專利名稱：碳硅纖維介導(dǎo)的植物愈傷組織基因轉(zhuǎn)移的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的講是一種碳硅纖維介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)移的方法。
植物基因工程的關(guān)鍵技術(shù)是高效地導(dǎo)入外源基因進(jìn)入植物受體細(xì)胞，目前國(guó)內(nèi)外常用的轉(zhuǎn)基因方法有基因槍法和農(nóng)桿菌法。
基因槍法是1987年美國(guó)科學(xué)家發(fā)明的方法(Sanford et al.J.Particle Sci.Technol,5,27-37,1987)，其特點(diǎn)是將DNA包裹于微小的金屬鎢或金粉顆粒的表面，在高壓、火藥或放電的作用下金屬顆粒在真空中高速噴射，穿透受體細(xì)胞或組織，隨著金屬顆粒外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞中并表達(dá)。由于可以應(yīng)用在雙子葉、單子葉植物的愈傷組織或根莖葉等器官，基因槍法已被廣泛使用。然而，該方法需要昂貴的儀器設(shè)備以及維持費(fèi)用，國(guó)產(chǎn)基因槍雖然價(jià)格較低廉，但是性能相對(duì)不太穩(wěn)定，在一定程度上影響了基因槍的普及。
農(nóng)桿菌法是一種天然轉(zhuǎn)基因方法，多種雙子葉植物的冠癭瘤是由土壤農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒在植物細(xì)胞的傷口處導(dǎo)入外源DNA造成的，Ti質(zhì)粒中包含一些改變植物宿主代謝的基因，利用這些特性將目的基因插入T-DNA片段中，通過(guò)Ti質(zhì)粒導(dǎo)入宿主植物細(xì)胞中，雖然該方法不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是組織培養(yǎng)操作繁瑣，并且存在著宿主特異性問(wèn)題。
碳硅纖維介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)已有報(bào)導(dǎo)(Kaeppler et al.Plant CellRep.9,415-418,1990)。碳硅纖維介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移的機(jī)理，主要是利用其很高的內(nèi)在硬度和斷層易形成尖銳的切面。電子掃描顯微鏡顯示，碳硅纖維直徑平均為0.5微米，長(zhǎng)25微米。經(jīng)碳硅纖維處理的細(xì)胞，細(xì)胞壁被穿透。碳硅纖維表面帶負(fù)電荷，不攜帶DNA，而作為微針通過(guò)振蕩在細(xì)胞上打孔，幫助DNA進(jìn)入細(xì)胞。目前該方法只局限于幾種植物的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，如玉米、煙草和翦股潁等的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因(Kaeppler et al.Theor.Appl Genet 84,560-566,1 992；Asano et al PlantSci.79:247-252,1991；Frame et al.Plant J.6,941-948,1994)，其余組織如愈傷組織的基因?qū)胫两裆形匆?jiàn)報(bào)道。
本發(fā)明的目的是提出一種碳硅纖維介導(dǎo)的植物愈傷組織基因轉(zhuǎn)移的方法，它是利用碳硅纖維很高的內(nèi)在硬度，在斷層處易形成尖銳的切面，能夠穿透植物細(xì)胞壁，將外源DNA導(dǎo)入各種植物愈傷組織塊中，愈傷組織作為基因的受體具有植株再生容易，培養(yǎng)簡(jiǎn)單，易于繁殖的特點(diǎn)。本發(fā)明為碳硅纖維轉(zhuǎn)基因方法的廣泛使用奠定基礎(chǔ)，為植物轉(zhuǎn)基因增添了新的方法，為農(nóng)作物及花卉新品種的培育開(kāi)辟一條新途徑。
本發(fā)明是將植物愈傷組織放入改良培養(yǎng)基溶液中預(yù)處理，然后在外源DNA存在的條件下，加入碳硅纖維，振蕩后即可將外源DNA直接導(dǎo)入植物組織。
本發(fā)明的具體實(shí)施方式
包含下列各步驟(1)將誘導(dǎo)得到的植物愈傷組織沒(méi)入改良培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)5～60分鐘；改良培養(yǎng)基溶液為pH值為5.5-8.0的N6培養(yǎng)基或其它植物培養(yǎng)基，再加入1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖、0.1～2mol/L山梨醇和0.1～2mol/L甘露醇；(2)將外源DNA加入上述反應(yīng)液中，外源DNA的終濃度至少5μg/mL，外源DNA為質(zhì)?；蚓€性DNA；(3)加入0.1-5％(w/v)碳硅纖維(SCW直徑是0.5μm，長(zhǎng)度為20～80μm)；(4)振蕩混合1-60分鐘。
本發(fā)明也可以將誘導(dǎo)得到的植物愈傷組織直接沒(méi)入含有外源DNA和碳硅纖維的改良培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)5～60分鐘，然后再振蕩混合。
適合本發(fā)明所用的植物愈傷組織為生長(zhǎng)旺盛時(shí)期的愈傷組織。將誘導(dǎo)出來(lái)的愈傷組織從組織上分離下來(lái)，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基(MS2D)，將轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基設(shè)為第0天，每14天繼代一次(更換一次培養(yǎng)基)。轉(zhuǎn)基因所使用的植物愈傷組織為每次繼代后第1天至第14天的愈傷組織，而在第二次繼代后七天左右所取愈傷組織，轉(zhuǎn)化效率高。


圖1是外源pActl-F質(zhì)粒的物理圖譜圖；pActl-F質(zhì)粒具有Actl/gus/nos基因，gus基因?yàn)閳?bào)告基因，當(dāng)質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞后，gus基因表達(dá)產(chǎn)物與顯色底物5-溴-4-氯-3吲哚葡糖苷酸(X-Gluc)作用后顯示藍(lán)色，可以通過(guò)檢驗(yàn)轉(zhuǎn)化愈傷組織出現(xiàn)的藍(lán)斑，來(lái)檢驗(yàn)基因的轉(zhuǎn)移及效率。
本發(fā)明可以很容易地將外源基因?qū)胫参镉鷤M織中，植物愈傷組織易再生出植株，因此它特別適合于由原生質(zhì)體、懸浮細(xì)胞不易再生出植株的植物的基因轉(zhuǎn)移；本發(fā)明不受宿主種類(lèi)的限制，可以用于單子葉(例如水稻Oryza sativa L)和雙子葉植物(Rose Chinensis Jacq.)；本發(fā)明轉(zhuǎn)化效率高，瞬間表達(dá)效率可以達(dá)到50％，而且操作簡(jiǎn)便，只需一般實(shí)驗(yàn)室所具有的旋渦混合儀就可以完成。本發(fā)明具有設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、操作方便、適用廣泛和轉(zhuǎn)化效率高的特點(diǎn)，是適合我國(guó)國(guó)情的一種植物轉(zhuǎn)基因方法。
本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)可從下述實(shí)施例得以體現(xiàn)，但是它們并不是對(duì)本發(fā)明作任何限制。
實(shí)例1碳硅纖維介導(dǎo)月季(Rose Chinensis Jacq.)愈傷組織基因轉(zhuǎn)移截取生長(zhǎng)良好的月季(北京改良火焰，南開(kāi)大學(xué)生物系花房采集)枝條，沖洗干凈，分別用70％的乙醇和0.1％HgCL溶液處理，用水沖洗得到無(wú)菌枝條，然后以葉芽為中心截成1cm長(zhǎng)的小段，放入含有2mg/L6-芐氨基嘌呤(BA)、0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)、3％蔗糖和0.68％瓊脂的基本培養(yǎng)基(MS)中，于25±1℃下培養(yǎng)一周后開(kāi)始發(fā)芽；取無(wú)菌芽的葉和葉柄置于含有2mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、3％蔗糖和0.68％瓊脂的誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基(MS2D)中，誘導(dǎo)出愈傷組織后將其從組織上分離下來(lái)，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基(MS2D)，將轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基設(shè)為第0天，每14天繼代一次(更換一次培養(yǎng)基)。在第二次繼代后七天取愈傷組織切成2-3毫米見(jiàn)方的小塊，取十塊(455μg)，置于無(wú)菌1.5mL炮彈管中，加入振蕩緩沖液改良N6培養(yǎng)基500μL(附加1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸，3％蔗糖，0.25mol/L山梨醇，0.25mol/L甘露醇)，沒(méi)過(guò)愈傷組織，處理15分鐘，加入pActl-F質(zhì)粒DNA 40μL(μg/μL),80μL5％SCW(TOKAWHISKER TWS-100,Tokai CarbonCo TOKYO,JAPAN)后，在WH-2旋渦混合儀上(上海滬西儀器廠)，以2000轉(zhuǎn)每分，振幅6毫米，振蕩15分鐘，用改良N6培養(yǎng)基清洗愈傷組織，并轉(zhuǎn)到MS2D培養(yǎng)基上，25±1℃培養(yǎng)24小時(shí)，置于顯色液(19mmol/LX-Gluc,0.5mmol/L鐵氰化鉀，0.5mmol/L亞鐵氰化鉀，0.3％Triton X-100)37℃顯色16小時(shí)，用70％乙醇終止反應(yīng)，在解剖顯微鏡(322325 OLYMPUS,SZ Japan)下檢查結(jié)果，檢測(cè)GUS活性。對(duì)照實(shí)驗(yàn)不加質(zhì)粒，其它處理過(guò)程相同，結(jié)果見(jiàn)表1，表1是碳硅纖維介導(dǎo)月季愈傷組織基因轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化效率。表1
結(jié)果顯示，以第二次繼代后第七天愈傷組織加入40μgpActl-F質(zhì)粒DNA，有很高的轉(zhuǎn)化效率，而對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)GUS活性表達(dá)，證明碳硅纖維介導(dǎo)植物愈傷組織基因轉(zhuǎn)移方法是一種高效的基因轉(zhuǎn)移方法。
實(shí)例2.
月季(Rose Chinensis Jacq)愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間與表達(dá)效率關(guān)系實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)例1，轉(zhuǎn)基因受體為不同培養(yǎng)時(shí)期的愈傷組織，從用無(wú)菌芽的葉和葉柄誘導(dǎo)出愈傷組織，14天后將其從組織上分離下來(lái)，轉(zhuǎn)入新的培養(yǎng)基(MS2D)，將轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基設(shè)為第0天，每14大繼代一次(更換一次培養(yǎng)基)。第二次繼代后的0天、7天、11天和14天的愈傷組織作為受體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別在1.5mL炮彈管加入愈傷組織10余塊，改良N6培養(yǎng)基500μL,pActl-F質(zhì)粒DNA 40μL(μg/μl),80μL5％(質(zhì)量體積比)SCW，在WH-2旋渦混合儀上(上海滬西儀器廠)，以2000轉(zhuǎn)每分，振幅6毫米，振蕩30分鐘。用改良N6培養(yǎng)基清洗后，置于25±1℃培養(yǎng)24小時(shí)，加入顯色液(19mmol/L X-Gluc,0.5mmol/L鐵氰化鉀，0.5mmol/L業(yè)鐵氰化鉀，0.3％TritonX-100)37℃顯色14小時(shí)，用70％乙醇終止反應(yīng)，在顯微鏡(322325 OLYMPUS,SZ Japan)下檢查結(jié)果，結(jié)果見(jiàn)表2，表2是月季愈傷組織培養(yǎng)時(shí)間與GUS基因表達(dá)效率的關(guān)系。
表2.<
>實(shí)例3外源DNA濃度與月季(Rose Chinensis Jacq.)愈傷組織基因表達(dá)效率關(guān)系實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)例1，改變外源DNA濃度，即每1.5mL炮彈管加入從組織剝離后第二次繼代后培養(yǎng)七天的愈傷組織450mg±79mg約10塊，改良N6培養(yǎng)基500μL，處理15分鐘，分別加入質(zhì)粒DNA20μg、40μg、80μg和160μg以及80μL5％SCW，置于WH-2旋渦混合儀上(上海滬西儀器廠)，以2000轉(zhuǎn)每分，振幅6毫米，振蕩15分鐘，用改良N6培養(yǎng)基清洗后，25±1℃培養(yǎng)24小時(shí)后，置于顯色液(1.9mmol/LX-Gluc,0.5mmol/L鐵氰化鉀，0.5mmol/L亞鐵氰化鉀，0.3％Triton X-100),37℃顯色14小時(shí)，用70％乙醇終止反應(yīng)，在顯微鏡下檢查結(jié)果(322325 OLYMPUS,SZJapan)并拍照(PM-10AD顯微照相系統(tǒng)OLYMPUS)，見(jiàn)附圖2和表3，圖2是外源pActl-F質(zhì)粒為20微克的月季愈傷組織GUS表達(dá)結(jié)果二十倍放大圖。表3是外源DNA量與GUS基因表達(dá)效率的關(guān)系。
權(quán)利要求
1．一種碳硅纖維介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于它包含下列各步驟(1)將植物組織沒(méi)入pH值為5.5-8.0的改良培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)5～60分鐘；(2)將外源DNA加入上述反應(yīng)液中，外源DNA的終濃度至少5μg/mL；(3)加入0.1-5％(w/v)碳硅纖維；(4)振蕩混合1-60分鐘。
2．如權(quán)利要求書(shū)1所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述的植物為雙子葉植物或單子葉植物；
3．如權(quán)利要求書(shū)1所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述的植物組織為誘導(dǎo)得到的植物愈傷組織；
4．如權(quán)利要求書(shū)3所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述的誘導(dǎo)得到的植物愈傷組織為每次繼代后第1天至第14天的愈傷組織。
5．如權(quán)利要求書(shū)1所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述的改良培養(yǎng)基溶液為含有1mg/L2,4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖、0.1～2mol/L山梨醇和0.1～2mol/L甘露醇的N6培養(yǎng)基或其它植物培養(yǎng)基；
6．如權(quán)利要求書(shū)1所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述的外源DNA為質(zhì)粒或線性DNA；
7．如權(quán)利要求書(shū)1所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于所述的碳硅纖維直徑是0.5μm，長(zhǎng)度為20～80μm。
8．如權(quán)利要求書(shū)1所述的植物基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于也可以將誘導(dǎo)得到的植物愈傷組織直接沒(méi)入含有外源DNA和碳硅纖維的改良培養(yǎng)基溶液中培養(yǎng)5～60分鐘，然后再振蕩混合。
全文摘要
本發(fā)明涉及碳硅纖維介導(dǎo)的植物基因轉(zhuǎn)移的方法。碳硅纖維具有堅(jiān)硬的針狀結(jié)構(gòu)。在含有外源DNA和植物愈傷組織的液體介質(zhì)中通過(guò)劇烈振蕩,使針狀結(jié)構(gòu)刺入細(xì)胞壁,從而將外源DNA導(dǎo)入植物細(xì)胞。本發(fā)明適用于單子葉及雙子葉植物,是一種價(jià)格低廉,操作方便,轉(zhuǎn)化效率高的植物基因轉(zhuǎn)移方法。
文檔編號(hào)C12N15/82GK1230594SQ98125879
公開(kāi)日1999年10月6日 申請(qǐng)日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1998年12月22日
發(fā)明者鄭堅(jiān)瑜, 張洪濤, 李志茹, 周麗英, 李凝 申請(qǐng)人:南開(kāi)大學(xué)