專利名稱：一種新的人蛋白質(zhì)及其編碼序列,及制法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種新的人蛋白質(zhì)及其核苷酸編碼序列。更具體地說，本發(fā)明涉及人ARL5的cDNA序列，該蛋白是鼠ARL5的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽，這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用，以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
ADP核糖基化因子(ADP ribosylation factor，簡稱為“ARF”)是分子量為20KD左右的鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白(Trends Biochem.Sci.1995，20，147-150；Cell.Signal.1992.4.367-399；Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.1993，45，47-65；Nature1994，372，704-708)。哺乳動物的ARF家族至少有六個成員，即ARF1至ARF6，而在酵母中則至少已發(fā)現(xiàn)了三個成員。另外ARF家族還包括了一些與ARF高度同源，但缺乏霍亂毒素輔助因子活性的蛋白；此外，與ARF不同的是，這些蛋白在與GTP結(jié)合時依賴于鎂離子與磷脂，因此這些蛋白被統(tǒng)稱為ARL蛋白(ARF樣蛋白，ARF-like protein)。另外，ARF蛋白的氨基端能被肉豆蔻?；?，ARF豆蔻醇化被認(rèn)為有利于ARF作用，而在ARL中則沒有發(fā)現(xiàn)這一特點(diǎn)。
哺乳動物中的ARF高度保守，廣譜表達(dá)于各組織。根據(jù)氨基酸順序、大小和基因結(jié)構(gòu)可分為三類一，ARF1-3；二，ARF4和ARF5；三，ARF6。ARF家族的成員通常被歸入RAS超家族(Biochemestry，1991，30，4637-4648)，然而它們一般與RAS家族其它成員僅有輕微的同源性，并且與其它Ras家族成員不同的是，它們的羧基端缺少半胱氨酸殘基，從而無法成為異戊二烯化的底物。
ARF1最初被發(fā)現(xiàn)時，是作為一種對霍亂毒素的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性有協(xié)同作用的激活劑，并因此而得名。Kahn，R，A和Gilman，A，G分別于1984年和1986年從兔肝臟和牛腦膜中提取出ARF因子(J.Biol.Chem1984，259，6228-6234 J.Biol.Chem 1986，261，7906-7911)。1987年和1988年，Tsai等又從牛腦中提取出一種膜ARF(mARF)和兩種可溶性ARF(sARF1，2)(Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.1987，84，5139-5142 J.B.C.1988，263，1768-1772)。此后科學(xué)家相繼通過雜交進(jìn)行ARF cDNA克隆，并用寡核苷酸作為探針，發(fā)現(xiàn)了不同動物的不同ARF。1988年，Sewell，J，L等從牛腎上腺中克隆bARF1(bovineARF1)，并從酵母基因庫中克隆到了yARF2(yeast ARF2)(Pro.Natl.Acad.Sci.USA1988，85，4620-4624)。同年，Price等在牛視網(wǎng)膜中克隆得到bARF2(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1988，85，5488-5491)。1989年，Peng，Z，Calver等得到了 hARF(human ARF1)(Biofactor 1989，2，45-49)。同時，Bobak等也從人腦庫中獲得了hARF1和另一個因子hARF3(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1989，86，6101-6105)。1990年，Stearn，T等得到了yARF1(Mol.Cell.Biol，1994，138(1-2)，157-166)。1991年，Kahn，R，A等克隆得到hARF4(J.Biol.Chem.1991，266，2606-2614)。同年，Price，Tsai等得到了家族中最后兩個因子ARF5，6(J.Biol.Chem.1991，266，2772-2777)。
近年來，從不同物種中相繼克隆了一些編碼與ARF同源的蛋白的cDNA，并被命名為ARL-like或ARL。它們包括果蠅的ARL1和ARL2，人的ARL1、ARL2、ARL3、ARL4*和ARL5*、大鼠的ARL1、ARL3、ARL4、ARL5，小鼠的ARL4*(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，3120-3124；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1993，90，8952-8956；J.Biol.Chem.，1994，269，15683-15688；J.Biol.Chem.，1994，269，18937-18942；J.Biol.Chem.，1995，270，21-24；J.Cell.Sci.，1996，109，209-220；標(biāo)“*”者在申請之前尚未公開報導(dǎo))，盡管已有一些ARL的研究顯示出組織或/和分化的表達(dá)特異性，然而總體來說，對ARL的功能仍不清楚。
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的多核苷酸，該多核苷酸編碼ARF家族的一個新成員，本發(fā)明的ARF家族成員被命名為人ARL5。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種新的人的ARF家族成員，該蛋白被命名為人ARL5蛋白。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種利用重組技術(shù)生產(chǎn)所述的新的人的ARL5蛋白的方法。
本發(fā)明還提供了這種人ARL5蛋白多肽和核酸序列的用途。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種分離出的DNA分子，它包括編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。更佳地，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種分離的人ARL5蛋白多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種載體，它含有上述分離出的DNA。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一方面，提供了一種產(chǎn)生具有人ARL5蛋白活性的多肽的方法，該方法包括(a)將編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人ARL5蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人ARL5蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人ARL5蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人ARL5蛋白活性的多肽。
在本發(fā)明的一個具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的分離的多核苷酸全長為849個核苷酸，其詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于17-556位核苷酸。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”或“基本純的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組份分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人ARL5蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中17-556位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框17-556位核苷酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO.3中17-556位核苷酸序列同源性低至約70％的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO.4所述的序列。該術(shù)語還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳地在高度嚴(yán)緊條件下，與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。還術(shù)語還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％的核苷酸序列。
該術(shù)語還包括能編碼具有與人ARL5相同功能的蛋白的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(通常為60個以內(nèi)，較佳地為30個以內(nèi)，更佳地為10個以內(nèi)，最佳地為5個以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，“基本純的”蛋白質(zhì)或多肽是指其至少占樣品總物質(zhì)的至少20％，較佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或濕重計)。純度可以用任何合適的方法進(jìn)行測量，如用柱層析、PAGE或HPLC法測量多肽的純度。基本純的多肽基本上不含天然狀態(tài)下的伴隨其的組分。
在本發(fā)明中，術(shù)語“人ARL5蛋白多肽”指具有人ARL5蛋白活性的SEQ IDNO.4序列的多肽。該術(shù)語還包括具有與人高效淋巴細(xì)胞趨化因子相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內(nèi)，較佳地為10個以內(nèi)，更佳地為5個以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時，通常不會改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語還包括人ARL5蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與人ARL5 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗人ARL5多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含人ARL5多肽或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了人ARL5多肽的可溶性片段。通常，該片段具有人ARL5多肽序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供人ARL5蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然人ARL5多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然Ｐ揎椷€包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“人ARL5保守性變異多肽”指與SEQ ID No.4的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。
表1
本發(fā)明還包括人ARL5多肽編碼序列及其片段的反義序列。這種反義序列可用于抑制細(xì)胞內(nèi)人ARL5的表達(dá)。
本發(fā)明還包括一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有人ARL5多肽編碼序列的8-100個，較佳地15-50個連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼人ARL5的核酸分子。
本發(fā)明還包括檢測人ARL5核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對應(yīng)于人ARL5多肽的編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長度一般為20-50個核苷酸。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體。比如，選用市售的載體，然后將編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，可以形成蛋白表達(dá)載體。
如本文所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰近，而對于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語“宿主細(xì)胞”包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。常用的原核宿主細(xì)胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞、和哺乳動物細(xì)胞。較佳地，該宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，如CHO細(xì)胞、COS細(xì)胞等。
另一方面，本發(fā)明還包括對人ARL5 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于人ARL5基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與人ARL5基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關(guān)抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結(jié)合并抑制人ARL5蛋白的分子，也包括那些并不影響人ARL5蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經(jīng)修飾形式的人ARL5基因產(chǎn)物結(jié)合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab′或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈FV分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。例如，純化的人ARL5基因產(chǎn)物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導(dǎo)多克隆抗體的產(chǎn)生。與之相似的，表達(dá)人ARL5或其具有抗原性的片段的細(xì)胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。本發(fā)明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術(shù)來制備(見Kohler等人，Nature 256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發(fā)明的抗體包括能阻斷人ARL5功能的抗體以及不影響人ARL5功能的抗體。本發(fā)明的各類抗體可以利用人ARL5基因產(chǎn)物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術(shù)獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與人ARL5基因產(chǎn)物的未修飾形式結(jié)合的抗體可以用原核細(xì)胞(例如E.Coli)中生產(chǎn)的基因產(chǎn)物來免疫動物而產(chǎn)生；與翻譯后修飾形式結(jié)合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細(xì)胞(例如酵母或昆蟲細(xì)胞)中產(chǎn)生的基因產(chǎn)物來免疫動物而獲得。
本發(fā)明的人ARL5核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計引物，并用市售的cDNA庫或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長時，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。
在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，人ARL5的cDNA核苷酸序列是如此獲得的，以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-GGTCCGCTGCCCGAGAATGGG-3′為正向引物，寡核苷酸A25′-GTCTTCCTCTCCCTTTGTACTTAC-3′為反向引物，進(jìn)行PCR。測序后得到SEQID NO.3的全長cDNA序列。
ARF是一個別構(gòu)激活因子，當(dāng)ARF與GTP結(jié)合后即具有活性，激活PLD；水解GTP后，復(fù)合物失活變?yōu)锳RF-GDP。ARF的功能可能涉及到從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體順式面的蛋白質(zhì)運(yùn)輸過程(J.Biol.Chem.1992，267，13053-13061)、高爾基體順式面內(nèi)部運(yùn)輸(Cell，1992，70，69-79)、囊泡的外吐作用(FEBS Lett，1993，121-124)和核內(nèi)囊泡運(yùn)輸(Nature，1992，358，512-514)等方面。它不但調(diào)節(jié)分泌作用早期外被體(coatomer)的聚集過程(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，6408-6412；J.Biol.Chem，1993，268，12083-12089)，而且是聚集于高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)格蛋白(clathrin coat)的有效調(diào)節(jié)物。
在附圖中，

圖1為本發(fā)明的人ARL5蛋白(hARL5)與小鼠ARL5蛋白(mARL5)的氨基酸序列的同源比較圖。其中，相同的氨基酸在兩個序列之間用“|”標(biāo)出，相似的氨基酸用“”標(biāo)出。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人ARL5的cDNA序列的克隆和測定1.引物擴(kuò)增以人肝臟λgt11cDNA文庫(購自Clontech公司)為模板，用一對寡核苷酸為引物——A15′-GGTCCGCTGCCCGAGAATGGG-3′(SEQ ID NO1)為正向引物，寡核苷酸A25′-GTCTTCCTCTCCCTTTGTACTTAC-3′(SEQ ID NO2)為反向引物，進(jìn)行PCR。A1/A2的PCR條件為93℃4分鐘，隨之以93℃1分鐘、68℃1分鐘和72℃1分鐘進(jìn)行35個循環(huán)，最后72℃延伸5分鐘。電泳檢測得到約850bp的目的片段。
2.PCR產(chǎn)物的測序?qū)⑷缟汐@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物A1/A2與pGEM-T載體(Promega)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM103，用QIAprep Plasmid試劑盒(QIAGEN)提取質(zhì)粒，用雙鏈嵌套式缺失試劑盒(Pharmacia)對插入片段進(jìn)行定向系列缺失，然后用PCR對缺失子進(jìn)行快速鑒定及排序。用SequiTherm EXCELTMDNA測序試劑盒(Epicentre Technologies)對依次截短的缺失子進(jìn)行測序，最后用電腦軟件拼接順序，獲得全長cDNA序列，共849bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO3，其中開放讀框位于17-556位核苷酸。
根據(jù)得到的全長基因組序列推導(dǎo)出人ARL5的氨基酸序列，共179個氨基酸殘基，其氨基酸序列詳見SEQ ID NO4。
實(shí)施例2同源比較將本發(fā)明的人ARL5的全長cDNA序列及其編碼蛋白，在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+PDB數(shù)據(jù)庫及Non-redundant GenBank CDS translations+PDB+SwissProt+Spupdate+PIR數(shù)據(jù)庫中用BLAST進(jìn)行核酸和蛋白同源檢索。結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們與ARF家族基因及其編碼蛋白具有廣泛的同源性，用BLAST軟件比較，發(fā)現(xiàn)它與大鼠ARL5基因在蛋白水平上的同一性(也稱為相同性)高達(dá)99％(圖1)，與ARF家族的其它大多數(shù)成員的同一性和相似性也分別在50％和70％左右(數(shù)據(jù)未給出)。用ProSite軟件對氨基酸保守區(qū)分析表明，本發(fā)明的cDNA編碼的蛋白具有一ARF家族特征性的序列。該序列在ARF家族中顯示為(H/R/Q/T)X(F/Y/W/I)X4AX2GX2(L/I/V/M)X2(G/S/A)(L/I/V/M/F)X(W/K)(L/I/V/M)，其中，(H/R/Q/T)等表示H、R、Q、T中的一種氨基酸，X表示任一氨基酸，下標(biāo)表示氨基酸數(shù)。在已知的ARF家族成員中僅有4個沒有上述特征性序列；在本發(fā)明的蛋白序列中，符合上述特征的序列為150HQWHIQACCALTGEGLCQGLEWM。除此之外，在本發(fā)明的蛋白序列中還發(fā)現(xiàn)了兩個GTP結(jié)合位點(diǎn)---65WDIGGQ70和125NKQD129，這兩個GTP結(jié)合位點(diǎn)在ARF家族中也是高度保守的。綜合上述現(xiàn)象，本發(fā)明的基因被確定是人ARF家族的在人體中的又一新成員，并據(jù)此命名為人ARL5，并且依據(jù)結(jié)構(gòu)決定功能，結(jié)構(gòu)相似功能相近的生物學(xué)原理，可以從ARF家族其它成員的功能來推測本發(fā)明的人類ARL5的功能。
ARF1最初是作為一種對霍亂毒素的ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性有協(xié)同作用的激活劑被發(fā)現(xiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)ARF是一個別構(gòu)激活因子，當(dāng)ARF與GTP結(jié)合后即具有活性，；水解GTP后，復(fù)合物失活變?yōu)锳RF-GDP。鳥嘌呤核苷酸交換蛋白(GEPs)促使ARF與GTP結(jié)合。而GTP酶活化蛋白(GAPs)促進(jìn)GTP水解。ARF通常影響與膜結(jié)合的磷酸化酶D(PLD)的活性，然而在酵母中似乎并不是這樣。在釀酒酵母中，PLD主要調(diào)控原孢子膜的形成--這是芽孢形成的先決條件，在ARF1羧基端增加一個C-myc表位，得到酵母的ARF1-myc ARF2突變型，雖然原孢子膜的形成受到削弱，但這并非是由于PLD的催化活性受到影響的緣故，事實(shí)上酵母中ARF并不激活PLD的活性(Mol.Biol.Cell.1998，9(8)，2025-2036)。ARF的功能可能涉及到從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體順式面的蛋白質(zhì)運(yùn)輸過程(J.Biol.Chem.1992，267，13053-13061)、高爾基體順式面內(nèi)部運(yùn)輸(Cell，1992，70，69-79)、囊泡的外吐作用(FEBS Lett，1993，121-124)和核內(nèi)囊泡運(yùn)輸(Nature，1992，358，512-514)等方面。它不但調(diào)節(jié)分泌作用早期外被體(coatomer)的聚集過程(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1992，89，6408-6412；J.Biol.Chem，1993，268，12083-12089)，而且是聚集于高爾基體外側(cè)網(wǎng)絡(luò)的網(wǎng)格蛋白(clathrin coat)的有效調(diào)節(jié)物。體外實(shí)驗證實(shí)真菌布雷菲爾德菌素A(brefeldin A)能抑制AP-1(Trends Cell Biol，1992，2，293-297；J.Biol.Chem.1992，117，171-1179)和β-COP與高爾基體膜(Cell1991，64，1183-1195)的結(jié)合。已知AP-1是衣被的一部分，很可能通過與網(wǎng)格蛋白及三角蛋白體的相互作用而在衣被的聚集過程中起主要作用；而β-COP則是外被體的一個亞單位，它是早期分泌途徑中囊泡出芽所必須的。布雷菲爾德菌素A通過阻止ARF上GDP到GTP的轉(zhuǎn)換而抑制ARF的功能。(J.Biol.Chem.1996，271(4)，2162-2170)。
ARF被推測參與內(nèi)質(zhì)體-內(nèi)質(zhì)體的融合(J.Biol.Chem.1992，267，13047-13052)，然而同時一些實(shí)驗則否定了這種假設(shè)(Mol.Cell.Biolchem.1994，135，159-164)，同時有實(shí)驗發(fā)現(xiàn)ARF對內(nèi)體小泡(endosomal vesicle)的融合并非必需，但是5′-O-(3-硫代三磷酸)(GTP gamma S)等對內(nèi)體小泡融合的抑制必須依賴ARF的存在(J.Biol.Chem.1995 Jun 9，270(23)，13693-13697)ARL的作用目前還很不清楚。1991年，Tamkun，J.W.等報導(dǎo)稱，果蠅的ARL蛋白與ARF具有許多相似的性質(zhì)，然而前者完全缺乏ARF的活性；基因突變研究發(fā)現(xiàn)了一個隱性突變的ARL基因，該突變導(dǎo)致了果蠅合子致死的表型，這暗示了果蠅中ARL可能是一重要功能基因(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88，3120-3124)。另一些研究表明了ARL表達(dá)上的特異現(xiàn)象。如大鼠ARL4在成纖維細(xì)胞系中無法被檢測到，而在已分化至脂肪細(xì)胞樣(adipocyte-like)表型的細(xì)胞中則含量豐富，ARL6的表達(dá)開始于3T3-L1細(xì)胞系分化的第6天(J.Biol.Chem.1994，269(22)，15683-15688)，這說明ARL4的功能可能與3T3-L1細(xì)胞的脂肪細(xì)胞樣表型有關(guān)。1996年，Lowe，S.L.等在大鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腎臟中ARL1與高爾基體相連(J.Cell Sci.1996，109(ptl)，209-220)，最近在對酵母ARF1(yARF1)研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象(J.Biol.Chem.1997，272(49)，30998-31005)，這提示ARL也可能與ARF一樣在囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用。
1996年一個新的與Ras相關(guān)的GTP酶，通過運(yùn)用PCR，從老鼠的脂肪細(xì)胞cDNA庫中克隆出來。這個蛋白有ARF的典型特征，而且與ARL1(ARF樣蛋白)最相關(guān)，被命名為ARL5。對大鼠ARL5的研究尚不深入，有關(guān)報導(dǎo)稱其mRNA在大多數(shù)大鼠被檢測的組織(如心臟，骨骼肌，脂肪，肝，腎，肺，脾，腸，胸腺)中含量較低，而大腦，腸，胸腺中含量最高(Biochim Biophys Acta 1996 Jul31，1308(1)，1-6)。有關(guān)人的ARL5還未見公開報導(dǎo)。關(guān)于它們在生物體內(nèi)所起的作用尚有待進(jìn)一步研究。
綜上所述，本發(fā)明的新蛋白很可能在囊泡的運(yùn)輸途徑(如外吐作用、內(nèi)吞作用以及高爾基體內(nèi)部的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)等等)中，以及其它一些細(xì)胞功能中發(fā)揮作用。另外本發(fā)明還為進(jìn)一步研究ARL在生物體(尤其人體)內(nèi)的作用及機(jī)理提供了新的途徑。
本發(fā)明的人ARL5除了可作為該家族一員用于進(jìn)一步的功能研究，還可用于與其他蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白，比如與免疫球蛋白一起產(chǎn)生融合蛋白。此外，本發(fā)明人ARL5還可以與該家族的其他成員進(jìn)行融合或交換片段，以產(chǎn)生新的蛋白。例如將本發(fā)明人ARL5的N端與其他動物的ARL5蛋白的N端進(jìn)行交換，以產(chǎn)生新的活性更高或具有新特性的蛋白。
針對本發(fā)明人ARL5的抗體，用于篩選該家族的其他成員，或者用于親和純化相關(guān)蛋白(如該家族的其他成員，比如小鼠的ARL5蛋白)。
此外，本發(fā)明人ARL5核酸(編碼序列或反義序列)可以被引入細(xì)胞，以提高人ARL5的表達(dá)水平或者抑制人ARL5的過度表達(dá)。本發(fā)明的人ARL5蛋白或其活性多肽片段可以施用于病人，以治療或減輕因人ARL5缺失、無功能或異常而導(dǎo)致的有關(guān)病癥。此外，還可以用基于本發(fā)明的核酸序列或抗體進(jìn)行有關(guān)的診斷或預(yù)后判斷。
實(shí)施例3人ARL5在大腸桿菌中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼人ARL5的cDNA序列(實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人ARL5cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGGAATTCTCTTCACTAG-3′(SEQ ID NO.5)，該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人ARL5編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5i-TTGGgtcgacTCATCTAATCTTAAGTCGT-3i(SEQ ID NO.6)，該引物含有SalI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、翻譯終止子和人ARL5的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于細(xì)菌表達(dá)載體pQE-9(Qiagen Inc.，Chatsworth，CA)上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr)、一個細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)(ori)、一個IPTG-可調(diào)啟動子/操縱子(P/O)、一個核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)、一個6-組氨酸標(biāo)記物(6-His)以及限制性內(nèi)切酶克隆位點(diǎn)。
用BamHI和SalI消化pQE-9載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pQE-9載體并保持開放讀框在細(xì)菌RBS起始。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化購自Qiagen，商品名為M15/rep4的E.coli菌株，M15/rep4含有多拷貝的質(zhì)粒pREP4，其表達(dá)lacI阻遏物并攜帶卡那霉素抗性(Kanr)。在含有Amp和Kan的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，抽提質(zhì)粒，測序驗證人ARL5的cDNA片段已正確插入了載體。
在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)和Kan(25μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的陽性轉(zhuǎn)化子克隆。過夜(O/N)培養(yǎng)物以1∶100-1∶250的稀釋率稀釋，然后接種到大體積培養(yǎng)基中，培養(yǎng)細(xì)胞生長至600光密度(OD600)為0.4-0.6時，加入IPTG(“異丙基硫代-β-D-半乳糖苷”)至終濃度為1mM。通過使lacI阻遏物失活，IPTG誘導(dǎo)啟動P/O導(dǎo)致基因表達(dá)水平提高。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞3-4小時，隨后離心(6000×g，20分鐘)。超聲裂解包涵體，收集細(xì)胞并將細(xì)胞沉淀溶于6M的鹽酸胍中。澄清后，通過在能使含6-His標(biāo)記物蛋白緊密結(jié)合的條件下，用鎳-螯合柱層析從溶液中純化溶解的人ARL5。用6M鹽酸胍(pH5.0)從柱中洗脫人ARL5?？捎脦追N方法從鹽酸胍中變性沉淀蛋白?；蛘?，使用透析步驟除去鹽酸胍，或者從鎳-螯合柱中分離出的純化蛋白。純化后的蛋白質(zhì)被結(jié)合到第二個柱中，該柱中具有遞減的線性鹽酸胍梯度。在結(jié)合到該柱時蛋白質(zhì)變性，隨后用鹽酸胍(pH5.0)洗脫。最后，將可溶的蛋白質(zhì)用PBS進(jìn)行透析，然后將蛋白質(zhì)保存在終濃度為10％(w/v)甘油的貯存液中。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為約21KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例4人ARL5在真核細(xì)胞(CHO細(xì)胞株)中的表達(dá)在該實(shí)施例中，將編碼人ARL5的cDNA序列(實(shí)施例1中的PCR擴(kuò)增片段)用對應(yīng)于該DNA序列的5′和3′端的PCR寡核苷酸引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得人ARL5cDNA作為插入片段。
PCR反應(yīng)中使用的5′寡核苷酸引物序列為5′-TCAGGGATCCATGGGAATTCTCTTCACTAG-3′(SEQ ID NO.5)該引物含有BamHI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，在該酶切位點(diǎn)之后是由起始密碼子開始的人ARL5編碼序列的20個核苷酸；3′端引物序列為5i-TTGGGATATCTCATCTAATCTTAAGTCGT-3i(SEQ ID NO.7)該引物含有EcoRV限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)、一個翻譯終止子和人ARL5的部分編碼序列。
引物上的限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)對應(yīng)于CHO細(xì)胞表達(dá)載體pcDNA3上的限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，該質(zhì)粒載體編碼抗生素抗性(Ampr和Neor)、一個噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(f1 ori)、一個病毒復(fù)制起點(diǎn)(SV40 ori)、一個T7啟動子、一個病毒啟動子(P-CMV)、一個Sp6啟動子、一個SV40啟動子、一個SV40加尾信號和相應(yīng)的polyA順序、一個BGH加尾信號和相應(yīng)的polyA順序。
用BamHI和EcoRV消化pcDNA3載體及插入片段，隨后將插入片段連接到pcDNA3載體。隨后用連接混合物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α菌株。在含有Amp的LB培養(yǎng)皿上篩選轉(zhuǎn)化子，在補(bǔ)加Amp(100μg/ml)的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)(O/N)含所需構(gòu)建物的克隆。抽提質(zhì)粒，并測序驗證人ARL5的cDNA片段已正確插入了載體。
質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞是采用脂轉(zhuǎn)染法，用Lipofectin(GiBco Life)進(jìn)行的。轉(zhuǎn)染48小時后，經(jīng)2-3周的持續(xù)G418加壓篩選，收集細(xì)胞及細(xì)胞上清測定表達(dá)蛋白酶活力。去G418，連續(xù)傳代培養(yǎng)；對混合克隆細(xì)胞極限稀釋，選擇具有較高蛋白活性的細(xì)胞亞克隆。按常規(guī)方法大量培養(yǎng)上述陽性亞克隆。48小時后，開始收集細(xì)胞及上清，用超聲裂解方法破碎細(xì)胞。以含0.05％Triton的50mMTris·HCl(pH7.6)溶液為平衡液及洗脫液，用經(jīng)預(yù)平衡的Superdex G-75柱收集上述蛋白的活性峰。再用50mMTris·HCl(pH8.0)平衡的DEAE-Sepharose柱，以含0-1M NaCl的50mMTris·HCl(pH8.0)溶液為洗脫液進(jìn)行梯度洗脫，收集上述蛋白的活性峰。然后以PBS(pH7.4)為透析液對表達(dá)蛋白溶液進(jìn)行透析。最后凍干保存。
用12％的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳，鑒定表達(dá)蛋白的分子量大小為21KDa。
此外，用常規(guī)方法對達(dá)蛋白的N端和C端各10個氨基酸長度的氨基酸進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)與SEQ ID NO.4的序列一致。
實(shí)施例5制備抗體將實(shí)施例3和4中獲得的重組蛋白用來免疫動物以產(chǎn)生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進(jìn)行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進(jìn)行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freundis佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)注射。14天后，用非完全Freundis佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進(jìn)行腹膜內(nèi)注射以加強(qiáng)免疫。每隔14天進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，至少進(jìn)行三次。獲得的抗血清的特異反應(yīng)活性用它在體外沉淀人ARL5基因翻譯產(chǎn)物的能力加以評估。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗體可特異性地與本發(fā)明蛋白特異性地發(fā)生沉淀。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表(1)一般信息(i)申請人復(fù)旦大學(xué)(ii)發(fā)明名稱一種新的人蛋白質(zhì)及其編碼序列，及制法和用途(iii)序列數(shù)目7(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長度21堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.1GGTCCGCTGC CCGAGAATGG G 21(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長度24堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO2GTCTTCCTCT CCCTTTGTAC TTAC 24(2)SEQ ID NO.3的信息(i)序列特征
(A)長度849bp(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO.3GGTCCGCTGC CCGAGAATGG GAATTCTCTT CACTAGAATA TGGAGACTGT TCAATCACCA 60GGAGCACAAA GTTATCATTG TTGGGCTGGA TAATGCAGGG AAAACTACCA TTCTTTACCA 120ATTTTCTATG AATGAAGTTG TACATACATC TCCTACAATA GGAAGTAATG TAGAAGAGAT 180AGTGATTAAT AATACACGTT TCCTAATGTG GGATATTGGT GGCCAAGAAT CTCTTCGTTC 240TTCCTGGAAC ACTTACTATA CTAACACAGA GTTTGTAATA GTTGTTGTGG ACAGTACAGA 300CAGAGAGAGG ATTTCTGTAA CTAGAGAAGA ACTCTATAAA ATGTTAGCGC ATGAGGACCT 360AAGAAAAGCT GGATTGCTGA TTTTTGCTAA TAAACAAGAT GTTAAAGAAT GCATGACTGT 420AGCAGAAATC TCCCAGTTTT TGAAGCTAAC TTCTATTAAA GATCACCAGT GGCATATCCA 480GGCATGCTGT GCTCTAACTG GCGAGGGATT GTGCCAAGGA CTTGAATGGA TGATGTCACG 540ACTTAAGATT AGATGATCTC TACTGACCTC TTCTCATAGA TTTTGTATAA ATGAAGTGCT 600GGACTTTACC TGAAAGCTGC AAAAATTAAT GGTTTAGATA TATTTATAAT AAACTGATTT 660AAACTTTTTC TATAAGAAGA AAAATTAAGA CCACTTATTT GAAAACAAAG ATGAAGTCTC 720ACCTTCCAGT TTGCTTTCTC ATTAGTTTTT TCCAAAGTAA GTTATTGAAG CTGTGATTGA 780CATTTTTCTC ATAATGAATC CTCTCAGGAC ATTGTGTAGC CTATGGTAAG TACAAAGGGA 840GAGGAAGAC 849(2)SEQ ID NO.4的信息(i)序列特征(A)長度179個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型多肽(xi)序列描述SEQ ID NO.4Met Gly Ile Leu Phe Thr Arg Ile Trp Arg Leu Phe Asn His Gln 15Glu His Lys Val Ile Ile Val Gly Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr 30Thr Ile Leu Tyr Gln Phe Ser Met Asn Glu Val Val His Thr Ser 45Pro Thr Ile Gly Ser Asn Val Glu Glu Ile Val Ile Asn Asn Thr 60Arg Phe Leu Met Trp Asp Ile Gly Gly Gln Glu Ser Leu Arg Ser 75Ser Trp Asn Thr Tyr Tyr Thr Asn Thr Glu Phe Val Ile Val Val 90Val Asp Ser Thr Asp Arg Glu Arg Ile Ser Val Thr Arg Glu Glu 105Leu Tyr Lys Met Leu Ala His Glu Asp Leu Arg Lys Ala Gly Leu 120Leu Ile Phe Ala Asn Lys Gln Asp Val Lys Glu Cys Met Thr Val 135Ala Glu Ile Ser Gln Phe Leu Lys Leu Thr Ser Ile Lys Asp His 150Gln Trp His Ile Gln Ala Cys Cys Ala Leu Thr Gly Glu Gly Leu 165Cys Gln Gly Leu Glu Trp Met Met Ser Arg Leu Lys Ile Arg 179(2)SEQ ID NO.5的信息(i)序列特征(A)長度30堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.5TCAGGGATCC ATGGGAATTC TCTTCACTAG 30(2)SEQ ID NO.6的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.6TTGGGTCGAC TCATCTAATC TTAAGTCGT 29(2)SEQ ID NO.7的信息(i)序列特征(A)長度29堿基(B)類型核酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型寡核苷酸(xi)序列描述SEQ ID NO.7TTGGGATATC TCATCTAATC TTAAGTCGT 29
權(quán)利要求
1.一種分離出的DNA分子，其特征在于，它包括編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，所述的序列編碼一多肽，該多肽具有SEQ ID NO.4所示的序列。
3.如權(quán)利要求1所述的DNA分子，其特征在于，該序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列。
4.一種分離的人ARL5蛋白多肽，其特征在于，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
5.如權(quán)利要求4所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA。
7.一種用權(quán)利要求6所述載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是大腸桿菌。
9.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，該細(xì)胞是真核細(xì)胞。
10.一種產(chǎn)生具有人ARL5蛋白活性的多肽的方法，其特征在于，該方法包括(a)將編碼具有人ARL5蛋白活性的多肽的核苷酸序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，形成人ARL5蛋白表達(dá)載體，所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(b)將步驟(a)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞，形成人ARL5蛋白的重組細(xì)胞；(c)在適合表達(dá)人ARL5蛋白多肽的條件下，培養(yǎng)步驟(b)中的重組細(xì)胞；(d)分離出具有人ARL5蛋白活性的多肽。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，該序列為SEQ ID NO.3中從核苷酸17-556位。
12.一種能與權(quán)利要求4所述的人ARL5蛋白多肽特異性結(jié)合的抗體。
13.一種核苷酸分子，其特征在于，它是權(quán)利要求1所述DNA分子的反義序列。
14.一種探針分子，其特征在于，它含有權(quán)利要求1所述的DNA分子中8-100個連續(xù)核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新的人蛋白質(zhì)及其核苷酸編碼序列。更具體地說,本發(fā)明涉及人ARL5的cDNA序列,該序列所編碼的蛋白是鼠ARL5的同系物。本發(fā)明還涉及由該核苷酸序列編碼的多肽,這些多核苷酸和多肽的應(yīng)用,以及所述多核苷酸和所述多肽的生產(chǎn)方法。
文檔編號C12N15/12GK1257927SQ9812605
公開日2000年6月28日 申請日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者余龍, 傅強(qiáng), 趙勇, 屠強(qiáng), 趙壽元 申請人:復(fù)旦大學(xué)