污損劑(anti-fouling agents)和利用海洋細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)海洋防污損劑的生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
對(duì)于海洋產(chǎn)業(yè)包括海洋運(yùn)輸業(yè)和海水養(yǎng)殖業(yè)等，海洋污損生物(biofouling)如海洋細(xì)菌、藤壺、軟體動(dòng)物和藻類等的大量附著會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。海洋污損生物易于在水管，發(fā)電站進(jìn)水系統(tǒng)，下水管道，船體外殼，螺旋推進(jìn)器，熱交換器，柵欄，漁網(wǎng)和籠子等物體或建筑物的水下部分附著。海洋污損生物經(jīng)常堵塞管道或附著在水面下的物體上，從而影響其正常工作。例如，發(fā)電站冷卻系統(tǒng)有關(guān)的溫水為水生生物的附著和生長(zhǎng)提供了一個(gè)理想的環(huán)境。污損生物還附著在水中的物體如漁網(wǎng)，浮標(biāo)，樁，海面平臺(tái)，木材和混凝土等的表面。當(dāng)將一個(gè)干凈的物體置入水環(huán)境中，它的表面很快被疏水性有機(jī)化合物所粘附，形成有機(jī)層(RittschofD.1997 In Fingerman M等(eds)Recent advances in marine biotechnology，vol.3.Science Publishers，Inc.，NH，pp.245-257)。微生物如細(xì)菌，藻類，真菌和原生動(dòng)物又能附著在有機(jī)層上并發(fā)展成群落，形成了粘附層(Clare等，1992 Invert ReportDev 2267-76)。許多無(wú)脊椎污損生物的浮游(自由漂浮的)幼蟲被吸引至該層上(Wieczorek等，1997 Mar Ecol Prog Ser 119221-226)，最終形成污損生物群落。具有鈣質(zhì)殼或管的污損生物如蚌類，管蟲和藤壺是污損生物中危害最大的。被污損生物附著的船體不僅可增加10％的重量，而且會(huì)導(dǎo)致船動(dòng)力效率下降20％，增加50％的燃油耗費(fèi)。而且生物污損和生物腐蝕是兩種同時(shí)存在的現(xiàn)象，生物污損能夠加速船殼的腐蝕，縮短一半的船體使用壽命。在海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面，生物污損可導(dǎo)致漁箱、扇貝籠的堵塞等，導(dǎo)致所養(yǎng)殖的海洋生物因缺氧和缺泛養(yǎng)料而死亡。海洋生物污損對(duì)船舶業(yè)，漁業(yè)等帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失，每年由于海洋生物污損導(dǎo)致的直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)幾十億美元。人們?yōu)榉乐购Ｑ笊镂蹞p已經(jīng)做了很大努力，研究開發(fā)了多種方法和物質(zhì)用于防止海洋生物的附著。采用了一系列方法除去已形成的生物污損群落，例如發(fā)電站系統(tǒng)利用周期性停電，進(jìn)入發(fā)電系統(tǒng)利用人工來(lái)除去生物體和殘?jiān)Ａ硗?，還經(jīng)常通過(guò)水處理系統(tǒng)泵入大量的氯或其它藥物來(lái)殺死已形成群落的污損生物。但是這些方法不僅作用慢，而且對(duì)排水道下游的局部生態(tài)系統(tǒng)造成不利影響。另外，因?yàn)檫@些藥物與大量的水混合來(lái)處理物體表面，所以這種化學(xué)方法處理效率低。化學(xué)處理方法的另一個(gè)缺點(diǎn)是必須保持長(zhǎng)時(shí)間的相對(duì)較大的有毒物質(zhì)的劑量以有效清除污損生物(Rittschof D.1997 In Fingerman M，Nagabhushanam R，Thompson M-F(eds)Recent advances in marinebiotechnology，vol.3.Science Publishers，Inc.，NH，pp.245-257)。
含有三丁基錫，含銅合金，含汞化合物等的有毒抗污損生物涂料被廣泛用于控制生物污損。這些抗污損涂料通過(guò)向水環(huán)境中釋放毒素以抑制生物污損(RittschofD.1997 In Fingerman M，NagabhushanamR，Thompson M-F(eds)Recent advances in marine biotechnology，vol.3.Science Publishers，Inc.，NH，pp.245-257)。最廣泛應(yīng)用的抗污損化合物是三丁基錫(TBT)。然而這種通過(guò)化學(xué)合成的化學(xué)物質(zhì)具有強(qiáng)烈毒性，對(duì)海洋生態(tài)環(huán)造成了嚴(yán)重的破壞(Bryan et al.1986，Stewart& De Mora 1990，Gibbs et al.1990)，對(duì)于漁業(yè)有著極大的危害。在沉積物中，尤其是港口和商業(yè)航運(yùn)路線的沉積物中發(fā)現(xiàn)了高濃度的TBT(Hashimoto等，1998 Mar Environ Res 45169-177)。一段時(shí)間以來(lái)，人們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到了TBT及其衍生物對(duì)海洋環(huán)境的不利影響，特別是對(duì)雄性激素作用(Fisher等1999 Mar Environ Res 47185-201；Mathiessen P.，Gibbs P.E.1998 Environ Toxicol Chem 1737-43)。因此國(guó)際海事組織(IMO)海上環(huán)境保護(hù)委員會(huì)(MEPC)提出了自2003年1月1日起禁止使用三丁基錫涂料，并在2008年1月1日后在船體上不再漆TBT涂料(http//www.imo.org/conventions)。目前，在未有發(fā)現(xiàn)無(wú)毒或低毒的抗生物附著的物質(zhì)之前，以重金屬和生物殺蟲劑為主要抗生物污損成分的油漆作為TBT的替代品尚被廣泛使用。
目前人們逐漸采用含銅涂料代替TBT涂料來(lái)保護(hù)船體。然而，這些“替代品”對(duì)海洋環(huán)境也有負(fù)面影響。例如，牡蠣體內(nèi)積累了相當(dāng)量的銅，另外含銅物質(zhì)對(duì)海洋藻類也具有毒性(Claisse & Alzieu1993 Mar Pollut Bull 26395-397)。而且，由于重金屬和生物殺蟲劑對(duì)生物環(huán)境的破壞作用的問(wèn)題日益突出，越來(lái)越多的國(guó)家禁止使用以有機(jī)金屬為主要抗污損成分的油漆，到2010年，這些油漆將在全球被禁用。因此，開發(fā)無(wú)毒的，無(wú)重金屬的和對(duì)海洋環(huán)境是無(wú)害的抗污損生物涂料具有其特殊的重要性和迫切性。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)抗污損劑及其衍生物的方法。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種通過(guò)在適于其生長(zhǎng)的水環(huán)境中培養(yǎng)解藻酸弧菌(Vibrio alginolyticus)或解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)生產(chǎn)抗污損劑的方法?？刮蹞p劑由這兩種弧菌產(chǎn)生和分泌，并被用作生產(chǎn)其它抗污損劑的組分。根據(jù)用途不同，解藻酸弧菌或解蛋白弧菌合成的抗污損劑可直接使用，或進(jìn)行進(jìn)一步純化。
在一個(gè)優(yōu)化的實(shí)施方案中，由以上弧菌產(chǎn)生和分泌到發(fā)酵培養(yǎng)基中的抗污損劑，可通過(guò)從培養(yǎng)基中除去細(xì)菌細(xì)胞，然后將無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)基脫鹽而進(jìn)一步純化。另一個(gè)優(yōu)化的實(shí)施方案中，抗污損劑可通過(guò)一些傳統(tǒng)技術(shù)濃縮，并直接使用或摻入到適當(dāng)?shù)奈镔|(zhì)中，如涂料，混凝土，涂層等，以產(chǎn)生抗污損效果。
本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)抗污損劑的方法。所述方法包括在適合的培養(yǎng)基中培養(yǎng)解藻酸弧菌或解蛋白弧菌以便可以分泌抗污損劑至培養(yǎng)基中。這種粗制方法足以產(chǎn)生足夠數(shù)量和濃度的抗污損劑以供使用。一個(gè)優(yōu)選的方法中，細(xì)胞被進(jìn)一步從培養(yǎng)基中分離出去，和/或抗污損劑可使用傳統(tǒng)手段被進(jìn)一步純化和濃縮。
本發(fā)明中所述生產(chǎn)抗污損劑的方法可以通過(guò)培養(yǎng)不同的弧菌菌種而進(jìn)行，并首先針對(duì)污損生物使用傳統(tǒng)的生物活性分析方法測(cè)試它們以鑒別可以產(chǎn)生一或多種抗污損劑的菌種或菌株。然后，使用上述相同的方法進(jìn)一步培養(yǎng)所述的弧菌菌種或菌株來(lái)生產(chǎn)防污劑。鑒定有用菌株的方法在后面詳細(xì)描述。按照這個(gè)方法鑒別的弧菌菌種或菌株可以從生物保藏機(jī)構(gòu)獲得或從環(huán)境中分離得到。
另一方面，本發(fā)明提供了在海上構(gòu)筑物表面(marine surface)減少污損的方法，其包括應(yīng)用解藻酸弧菌或解蛋白弧菌產(chǎn)生的抗污損劑方法。例如，所述抗污損劑可以采用永久涂層或至少一種噴霧或沖洗液體的形式。
本發(fā)明發(fā)明的抗污損劑具有以下突出的優(yōu)點(diǎn)，解藻酸弧菌或解蛋白弧菌產(chǎn)生的抗污損劑不含對(duì)局部生態(tài)造成不利影響的重金屬或有機(jī)合成的有毒物質(zhì)。用成熟的培養(yǎng)細(xì)菌的方法和可商業(yè)化的發(fā)酵設(shè)備可以容易地生產(chǎn)所述抗污損劑。更重要的是，這種防污劑以無(wú)毒方式抑制了海洋大型污損生物(macrofouler)的幼蟲附著。
另一方面，本發(fā)明提供了保藏號(hào)為DSM15590的解藻酸弧菌新分離株，其特征將在以下部分里加以詳細(xì)描述。
圖1示出了新分離株DSM15590的16S rRNA的DNA序列編碼(SEQ ID NO1)。
圖2示出了不同解藻酸弧菌和解蛋白弧菌的抗污損活性的比較研究結(jié)果。
圖3示出了通過(guò)使用Sephacryl-400色譜分離本發(fā)明的抗污損劑的部分純化結(jié)果。
圖4示出了本發(fā)明的抗污損劑在電泳分離后的染色圖案。
具體實(shí)施方案本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，即一株細(xì)菌菌株解藻酸弧菌分泌對(duì)苔蘚蟲，藤壺和多毛綱的幼蟲附著和變態(tài)具有抑制活性的高分子量化合物。這個(gè)新分離的解藻酸弧菌菌株由本發(fā)明人純化和鑒定。它是分離自海洋大型藻類石荀(Ulva reticulata)(Forsskal)(綠藻門，石荀科)的附生細(xì)菌。這是一種廣泛分布在香港東部沿海的綠色大型藻類。解藻酸弧菌菌株于2003年4月30日保藏在德國(guó)微生物和細(xì)胞培養(yǎng)保藏中心(“Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGmbH”(Braunschweig，Germany))，保藏號(hào)DSM 15590。這個(gè)新分離株也可以稱為UST株。
本發(fā)明所涉及的一種純化的抗污損劑是由DSM 15590株產(chǎn)生的。
通過(guò)富集技術(shù)純化所述細(xì)菌，并通過(guò)16S rRNA基因序列和特異底物利用的比較分析鑒定為解藻酸弧菌。在懸浮培養(yǎng)過(guò)程中，這個(gè)細(xì)菌分泌出可以通過(guò)超濾收集的高分子量化合物。這個(gè)高分子量物質(zhì)顯示了明顯的抑制許多海洋無(wú)脊椎動(dòng)物幼蟲附著和變態(tài)的活性，所述海洋無(wú)脊椎動(dòng)物即多毛綱華美盤管蟲(polychaete Hydroides elegans)，藤壺紋藤壺(barnacle Balanus amphitrite)和苔蘚蟲總合草苔蟲(bryozoan Bugula neritina)，這些無(wú)脊椎動(dòng)物是廣泛認(rèn)可的污損生物。與目前使用的大多數(shù)殺蟲劑相反，本發(fā)明的抗污損劑的抗污損作用不但是無(wú)毒的，而且還是可逆的，即暴露于所述抗污損劑后，本能的幼蟲附著過(guò)程在未受影響的海上構(gòu)筑物表面繼續(xù)進(jìn)行。
細(xì)菌分泌出的生物活性成分，在活性跟蹤下，采用凝膠色譜進(jìn)行分離純化，并且該成分和變性聚丙烯酰胺凝膠上的一個(gè)條帶相對(duì)應(yīng)。特異的染色反應(yīng)結(jié)果表明抗污損劑是大約200kD的多糖類物質(zhì)。通過(guò)糖基組成分析方法鑒別了所述多糖的單體組成。一旦釋放入海洋環(huán)境中，多糖易于被微生物降解因而不會(huì)發(fā)生生物積累。因此，一旦這個(gè)化合物以工業(yè)規(guī)模加入抗污損涂料中，其對(duì)海洋環(huán)境的可能有害影響是微小的。
與其它從大型海洋生物中獲得的具有抗污損特性的天然產(chǎn)物(例如，US專利4788302,5607741,5695552,5989323)相反，此處所述的細(xì)菌產(chǎn)物可以采用商業(yè)化的發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模產(chǎn)生，而利用大型海洋生物來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)天然抗污損劑則需要水產(chǎn)養(yǎng)殖這些大型生物。這個(gè)優(yōu)點(diǎn)使該細(xì)菌產(chǎn)生的抗污損劑具有商業(yè)化的潛力。使用所述鑒別的細(xì)菌，生產(chǎn)抗污損劑不依賴于和局限于沿海制造業(yè)、勞動(dòng)強(qiáng)度高并受氣候條件限制的水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)。而且，商業(yè)生產(chǎn)所述細(xì)菌衍生的抗污損劑沒(méi)有地域限制，因?yàn)槠淇梢匀菀椎卦陉懙厣系陌l(fā)酵器中進(jìn)行。
本發(fā)明還測(cè)試了公開可獲得的其它解藻酸弧菌菌株，并發(fā)現(xiàn)每一個(gè)菌株都可以產(chǎn)生至少一種具有類似活性的化合物，其細(xì)節(jié)描述如下。在測(cè)試它們的過(guò)程中，被鑒別為解藻酸弧菌株的一株公眾可獲得的菌株ATCC 19108在培養(yǎng)時(shí)不顯示解藻酸弧菌的特點(diǎn)，而進(jìn)一步測(cè)序其16S RNA基因揭示，其應(yīng)該更準(zhǔn)確地被歸類為解蛋白弧菌。從以下提供的信息，及從此處提供的測(cè)試方法，其它弧菌菌種，如解蛋白弧菌，鯊魚弧菌(V.carchariae)，哈氏弧菌(V.harveyi)，坎氏弧菌(V.campbellii)，和副溶血弧菌(V. parahaemolyticus)也可以進(jìn)行相應(yīng)的測(cè)試，并從中生產(chǎn)抗污損劑。
以下是生產(chǎn)，鑒定和使用通過(guò)本發(fā)明獲得的抗污損劑的詳細(xì)說(shuō)<p>表2
UV柔軟觸覺(jué)制劑和面板(panel)的制備在250ml燒杯中，用Dispermat CV分散混合器在1000rpm的攪拌下使70份的每種分散體與0.77份Byk-346和0.62份Tego Foamex 805混合。向該混合容器中加入(在1500rpm的攪拌下)25份無(wú)光漿糊(Acematt TS-100/Disperbyk190/水(1/.4/10))。將上述溶液混合10分鐘。在100ml燒杯中，使9.85份去離子水與6.50份丁基卡必醇混合。在1500rpm的攪拌下將上述溶液緩慢加入到250ml混合容器中。然后在500rpm的攪拌下將Irgacure 819-DW(1.5份)加入到混合容器中并將該溶液混合5分鐘以確保均勻性。將該制劑過(guò)濾到塑料廣口瓶中并放置過(guò)夜以消除泡沫。
使用用VM&P石胺油/異丙醇溶液(1∶1)潤(rùn)濕的紙巾將要涂層的面板擦拭干凈。然后使用常規(guī)噴涂技術(shù)即Binks 2001ss噴槍在45psi.下在面板上噴涂約4密耳(濕的膜厚度)的UV-可固化涂層。每種組合物分別涂覆5個(gè)面板。
噴涂后，將面板在室溫下放置10分鐘，然后在50℃烘焙10分鐘以去除全部水分。使用用VPS-3電源驅(qū)動(dòng)的HP-6-高功率的六英寸紫外燈(Fushion UVSystems，Inc)固化該涂層。傳送帶的速度設(shè)定為每分鐘10英尺，同時(shí)汞蒸汽燈設(shè)定為100％功率。這樣得到的總劑量約為2700mJ/cm2。
然后對(duì)面板進(jìn)行柔軟觸覺(jué)和耐化學(xué)性的試驗(yàn)。根據(jù)手感來(lái)測(cè)試涂層的柔軟<p>1.2在TCBS(硫代硫酸鹽-檸檬酸鹽-膽汁-蔗糖)瓊脂上的生長(zhǎng)形式小的，黃色的菌落1.3通過(guò)使用Biolog Microlog 2-系統(tǒng)(Biolog，Inc；USA)如使用手冊(cè)所述確定的碳底物的利用表2總結(jié)了使用Biolog Microlog 2系統(tǒng)所確定的DSM 15590和ATCC 17749(ATCC 17749是解藻酸弧菌模式株)的碳利用特性。
表2
+，陽(yáng)性；-，陰性；W，弱陽(yáng)性1.4DSM 15590的脂肪酸分布使用MIDI Sherlock微生物鑒別系統(tǒng)(MIDI，Inc.；USA)如使用手冊(cè)所述分析了生長(zhǎng)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂(在0.22μm過(guò)濾的海水中含0.5％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)酵母提取物，1.5％瓊脂)上的細(xì)菌菌落DSM 15590和ATCC 17749中的脂肪酸分布。結(jié)果示于表3。
表3
1.5 DSM 15590生產(chǎn)的抗污損劑的部分純化1.5.1懸浮，發(fā)酵為獲得經(jīng)DSM 15590發(fā)酵生產(chǎn)的具有抗污損活性的粗制樣品，穩(wěn)定期的該細(xì)菌菌株以5000×g離心或通過(guò)0.22μm過(guò)濾。細(xì)菌沉淀物或過(guò)濾殘?jiān)煤Ｋ疀_洗，隨后再懸浮于海水中。細(xì)菌懸浮液在25-30℃培養(yǎng)24小時(shí)，其后細(xì)胞再沉淀或過(guò)濾。無(wú)細(xì)胞的上清液含有抗污損劑。生物活性的粗制樣品用截留值為100kD的濾膜通過(guò)超濾脫鹽。可以使用相同的程序濃縮抗污損劑。每升海水中含0.25g(濕重)細(xì)菌產(chǎn)生0.035g(冷凍干燥重量)部分純化的抗污損產(chǎn)物。
1.5.2在生物膜反應(yīng)器中的生長(zhǎng)除了以上的方法，生物膜反應(yīng)器可以用來(lái)產(chǎn)生具有生物活性的粗制樣品。為此目的，將細(xì)菌菌株覆蓋過(guò)的板浸于海水中3小時(shí)，其后產(chǎn)生的海水含有抗污損化合物。使用上述同樣的作業(yè)程序脫鹽和濃縮。
1.6通過(guò)色譜進(jìn)一步純化所述部分純化的抗污損產(chǎn)物將部分純化的抗污損產(chǎn)物加在Sephacryl-400凝膠柱，用0.1M磷酸緩沖液(pH7)為洗脫液，以0.4ml/min的流速洗脫，并在220和254nm處雙波長(zhǎng)檢測(cè)。粗提物通過(guò)分子排阻色譜法(SEC)得到分離，同時(shí)還進(jìn)行生物活性跟蹤測(cè)定，結(jié)果示于圖3，其中標(biāo)示了每個(gè)組分的220nm和234nm的吸收值。
圖3中垂直虛線表示用于進(jìn)行抑制華美盤管蟲幼蟲附著活性分析的8個(gè)組分。在含有20個(gè)華美盤管蟲幼蟲、待測(cè)樣品和FSW中的加入20個(gè)用10-4M3-異丁基-1-甲基黃嘌呤理的華美盤管蟲幼蟲(幼蟲附著誘導(dǎo)劑)的無(wú)菌聚苯乙烯培養(yǎng)皿中進(jìn)行了靜水實(shí)驗(yàn)室生物活性分析，5個(gè)平行樣。1小時(shí)后，倒空培養(yǎng)皿并在顯微鏡下計(jì)數(shù)附著的幼蟲。這個(gè)分析的結(jié)果見(jiàn)表4。
FSW＝過(guò)濾海水的空白對(duì)照表4
數(shù)據(jù)是5次重復(fù)的平均數(shù)±SD。星號(hào)是顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Dunnett’s multiple pairwisecomparison test)1.7通過(guò)細(xì)菌發(fā)酵獲得的部分純化的產(chǎn)物的抗污損活性表5總結(jié)了解藻酸弧菌DSM 15590的部分純化的抗污損產(chǎn)物對(duì)3種類型常見(jiàn)污損生物的抗抗污損活性，所述常見(jiàn)污損生物是華美盤管蟲(管蟲)，總合草苔蟲(苔鮮蟲)，和紋藤壺(藤壺)。樣品是通過(guò)發(fā)酵(在400ml FSW中的3.37g濕重細(xì)菌沉淀物)24小時(shí)得到的。
如上述進(jìn)行管蟲生物分析。按照Bryan等(1997 Mar Ecol Prog Ser14681-90)用總合草苔蟲進(jìn)行幼蟲附著生物分析并按照Maki等(1988 Mar Biol 97199-206)用紋藤壺進(jìn)行生物分析。上述參考文獻(xiàn)全文引入本文作參考。
表5
1.8用生物膜反應(yīng)器制備的部分純化的抗污損產(chǎn)物的抗污著活性表6總結(jié)了所述產(chǎn)物對(duì)3種類型的常見(jiàn)污損生物，即華美盤管蟲(管蟲)，總合草苔蟲(苔鮮蟲)，和紋藤壺(藤壺)的抗污損活性。樣品是通過(guò)將上述的生物膜反應(yīng)器(在5ml海水中的5000個(gè)細(xì)胞mm-2的20cm2細(xì)菌膜)暴露3小時(shí)而得到。FSW＝過(guò)濾海水對(duì)照，F(xiàn)SW*＝含10-4M的3-異丁基甲基黃嘌呤(IBMX，一種華美盤管蟲幼蟲附著誘導(dǎo)劑)的過(guò)濾海水對(duì)照。用總合草苔蟲和紋藤壺的生物分析不加IBMX。
表6
1.9凝膠電泳特性和分析結(jié)果解藻酸弧菌DSM15590的部分純化抗污損產(chǎn)物和高生物活性組分2&3在1mm厚度的7.5％聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳，如圖4所示。電泳結(jié)束后(200V，45min)凝膠用銀(膠A)，考馬氏藍(lán)R-250(膠B)和甲苯胺藍(lán)(膠C)染色。泳道1蛋白質(zhì)標(biāo)記(ca.0.5mg/ml)；泳道2濃縮的部分純化的抗污損產(chǎn)物(ca.2mg/ml糖類)；泳道3SEC組分2；泳道4SEC組分3。主要標(biāo)記條帶被星號(hào)標(biāo)記d＝200kDa，c＝97.2kDa，b＝66.4kDa，a＝26.6kDa。圖4中的抗污損產(chǎn)物的電泳特性是(1)用銀染時(shí)，在分子量大于200kD處有條帶；(2)用考馬氏藍(lán)染色時(shí)，沒(méi)有條帶；(3)用甲苯胺藍(lán)染色時(shí)，在分子量大于200kD處有條帶。三種染色劑的結(jié)果證實(shí)抗污損化合物是一種多糖。
多糖的單糖組成組成分析的結(jié)果見(jiàn)表7。通過(guò)將多糖水解成的單糖乙?；缓罄脷庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)進(jìn)行糖殘基組成分析。將樣品溶入2M三氟乙酸(TFA)中，然后加入管中密封，在121℃水解2小時(shí)，然后用硼氫化鈉還原及用乙酐/TFA乙酰化。分析糖組成的GC/MS儀器為Hewlett Packard 5890型氣相色譜，30mSupelco 2330熔融石英毛細(xì)管柱，檢測(cè)器為5970質(zhì)譜儀。
表7
1.10 DSM 15590分泌的抗污損劑的生態(tài)毒性用總合草苔蟲的幼蟲對(duì)DSM 15590的純化的抗污損產(chǎn)物進(jìn)行生態(tài)毒性分析。將10個(gè)幼蟲加入含有50μl待測(cè)樣品溶液的聚苯乙烯帶蓋培養(yǎng)皿中。每個(gè)生物分析重復(fù)5次，并用FSW和CuCl2溶液作為相應(yīng)的空白對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。24小時(shí)后，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)幼蟲的死亡率。
這樣將輪輞型鋼的腰寬尺寸加大，從而使由之加工出的輪輞標(biāo)定寬度的尺寸加大，裝上輪胎時(shí)，內(nèi)胎充氣后，膨脹均勻，減少輪胎中部的膨脹，使外胎的側(cè)面平緩，增加了外胎的著地面積，使整車附著力大，方向性、制動(dòng)性好；對(duì)于載重貨車而言，每側(cè)輪軸上裝有兩個(gè)輪胎，這將使兩個(gè)輪胎之間的間距變寬，增強(qiáng)了輪胎的散熱效果，延長(zhǎng)了輪胎的使用壽命。
本實(shí)用新型對(duì)傳統(tǒng)輪輞型鋼的腰寬尺寸提出質(zhì)疑，盡管由這種型鋼制成的輪輞已經(jīng)導(dǎo)致上述的許多不足之處，卻從未有任何人去考慮對(duì)其進(jìn)行改進(jìn)的可能性。顯然，這種技術(shù)偏見(jiàn)已經(jīng)直接阻礙了對(duì)該技術(shù)的研究和開發(fā)。本實(shí)用新型無(wú)疑是一種克服技術(shù)偏見(jiàn)的技術(shù)，使輪胎與輪輞的配合更加合適。
本實(shí)用新型雖然只是對(duì)輪輞型鋼的腰寬尺寸進(jìn)行的改進(jìn)，但這種改進(jìn)顯然改變了輪輞型鋼的形狀，并且，這樣的改進(jìn)不但改變了輪輞的形狀，而且?guī)?lái)出乎意料的效果。
現(xiàn)將本實(shí)用新型各種規(guī)格的輪輞型鋼的腰寬尺寸增大范圍、最佳尺寸與現(xiàn)行行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的對(duì)應(yīng)尺寸制成下表
表10
表10中所示的可商業(yè)獲得的不同解藻酸弧菌菌株在無(wú)菌肉湯培養(yǎng)基(0.22μm過(guò)濾的海水中的0.5％(w/v)蛋白胨，0.3％(w/v)酵母提取物)中在30℃下培養(yǎng)24小時(shí)至穩(wěn)定期。通過(guò)離心收獲懸浮的細(xì)菌，并用滅菌的過(guò)濾海水中清洗，然后稀釋到在610nm波長(zhǎng)時(shí)光密度為0.1。向帶蓋聚苯乙烯培養(yǎng)皿中加入4ml細(xì)菌懸浮液，并在22℃培養(yǎng)3小時(shí)使細(xì)菌附著，其后培養(yǎng)皿用滅過(guò)菌的過(guò)濾海水中浸洗以除去未附著的細(xì)菌。除了5個(gè)培養(yǎng)皿用于幼蟲附著分析，3個(gè)培養(yǎng)皿用所列的細(xì)菌在培養(yǎng)皿表面做相應(yīng)的處理。這個(gè)實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)?zāi)ど系募?xì)菌數(shù)在8000-10000細(xì)胞/mm2之間。覆蓋了細(xì)菌膜的培養(yǎng)皿中加入4ml過(guò)濾的海水，并在22℃培養(yǎng)1小時(shí)以獲得水中細(xì)菌產(chǎn)物(以下稱為條件水)。條件水經(jīng)過(guò)100kDa膜的超過(guò)濾，其過(guò)濾殘?jiān)晦D(zhuǎn)移到新的培養(yǎng)皿中。含有不同解藻酸弧菌的條件水樣品的培養(yǎng)皿使用前述相同的方法用總合草苔蟲進(jìn)行幼蟲附著分析。1小時(shí)后統(tǒng)計(jì)幼蟲附著和變態(tài)數(shù)量，并與過(guò)濾海水對(duì)照(空白對(duì)照)比較。
如圖2所示，所有研究的菌株都明顯抑制總合草苔蟲幼蟲的附著和變態(tài)。
盡管描述本發(fā)明時(shí)使用了上述圖及DSM 15590和多種可獲得的解藻酸弧菌的特別實(shí)施例，應(yīng)理解這些只是實(shí)施例并不應(yīng)限制本發(fā)明。還應(yīng)理解盡管術(shù)語(yǔ)“抗污損劑”以單數(shù)形式使用，很明顯每個(gè)解藻酸弧菌菌株可能產(chǎn)生略有不同的制劑。然而，如果使用者選擇了純的單一的菌株來(lái)大規(guī)模生產(chǎn)所述抗污損劑，則可能是單一的制劑，因此以單數(shù)形式適當(dāng)描述它。而且，從此處提供的菌株獲得的抗污損劑表示了本發(fā)明的一些實(shí)施方案，而且使用此處提供的指導(dǎo)，可以將本發(fā)明的相同原理應(yīng)用于在相同菌種的其它菌株中生產(chǎn)抗污損劑。
序列表<110> 香港科技大學(xué)<120> 抗污損化合物及其生產(chǎn)方法<130> 12069-3<140> Not assigned<141> 2003-06-19<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 1490<212> DNA<213> 解蛋白弧菌或解藻酸弧菌<400> 1aagtcgagcg gaaacgagtt atctgaacct tcggggaacg ataacggcgt cgagcggcgg 60acgggtgagt aatgcctagg aaattgccct gatgtggggg ataaccattg gaaacgatgg120ctaataccgc atgatgccta cgggccaaag agggggacct tcgggcctct cgcgtcagga180tatgcctagg tgggattagc tagttggtga ggtaagggct caccaaggcg acgatcccta240gctggtctga gaggatgatc agccacactg gaactgagac acggtccaga ctcctacggg300aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgcaagcctg atgcagccat gccgcgtgta360tgaagaaggc cttcgggttg taaagcactt tcagtcgtga ggaaggtagt gtagttaata420gctgcattat ttgacgttag ctacagaaga agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc480ggtaatacgg agggtgcgag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgc atgcaggtgg540tttgttaagt cagatgtgaa agcccggggc tcaacctcgg aatagcattt gaaactggca600gactagagta ctgtagaggg gggtagaatt tcaggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc660tgaaggaata ccggtggcga aggcggcccc ctggacagat actgacactc agatgcgaaa720gcgtggggag caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgtctactt780ggaggttgtg gccttgagcc gtggctttcg gagctaacgc gttaagtaga ccgcctgggg840agtacggtcg caagattaaa actcaaatga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc900atgtggttta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctac tcttgacatc cagagaactt960tccagagatg gattggtgcc ttcgggaact ctgagacagg tgctgcatgg ctgtcgtcag 1020ctcgtgttgt gaaatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg caacccttat ccttgtttgc 1080cagcgagtaa tgtcgggaac tccagggaga ctgccggtga taaaccggag gaaggtgggg 1140acgacgtcaa gtcatcatgg cccttacgag tagggctaca cacgtgctac aatggcgcat 1200acagagggcg gccaacttgc gaaagtgagc gaatcccaaa aagtgcgtcg tagtccggat 1260
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權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)抗污損劑的方法，包含在適于弧菌生長(zhǎng)的水溶液中培養(yǎng)一種弧菌。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述弧菌選自于解藻酸弧菌(Vibrioalginolyticus)，解蛋白弧菌(Vibrio proteolyticus)，和其混合物。
3.權(quán)利要求2的方法，進(jìn)一步包含從所述水溶液中分離所述弧菌以形成含有所述抗污損劑的無(wú)細(xì)胞溶液。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述水溶液是海水，而且所述方法進(jìn)一步包含對(duì)所述無(wú)細(xì)胞溶液脫鹽。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述脫鹽是通過(guò)使用截留值100kDa的大小分離進(jìn)行的。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述弧菌選自以下菌株簇DSM15590，ATCC 14582，ATCC 17749，ATCC 19108，CIP 71.3，NCIMB1318，NCIMB 2047，和NCIMB 11038。
7.權(quán)利要求2的方法，其中所述弧菌選自以下菌株簇DSM15590，ATCC 14582，ATCC 17749，ATCC 19108，CIP 71.3，NCIMB1318，NCIMB 2047，和NCIMB 11038。
8.權(quán)利要求3的方法，其中所述弧菌選自以下菌株簇DSM15590，ATCC 14582，ATCC 17749，ATCC 19108，CIP 71.3，NCIMB1318，NCIMB 2047，和NCIMB 11038。
9.一種抗污損劑是由在水溶液中培養(yǎng)由解藻酸弧菌，解蛋白弧菌簇中的弧菌而形成的培養(yǎng)物中獲得，所述水溶液適于弧菌的生長(zhǎng)。
10.權(quán)利要求9的抗污損劑，其中所述解藻酸弧菌菌株名稱為DSM 15590。
11.權(quán)利要求9的抗污損劑，其中含有所述抗污著劑的粗提物的分離步驟，該分離步驟包括從含有抗污損劑的所述溶液中將所述弧菌分離出去。
12.權(quán)利要求10的抗污損劑，其中含有所述試劑的培養(yǎng)物被進(jìn)一步通過(guò)一分離步驟，該分離步驟包括從含有抗污損劑的所述溶液中將所述弧菌分離出去。
13.權(quán)利要求9的抗污損劑，其具有至少100kDa的大小。
14.權(quán)利要求10的抗污損劑，其具有至少100kDa的大小。
15.權(quán)利要求9的抗污損劑，其包含以下一組的單糖組成組分，所述組由半乳糖，葡萄糖，庚糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺及其混合物組成。
16.權(quán)利要求10的抗污損劑，其包含以下單糖組分，所述組由半乳糖，葡萄糖，庚糖，N-乙酰葡糖胺，N-乙酰半乳糖胺及其混合物組成。
17.一種抗污著組合物，其包含權(quán)利要求9的抗污損劑和適于在海上構(gòu)筑物上應(yīng)用的載體。
18.一種抗污著組合物，其包含權(quán)利要求10的抗污損劑和適于在海上構(gòu)筑物上應(yīng)用的載體。
19.權(quán)利要求17的抗污損化合物，其中所述載體選自如下一組船舶涂料，船舶涂層及其混合物。
20.一種減少海上物體表面污著的方法，包含應(yīng)用上述抗污損劑于構(gòu)筑物表面，所述抗污損劑是由選自于由解藻酸弧菌，解蛋白弧菌及其混合物組成的組中的弧菌所分泌的。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述解藻酸弧菌是名稱為DSM15590的菌株。
22.一種名稱為DSM 15590的細(xì)菌純培養(yǎng)物。
全文摘要
本發(fā)明描述了通過(guò)在適于解藻酸弧菌生長(zhǎng)的水溶液中培養(yǎng)解藻酸弧菌而產(chǎn)生的抗污損劑。所述抗污損劑是解藻酸弧菌生產(chǎn)和分泌的，可以用作生產(chǎn)其它抗污損化合物的成分。根據(jù)用途，解藻酸弧菌產(chǎn)生的抗污損劑可以直接使用，或者進(jìn)行進(jìn)一步純化后使用。本發(fā)明還包括了一種新分離的解藻酸弧菌菌株(DSM 15590)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1572867SQ200410049569
公開日2005年2月2日 申請(qǐng)日期2004年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月19日
發(fā)明者錢培元, 塞爾蓋·多布列佐夫, 蒂爾曼·哈德, 劉振鈞 申請(qǐng)人:香港科技大學(xué)