專利名稱：Dna序列、其編碼的蛋白質(zhì)及制法、轉(zhuǎn)化酵母菌株及用途的制作方法
本申請是申請?zhí)枮?6106077.8申請的分案申請，原申請的申請日為1996年2月14日，發(fā)明名稱為“編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列和該蛋白質(zhì)及生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化酵母菌株，用途”。
編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana蛋白質(zhì)的DNA序列，δ7-Red蛋白質(zhì)，生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化酵母菌株，用途。
本發(fā)明涉及編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana蛋白質(zhì)的DNA序列，δ 7-Red蛋白質(zhì)，它們的生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化酵母菌株及其用途。
δ-5，7甾醇，δ-7還原酶(E.C.1.3.1.21)是一種微粒體酶，根據(jù)其在大鼠的肝勻漿中具有活性(M.E.Dempsey等人，MethodsEnzymol.，15，501-514，1969)以及在玉米植物制劑中具有活性(M.Taton等人，Biochem.Biophys.Res，Commun.，181，465-473，1991)已經(jīng)證明了該酶的存在。該還原酶依賴于NADPH并在體外將7-脫氫膽甾醇還原為膽甾醇。
膽甾是真核生物膜的主要組成成分，但根據(jù)種的不同顯示出結構上的差異。在真核生物例如酵母的細胞中，主要甾醇是麥角甾醇，該甾醇在C-5和C-7位均是不飽和的，在C-24位具有一個分支側(cè)鏈，并且在C-22位也是不飽和的，而哺乳動物甾醇特征在于在C-5位進行了脫飽和作用并且含有一個飽和的側(cè)鏈。植物中最有代表性的一般甾醇的谷甾醇，豆甾醇和菜油甾醇具有一個分支但飽和的側(cè)鏈并且如同脊椎動物的甾醇，在C-7位上也是不飽和的。對甾醇核結構之間的這種差異起作用的酶是δ-5，7甾醇，δ-7還原酶。
還從沒有將δ-5，7甾醇，δ-7還原酶純化至均一并且僅描述了部分純化方法(M.E.Dempsey等人；M.Taton等人，已經(jīng)引述過)。該蛋白質(zhì)的物理-化學特性還沒有得到表征。對該蛋白質(zhì)的序列信息以及針對該蛋白質(zhì)的抗體都沒有描述。此外，對患有RSH/Smith-Lemli-Opitz(SLO)綜合癥的人體的7-脫氫膽甾醇還原酶的近核效率已有描述(J.M.Opitz等人，Am.J.Med.Genet.，50，326-338，1994)。
采用已知方法還沒有獲得編碼δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的CDNA的克隆，利用該克隆可以鑒定相應蛋白質(zhì)的序列，也可以對人基因進行定性或者將該基因的先天性缺陷顯露出來，所述已知方法是使用例如雜交和/或免疫檢測技術。因此特別尋求可以實施克隆的有創(chuàng)造性的篩選方法，尤其是在沒有有關蛋白質(zhì)信息的情況下。
真菌膜的主要甾醇，豆甾醇在C-5，7位含有一對共軛的雙鏈，該雙鍵為多烯族化合物例如制霉菌素提供了抗霉菌素的活性(R.Bittman等人，J.Biol.Chem.260，2884-2889，1985)。根據(jù)制霉菌素作用的發(fā)揮對C-5，7位不飽和的甾醇在膜中的濃度有強烈依賴性這一情況，可以在釀酒酵母中選擇有關積累甾醇的突變菌株(S.W.Molzahn等人，J.Gen.Microbiol.，72，339-348，1972)。因此，突變體erg2和erg3積累甾醇，它們在C-5，7位沒有共軛雙鍵，因為它們分別在甾醇δ-8，7異構酶(W.Ashman等人，Lipids，26，628，1991)以及甾醇δ-5脫氫酶(B.Arthinton等人，Gene，102，39，1991)方面有缺陷。這樣的突變體是能生存的，因為在適當條件下可用不同替代甾醇包括膽甾醇代替豆甾醇，酵母的主要天然甾醇。
發(fā)明人利用一種干擾釀酒酵母代謝的篩選方法將編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的異源蛋白質(zhì)的CDNA進行克隆，發(fā)現(xiàn)了富含在C-5，7位沒有雙重不飽和的甾醇的酵母菌株其對制霉素素抗性的增加是具有益處。而且這種方法的成功之處在于克服了許多技術難點也是沒有預見到的，該方法具有不依賴于已知DNA序列或蛋白質(zhì)并且可僅根據(jù)酶活性進行檢測的雙重優(yōu)點。
第一方面的限制處來自于下列事實制霉菌素起作用的方式還沒有被完全闡明(L.W.Parks等人，CRC Critical Reviews inMicrobiology，301-304，1978)。例如，由于促使酵母中對自發(fā)基因組突變例如erg突變體(S.W.Molzahn等人，已經(jīng)引述過)或者涉及獨立于甾醇途徑的抗性的基因組突變發(fā)生進行選擇的制霉菌素的間接特性，這種低特異性的制霉菌素的選擇作用是可預見到的。同樣，由基因文庫轉(zhuǎn)化的細胞可以表達能提供與甾醇途徑不相關的制霉菌素抗性的異源基因。
另一個預料中的受限制方面的實例是涉及下列事實該異源蛋白質(zhì)在細胞中活性弱，由于例如下列原因之一而導致對制霉菌素沒有或較低抗性1)微弱地表達編碼δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的基因；2)由于缺乏折疊或者由于不正確的亞細胞定位，該蛋白質(zhì)是弱活性或沒有活性；3)植物蛋白質(zhì)不能將酵母自身甾醇辨認為底物或者4)可以作為底物的甾醇是酯化形式或者貯存于泡囊中并且不與酶接觸。因此，預期以這種方式積累的甾醇逃脫了δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的作用，在真核生物中認為該還原酶定位于微粒體中。
本發(fā)明涉及根據(jù)一種克隆方法將編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)(命名為δ-7Red)的A.thaliana cDNA的進行克隆，所述克隆方法是根據(jù)對制霉菌素的抗性在酵母中進行代謝干擾來完成的。該δ-7Red蛋白質(zhì)通過一個生物還原方法使在C-7位不飽和的甾醇被還原，另外，該蛋白質(zhì)為使甾醇或類固醇(在C-5，7位有雙重不飽和位)的C-7位進行選擇性還原提供了有益的解決辦法，這種選擇性還原作用是采用化學途徑的還原方法達不到的。
本發(fā)明還涉及表達δ-7Red的轉(zhuǎn)化酵母細胞，所述酵母細胞以令人驚奇的方式積累C-7位飽和并且C-22位飽和或不飽和的產(chǎn)品，與豆甾醇相反，該產(chǎn)品是膽因醇側(cè)鏈的限制性酶的底物即細胞色素P450SCC。
這些未曾預料到特性可將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母用于制備具有工業(yè)的和/或藥物用途的甾醇或類固醇的方法中，尤其是通過在腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(ADR)和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白(ADX)存在下，由細胞色素P450SCC(P450SCC)在第C-7位上使之還原而使內(nèi)源酵母甾醇發(fā)生生物氧化從而制備孕甾烯醇酮。還可以將本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母用于制備在哺乳動物和其他脊椎動物中膽固醇轉(zhuǎn)化為氫化可的松的代謝途徑的中間產(chǎn)物類固醇的方法中。這種應用具有在生物氧化方法制備氫化可的松或其中間體的優(yōu)點，這種方法不需要將外源甾醇例如膽甾醇用作為起始底物，從而回避了甾醇滲透到酵母中的問題，前面已經(jīng)描述過在有氧條件下外源甾醇不具有滲透性(R.T.Lorentz等人，J.Bacteriology，981-985，1986)。
本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的克隆方法獲得的核酸序列的使用。編碼δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的RNA或DNA可用于診斷或治療涉及δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的基因產(chǎn)物的疾病。例如，據(jù)推測能將7-脫氫膽固醇轉(zhuǎn)化為膽固醇的δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的缺陷與RSH/SLO綜合癥有關。因此，可將人DNA序列用作為探計，用于診斷δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的缺陷，并且也可用于糾正這種缺陷而進行的基因治療。
因此，本發(fā)明的一個主題是一種核酸序列，包含有編碼具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的序列，所述核酸是一種DNA或一種RNA并且尤其是一種CDNA。
利用在實施例部分進一步描述的體外酶促檢測方法例如，可以顯示δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性。
本發(fā)明更具體的一個方面是涉及一種cDNA序列，其中的編碼序列為具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana的蛋白質(zhì)編碼，并且它具有序列SEQ ID No.1的核苷酸序列GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA 60AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC 111Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr1 5 10GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu15 20 25CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe30 35 40GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro45 50 55 60
AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe65 70 75GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro80 85 90ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala95 100 105GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly110 115 120ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser125 130 135 140GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys145 150 155GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu160 165 170ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys175 180 185AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser190 195 200TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn205 210 215 220
GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val225 230 235TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met240 245 250GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu255 260 265GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn270 275 280CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala285 290 295 300GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA1023Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln305 310 315GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG1071Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro320 325 330TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT1119Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr335 340 345AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT1167Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His350 355 360TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC1215Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu365 370 375 380TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT1263Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe385 390 395
GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA1311Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys400 405 410TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA1359Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly415 420 425ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC 1415Ile Tyr430GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A1496以及該序列的等位變異體。
編碼具有相應于圖3中所示序列(SEQ ID NO2)的430個氨基酸的蛋白質(zhì)的上述cDNA序列是一種cDNA序列，按照在下文中進一步詳細描述的操作條件，利用基于酵母對制霉菌素的抗性出現(xiàn)進行的篩選方法，從A.thaliana表達文庫開始在酵母中進行克隆可以獲得該cDNA序列。
知道了上述的核苷酸序列SEQ ID NO1，采用本領域內(nèi)技術人員已知的方法，例如采用化學合成法或者利用合成的寡核苷酸探針以及雜交技術篩選基因文庫或cDNA文庫或者采用PCR擴增?？梢灾貜捅景l(fā)明。
本發(fā)明還有一個主題是涉及編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，該DNA序列在中等或者高度嚴緊條件下與SEQ ID NO1的核苷酸序列雜交或者這兩個序列有約60％或者更多的序列相同性。
在中等嚴緊的標準條件下，例如在50％甲酰胺SSC×6溶液中，42℃雜交12小時，隨后進行洗滌或者在低嚴謹性條件下，例如在20％甲酰胺，SSC×6溶液中，于42℃雜交24小時，隨后在已知標準條件下進行洗滌(T.Maniatis等人，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)能夠以一種可檢測方式將上述所述序列與SEQ ID NO.1序列進行雜交。
利用例如BLAST程序″basic local alignment search tool″(S.F.Altschul等人，J.Mol.Biol.，215，403-410，1990)在NCBI輔助器上測出核苷酸序列等同性的百分數(shù)。
本發(fā)明還涉及編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列，并且采用PCR技術，利用編碼具有SEQ ID NO3氨基酸序列的共有序列的寡核苷酸作為引物可擴增該DNA序列Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa1 5 10Xaa Tyr15其中7位的Xaa是Trp或者Tyr并且第12位的Xaa是His或者Lys。
上述SEQ ID NO.3序列對應于一種新的共有序列，通過對從SEQ ID NO.1核苷酸序列推測出的新序列SEQ ID NO.2與編碼在除C-7位以外的一個位置上具有持異性作用的其他甾醇還原酶或者編碼lamin B受體的已知序列之間的氨基酸序列等同性進行排列，已經(jīng)對該新的共有序列進行了限定，在實施例部分對該步驟將作詳細描述。根據(jù)氨基酸序列SEQ ID NO.3給出的信息，可以定義并合成至多由45個核苷酸組成的引物，利用該引物，并與作為返回序列的第二種引物寡聚dT(17個核苷酸)結合一起，可以用商業(yè)途徑購買的PCR檢測藥盒(例如Stratagene)，對編碼具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA進行擴增。
本發(fā)明還涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性并且具有SEQID NO2的氨基酸序列的A.thaliana蛋白質(zhì)
Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr20 25 30Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp35 40 45Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu50 55 60Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala85 90 95Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val100 105 110Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro115 120 125Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe130 135 140Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala145 150 155 160Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ila Ile Asp Phe165 170 175Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile180 185 190Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu195 200 205Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser210 215 220
Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys225 230 235 240Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His245 250 255Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro260 265 270Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu275 280 285Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys290 295 300Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg305 310 315 320Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val325 330 335Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu340 345 350Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu355 360 365Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe370 375 380Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys385 390 395 400Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu405 410 415Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr420 425 430以及該序列的等位變異體和類似物。
對于等位體和類似物，包括通過取代，缺失或增加一或多個氨基酸而修飾得到的序列，只要這些產(chǎn)物保留了相同的功能。利用本領域內(nèi)已知的位點特異性誘變技術例如可以制備這些修飾序列。
本發(fā)明的一個特定方面是具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性并且具有上述的SEQ ID NO.2氨基酸序列的A.thaliana蛋白質(zhì)并且命名為δ-7Red。
本發(fā)明還涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)的氨基酸序列與SEQ ID NO.2序列具有約60％和更多的序列等同性。
利用上面指出的BLAST程序例如可以測出等同性百分數(shù)。
本發(fā)明還涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性以及與上文中定義的A.thaliana δ-7Red蛋白質(zhì)具有交叉免疫反應性的蛋白質(zhì)。
例如利用根據(jù)已知方法制備的針對δ-7Red蛋白質(zhì)的抗血清，以及免疫沉淀方法可以檢測到該蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的一個方面涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)例如通過在含有前面定義的DNA序列的宿主細胞中表達而獲得的蛋白質(zhì)，本發(fā)明具體涉及A.thaliana蛋白質(zhì)，例如通過在含有編碼上述SEQ ID NO.2的氨基酸序列的DNA序列的宿主細胞中表達而獲得的蛋白質(zhì)。
當在宿主細胞表達而獲得本發(fā)明蛋白質(zhì)時，可根據(jù)本領域內(nèi)技術人員熟知的遺傳工程方法和細胞培養(yǎng)方法來完成。
表達可以在原核宿主細胞，例如大腸桿菌或在真核宿主細胞例如哺乳動物細胞，昆蟲細胞或酵母中完成，所述宿主含有前面有合適啟動子的編碼本發(fā)明的δ-7Red的序列。
所獲得的重組蛋白可以是糖基化的或非糖基化的。
具體地講本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明得到的蛋白質(zhì)，例如通過在酵母細胞中表達獲得的。
本發(fā)明還涉及針對前面定義的具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的抗體。該抗體可以是根據(jù)本領域內(nèi)技術人員熟知的方法制備的一種多克隆或單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及含有前面定義的DNA序列的表達載體以及涉及由該載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
表達載體是允許蛋白質(zhì)在合適載體控制下進行表達的已知載體。對于原核細胞，啟動子可以是例如lac啟動子，trp啟動子，tac啟動子，β-內(nèi)酰胺酶啟動子或pl啟動子。對于哺乳動物細胞，啟動子可以是SV40啟動子或腺病毒的啟動子。桿狀病毒型載體也可用于在昆蟲細胞中進行表達。對于酵母細胞細胞該啟動子可以是例如PGK啟動子，ADH啟動子，CYC1啟動子或GAL10/CYC1啟動子。
宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。原核細胞例如有大腸桿菌，芽孢桿菌或鏈霉菌，原核宿主細胞包括酵母和絲狀真菌以及更高等生物細胞，例如哺乳動物細胞或昆蟲細胞。哺乳動物細胞可以是倉鼠CHO細胞或猴COS細胞。昆蟲細胞可以是例如SF9細胞。酵母細胞可以是例如釀酒酵母細胞，Schizosaccharomyces pombe或Kluyveromyces lactis本發(fā)明的又一主題是在微生物中克隆編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的核酸的克隆方法，該方法包括一種篩選方法，該篩選方法用于選擇-對制霉菌素或一種類似化合物具抗性的微生物，所述化合物的毒性依賴于在C-7位攜帶不飽和鍵的甾醇的存在而定，
克隆方法還包括-將該核酸與上述SEQ ID NO.1的核苷酸序列進行雜交，-利用數(shù)據(jù)處理技術從隨機分離到的DNA序列鑒別出該核酸，-直接表達該蛋白質(zhì)，隨后用針對具有上述SEQ ID NO.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的抗體進行免疫檢測。
所述微生物是指一種酵母例如釀酒酵母S.pombe或K.laetis。
類似于制霉菌素的化合物包括例如兩性霉素B或菲律賓菌素。
所述雜交是指在中等或高度嚴緊條件下根據(jù)已知標準方法(T.Maniatis等人，已經(jīng)引述)進行的雜交。
根據(jù)上面說明的BLAST程序例如可以完成利用數(shù)據(jù)處理技術進行鑒別。
在實施例部分進一步描述了上面所述克隆方法的一個實例，其中的篩選方法使用了對制霉菌素具抗性的酵母。
本發(fā)明的一個主題還包括采用上面克隆方法獲得的DNA或RNA核酸序列。核酸序列可根據(jù)完成克隆所取材料而分為原核或真核來源例如來源于人類。
本發(fā)明的一個方面還涉及用含有經(jīng)上述克隆方法得到之DNA序列的載體而轉(zhuǎn)化的宿主細胞，宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。前文已列舉了宿主細胞和載體的實例。
本發(fā)明的一個方面還特別涉及由載體轉(zhuǎn)化的選自酵母或絲狀真菌的宿主細胞，所述載體含有本發(fā)明上文所定義的DNA序列或用上述克隆方法得到的DNA序列。
本發(fā)明一個方面也涉及具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的制備方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的轉(zhuǎn)化宿主細胞，并且分離表達的蛋白質(zhì)，本發(fā)明特別涉及其中所用宿主細胞為一種轉(zhuǎn)化酵母的方法，在該宿主細胞中DNA序列處于酵母啟動子控制之下。
本發(fā)明的另一方面涉及在C-7位上不飽和的甾醇的體外還原方法，其中包括將待還原的甾醇與上述方法獲得的蛋白質(zhì)進行保溫，并且選擇性包括分離獲得被還原甾醇的步驟。
本發(fā)明一個方面還涉及在C-7位不飽和的外源甾醇的體內(nèi)還原方法，該方法包括將甾醇與本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化酵母細胞一起保溫，并且可選擇性地采用分離被還原甾醇的步驟，宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞，尤其是酵母或絲狀真菌。
本發(fā)明的一個方面還涉及在C-7位不飽和的內(nèi)源甾醇的體內(nèi)還原方法，其中培養(yǎng)選自于酵母或絲狀真菌的本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主菌株，并且選擇性地采用分離所積累的還原所得甾醇的步驟。
具體地說，本發(fā)明涉及上述定義的體外或體內(nèi)還原方法，其中所獲得的被還原的甾醇是膽固醇側(cè)鏈限制性酶的底物(P450SCC)并且本發(fā)明尤其是涉及體內(nèi)還原方法，其中待還原的內(nèi)源甾醇是麥角甾5，7二烯3-醇，麥角甾5，7，24(28)三烯3-醇或者麥角甾5，7，22三烯3-醇或者它們的混和物。
本發(fā)明的一個方面還涉及孕甾烯醇酮的生產(chǎn)方法，其中包括將選自于酵母或絲狀真菌的本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化宿主細胞進行培養(yǎng)，將在C-7位被還原的被積累的內(nèi)源甾醇或類固醇進行分離或不分離，在P450SCC存在，并且有或沒有腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADR)以及腎上腺皮質(zhì)激素(ADX)存在下保溫被還原的甾醇，并且分離或不分離獲得的孕甾烯醇酮。
本發(fā)明的一個特定方面是生產(chǎn)上文中定義的孕甾烯醇酮的方法，其中宿主細胞是酵母。
本發(fā)明還涉及孕甾烯醇酮的生產(chǎn)方法，其中將由一個或多個載體轉(zhuǎn)化的酵母進行培養(yǎng)，所述載體允許具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)以及P450SCC以及有或沒有ADR和ADX一起共表達，對游離或酯化的孕甾烯醇酮進行分離或不分離。
本發(fā)明特別涉及上述方法，在該方法中將具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，P450SCC，ADR和ADX進行共表達的轉(zhuǎn)化酵母進行培養(yǎng)，更具體地涉及這樣的方法，其中具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是A.thalianaδ-7Red的蛋白質(zhì)，并更進一步涉及其中酵母菌株是ECO1/PCD63的菌株的上述方法。
在實施例部分進一步給出了本發(fā)明所述孕甾烯醇酮的生產(chǎn)的實施例。
用于實施孕甾烯醇酮生產(chǎn)方法的轉(zhuǎn)化酵母可以是例如由本發(fā)明表達載體以及細胞色素P450SCC和包括或不包括ADX和ADR的表達載體共轉(zhuǎn)化的酵母，所述表達載體含有編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性之蛋白質(zhì)的DNA序列。細胞色素P450SCC和/或ADX的表達載體是已知的并且其制備描述于例如歐洲專利申請EP0340878以及進一步可參見實施例部分描述。
所使用的轉(zhuǎn)化酵母還可以是一種酵母，其中編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的DNA序列整合到基因組特定位點，例如在ADE2位點，并且麥角甾醇不再是在δ-7還原酶表達條件下的主要甾醇。然后用整合性表達盒或由表達載體轉(zhuǎn)化獲得的″整合″酵母，所述表達載體含有編碼細胞色素P450SCC并且包括或不包括ADX和ADR的DNA序列。
在實施例部分進一步給出了構建體內(nèi)生產(chǎn)孕甾烯醇酮或其乙酸酯的酵母菌株的實施例。
因此本發(fā)明主題還包括轉(zhuǎn)化酵母菌株，它能共表達具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，P450SCC，ADR和ADX并且積累游離或酯化孕甾烯醇酮，本發(fā)明特別包括這樣的上述酵母菌株，其中具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是A.thaliana δ-7Red蛋白質(zhì)以及具體涉及稱為ECO1/PCD63酵母菌株，其精確結構進一步描述于實施例部分。
本發(fā)明還延伸到根據(jù)上文中定義的克隆方法獲得的人DNA序列，利用該序列作為探針可用于診斷δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的先天性缺陷。δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的缺陷包括例如7-脫氫膽固醇還原酶的缺陷，該酶的缺陷是導致血漿中膽固醇含量異常低的原因。
本發(fā)明還涉及檢測δ-5，7甾醇，δ-7還原酶缺陷的方法，該方法包括在標準雜交條件下將含有人基因組DNA的樣品與上文中定義的探針一起保溫，并且展現(xiàn)出該探針是否與基因組DNA固定，如果后者沒有被固定或還原，表明δ-5，7甾醇，δ-7還原酶先天性缺陷。
本發(fā)明方法還可用于例如檢測胎兒期或新生兒以及患有各種疾病的病人尤其是具有RSH/SLO綜合癥臨床表現(xiàn)的患者的δ-5，7甾醇，δ-7還原酶的先天缺陷。
附圖描述了發(fā)明的特定方面

圖1表示從對制霉菌素具抗性的F22克隆提取到的總甾醇的概況，所述克隆是通過從FY1679酵母中篩選A.thaliana文庫獲得的。在205nm或在285nm處進行RP-HPLC(圖1A)或者與未轉(zhuǎn)化酵母FY1679比較GC(圖1B)可完成上述分析。
圖2描述了pF22質(zhì)粒的NotI片段的限制性圖譜以及測序方案。
圖3描述了cDNA δ-7Red的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)以及相應的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)。
圖4描述了用誘導型表達載體″δ-7/V8″轉(zhuǎn)化的FY1679的微粒體部分的δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的體外檢測。分析是采用GC進行的，并且證明在內(nèi)源甾醇5，22二烯3-醇(RT＝16.682)；麥角甾醇(RT＝17.249)；麥角甾5-烯3-醇(RT＝17.664)存在下底物7-脫氫膽固醇(RT＝16.528)轉(zhuǎn)化為膽固醇(RT＝15.887)。
圖5描述了孕甾烷酮醇的體外制備，即通過將從表達δ-7Red的轉(zhuǎn)化酵母純化到的麥角甾5-烯3-醇(圖5A)；麥角甾5，24(28)二烯3-醇(5B)或麥角甾5，22二烯3-醇(5C)進行限制，然后與P450SCC，ADX和ADR一起保溫而制備。通過與作為對照限制的膽固醇比較GC而進行分析。
圖6描述了整合性質(zhì)粒PADδ-7的構建，該質(zhì)粒允許編碼δ-7Red(甾醇δ-7還原酶)的cDNA整合到ADE2位點。
圖7描述通過將在半乳糖存在下培養(yǎng)的FY1679菌株和ELR01整合菌株進行堿性皂化而提取到的總甾醇的GC進行分析結果。
圖8是穿梭載體大腸桿菌-釀酒酵母V13的構建示意圖，該載體在多克隆位點中含有單一的Sal I(Sa)位點。
圖9表示整合質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構建過程，這兩質(zhì)粒允許ADR表達盒插入到leu 2基因和Spl1δ基因的基因間隔區(qū)。MCS1和MCS2多克隆位點圖10表示CDRO1菌株的構建方案。
圖11表示含有兩個表達盒ADX和P450SCC的PCD63表達質(zhì)粒的構建過程。
圖12表示對甾醇的GC進行的分析，所述甾醇是從用半乳糖誘導9小時(圖12a)或24小時(圖12b)之后的EC01/PCD63菌株分離到的細胞(細胞裂解液)或培養(yǎng)基(介質(zhì))提取的。
圖13表示pTG7457質(zhì)粒的結構。
圖14表示pTG7453質(zhì)粒的結構。
圖15表示pTG10014質(zhì)粒的結構。
圖16表示pTG10004質(zhì)粒的結構。
圖17表示pTG10031質(zhì)粒的結構。
圖18表示pTG10033質(zhì)粒的結構。
下列實施例是用于描述發(fā)明而不是用于限制。
實施例1編碼A.thaliana的δ-5，7甾醇，δ-7還原酶(δ-7Red)的CDNA的克隆A.-在酵母中篩選A.thaliana表達文庫起始cDNA表達文庫是由M.Minet等人(Plant J.，2，417-422，1992)描述的文庫，該文庫是從二片子葉發(fā)芽期的A.thaliana的mRNA制備的，并且其兩為Not I位點的CDNA已被插入到穿梭載體大腸桿菌/釀酒酵母PFL61的表達盒的Bst XI位點。該表達盒含有磷酸甘油酸激酶基因(PGK)的啟動子和終止序列。酵母的復制原點來源于2u序列，并且有一個選擇指示信號URA3保證載體在酵母中繁殖。該載體在大腸桿菌中繁殖是源自于pUC19質(zhì)粒。
利用由D.Gietz等人描述的乙酸鋰方法(Nucleic Acids Res.，20，1425，1992)由CDNA文庫轉(zhuǎn)化FY1679酵母菌株(Mata)，該菌株是由A，Thierry等人描述的S288C菌株的等基因菌株(Yeast，6，521-534，1990)。
在含有7克/升的″酵母氮源″(Difco)，1克/升的細菌酪蛋白氨基酸(Difco)，20克/升葡萄糖，20mg/升的色氨酸并且不含尿嘧啶的SGI合成培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)細胞。然后將獲得的105個尿嘧啶原養(yǎng)型轉(zhuǎn)化體分組并在相同的無尿嘧啶并含有2或5μg/ml制霉菌素的合成培養(yǎng)基平板上以每平皿5×104個細胞的比例進行培養(yǎng)。以這種方式對每個制霉菌素濃度篩查106個轉(zhuǎn)化體。在28℃培養(yǎng)3天之后，以5個克隆為一組收集大約100個在2μg/ml制霉菌素濃度生長的克隆，采用反相高效液相色譜(在下文中稱為RP-HPLC)分析這些克隆的甾醇組分，而在濃度為5μg/ml的制霉菌素時獲得了稱為F22的單個抗性克隆。
B.-分析在F22克隆中積累的甾醇根據(jù)L.Parks等人描述的堿性皂化方法(Methods in Enzymol，111，333-346，1985)制備酵母的總甾醇，然后采用RP-HPLC和/或采用氣相色譜(稱為GC)進行分析。
將獲得的甾醇殘基溶于乙醇-四氫呋喃-水混合物(65∶10∶25V/V)中，然后采用RP-HPLC方法在Applied Biosysterns C18鍵合的二氧化硅柱(100×2.1mm)上以1ml/分鐘的流速以及在55℃和利用溶于水中的甲醇的線性梯度(50％-100％，經(jīng)18分鐘)對此混合物進行分析，在205nm和285nm處檢測光密度值，并與麥角甾醇，油菜甾醇和膽固醇標準物進行比較。
在Alltech SE-30毛細管柱(30m×0.32mm)上用氦作為載體氣體，對于注射器和檢測器溫度分別為280℃和310℃，在起始時溫度從110℃增加到245℃時增加速度為45℃/分鐘，然后增加速度為3℃/分鐘以至達到280℃，再對甾醇組合物的GC進行分析。
根據(jù)RP-HPLC分析(圖1A)以及根據(jù)GC分析(圖1B)顯示了上面獲得的F22克隆中積累甾醇的概況，其特征為在非轉(zhuǎn)化菌株FY1679中的主要甾醇麥角甾醇實質(zhì)上完全消失，并由兩種主要甾醇以相同的量取代，它們在285nm處沒有吸收峰，因而根據(jù)RP-HPLC分析，獲得的甾醇不再具有共軛的雙不飽和鍵。
在圖1A中，油菜甾醇(Sigma)(24-R-麥角甾-5-烯-3-醇)含有大約35％的二氫蕓苔屬甾醇(24-S-麥角甾5-烯-3-醇)。
C-δ-7Red CDNA的克隆根據(jù)J.N.Strathern等人描述的方法(Methods in Enzymol.，194，319-329，1991)，在大腸桿菌中擴增源自于F22克隆的質(zhì)粒，然后用Not I進行消化。獲得約600堿基對(bp)的片段以及1.6kbp的片段。分別用上面各個片段轉(zhuǎn)化FY1679菌株。按照上面指示的方法對轉(zhuǎn)化酵母的各個克隆的甾醇的組分進行分析，并且辨別出攜帶有對甾醇的修飾情況起作用的基因的質(zhì)粒。以這種方式鑒別出的質(zhì)粒稱為PF22。
D-δ-7Red的CDNA序列的測定將pF22的CDNA插入物再克隆到來源于PUC9(pharmacia)的PUC9N載體的Not I位點，該載體中多克隆位點中的EcoRI位點被插入的Not I限制性位點所替代，但保留了Lacz基因的閱讀框架。然后測出限制性圖譜(圖2)。
將分別含有Not I外來位點以及EcoRI，Pvu II或Hind III內(nèi)源位點的限制性片段亞克隆到pBluescript質(zhì)粒(Stratagene)上。利用PBluescript PUC9，T3和T7的直接和反向引物或者推導出的CDNA核苷酸序列的特異引物，根據(jù)Sanger方法以及DNA聚合酶測序酶(Stratagene藥盒)，在兩條鏈上測定核苷酸序列。
所獲得所有序列匯編代表A.thaliana的δ-7Red CDNA核苷酸序列(SEQ ID NO.1)，其序列列于圖3中。該序列含有1496個核苷酸，其末端含有一個多聚腺苷酸序列。該序列有一個開放式閱讀框架，該框架起始于第76核苷酸的甲硫氨酸起始密碼子，結束于第1366位核苷酸的終止密碼子。這樣該開放式閱讀框架具有1290個核苷酸，編碼含有430個氨基酸的蛋白質(zhì)。編碼δ-7Red蛋白質(zhì)的δ-7Red CDNA的編碼區(qū)，及其推測出的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)顯示于圖3中。該蛋白質(zhì)序列包括430個氨基酸胺，它具有計算出的分子質(zhì)量為49.286KDa。
含有位于載體PUC9N中的δ-7Red CDNA(命名為δ7Red/PUC9N CDNA)的大腸桿菌DH5-1菌株的樣本于1995年2月10日寄存于CNCM，寄存號為I-1535。
E-共有序列SEQ ID NO.3的測定利用序列數(shù)據(jù)庫(Genbank和EMBL)進行計算機檢索，已經(jīng)證明A.thaliana的δ-7Red蛋白質(zhì)的序列與其他甾醇還原酶具有某些序列相似性，尤其是與由R.T.Lorentz等人(DNA Ceu Biol.，11，685-692，1992)以及W.Chen等人(Yeast，7，305-308，1991)分別描述的釀酒酵母的甾醇C-14還原酶以及甾醇C-24(28)還原酶，以及由M.Shimanuki等人(Mol.Biol，Cell，3，263-273，1992)描述的S.Pombe的sts 1+基因的產(chǎn)物以及Neurospora crassa的甾醇C-14還原酶(在EMBL數(shù)據(jù)庫中為NO.X77955)。另外，δ-7Red蛋白質(zhì)與由H.J.Worman等人(J.Cell Biol.，111，1535-1542，1990)以及E.Schuler等人(J.Biol.Chem.，269，11312-11317，1994)描述的雞野芝麻花堿B受體的C末端的400個氨基酸以及人受體的相應區(qū)域都具有相似性。
在由上面獲得的δ-7Red cDNA推導出的SEQ ID NO.2氨基酸序列和三個酵母甾醇還原酶以及兩個野芝麻花堿B受體的氨基酸序列進行序列等同性排列，然后為了制備寡核苷酸，定義了一個具有下列氨基酸序列的新的共有序列(SEQ ID NO.3)Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa Xaa15 10Tyr15其中第7位上的Xaa是Trp或Tyr以及第12位上的Xaa是His或者Lys，所制備的寡核苷酸可在PCR中用作為引物用于擴增編碼具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的新的基因組DNA或cDNA序列。
F-δ-7Red蛋白質(zhì)在酵母中的表達a)在酵母中構建誘導型表達載體δ-7/V8利用下面特定寡核苷酸通過PCR擴增將PF22的CDNA的非編碼區(qū)缺失5′CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 3′(SEQ ID No.4)和5′CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG 3′(SEQ ID No.5)定義這些寡核苷酸是為了在緊接起始密碼子的上游導入一個BamHI限制性位點，并且在緊挨終止密碼子的下游導入一個Kpn I位點。
在2個單位的Pfu DNA聚合酶以及0.2μM的每個上述各種引物。存在下，利用下面擴增條件94℃，10秒；52℃，50秒；74℃，90秒；從1ng的″δ-7Red/pUC9N cDNA″質(zhì)粒開始將該cDNA用Stratagene PCR藥盒擴增33個循環(huán)。
結果獲得了約1300bp的片段，然后用限制性酶BamHI和Kpn I進行消化并插入到C.Cullin等人(Gene，65，203-217，1988)描述的大腸桿菌/釀酒酵母pYeDP1/8-2穿梭載體(稱為V8)的BamHI和Kpn I位點。V8攜帶了選擇性指示劑URA3并且含有適用于酵母的表達盒，該表達盒含有啟動子GAL10/CYC1以及PGK基因的終止序列。由此獲得的載體稱為δ-7/V8，該載體可在半乳糖誘導時表達δ-7Red蛋白質(zhì)。
b)δ-7Red蛋白質(zhì)的生產(chǎn)采用D.Gietz等人描述的乙酸鋰方法(已經(jīng)引述過)用上述得到的δ-7/V8質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母菌株FY1679(Mata)。
在上面描述的SGI選擇性培養(yǎng)基(但是其中葡萄糖濃度為5克/升)上，于27℃將轉(zhuǎn)化酵母進行培養(yǎng)，直到獲得細胞密度達飽和(oD600nm＝12)。然后通過加入1倍體積的完全培養(yǎng)基YP(酵母提取物10克/升(Difco)并且細菌用蛋白胨(Difco)10克/升)，然后加入作為碳源的乙醇(1.5％V/V)而將該培養(yǎng)物稀釋，當生長至細胞濃度至少為7×107個細胞/ml時，加入濃度為20克/升的半乳糖而誘導δ-7Red的表達。
在SLI選擇性基本培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至細胞濃度為2×107個細胞/ml時也可以實施誘導，該SLI培養(yǎng)基相當于SGI培養(yǎng)基，但其中由半乳糖(20克/升)取代葡萄糖。
c)δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的體外酶促檢測利用M.Taton等人描述的酶促檢測法(Biochem.Bioph.Res.Commun，181，465-473，1991)但沒有利用NADPH再生系統(tǒng)，而是用上面描述的被誘導酵母的微粒體或胞液細胞制劑可以證明δ-7Red蛋白質(zhì)的表達。
將被誘導的細胞進行機械破碎可以獲得細胞的各個組分，并且采用由P.Urban等人描述的方法(Eur.J.Biochem.222，843-850，1994)進行超離心將各個部分分離。收集細胞，然后用TE-Kcl緩沖液(50mM Tris-Hcl，pH7.4；1mM EDTA，0.1MKcl)洗滌兩次，并且重懸于0.6MTE-山梨醇裂解緩沖液中。加入直徑為0.45-0.5mm(Braun)的玻璃珠，直到顯示玻璃珠穿過細胞懸液表面，然后在4℃攪拌5分鐘。將表面的細胞裂解液集合在一起，用裂解緩沖液將玻璃珠洗三次。將裂解液和洗液混合，然后在4℃以20,000g離心13分鐘，以便去除線粒體部分。將收集到的上清液于4℃以100,000g離心1小時。單獨收集含有微粒體部分的團丸以及代表胞質(zhì)部分的上清液。
將由此獲得的微粒體部分或胞質(zhì)部分分別在100mM Tris/Hcl緩沖液，pH7.3，37℃，以及在2mM NADPH存在下保溫90分鐘，所述緩沖液含有用吐溫-80(1.5g/l)乳化的150μm的7-脫氫膽固醇作為底物。通過加入3倍體積的甲醇-二氯甲烷混合物(50∶50，V/V)提取甾醇，然后與標準產(chǎn)物進行GC比較分析。
由上述FY1679酵母獲得的微粒體部分(3.5mg/ml蛋白質(zhì))將7-脫氫膽固醇(RT-16.528分鐘)轉(zhuǎn)化成的膽固醇(RT＝15.887分鐘)顯示于圖4中，所述FY1679酵母已用δ-7/V8載體轉(zhuǎn)化并且被誘導了3小時，其內(nèi)源甾醇具有較高的滯留時間(對于麥角甾5-22二烯3-醇其RT＝16.682；對于麥角甾醇其RT＝17.249分鐘并且對于麥角甾5-烯3-醇其RT＝17.664分鐘)。
這些結果證明該轉(zhuǎn)化酵母一方面表達δ-7Red蛋白質(zhì)，另一方面具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性。
實施例2在C-7位不飽和的酵母的內(nèi)源性甾醇的體內(nèi)還原用實施例1中獲得的δ-7/V8載體轉(zhuǎn)化酵母菌株，該菌株的主要甾醇在C-5，7位上具有一個雙鍵，然后按實施例1所述將該菌株培養(yǎng)并誘導。提取內(nèi)源甾醇，分析其GC概況，并按實施例1所述，利用制備性C18柱(100×4.6mm)采用RP-HPLC進行純化，然后根據(jù)IR，UV，MS和NMR進行鑒別。分別使用下面三個菌株-實施例1中描述的FY1679菌株；-突變菌株erg5，稱為PLC1051，其特征在于缺失了甾醇C-22去飽和酶，通過FY1679菌株和S.W.Molzahn等人描述的原始菌株pol5(J.Gen.Microbiol.，72，339-348，1972)之間進行雜交可以構建該菌株，該菌株積累麥角甾5，7-二烯3-醇。
-雙重突變菌株erg4，5，稱為PLC1451，其特征在于缺失甾醇C-22去飽和酶(erg5)以及甾醇C-24(28)還原酶(erg4)，通過將FY1679菌株與由S.W.Molzahn等人(已經(jīng)引證)描述pol5菌株進行雜交可獲得該突變菌株，其中pol5菌株在系統(tǒng)篩查用于研究甾醇突變體的酵母的過程中獲得了自發(fā)的對制霉菌素的抗性，所述雙突變菌株積累麥角甾5，7，24(28)三烯3-醇。得到的單倍體菌株攜帶雙突變erg4，erg5，它能在半乳糖和一種不能發(fā)酵的底物存在下生長，并且是尿嘧啶，色氨酸和組氨酸營養(yǎng)缺陷型。菌株PLC1051和PLC1451已于1995年2月10日寄存于CNCM，分別得到保存號為I-1536和I-1537。
下表中列出了分別從上述三個轉(zhuǎn)化菌株鑒別出的主要被還原甾醇起始菌株起始主要在C-7位被還原內(nèi)源甾醇的主要內(nèi)源甾醇- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -FY1679 麥角甾5，7，22三烯 麥角甾5-烯3-醇3-醇(麥角甾醇) (二氫油菜甾醇)麥角甾5，22二烯3-醇(油菜甾醇)erg5麥角甾5，7二烯3-醇 麥角甾5-烯3-醇PLC1051erg4，5 麥角甾5，7，24(28) 麥角甾5，24(28)二烯3-醇PLC1451 三烯-3-醇 (牡蠣甾醇)實施例3將在第C-7位上被還原的酵母內(nèi)源甾醇進行限制而體外制備孕甾烯酮醇利用Wada等人描述(Arch.Biochem.Biophys.，290，376-380，1991)的膽固醇側(cè)鏈的體外酶促限制檢測而制備孕甾烯酮醇，在該過程中，根據(jù)D.W.Seybert等人，J.Biol.Chem.，254，12088-12098，1979的描述在140nM腎上腺皮質(zhì)激素還原酶，1.16μM腎上腺皮質(zhì)激素和0.68μM來源于牛腎上腺的細胞色素P450SCC存在下，在150μl的10mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，100mM NaCl，0.3％吐溫20中將實施例2中獲得的在C-7位上被還原的甾醇260μM保溫。
通過加入150μM的NADPH而激發(fā)反應。在37℃保溫80分鐘之后，加入1倍體積的甲醇-二氯甲烷混合物(50∶50V/V)而終止反應。按實施例1所述提取甾醇并分析GC。
圖5分別證明麥角甾5-烯3-醇(圖5A)，麥角甾5，24(28)二烯3-醇(圖5B)或者麥角甾5，22二烯3-醇(圖5C)是細胞色素P450SCC的底物并且產(chǎn)生一種產(chǎn)物，該產(chǎn)物，與同樣條件下限制膽固醇獲得的孕甾烯醇酮具有同樣的RT。
所得結果顯示能表達δ-7Red的轉(zhuǎn)化酵母積累可直接用于通過體外生物氧化而制備孕甾烯酮醇的甾醇。
實施例4體內(nèi)生產(chǎn)孕甾烯酮醇或其乙酸酯的酵母菌株的構建A-含有A.thaliana的δ-7Red的表達盒的ELR01菌株的構建，所述表達盒整合于單倍體菌株FY1679交配型a(FY1679 Mata)的ADE2位點a)整合性質(zhì)粒PADδ-7(PAD△7)的構建質(zhì)粒pAD△7的構建是按照圖6描述完成的。從pASZ11質(zhì)粒(A.Stotz等人，Gene，95，91，1990)中分離含有釀酒酵母的ADE2基因的Bgl II片段(2244bp)并將該片段插入到pBluescript II KS+載體(Stratagene)的多克隆位點的BamHI位點。
得到的質(zhì)粒稱為pBS-ADE2，然后在其單一的Stu I位點將該質(zhì)粒線性化并且脫磷酸化。根據(jù)PCR技術，利用下列寡核苷酸作為引物5′GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 3′ (SEQ ID NO.6)5′AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 3′(SEQ ID NO.7)從實施例1F獲得的質(zhì)粒δ-7/V8制備大約2.44Kb的片段，該片段含有GAL10/CYC1啟動子，δ-7Red的編碼區(qū)(甾醇7還原酶)以及終止子PGK(tPGK)，所述寡核苷酸引物被限定為分別與tPGK的3′末端以及與URA3基因的3′末端相匹配。使用下列物質(zhì)作為模板的δ-7/V8質(zhì)粒(80ng)，上述寡核苷酸(各為0.5μM)，天然的Pfu DNA聚合酶(溶于由Stratagene推薦的緩沖液中的1個單位)以及使用了下列擴增條件35個周期縮環(huán)在95℃1分鐘；在95℃ 5秒；在56℃30秒鐘；在70℃4分鐘30秒)。然后將獲得的擴增片段克隆到上面線性化的pBS-ADE2質(zhì)粒的平齊末端以便得到pAD△7質(zhì)粒，該質(zhì)粒中大約有4720bp的NotI-Pst I片段攜帶有被δ-7Red表達盒間斷的ADE2基因。
b)酵母菌株FY1679 Mata中的染色體整合從pAD△7質(zhì)粒分離到的Not I-Pst I片段(4720bp)用限制性酶Not I和Pst I消化，然后利用D.Gietz等人描述(已經(jīng)引述過)乙酸鋰方法通過轉(zhuǎn)化將消化后的片段導入到FY1679 Mata酵母中。
根據(jù)其對制霉菌素的抗性，及其表型，選擇出由于同源重組而已經(jīng)整合了該片段的轉(zhuǎn)化體，由于δ-7Red的表達而將酵母的δ-5，7甾醇轉(zhuǎn)化為δ-5甾醇產(chǎn)生其表型。
在實施例1F描述的含有葡萄糖(20克/升)并補充了腺嘌呤(20mg/l)的YP完全培養(yǎng)基上28℃將轉(zhuǎn)化細胞培養(yǎng)4小時。然后將細胞濃縮并涂布于SLI-瓊脂基本培養(yǎng)基(細菌用酪蛋白氨基酸1克/升；″酵母氮源″7克/升；半乳糖20克/升；腺嘌呤20mg/升，瓊脂20克/升)平板上，在28℃培養(yǎng)過夜以便誘導δ-7Red基因的表達。沒有尿嘧啶互補作用使細胞生長受限制，收集克隆，分組然后涂布于含有YP完全培養(yǎng)基的平板上，該YP完全培養(yǎng)基含有半乳糖(20克/升)并補充了腺嘌呤(20mg/升)以及濃度逐漸增高的制霉菌素(分別0μg/ml，1μg/ml，2μg/ml，5μg/ml，20μg/ml)。在第4天，獲得了在5μg/ml濃度時能生長的約二十個克隆。在裝有WO基本培養(yǎng)基(7克/升″酵母氮源″，沒有氨基酸，20克/升葡萄糖)的平皿中再培養(yǎng)這十二個克隆，該WO培養(yǎng)基富含尿嘧啶，亮氨酸，色氨酸，組氨酸和腺嘌呤(各為20mg/升)。
然后通過在上面描述的富含尿嘧啶，殼氨酸，色氨酸，組氨酸，沒有腺嘌呤的WO基本培養(yǎng)基上沒有觀察到有任何生長而證實由于破壞了ADE2基因而成為腺嘌呤營養(yǎng)缺陷型。
通過從獲得的克隆的基因組DNA進行PCR擴增并且利用具有上述的SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7的序列作為引物可以控制酵母基因組中表達盒的存在。
通過對酵母中積累并且采用一個5米SE30毛細管柱(Alltech)根據(jù)實驗例1B描述的操作方法進行堿性皂化作用提取到的甾醇的GC組分分析而證實整合人的δ-7Red基因的功能。分析結果顯示當在半乳糖存在下培養(yǎng)該克隆時顯示有含有第C-7位上不飽和的甾醇的改良過的分布概況。所獲得的稱為ELR01的菌株積累了麥角甾5烯3-醇和麥角甾5，22二烯3-醇而不是麥角甾5，7，22三烯3-醇(麥角甾醇)，如圖7所示，被替代的麥角甾醇是起始菌株FY1679的主要甾醇。
由此方式構建的ELR01菌株在半乳糖存在下培養(yǎng)時，由于轉(zhuǎn)錄受啟動子GAL 10/CYC1控制這一事實，因而能表達δ-7Red基因。雖然δ-7Red的表達單位具有相同于ADE2基因的轉(zhuǎn)錄方向，但是當在半乳糖存在下培養(yǎng)時通過對甾醇的GC組分進行分析沒有檢測到δ-7Red的表達，這是由于啟動子GAL10/CYC1的阻遏作用造成的。B-含有牛腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADRm)的成熟形式的表達盒的CDR01菌株的構建，所述表達盒整合到單倍體菌株FY1679交配型α(mat.α)的LEU2和SPL1位點之間
a)穿梭載體大腸桿菌-釀酒酵母V13的構建V13載體相當于V8載體(C.Cullin等人，已經(jīng)引述過)，該載體攜帶選擇性標記URA3和適用于酵母的含有GAL10/CYC1啟動子的表達盒(PG/C)并且在該載體中根據(jù)圖8顯示的構建示意圖，在其多克隆位點已經(jīng)導入了另一個SalI位點(Sa)。
用限制性酶Hind III和BamHI消化V8載體，并將獲得的含有URA3基因和GAL10/CYC1啟動子(稱為進一步根據(jù)Ura-gal)的BamHI-HindIII片段亞克隆到用限制性酶Hind III和BamHI消化的PUC18載體(pharmacia)的相應位點。
然后采用PCR方法，利用下列條件30次循環(huán)；在86℃，5秒鐘；在95℃，10秒；在38℃，40秒；在55℃，5秒以及在74℃，2分鐘，溶于制造商的緩沖液中的2個單位的Taq DNA聚合酶以及具有下列核苷酸序列的各種引物各1μM5′GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 3′(SEQ ID NO.8)和5′GTAAAACGAC GGCCAGT 3′ (SEQ ID NO.9)從上述獲得的在95℃退化30秒的30ng PUC 18/″ura-gal″質(zhì)粒擴增″Ura-gal″片段。引物SEQ ID No.8含有相同于″Ura-gal″片段的Bam HIGGATCC位點，在Bam HI位點有3個連續(xù)的核苷酸不與模板雜交，還含有一個SalI GTCGAC位點以及一個與GAL10/CYC1啟動子同源的序列。引物XEQ ID NO.9與位于多克隆位點PUC18的Hind III位點前面的序列相匹配。在擴增之后獲得的1722bp的Hind III-BamHI片段用Xho I和BamHI進行消化，釋放出含有GAL10/CYC1啟動子(pG/c)的一個254bp片段，然后將該片段亞克隆到用限制性酶BamHI和XhoI消化的V8載體中。
最后得到的V13載體含有限制性位點，允許編碼成熟牛腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADRm)，成熟牛腎上腺皮質(zhì)激素(ADXm)以及牛細胞色素P450SCC的CDNA容易地進行亞克隆。
在下列方式中從V13載體開始，分別制備V13-ADR載體和V13-ADX載體和V13-SCC10載體a)V13-ADR載體的構建從EP.340878的實施例25中描述的pGBADR-2質(zhì)粒分離攜帶有編碼ADRm的cDNA的1478bp的SalI-KpnI片段并且再克隆到V13載體的相應位點得到V13-ADR載體。
b)V13-ADX載體的構建從歐洲專利申請EP340878的實施例23中描述的PGBADX-1質(zhì)粒分離攜帶有編碼ADXm的CDNA的390bp的SalI-BamHI片段并且再克隆到V13載體的相應位點得到V13-ADX載體。
c)V13-SCC10載體的構建從歐洲專利申請EP 340878的實施例6描述的pGBSCC-10質(zhì)粒分離攜帶了編碼P450SCC的CDNA的1554bp的SalI-EcoRI片段并且再克隆到V13載體的相應位點得到V13-SCC10載體。
b)整合性質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構建質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構建按圖9描述來完成。
a)質(zhì)粒pFL26CD的構建根據(jù)下列操作方法，在從splI基因(稱為spl1)的5′末端隔離開的leu2基因的基因間隔區(qū)(C.Kolman等人，J.Bacteriol.，175，1433，1993)將Not I位點導入到pFL26質(zhì)粒(N.Bonneaud等人，Yeast，7，609-615，1991)利用具有下列核苷酸序列5′TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG 3′(SEQ ID NO.10)5′GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG 3′(SEQ IDNO.11)(用于擴增704bp片段)以及核苷酸序列5′CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT 3′(SEQ ID NO.12)5′TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 3′ (SEQ ID NO.13)(用于擴增347bp片段)的引物進行PCR合成分別攜帶leu2的5′末端和Spl1的3′末端的704bp和347bp的兩個DNA片段。
引物SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12具有一個GGCGGCCG序列，該序列對應于NotI位點并且該序列中3個堿基與模板不相配。引物SEQ ID NO.10與定位于Leu2終止密碼子上游536bp處的一個序列相匹配，并且引物SEQ ID NO.13與定位于Spl 1△終止密碼子上游194bp處的一個序列相匹配。
利用PFL26質(zhì)粒作為模板，pfu DNA聚合酶作為酶，在由供應商(Stratagene)描述的標準條件下進行pCR首先擴增704bp和347bp片段。
所獲得的兩個擴增片段與由SEQ ID NO.11引物(704bp片段)和SEQ ID NO.12引物(347bp片段)從5′末端起始產(chǎn)生末端水平的20bp相匹配；這些20bp分別對應于每種引物的開始20個核苷酸。
利用SEQ ID NO.10引物和SEQ ID NO.13引物以及下列條件30次循環(huán)，包括95℃10秒，60℃5秒，45℃，1分鐘，65℃5秒，以及72℃2分鐘，隨后一個循環(huán)在72℃，7分鐘；各種引物各50pmol，以及1個單位的pfu DNA聚合酶，都溶于50μl反應緩沖液(Stratagene)中，對由704bp DNA片段(1ng)和347bp DNA片段(2ng)進行配對得到的產(chǎn)物進行擴增。獲得了含有一個Not限制性位點的1031bp的擴增片段。然后用BstXI和NsiI酶消化該片段，將獲得的含有Not I位點的920bp片段插入到pFL26的起始BstXI-NsiI片段的位置，得到質(zhì)粒pFL26CD，其圖譜描述于圖9a中。
b)pCD60質(zhì)粒的構建-pDP10036質(zhì)粒的制備從質(zhì)粒V13-ADX中分離出攜帶有編碼成熟牛腎上腺皮質(zhì)激素(ADXm)的CDNA的390bp SalI-BamHI片段，然后亞克隆于pTG10033質(zhì)粒的多克隆位點的SalI-Bgl II位點，該pTG10033質(zhì)粒的兩側(cè)是誘導型啟動子GAL10/CYC1以及終止子ter PGK。根據(jù)下文中進一步描述的操作方法可以制備pTG10033質(zhì)粒，其圖譜描述于圖18中，它相當于表達載體pTG10031(圖17)，含有啟動子CYC1和terPGK，其中啟動子CYC1已被啟動子GAL10/CYC1替代。
由此獲得的質(zhì)粒稱為pDP10034，它攜帶ADX表達盒，即處于GAL10/CYC1和terPGK轉(zhuǎn)錄控制下的編碼ADXm的基因。隨后，將術語″表達盒″用于其轉(zhuǎn)錄依賴于GAL10/CYC1和ter PGK的任何基因。
采用限制性酶Hind III消化而從質(zhì)粒V13-ADR中分離出攜帶選擇性標記URA3和ADR表達盒的3593bp的Hind III片段，然后將該片段插入到用限制性酶Hind III消化的pDP10034質(zhì)粒的相應位點。獲得的質(zhì)粒稱為pDp10036，該質(zhì)粒含有由標記URA3使之相互隔離開的ADX和ADR表達盒(圖9b)。
-pCD60質(zhì)粒的制備
通過用限制性酶Afl III和AccI將pDp10036質(zhì)粒進行部分消化而分離出攜帶ADR表達盒的2770bp的Afl III-AccI片段，用DNA聚合酶I的Klenow片段處理而制備平齊末端，連接后亞克隆到質(zhì)粒pBlue-Script KS+(Stratagene)的SmaI位點的平齊末端。在獲得的稱為PCD60的質(zhì)粒中，該ADR表達盒在NotI位點的任一側(cè)構建形成，一個定位于Afl III/SmaI連接位點上游的209bp處并且來源于亞克隆片段，而另一個來源于pBlue-Script KS+的多克隆位點(MCS1)(圖9b)。
C)質(zhì)粒pCD62-1和pCD62-2的構建采用限制性酶NotI消化質(zhì)粒pCD60，消化后分離出的2558bp的NotI片段亞克隆到pFL26CD質(zhì)粒的單一NotI位點。根據(jù)該片段插入的方向，獲得兩個質(zhì)粒稱為pCD62-1和pCD62-2(圖9C)。
在pCD62-1質(zhì)粒中，ADR表達盒定位于leu2基因的轉(zhuǎn)錄方向，而在pCD62-2質(zhì)粒中其方向正好相反。
保留pCD62-1質(zhì)粒，用于后來的構建過程。
c)-酵母菌株FY1679(Matalpha)的染色體整合pCD62-1質(zhì)粒含有與FY1679菌株的染色體上位點同源的區(qū)域。這些區(qū)域分別對應于圖10中描述的1060bp的Bgl II-ClaI片段(A)，707bp的EcoRI-NotI片段(B)以及602bp的Nat I-Bgl II片段。
在FY1679菌株中缺失對應于pCD62-1質(zhì)粒的486bp的ClaI-EcoRI片段的區(qū)域，暗示著該菌株實際上是亮氨酸營養(yǎng)缺陷型(LEU2菌株)(R.S.Sikorski等人，Genetics，122，19，1989)。
通過用限制性酶XbaI消化而將pCD62-1質(zhì)粒線性化，該質(zhì)粒的限制性位點定位于同源區(qū)的外面，然后利用乙酸鋰方法(D.Gietz等人，已經(jīng)引證)通過轉(zhuǎn)化將線性化質(zhì)粒導入到FY1679菌株(Matα)。
由于酵母具有的對DNA的細胞修復能力(″缺口修復″)以及對具有LEU2+表現(xiàn)型的重組體的選擇能力，因而在第一種情況下選擇出了兩種類型的重組子第一種類型是在片段A和B水平上發(fā)生同源重組之后獲得的，第二種類型是在片段A和C水平上發(fā)生同源重組之后獲得的。僅僅后一種重組類型除了使表現(xiàn)型LEU2+修復以外還允許ADR表達盒整合。
為了選擇第二種類型的克隆，利用上面的SEQ ID NO.10引物以及具有下列核苷酸序列的引物5′TACATTAGGT CCTTTGTAGC 3′(SEQ ID NO.14)進行PCR篩選以便證實在FY1679菌株(Matα)基因組中既存在ADR表達盒又使ADR表達盒有正確定位。
在該篩選方法中，SEQ ID NO.14引物全部與編碼ADRm的序列相匹配，而SEQ ID NO.10引物與染色體上一個序列相匹配(圖10)。
利用從FY1679菌株(Matα)分離的基因組DNA(20ng)(C.Hoffman等人，Gene，57，267，1987)作為模板，以及Taq DNA聚合酶(1U，Bochringer)，各個引物各50pmol以及在供應商描述的標準條件下30次PCR循環(huán)(在95℃，10秒，在55℃1分鐘，在72℃3分鐘)而完成擴增反應。
在表達盒被整合的情況下擴增之后分離出相應的2.9kb片段。在相反情況下，沒有檢測到擴增產(chǎn)物。
以這種公式選擇的FY1679菌株(Mataα)含有整合的ADR表達盒，將該菌株稱為CDR01。
采用對抗ADR抗體識別的蛋白質(zhì)進行免疫檢測，可以實施例1F描述的方案制備的胞質(zhì)細胞組分證明由該菌株表達了ADR。
在實施例3描述的膽固醇側(cè)鏈的體外酶限制檢測中證實了由CDR01菌株表達的ADR的功能，其中由含有100μg總蛋白的CDR01菌株的細胞的胞質(zhì)部分代替純化ADR(0.28pmol)來完成的。觀察到膽固醇轉(zhuǎn)化為孕甾烯酮醇的生物轉(zhuǎn)化速率約為25％，這相當于用純化ADR獲得的速率。
C.-共表達A.Thaliana的δ-7Red和ADRm的二倍體EC01菌株的構建根據(jù)G.Sprague等人描述的方案(Methods in Enzymology，194，77，1991)將單倍體菌株CDR01和上文中獲得的ELR01菌株雜交獲得了二倍體菌株EC01。
首先在前面描述的富含尿嘧啶，色氨酸和組氨酸(各20mg/l)但沒有亮氨酸的WO基本培養(yǎng)基上進行第一次選擇以便分離出二倍體LEU2+克隆(原養(yǎng)型特性，證明存在有ADR表達盒)。然后在前面描述的固體合成SLI瓊脂培養(yǎng)基上檢測這些克隆對5μg/ml的制霉菌素的抗性(抗性特征，證明存在有δ-7Red表達盒)。
以這種方式從對制霉菌素具抗性的克隆中任意地分離出一個菌株稱為EC01。
D-產(chǎn)生孕甾烯醇酮和孕甾烯醇酮-3-乙酸的EC01/pCD63菌株構建a)表達質(zhì)粒pCD63的構建按照圖11描述完成pCD63質(zhì)粒的構建。
利用限制性酶Not I從前面制備的質(zhì)粒pDP10036中分離含有ADX表達盒，選擇性標記URA3和ADR表達盒的4961bp的NotI片段并用限制性酶NotI消化，然后將該片段克隆到pFL45L質(zhì)粒(N.Bonneaud等人，Yeast，7，609，1991)的多克隆位點的Not I位點。由此獲得的載體稱為pDP10037，描述于圖11中。
一方面，用酶Tth111I消化而將質(zhì)粒pDP10037線性化，該質(zhì)粒的限制性位點定位于編碼ADRm的基因內(nèi)。
另一方面，將前面獲得的V13-SCC10質(zhì)粒用限制性酶Pvu II和EcoRV消化，純化出含有P450SCC的表達盒以及URA3標記物的5′末端的3476bp的PvuII-EcoRV片段。
分別得到的兩個線性化DNA具有同源區(qū)域，一方面該區(qū)域與URA3基因的5′末端以及GAL10/CYC1相對應，另一方面對應于terPGK，如圖11a描述。
然后利用乙酸鋰方法(D.Gietz等人，已經(jīng)引述過)通過共轉(zhuǎn)化將這兩個片段導入酵母菌株FY1679(Mata)中。
下面介紹的選擇尿嘧啶和色氨酸(URA3+，RTP1+)的原養(yǎng)型重組子的方法可以分離這樣的克隆，其中由于通過同源重組整合了表達盒P450SCC而將由限制性酶Tth111I消化產(chǎn)生的雙鏈破裂處修復。
在富含亮氨酸，組氨酸以及亮氨酸(各為20mg/l)沒有尿嘧啶和色氨酸的Wo基本培養(yǎng)基上選擇重組體(URA3+，RTP1+)。從收集到的50個克隆開始，采用C.Hoffman等人描述的方法(Gene，57，267，1987)提取總DNA，然后采用電穿孔方法導入到大腸桿菌XL1-藍色(Stratagene)菌株中。在含有50mg/l氨芐青霉素的豐富培養(yǎng)基LB(胰蛋白胨1％，酵母抽提物0.5％，NaCl1％)選擇由″缺口修復″產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的克隆。根據(jù)J.Sambrook等人，Molecular Cloning，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989描述的方法從選出的克隆之一提取稱為pCD63的質(zhì)粒。所獲得的質(zhì)粒pCD63含有由選擇標記URA3分隔開的表達盒ADX和P450SCC，如圖11b所描述的b)pCD63質(zhì)粒轉(zhuǎn)化EC01菌株根據(jù)乙酸鋰方法(D.Gietz等人，已經(jīng)引證過)通過轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pCD63導入到上述獲得的EC01菌株中。然后將轉(zhuǎn)化酵母培養(yǎng)于前面描述的WO基本培養(yǎng)基上，該培養(yǎng)基沒有尿嘧啶，色氨酸腺嘌呤和亮氨酸，但增補了組氨酸(20mg/l)。
以這種方式分離稱為EC01/pCD63菌株。參考名稱為EC01/pCD63的菌株樣品已于1995年2月10日寄存于CNCM，保芷號為I-1538。
c)體內(nèi)生產(chǎn)孕甾烯醇酮和孕甾烯醇酮-3乙酸在28℃有氧條件下(130r/min)將EC01/pCD63菌株培養(yǎng)于3升Erlenmeyer中的實施例1A中描述的SGI選擇性培養(yǎng)基中直到達到穩(wěn)定生長期(OD600＝12-13)，所述培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5克/升。然后加入1倍體積的上面描述的Yp完全培養(yǎng)基稀釋該培養(yǎng)物，然后加入乙醇(0.5％V/V)作為碳源。當達到新的穩(wěn)定生長期(OD600＝12-13)時，以濃縮溶液形式(500克/升)向該培養(yǎng)物中加入半乳糖(20克/升)，以便同時誘導編碼ADXm，ADRm，P450SCC和δ-7Red的基因進行表達，這些基因分別處于啟動子GAL10/CYC1控制之下。
根據(jù)下列操作方法分別對細胞中積累的甾醇以及培養(yǎng)上清液中的甾醇進行分析可以證明四個基因的共表達在誘導9個小時和24個小時之后收集50ml培養(yǎng)物樣品。將每個樣品離心(4000g，10分鐘，4℃)以便將細胞與培養(yǎng)基分離。
一方面，根據(jù)實施例1F說明的方法在玻璃珠存在下通過機械玻碎將細胞裂解。然后從由此獲得的裂解液中，通過加入1倍體積的己烷而提取細胞內(nèi)甾醇。
另一方面，通過加入1倍體積己烷直接提取培養(yǎng)基中存在的甾醇。
按照實施例1中說明的方法分析提取的甾醇GC組分，并與標準產(chǎn)品進行比較。
在誘導了9小時或24小時之后獲得的結果分別顯示于圖12a和圖12b中。
在誘導9小時之后，圖12a顯示-在細胞裂解液中，存在與標準孕甾烯醇酮乙酸鹽(RT＝11.8分鐘)具有同樣滯留時間的主要化合物，而在孕甾烯醇酮的滯留時間(RT＝9.9分鐘)時僅存在十分弱的峰。在RT＝18分鐘和RT＝17分鐘時分別鑒別出低量的第C-7位還原的酵母的內(nèi)源甾醇(麥角甾5-烯3-醇和麥角甾5，22二烯3-醇)。在分析之前將細胞裂解液堿性皂化導致存在與孕甾烯醇酮共遷移的主要化合物。這可以證實具有RT＝11.8分鐘的積累化合物相當于乙酸孕甾烯醇酮。
-在培養(yǎng)基中，孕甾烯醇酮或其乙酸鹽明顯缺乏。
在誘導24小時之后，圖12b顯示-在細胞裂解液中，存在低量的孕甾烯醇酮(RT＝10.2分鐘)和乙酸孕甾烯醇酮(RT＝12分鐘)以及存在被還原的酵母內(nèi)源甾醇(RT＝17分鐘和RT＝18分鐘)。膽固醇(RT＝16.2分鐘)是一種在提取之前加入的內(nèi)部標準物。
-在培養(yǎng)基中，主要存在乙酸孕甾烯醇酮以及小量的孕甾烯醇酮。
試驗也平行地用對照質(zhì)粒如pFL45L(已經(jīng)引述)轉(zhuǎn)化的EC01菌株進行，該平行試驗已經(jīng)證明沒有對應于游離孕甾烯醇酮或乙酸鹽形式的孕甾烯醇酮的峰。
以這種方式對甾醇進行鑒別顯示在沒有任何內(nèi)源甾醇存在下，在半乳糖存在下進行誘導之后酵母菌株EC01/pCD63積累了孕甾烯醇酮和乙酸孕甾烯醇酮，并且在誘導9小時之后具有最大生產(chǎn)量這些結果證明一方面EC01菌株中在C-7位還原的內(nèi)源甾醇的有效變化，另一方面，內(nèi)源甾醇的側(cè)鏈的限制性反應偶合十分有效。
整合菌株的概述表
實施例4pTG10033質(zhì)粒的構建
1.具有新的多克隆位點的pUC19衍生物利用下列寡核苷酸5′GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 3′SEQ ID NO.15將克隆載體M13mp19(C.Yanish-Peron等人，Gene，33，103，1985)誘變以便將NotI位點導入到被截斷的lac I基因的序列中得到質(zhì)粒M13TG724。
然后利用下列寡核苷酸5′AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 3′SEQ ID NO，165′AATTCATACG TACGCGGCCG C 3′SEQ ID NO.17將含有EcoRI，SnaBI和Not I位點的″多接頭″導入到質(zhì)粒M13TG724的EcoRI位點，得到質(zhì)粒M13TG7244，其中在擴增階段觀察到插入物修飾。質(zhì)粒M13TG7244的插入物具有下列核苷酸序列CAATTCATACGTACGCGGCCGCAATTGCGGCCGGTACGTATAATTCACTGGCCGT其中底下劃線部分為EcoRI，SnaBI和SstI位點，斜體字描寫為pUC19的lacZ基因。在用限制性酶EcoRI和SstI消化質(zhì)粒M13TG7244之后，利用下列寡核苷酸5′CAACGCGTCC TAGG3′ SEQ ID NO.18和5′AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT 3′ SEQ ID NO.19導入含有MluI和Avr II位點的″多接頭″。
在用酶Pvu II消化之后，將獲得的Pvu II片段亞克隆到pUc19(C.Yanish-Porch等人，已經(jīng)引述)得到質(zhì)粒pTG7457(圖13)。
2.PGK終止子的亞克隆
用限制性酶BamHI和EcoRI消化PUC19，利用下列寡核苷酸5′GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT 3′ SEQ ID NO.20，5′AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 3′SEQ ID NO.21，5′CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG 3′SEQ ID NO.22和5′AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 3′ SEQ ID NO.23.
導入一個新″多接頭″BamHI SstI。
以這種方式獲得了質(zhì)粒pTG7453(圖14)，然后用限制性酶BamHI和SstI消化。將位于BamHI和SstI之間的″多接頭″位點導入到上面獲得的并用限制性酶BamHI和SstI消化的質(zhì)粒pTG7457衍生物中，由此獲得的新質(zhì)粒含有Pvu II，Hind III，BamHI，EcoRI，XbaI，SmaI，Bgl II，Sst II(＝SacI)，MluI，Avr II，EcoRI，SnaBI，NotI，SnaBI，PvuI位點。
用限制性酶Bgl II和Hind III消化該新質(zhì)粒并將含有PGK啟動子的Bgl II-Hind III片段(R.A.Hitzeman等人，Nucleic Acids Res.10，7791，1982；G.Loison等人，Yeast，5，497，1989)插入到上述消化后的質(zhì)粒中得到pTG10014質(zhì)粒中(圖15)3.啟動子的亞克隆a)CYC1啟動子將pTG7453質(zhì)粒的BamHI和SstI之間的″多接頭″位點導入到前面所述質(zhì)粒pTG7457衍生物中。由限制性酶SnaBI將獲得的新質(zhì)粒消化，然后導入一個含有f1噬菌體的復制源點的質(zhì)粒pEMBL8的456bp的RsaI-DraI片段(L.Dente等人，Nucleic Acid Res.，11，1645，1983)，得到質(zhì)粒pTG7503。
將歐洲專利申請EP0340378的實施例6中制備的并且含有釀酒酵母的CYC1啟動子，一個″多接頭″以及乳克魯維氏酵母的乳糖酶終止子的pGBSCC-9質(zhì)粒的0.78Kb BamHI-Hind III片段亞克隆到用限制性酶Hind III和BamHI消化的質(zhì)粒pTG7503中得到質(zhì)粒pTG10004(圖16)。
然后利用下列寡核苷酸5′GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC 3′SEQ ID NO.24.
對質(zhì)粒pTG10004的雙鏈DNA進行定位誘變而消除了CYC1啟動子的XhoI和MluI位點。
然后用限制性酶SalI和XhoI將由此得到的質(zhì)粒pTG10005進行消化，然后利用下列寡核苷酸5′TCGACGGACG CGTGG 3′ SEQ ID NO.255′TCGACCACGC GTCC 3′ SEQ ID NO.26導入一個MluI位點得到質(zhì)粒pTG10006。
b)GAL10/CYC1啟動子用限制性酶XhoI將質(zhì)粒pYeDP1/8-2(C.Cullin等人，Gene，203，1988)打開。所制備的粘性末端用DNA聚合酶Klenow片段填充，然后再將質(zhì)粒連接。由此獲得的質(zhì)粒pTG10010用作為pCR擴增的模板，該質(zhì)粒中GAL10/CYC1啟動子不再含有XhoI位點。
4.表達載體pTG10031的構建利用下列寡核苷酸5′TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 3′SEQ ID NO.27進行位點特異性誘變從質(zhì)粒pTG7503中消除編碼lac Z的序列的剩余部分得到質(zhì)粒pTG7549。
然后用下列寡核苷酸5′GGCCGCAAAA CCAAA 3′ SEQ ID NO.285′AGCTTTTGGT TTTGC 3′ SEQ ID NO.29消除質(zhì)粒pTG7549中存在的lacZ啟動子，這兩個寡核苷酸插入到事先用限制性酶NotI和Hind III消化的該質(zhì)粒中并且恢復了兩個位點得到質(zhì)粒pTG7553。
通過用限制性酶BamHI和MluI消化質(zhì)粒pTG10006而獲得含有CYC1啟動子的BamHI-MluI片段，從用限制性酶MluI和Hind III消化的質(zhì)粒pTG10015中分離含有PGK啟動子的MluI-Hind III片段。將這兩個片段連接并將由此獲得的連接產(chǎn)物插入到事先用限制性酶MluI和Hind III消化的質(zhì)粒pTG7553中。
下列寡核苷酸5′GATCTATCGA TGCGGCCGCG 3′ SEQ ID NO.30與下列寡核苷酸5′CGCGCGCGGC CGCATCGATA 3′ SEQ ID NO.31相雜交，這一寡核苷酸組成了含有ClaI和NotI位點的BamHI-MluI″接頭″，加入該寡核苷酸并連接得到表達載體pTG10031(圖17)。
用限制性酶ClaI和SalI將上述從質(zhì)粒pYE DP1/8-2經(jīng)pCR擴增得到的片段進行消化，然后導入到事先用相同限制性酶消化的質(zhì)粒pTG10031中以便得到質(zhì)粒pTG10033(圖18)。
序列表(1)總體資料(i)申請人(A)姓名ROUSSEL UCLAF(B)街道102，Route de Naisy(C)城市ROMAINVILLE(E)國家法國(F)郵編(ZIP)93230(G)電話49.91.49.91(H)傳真49.91.46.10(ii)發(fā)明名稱編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的A.thaliana蛋白質(zhì)的DNA序列，δ-7Red蛋白質(zhì)，生產(chǎn)方法，轉(zhuǎn)化的酵母菌株，應用。
(iii)序列數(shù)31(iv)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(vi)以前的申請資料(A)申請?zhí)朏R9501723(B)申請日1995年2月15日(vi)以前的申請資料(A)申請?zhí)朏R9506517
(B)申請日1995年6月1日(2)SEQ ID NO.1的資料(i)序列特征(A)長度1496個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(C)幾何結構線性(ii)分子類型CDNA(vI)原始來源(A)生物體Arabidopsis thaliana(ix)特征(A)名稱/關鍵詞CDS(B)位置76..1365(xi)序列描述SEQ ID NO.1
GTGTGAGTAA TTTAGGTCAA CACAGATCAG AATCTGAGGC TTTGGCCGAG ACGAAGAGAA60AAGCAGAAGA AGAAA ATG GCG GAG ACT GTA CAT TCT CCG ATC GTT ACT TAC111Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr1 5 10GCA TCG ATG TTA TCG CTT CTC GCC TTC TGT CCA CCT TTC GTC ATT CTC 159Ala Ser Met Leu Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu15 20 25CTA TGG TAC ACA ATG GTT CAT CAG GAT GGT TCT GTT ACT CAG ACC TTT 207Leu Trp Tyr Thr Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe30 35 40GGC TTC TTT TGG GAG AAT GGA GTT CAA GGA CTT ATC AAC ATA TGG CCA 255Gly Phe Phe Trp Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro45 50 55 60AGA CCC ACT TTG ATT GCT TGG AAA ATT ATA TTT TGC TAT GGA GCA TTT 303Arg Pro Thr Leu Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe65 70 75GAA GCT ATT CTT CAG CTG CTT CTG CCT GGT AAA AGA GTT GAG GGT CCA 351Glu Ala Ile Leu Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro80 85 90ATA TCT CCA GCC GGA AAC CGA CCA GTT TAC AAG GCC AAT GGT CTG GCT 399Ile Ser Pro Ala Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala95 100 105GCT TAC TTT GTG ACA CTA GCA ACC CAT CTT GGT CTT TGG TGG TTT GGA 447Ala Tyr Phe Val Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly110 115 120
ATC TTC AAC CCT GCA ATT GTC TAT GAT CAC TTG GGT GAA ATA TTT TCG 495Ile Phe Asn Pro Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser125 130 135 140GCA CTA ATA TTC GGA AGC TTC ATA TTT TGT GTT TTG TTG TAC ATA AAA 543Ala Leu Ile Phe Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys145 150 155GGC CAT GTT GCA CCT TCA TCA AGT GAC TCT GGT TCA TGT GGT AAC CTA 591Gly His Val Ala Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu160 165 170ATA ATT GAC TTC TAT TGG GGC ATG GAG TTG TAC CCT CGA ATT GGT AAG 639Ile Ile Asp Phe Tyr Trp Gly Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys175 180 185AGC TTT GAC ATC AAG GTG TTT ACT AAT TGC AGA TTC GGA ATG ATG TCT 687Ser Phe Asp Ile Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser190 195 200TGG GCA GTT CTT GCA GTC ACG TAC TGC ATA AAA CAG TAT GAA ATA AAT 735Trp Ala Val Leu Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn205 210 215 220GGC AAA GTA TCT GAT TCA ATG CTG GTG AAC ACC ATC CTG ATG CTG GTG 783Gly Lys Val Ser Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val225 230 235TAT GTC ACA AAA TTC TTC TGG TGG GAA GCT GGT TAT TGG AAC ACC ATG 831Tyr Val Thr Lys Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met240 245 250GAC ATT GCA CAT GAC CGA GCT GGA TTC TAT ATA TGC TGG GGT TGT CTA 879Asp Ile Ala His Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu255 260 265GTG TGG GTG CCT TCT GTC TAC ACT TCT CCA GGC ATG TAC CTT GTG AAC 927Val Trp Val Pro Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn270 275 280CAC CCC GTC GAA CTC GGA ACT CAG TTG GCA ATA TAC ATT CTC GTT GCA 975His Pro Val Glu Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala285 290 295 300
GGA ATT CTG TGC ATT TAC ATA AAG TAT GAC TGT GAT AGA CAA AGG CAA 1023Gly Ile Leu Cys Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln305 310 315GAG TTC AGG AGG ACA AAC GGG AAA TGT TTG GTT TGG GGA AGA GCC CCG 1071Glu Phe Arg Arg Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro320 325 330TCA AAG ATT GTG GCG TCG TAT ACT ACA ACA TCT GGT GAA ACT AAA ACT 1119Ser Lys Ile Val Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr335 340 345AGT CTT CTC TTA ACG TCT GGA TGG TGG GGA TTG GCT CGT CAT TTC CAT 1167Ser Leu Leu Leu Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His350 355 360TAT GTT CCT GAG ATC TTA AGT GCT TTC TTC TGG ACC GTA CCG GCT CTC 1215Tyr Val Pro Glu Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu365 370 375 380TTC GAT AAC TTC TTG GCA TAC TTC TAC GTC CTC ACC CTT CTT CTC TTT 1263Phe Asp Asn Phe Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe385 390 395GAT CGA GCC AAG AGA GAC GAT GAC CGA TGC CGA TCA AAG TAT GGG AAA 1311Asp Arg Ala Lys Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys400 405 410TAT TGG AAG CTG TAT TGT GAG AAA GTC AAA TAC AGG ATC ATT CCG GGA 1359Tyr Trp Lys Leu Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly415 420 425ATT TAT TGATTGTAAC GAAGTCTGTT GTTCTCATTT TCTACTTATT ACGTTAATTC1415Ile Tyr430GAACGTTGGA ATCATCAAAA GACCGAGCCA AAACAAAAAT GCAAATTGAT GCGATAGACA 1475TTCTTTTGCT GAAAAAAAAA A 1496(2)SEQ ID NO.2的資料。
(i)序列特征(A)長度430個氨基酸(B)類型氨基酸(D)幾何結構線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO.2Met Ala Glu Thr Val His Ser Pro Ile Val Thr Tyr Ala Ser Met Leu1 5 10 15Ser Leu Leu Ala Phe Cys Pro Pro Phe Val Ile Leu Leu Trp Tyr Thr20 25 30Met Val His Gln Asp Gly Ser Val Thr Gln Thr Phe Gly Phe Phe Trp35 40 45Glu Asn Gly Val Gln Gly Leu Ile Asn Ile Trp Pro Arg Pro Thr Leu50 55 60Ile Ala Trp Lys Ile Ile Phe Cys Tyr Gly Ala Phe Glu Ala Ile Leu65 70 75 80Gln Leu Leu Leu Pro Gly Lys Arg Val Glu Gly Pro Ile Ser Pro Ala85 90 95Gly Asn Arg Pro Val Tyr Lys Ala Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Phe Val100 105 110Thr Leu Ala Thr His Leu Gly Leu Trp Trp Phe Gly Ile Phe Asn Pro115 120 125Ala Ile Val Tyr Asp His Leu Gly Glu Ile Phe Ser Ala Leu Ile Phe130 135 140Gly Ser Phe Ile Phe Cys Val Leu Leu Tyr Ile Lys Gly His Val Ala145 150 155 160Pro Ser Ser Ser Asp Ser Gly Ser Cys Gly Asn Leu Ile Ile Asp Phe165 170 175
Tyr Trp G Met Glu Leu Tyr Pro Arg Ile Gly Lys Ser Phe Asp Ile180 185 190Lys Val Phe Thr Asn Cys Arg Phe Gly Met Met Ser Trp Ala Val Leu195 200 205Ala Val Thr Tyr Cys Ile Lys Gln Tyr Glu Ile Asn Gly Lys Val Ser210 215 220Asp Ser Met Leu Val Asn Thr Ile Leu Met Leu Val Tyr Val Thr Lys225 230 235 240Phe Phe Trp Trp Glu Ala Gly Tyr Trp Asn Thr Met Asp Ile Ala His245 250 255Asp Arg Ala Gly Phe Tyr Ile Cys Trp Gly Cys Leu Val Trp Val Pro260 265 270Ser Val Tyr Thr Ser Pro Gly Met Tyr Leu Val Asn His Pro Val Glu275 280 285Leu Gly Thr Gln Leu Ala Ile Tyr Ile Leu Val Ala Gly Ile Leu Cys290 295 300Ile Tyr Ile Lys Tyr Asp Cys Asp Arg Gln Arg Gln Glu Phe Arg Arg305 310 315 320Thr Asn Gly Lys Cys Leu Val Trp Gly Arg Ala Pro Ser Lys Ile Val325 330 335Ala Ser Tyr Thr Thr Thr Ser Gly Glu Thr Lys Thr Ser Leu Leu Leu340 345 350Thr Ser Gly Trp Trp Gly Leu Ala Arg His Phe His Tyr Val Pro Glu355 360 365Ile Leu Ser Ala Phe Phe Trp Thr Val Pro Ala Leu Phe Asp Asn Phe370 375 380Leu Ala Tyr Phe Tyr Val Leu Thr Leu Leu Leu Phe Asp Arg Ala Lys385 390 395 400Arg Asp Asp Asp Arg Cys Arg Ser Lys Tyr Gly Lys Tyr Trp Lys Leu405 410 415Tyr Cys Glu Lys Val Lys Tyr Arg Ile Ile Pro Gly Ile Tyr420 425 430
(2)SEQ ID NO.3的資料。
(i)序列特征(A)長度15個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型肽(ix)特征(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置7(D)其他資料/注解＝″殘基7＝Trp或Tyr″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞肽(B)位置12(D)其他資料/注解＝″殘基12＝His或lys″(xi)序列描述SEQ ID NO.3Leu Leu Xaa Xaa Gly Trp Xaa Gly Xaa Xaa Arg Xaa Xaa1 5 10Xaa Tyr15(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位點10.29(D)其他資料/注釋＝″SEQ ID NO.1從76-95″(xi)序列描述SEQ ID NO.4CGCGGATCCA TGGCGGAGAC TGTACATTC 29(2)SEQ ID NO5的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置補體(10.28)(D)其他資料/注釋＝″互補序列ID NO.1從1350-1368″(xi)序列描述SEQ ID NO.5CAGGGTACCT CAATAAATTC CCGGAATG28
(2)SEQ ID NO6的資料(i)序列特征(A)長度23個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置補體(1.23)(xi)序列描述SEQ ID NO.6GATTACGCCA AGCTTTTCGA AAC 23(2)SEQ ID NO7的資料(i)序列特征(A)長度29個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.7AGATCTTGAG AAGATGCGGC CAGCAAAAC 29(2)SEQ ID NO8的資料
(i)序列特征(A)長度46個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.8GGGGATCCGT GGTCGACGTA ATTTAGTGTG TGTATTTGTG TTTGCG 46(2)SEQ ID NO9的資料(i)序列特征(A)長度17個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置補體(1.17)(xi)序列描述SEQ ID NO.9GTAAAACGAC GGCCAGT 17(2)SEQ ID NO10的資料(i)序列特征
(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.10TTGAAGGTTC AACATCAATT GATTG25(2)SEQ ID NO11的資料(i)序列特征(A)長度38個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-特征(B)位置襯體(1.38)(xi)序列描述SEQ ID NO.11GTGTGGCGGC CGCCTCCTTG TCAATATTAA TGTTAAAG38(2)SEQ ID NO12的資料(i)序列特征(A)長度34個堿基對
(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(iii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO.12CAAGGAGGCG GCCGCCACAC AAAAAGTTAG GTGT34(2)SEQ ID NO13的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..25)(xi)序列描述SEQ ID NO13TCTGCTTCCC TAGAACCTTC TTATG 25(2)SEQ ID NO14的資料(i)序列特征(A)長度20堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..20)(xi)序列描述SEQ ID NO14TACATTAGGT CCTTTGTAGC 20(2)SEQ ID NO15的資料(i)序列特征(A)長度25個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO15GCGCTCAGCG GCCGCTTTCC AGTCG 25(2)SEQ ID NO16的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈
(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO16AATTGCGGCC GCGTACGTAT G 21(2)SEQ ID NO17的資料(i)序列特征(A)長度21個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..21)(xi)序列描述SEQ ID NO17AATTCATACG TACGCGGCCG C21(2)SEQ ID NO18的資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性
(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO18CAACGCGTCC TAGG 14(2)SEQ ID NO19的資料(i)序列特征(A)長度22個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..22)(xi)序列描述SEQ ID NO19AATTCCTAGG ACGCGTTGAG CT22(2)SEQ ID NO20的資料(i)序列特征(A)長度33個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸
(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO20GATCCGCAGA TATCATCTAG ATCCCGGGTA GAT33(2)SEQ ID NO21的資料(i)序列特征(A)長度39個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..39)(xi)序列描述SEQ ID NO21AGAGCTCAAG ATCTACCCGG GATCTAGATG ATATCTGCG 39(2)SEQ ID NO22的資料(i)序列特征(A)長度34堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″
(xi)序列描述SEQ ID NO22CTTGAGCTCT ACGCAGCTGG TCGACACCTA GGAG34(2)SEQ ID NO23的資料(i)序列特征(A)長度28個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..28)(xi)序列描述SEQ ID NO23AATTCTCCTA GGTGTCGACC AGCTGCGT 28(2)SEQ ID NO24的資料(i)序列特征(A)長度40個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO24
GCGGATCTGC TCGAAGATTG CCTGCGCGTT GGGCTTGATC40(2)SEQ ID NO25的資料(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO25TCGACGGACG CGTGG 15(2)SEQ ID NO26的資料(i)序列特征(A)長度14個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..14)(xi)序列描述SEQ ID NO26TCGACCACGC GTCC 14
(2)SEQ ID NO27的資料(i)序列特征(A)長度35個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO27TGGCCGTCGT TTTACTCCTG CGCCTGATGC GGTAT 35(2)SEQ ID NO28的資料(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO28GGCCGCAAAA CCAAA15(2)SEQ ID NO29的資料(i)序列特征(A)長度15個堿基對(B)類型核酸
(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..25)(xi)序列描述SEQ ID NO29AGCTTTTGGT TTTGC 15(2)SEQ ID NO30的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(xi)序列描述SEQ ID NO30GATCTATCGA TGCGGCCGCG20(2)SEQ ID NO31的資料(i)序列特征(A)長度20個堿基對(B)類型核酸(C)鏈數(shù)單鏈
(D)幾何結構線性(ii)分子類型其他核酸(A)描述/desc＝″寡核苷酸″(ix)特征(A)名稱/關鍵詞misc-feature(B)位置補體(1..20)(xi)序列描述SEQ ID NO31CGCGCGCGGC CGCATCGATA 20
權利要求
1.克隆方法，用于將編碼具有δ-5，7甾醇δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的核酸克隆于一種微生物中，所述克隆方法包括篩查方法，篩選-對制霉菌素或一種類似化合物共抗性的微生物，所述類似化合物的毒性由在C-7位攜帶不飽和鍵的甾醇存在而定，-將其核酸與SEQ ID NO.1的核苷酸序列進行雜交，-利用數(shù)據(jù)加工技術從隨機分離的DNA序列鑒別核酸，-在該蛋白質(zhì)直接表達之后利用特異于具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的蛋白質(zhì)的抗體進行免疫檢測。
2.DNA或RNA核酸序列，根據(jù)權利要求1定義的方法獲得。
3.由含有權利要求2的DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞。
4.根據(jù)權利要求3所述轉(zhuǎn)化宿主細胞，其中宿主是一種酵母或絲狀真菌。
5.制備具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)的方法，其中將根據(jù)權利要求3或4所述轉(zhuǎn)化宿主細胞進行培養(yǎng)，并分離表達的蛋白質(zhì)。
6.根據(jù)權利要求5所述方法，其中宿主細胞是一種轉(zhuǎn)化酵母，其中DNA編碼序列置于酵母啟動子控制之下。
7.將C-7位不飽和的甾醇體外還原的方法，所述方法包括將待還原的甾醇與具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)一起保溫，并且對獲得的還原甾醇進行分離或不分離，其中所述蛋白質(zhì)是根據(jù)權利要求5或權利要求6的方法獲得的蛋白質(zhì)，或者是通過培養(yǎng)用含有下述核酸序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞而獲得的蛋白質(zhì)(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的核酸序列，(ii)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(iii)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且在中等或高嚴緊條件下與(i)中定義的序列雜交或者具有與該序列有約60％和更高的序列同一性的序列的核酸序列，或(iv)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且利用引物寡核苷酸和PCR技術擴增得到的核酸序列，所述引物編碼具有SEQID NO.3氨基酸序列的共有序列，其中第7位的Xaa是Trp或Tyr并且第12位Xaa是His或Lys。
8.將在C-7位不飽和的外源甾醇體內(nèi)還原的方法，其中將甾醇與轉(zhuǎn)化宿主細胞一起培養(yǎng)，并將得到的還原甾醇進行分離或不分離，其中所述轉(zhuǎn)化宿主細胞是權利要求3或4所述的轉(zhuǎn)化宿主細胞，或者是用含有選自以下一種DNA序列的載體轉(zhuǎn)化的宿主細胞(i)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的核酸序列，(ii)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(iii)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且在中等或高嚴緊條件下與(i)中定義的序列雜交或者具有與該序列有約60％和更高的序列同一性的序列的核酸序列和(iv)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且利用引物寡核苷酸和PCR技術擴增得到的核酸序列，所述引物編碼具有SEQID NO.3氨基酸序列的共有序列，其中第7位的Xaa是Trp或Tyr并且第12位Xaa是His或Lys。
9.將在C-7位不飽和的內(nèi)源甾醇進行體內(nèi)還原的方法，其中將權利要求4所述轉(zhuǎn)化的宿主菌株進行培養(yǎng)并將積累的還原甾醇進行分離或不分離。
10.根據(jù)權利要求7-9任一項所述體外或體內(nèi)還原方法，其中獲得的還原甾醇是膽固醇側(cè)鏈限制性酶(P450SCC)的底物。
11.根據(jù)權利要求10所述體內(nèi)還原方法，其中待還原的內(nèi)源甾醇是麥角甾5，7二烯3-醇、麥角甾5，7，24(28)三烯3-醇或麥角甾5，7，22三烯3-醇或它們的混合物。
12.制備孕甾烯醇酮的方法，其中將權利要求4所述轉(zhuǎn)化宿主細胞進行培養(yǎng)，將在C-7位還原的積累的內(nèi)源甾醇或甾醇類進行分離或不分離，在P450SCC存在以及有或沒有腎上腺皮質(zhì)激素還原酶(ADR)和腎上腺皮質(zhì)激素(ADX)存在下，將待還原的甾醇保溫，并對獲得的孕甾烯醇酮進行分離或不分離。
13.根據(jù)權利要求12所述方法，其中宿主細胞是酵母。
14.制備孕甾烯醇酮的方法，其中將由一個或多個載體轉(zhuǎn)化的酵母進行培養(yǎng)，所述載體能使具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性以及P450SCC活性和具有或不具有ADR和ADX活性的蛋白質(zhì)共表達，然后分離或不分離游離的或酯化的孕甾烯醇酮。
15.根據(jù)權利要求14所述孕甾烯醇酮的制備方法，其中將能共表達具δ-5，7甾醇，δ-7還原酶、P450SCC、ADR和ADX活性的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化酵母進行培養(yǎng)。
16.根據(jù)權利要求15所述方法，其中具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是擬南芥(Arabidopsis thaliana)δ-7Red蛋白質(zhì)。
17.根據(jù)權利要求16所述方法，其中酵母菌株是EC01/pCD63菌株。
18.轉(zhuǎn)化的酵母菌株，其共表達具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶、P450SCC、ADR和ADX活性的一種蛋白質(zhì)，并且積累游離或酯化的孕甾烯醇酮。
19.根據(jù)權利要求18所述酵母菌株，其中具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)是擬南芥δ-7Red蛋白質(zhì)。
20.根據(jù)權利要求19所述酵母菌株，其命稱為EC01/pCD63。
21.一種抗體，它特異于具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)，其中所述蛋白質(zhì)(i)含有氨基酸序列SEQ ID NO.2或其等位基因變異體；(ii)具有氨基酸序列SEQ ID NO.2并命名為δ-7Red；(iii)具有與SEQ ID NO.2序列至少有60％序列同一性的氨基酸序列；(iv)與(ii)中定義的擬南芥δ-7Red蛋白具有交叉免疫反應性；(v)是通過在含有編碼氨基酸序列SEQ ID NO.2的DNA序列的宿主細胞中表達而獲得的；(vi)是通過在含有選自以下一種DNA序列的宿主細胞中表達獲得的(a)含有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(b)具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列及其等位基因變異體的DNA序列，(c)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且在中等或高嚴緊條件下與(i)中定義的序列雜交或者具有與該序列有約60％和更高的序列同一性的序列的DNA序列，和(d)編碼具有δ-5，7甾醇，δ-7還原酶活性的蛋白質(zhì)并且利用引物寡核苷酸和PCR技術擴增得到的DNA序列，所述引物編碼具有SEQ ID NO.3氨基酸序列的共有序列，其中第7位的Xaa是Trp或Tyr并且第12位Xaa是His或Lys；或(vii)(v)或(vi)的蛋白質(zhì)，其中所述宿主細胞是酵母。
全文摘要
編碼A.thaliana蛋白質(zhì)的cDNA序列，該蛋白質(zhì)具有δ－5，7甾醇，δ－7還原酶活性(SEQ ID NO.1)?？寺》椒?。在C－7位不飽和甾醇的還原方法。孕甾烯醇酮的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12N15/81GK1664107SQ20041004883
公開日2005年9月7日 申請日期1996年2月14日 優(yōu)先權日1995年2月15日
發(fā)明者X·錢尼韋西, C·杜波, E·勒凱恩, D·龐彭 申請人:魯索-艾克勒夫公司