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在真核細(xì)胞中生產(chǎn)化合物的方法

文檔序號(hào):440463閱讀:463來(lái)源:國(guó)知局
專利名稱:在真核細(xì)胞中生產(chǎn)化合物的方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及重組DNA技術(shù)。特別地,本發(fā)明涉及用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)化合物的方法,其中所述化合物存在于下述過(guò)氧化物酶體中,所述過(guò) 氧化物酶體能與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)融合,這使得所述化 合物可被釋放到細(xì)胞外。
背景技術(shù)
蛋白通過(guò)真核細(xì)胞向培養(yǎng)基的分泌涉及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)經(jīng)過(guò)多個(gè)膜閉合的區(qū) 室,這構(gòu)成了分泌途徑。首先,蛋白被轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER內(nèi)腔。蛋白質(zhì)在 膜的泡囊中從那兒轉(zhuǎn)運(yùn)到Golgi復(fù)合體,并從Golgi復(fù)合體轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜。 分泌過(guò)程涉及多個(gè)歩驟,其中,含有被分泌蛋白的泡囊從供體膜上被剪下 來(lái),定位到受體膜并與之融合。在這些歩驟中的每一個(gè),需要若干種不同 蛋白(例如折疊蛋白的伴侶分子)的功能,以進(jìn)行對(duì)蛋白的足夠熟化,包 括糖基化和二硫鍵形成。細(xì)胞外蛋白在ER的氧化環(huán)境中成熟,在該處它 們成為核心糖基化的,該糖基化過(guò)程隨后在Golgi復(fù)合體中完成。
已經(jīng)進(jìn)行了若干嘗試,企圖提高有絲真菌中蛋白的分泌。用于提高異 源蛋白分泌的常用手段是使用信號(hào)序列(見,例如,EP 0215 594)。如上 文所示的真核細(xì)胞中的傳統(tǒng)分泌途徑被改造為適應(yīng)細(xì)胞外蛋白的成熟。細(xì)
胞內(nèi)蛋白的成熟在具有特定伴侶分子和折疊蛋白的細(xì)胞質(zhì)的還原環(huán)境中實(shí) 現(xiàn)。以工業(yè)設(shè)置對(duì)蛋白質(zhì)(尤其是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì))的生產(chǎn)仍是困難的忍 weu,因?yàn)榉置诤拖掠渭庸さ牡托蕦?dǎo)致低的蛋白產(chǎn)量(Hopkins TR. Physical and chemical cell disruption for the recovery of intracellular proteins. Bioprocess Technol. 1991 ;12:57-83.)
由于生產(chǎn)蛋白質(zhì)的日益增長(zhǎng)的工業(yè)重要性以及分泌和下游加工途徑的 低效率,人們?nèi)匀恍枰@得用于在真核細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的改進(jìn)方法。本
發(fā)明提供了一種新穎的方法,用于高效率地生產(chǎn)蛋白質(zhì)。


圖1展示了 A m'ger表達(dá)載體pGBFIN-32。 圖2展示了/ac^表達(dá)載體pGBK-20。
圖3展示了在用乙酰胺酶轉(zhuǎn)化過(guò)的對(duì)照A m'gw細(xì)胞中或者在用與 SKL序列融合的乙酰胺酶基因轉(zhuǎn)化過(guò)的A m'ga細(xì)胞中測(cè)量的乙酰胺酶活性。
圖4展示了在用乙酰胺酶轉(zhuǎn)化過(guò)的對(duì)照K /acto細(xì)胞中或者在用與 SKL序列融合的乙酰胺酶基因轉(zhuǎn)化過(guò)的《/^to細(xì)胞中測(cè)量的乙酰胺酶活 性。
圖5顯示了用GFP-SKL轉(zhuǎn)化過(guò)的A m'gw的過(guò)氧化物酶體。
圖6顯示了用GFP-SKL轉(zhuǎn)化過(guò)并且與油酸鈉(過(guò)氧化物酶體增殖的 介導(dǎo)物(mediator)) —起培養(yǎng)的A m'gw的過(guò)氧化物酶體。
圖7顯示了含有若千種經(jīng)轉(zhuǎn)化A w/gw菌株的培養(yǎng)物上清液的SDS-PAGE凝膠,其展示了 GFP-SKL在上清液中的釋放。
圖8顯示了含有若干種經(jīng)轉(zhuǎn)化A w/gw菌株的培養(yǎng)物上清液的Western 雜交印跡,其展示了 GFP-SKL在上清液中的釋放。
圖9顯示了表達(dá)GFP (圖C) 、 GFP-SKL (圖B)或GFP/Pmp22 (圖 A)的A m'ger菌株。
圖IO顯示了細(xì)胞的a-特異性溶解的程度,其作為乙酰胺酶(amdS) /ml培養(yǎng)物上清液的相對(duì)量展示。
圖11展示了 A w'ger表達(dá)載體pGBFIN-5。
圖12顯示了 IOL規(guī)模發(fā)酵中A m'ger中細(xì)胞外的GFP-SKL生產(chǎn)以及 生物物質(zhì)濃度。
圖13顯示了 A m'gw中細(xì)胞內(nèi)的GFP-SKL生產(chǎn)上的葡萄糖受限和氧 受限發(fā)酵條件之間的區(qū)別。
圖14顯示了具有C末端SKL的經(jīng)分泌乙酰胺酶在培養(yǎng)物上清液中的 存在;方塊2和4展示了能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的A m'ger宿主細(xì)胞中的具
有SKL的乙酰胺酶;方塊l和2展示了能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的A m'gw宿 主細(xì)胞中的不具有SKL的乙酰胺酶。
圖15展示了培養(yǎng)物上清液中具有C末端SRL的經(jīng)分泌乙酰胺酶的存在。
發(fā)明詳述
在第一個(gè)方面,本發(fā)明涉及一種真核細(xì)胞,其含有過(guò)氧化物酶體,所 述過(guò)氧化物酶體能與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)融合。以這種方 式,本發(fā)明提供了真核細(xì)胞的一種新能力,由此它們能將過(guò)氧化物酶體的 內(nèi)含物釋放到細(xì)胞外。以這種方式,過(guò)去不能被真核細(xì)胞分泌的化合物現(xiàn) 在可有利地通過(guò)過(guò)氧化物酶體途徑釋放。
根據(jù)本發(fā)明,過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的 融合等價(jià)于過(guò)氧化物酶體的膜與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的融
合。融合指不同元件的合并,形成統(tǒng)一的整體此處一種元件是過(guò)氧化物
酶體的膜,另外的元件是來(lái)自細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的膜。 過(guò)氧化物酶體的脂雙層膜與分泌途徑的膜結(jié)構(gòu)的脂雙層膜的融合在本文中 被理解為表示兩種脂雙層膜形成一種單一的、連續(xù)的脂雙層膜,其包圍著 過(guò)氧化物酶體和分泌途徑的膜結(jié)構(gòu)的內(nèi)含物。當(dāng)過(guò)氧化物酶體脂雙層膜與 質(zhì)膜融合形成單一的、連續(xù)的脂雙層膜的情況下,應(yīng)當(dāng)理解,新形成的單 一的膜將不包圍過(guò)氧化物酶體的內(nèi)含物,而是過(guò)氧化物酶體的內(nèi)含物將釋 放進(jìn)細(xì)胞外環(huán)境。例如,如果過(guò)氧化物酶體與質(zhì)膜的融合發(fā)生,過(guò)氧化物 酶體的內(nèi)含物將直接輸出到細(xì)胞外。在另一個(gè)例子中,如果過(guò)氧化物酶體
與Golgi復(fù)合體和/或與ER的融合發(fā)生,過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物將轉(zhuǎn)移到 Golgi復(fù)合體和/或ER中,由此通過(guò)細(xì)胞的內(nèi)在分泌途徑間接輸出到細(xì)胞 外。
過(guò)氧化物酶體(也稱作微體)被定義為單一膜限定的(single membrane-bound)細(xì)胞器,其涉及在真核細(xì)胞中普遍發(fā)現(xiàn)的多種代謝過(guò)程 (Sakaietal. Yeast 14, 1 175-1 187; 1998)。在真核細(xì)胞中,過(guò)氧化物酶體 通常不與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)融合,但其作為單一膜限定的細(xì)胞器被保持于胞質(zhì)中。
在本發(fā)明的上下文中,細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)可以是細(xì) 胞對(duì)多肽的分泌所涉及的任何膜結(jié)構(gòu)。在本發(fā)明通篇中,短語(yǔ)"細(xì)胞分泌 途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)"和術(shù)語(yǔ)"膜結(jié)構(gòu)"可同義使用。優(yōu)選地,細(xì) 胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)選自質(zhì)膜、Golgi復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)
(ER)構(gòu)成的組。Golgi復(fù)合體被定義為包括最少三種(順區(qū)、中區(qū)和反 區(qū)Golgi)不同的扁平膜限定區(qū)室(池,cistemae)構(gòu)成,所述區(qū)室互相連 接,形成堆疊(Pfeffer SR, Constructing a Golgi complex. J Cell Biol. 2001 Dec 10;155(6):873-5)。
分泌途徑中膜融合的過(guò)程在所有真核物種中高度保守。根據(jù)本領(lǐng)域的 現(xiàn)有技術(shù)狀況,驅(qū)動(dòng)膜融合的中央組分是被稱為SNARE (可溶N-乙基順 丁烯二酰亞胺-敏感因子聯(lián)接蛋白受體)的多肽。在供體(v-SNARE)和 受體(acceptor)膜(t-SNARE)上存在的互補(bǔ)性SNARE通過(guò)保守序列基 元(SNARE基元)區(qū)分。為介導(dǎo)膜融合,四種SNARE基元捆束起來(lái),形 成平行的巻曲螺旋(coiled-coil)結(jié)構(gòu),其被稱為SNAREpin 。該 SNAREpin包含在受體膜結(jié)構(gòu)上的至少一種錨定膜的SNARE,以及在供體 膜結(jié)構(gòu)上的至少一種錨定膜的SNARE。含有一種或多種SNARE基元(例 如Sec9)的可溶性或膜限定的SNARE可補(bǔ)充SNAREpin的形成。 SNAREpin組件在供體受體膜結(jié)構(gòu)中的排列可能是1: 3,但也可以是 2: 2 (Burri L, Lithgow T. A complete set of SNAREs in yeast Traffic. 2004 Jan;5(l):45-52)。
根據(jù)本發(fā)明,過(guò)氧化物酶體膜與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu) 的融合可以以多種方法來(lái)實(shí)現(xiàn),所述方法可單獨(dú)或組合使用。
本發(fā)明公開了為獲得過(guò)氧化物酶體與真核細(xì)胞的質(zhì)膜(或分泌途徑 的另一種膜)的融合, 一種優(yōu)選的選擇是將融合多肽或其一部分在過(guò)氧化 物酶體的表面暴露。根據(jù)本發(fā)明,融合多肽是供體膜結(jié)構(gòu)與受體膜結(jié)構(gòu)的 融合所涉及的多肽,其通常在供體膜結(jié)構(gòu)的表面暴露。在表面暴露在本文 中被理解為表示在供體膜的細(xì)胞質(zhì)側(cè)暴露,與內(nèi)腔側(cè)相反。供體膜結(jié)構(gòu)被 定義為能產(chǎn)生下述泡囊的膜結(jié)構(gòu),所述泡囊能與受體的膜結(jié)構(gòu)融合。優(yōu)選
地,供體和受體膜結(jié)構(gòu)是分泌途徑的膜。更優(yōu)選地,供體膜結(jié)構(gòu)選自
Golgi復(fù)合體和ER構(gòu)成的組。
典型地,融合多肽包含在供體膜結(jié)構(gòu)(例如Gk)gi復(fù)合體或ER)的表 面暴露的部分以及跨膜結(jié)構(gòu)域。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,融合多肽的通 常在供體膜結(jié)構(gòu)的表面暴露的部分,即,表面暴露的結(jié)構(gòu)域,被用于在過(guò) 氧化物酶體的表面暴露。
在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,供體膜結(jié)構(gòu)是Golgi復(fù)合體,即,融合多 肽是通常在Golgi復(fù)合體的泡囊表面表達(dá),并且已知涉及Golgi泡囊與質(zhì) 膜的融合的多肽。
優(yōu)選的融合多肽是v-SNARE或v-SNARE多肽家族的多肽,如 vesicle-SNAREs, Jahn et al, Annu Rev. Biochem.(1999) 863-911 ;上文所述的 Burri et al.所述。通過(guò)與SEQ ID NO: 13的序列同一性,在下文中對(duì)優(yōu)選 的v-SNARE進(jìn)行了進(jìn)一步定義。
在Golgi復(fù)合體的泡囊表面表達(dá)的若干種v-SNARE已被描述,例如, Sncl和Snc2 (上文所述的Burri et al.)。在ER表面表達(dá)的v-SNARE的例 子是Sec22和Ykt6 (上文所述的Bum et al.)。在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí) 施方式中,使用v-SNARE Sncl或Snc2中的至少一種或其同源體。 Sncl/Snc2同源體的例子是本發(fā)明提供的爿印erg/〃船m'gw SncA多肽。
本發(fā)明包括本發(fā)明中關(guān)于其從特定對(duì)照物種(通常是酵母(S. c^eW^^))的來(lái)源所述的任何多肽的同源體的用途。因此,同源體(或 同源序列)被定義為來(lái)自與對(duì)照物種不同的另一物種的、與對(duì)照物種的多 肽發(fā)揮實(shí)質(zhì)上相同的功能的多肽,雖然同源體可能具有與用于對(duì)照物種中 的名稱不同的名稱。典型地,此類同源體可能與對(duì)照物種的多肽具有至少 50%的同一性程度。此類同源體優(yōu)選來(lái)自與按照本發(fā)明修飾的真核細(xì)胞相 同的真核物種。
為獲得融合多肽例如v-SNARE在過(guò)氧化物酶體表面的暴露,融合多 肽或其能與受體膜上的互補(bǔ)SNARE發(fā)生相互作用的至少一部分與過(guò)氧化 物酶體的膜-多肽或其一部分可操作地相連,優(yōu)選地,與其融合。以這種方 式獲得包含融合多肽部分或組分以及過(guò)氧化物酶體膜-多肽部分或組分的嵌
合多肽。
過(guò)氧化物酶體膜-多肽或其一部分作為嵌合多肽的組分,優(yōu)選能介導(dǎo)嵌 合多肽向過(guò)氧化物酶體膜的靶向,更優(yōu)選地,過(guò)氧化物酶體膜多肽或其一 部分能將嵌合多肽錨定到過(guò)氧化物酶體膜。最優(yōu)選地,嵌合多肽向過(guò)氧化 物酶體膜的錨定由過(guò)氧化物酶體膜多肽或其一部分通過(guò)將至少一個(gè)跨越膜 的跨膜片斷整合進(jìn)過(guò)氧化物酶體膜來(lái)實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選地,整個(gè)嵌合多肽在過(guò)氧
化物酶體膜中的定位(localization)使得其作為膜-錨(membrane-anchor)
發(fā)揮作用,并且同時(shí),在過(guò)氧化物酶體的(胞質(zhì))表面暴露嵌合多肽的融 合多肽部分。優(yōu)選地,過(guò)氧化物酶體膜-多肽在N末端部分被修飾調(diào)整, 導(dǎo)致融合多肽盡可能接近過(guò)氧化物酶體膜的暴露,而不取消嵌合融合多肽 的過(guò)氧化物酶體靶向。
優(yōu)選地,融合多肽(例如v-SNARE)的部分用作為嵌合多肽的組分, 所述嵌合多肽至少包含通常在供體膜結(jié)構(gòu)(例如Golgi泡囊)表面暴露的 融合多肽的結(jié)構(gòu)域。融合多肽的跨膜結(jié)構(gòu)域在嵌合多肽中可部分不存在或 完全不存在。
適合用作為過(guò)氧化物酶體膜-錨的任何過(guò)氧化物酶體膜-多肽或其一部 分發(fā)揮作用適合用于與至少融合多肽的表面暴露結(jié)構(gòu)域可操作地相連,優(yōu) 選地,與其融合,只要能得到包含位于過(guò)氧化物酶體的胞質(zhì)側(cè)(或表面) 的融合多肽部分的嵌合肽(以便能與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu) 相互作用)。優(yōu)選地,融合多肽部分位于嵌合多肽的N末端部分,因此, 優(yōu)選地,過(guò)氧化物酶體膜多肽是下述多肽,所述多肽中,N末端天然在過(guò) 氧化物酶體胞質(zhì)側(cè)暴露,或者,其具有至少一種跨膜片斷,該片斷的天然 定向使得該片斷的N末端朝向胞質(zhì)。
優(yōu)選的過(guò)氧化物酶體膜多肽的一個(gè)例子是過(guò)氧化物酶體膜多肽22 (Pmp22)或其同源體(Brosius U, Dehmel T, Gartner J. Two different targeting signals direct human peroxisomal membrane protein 22 to peroxisomes. J Biol Chem. 2002 Jan 4;277(l):774-84) 。 Pmp22同源體的一 個(gè)例子是本發(fā)明提供的A/ e/^'〃w w'gw Pmp22。 Brosius et al. (2002,前 文所述)已顯示,人和大鼠的Pmp22蛋白具有四個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(l個(gè)以N
到C末端的方向經(jīng)過(guò))以及2個(gè)獨(dú)立的過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào),所述信號(hào) 位于第一個(gè)和第二個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的N末端。根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,
Pmp22多肽被用作為嵌合多肽組分的部分由此至少包含Pmp22的過(guò)氧化物 酶體跨膜結(jié)構(gòu)域3和4,更優(yōu)選地,Pmp22的4個(gè)過(guò)氧化物酶體跨膜結(jié)構(gòu) 域。優(yōu)選地,Pmp22多肽作為嵌合多肽組分的部分僅包含Pmp22的過(guò)氧化 物酶體跨膜結(jié)構(gòu)域3和4以及包含N末端到跨膜結(jié)構(gòu)域3的足夠的氨基 酸,以包括進(jìn)功能性過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)。優(yōu)選地,包括Brosiusetal.
(2002,前文所述)定義的N末端到跨膜結(jié)構(gòu)域3的至少15、 12、 10、 8 或7個(gè)氨基酸。
適用于與至少融合多肽的表面暴露結(jié)構(gòu)域可操作地相連(優(yōu)選地,與 其融合)的其它合適的過(guò)氧化物酶體膜蛋白(或其適合用作為過(guò)氧化物酶 體膜錨發(fā)揮作用的部分)包括但不限于,例如,PMP34、 PMP47、 PMP70、 PEX3、 PEXll、 PEX14禾卩PEX22 (綜述見Eckert JH and Erdmann R., Peroxisome biogenesis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2003; 147:75-121)。
優(yōu)選地,Pmp22和另外的過(guò)氧化物酶體膜蛋白在N末端部分按前文所 述經(jīng)過(guò)修飾調(diào)整。所述修飾調(diào)整包括至少第一個(gè)甲硫氨酸的缺失。在N末 端部分的修飾調(diào)整還可包含N末端1至50,例如48的氨基酸的缺失,優(yōu) 選地,N末端l至35,例如,33的氨基酸的缺失,更優(yōu)選地,N末端l至 20,例如,18的氨基酸的缺失。優(yōu)選地,對(duì)過(guò)氧化物酶體膜蛋白的N末端 加以修飾調(diào)整,使得至少15、 12、 8、 7、 5或3個(gè)氨基酸保留為N末端到 第一個(gè)(以N到C末端的方向)跨膜結(jié)構(gòu)域,其天然定向使得片斷的N 末端朝向胞質(zhì)。優(yōu)選地,對(duì)過(guò)氧化物酶體膜蛋白的N末端的修飾調(diào)整不會(huì) 使得過(guò)氧化物酶體耙向需要的氨基酸序列被缺失或破壞。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,在供體膜結(jié)構(gòu)的表面暴露的v-SNARE (例 如Sncl、 Snc2或SncA)的結(jié)構(gòu)域與過(guò)氧化物酶體膜多肽Pmp22可操作地 相連(或融合),以用v-SNARE (例如Sncl、 Snc2或SncA)的相應(yīng)部分 改裝(decorate)過(guò)氧化物酶體。更優(yōu)選地,使用SncA的表面暴露結(jié)構(gòu) 域。進(jìn)一步更優(yōu)選地,嵌合多肽具有根據(jù)SEQIDNO: 24的氨基酸序列。 技術(shù)人員將知道如何按照從針對(duì)SEQ ID NO: 24所述的同樣的原則從來(lái)自 其它生物的Pmp22多肽直向同源體和v-SNARE直向同源體構(gòu)建嵌合多
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中,融合多肽在過(guò)氧化物酶體表面的暴露由 細(xì)胞受體膜結(jié)構(gòu)(例如,Glogi復(fù)合體的質(zhì)膜)處的補(bǔ)充性 (complementing)融合多肽的過(guò)量表達(dá)來(lái)進(jìn)行。"補(bǔ)充性融合多肽"根據(jù) 本發(fā)明是協(xié)助供體膜結(jié)構(gòu)(例如Glogi復(fù)合體或ER的泡囊)與受體膜結(jié) 構(gòu)(例如Golgi復(fù)合體的質(zhì)膜)融合所涉及的多肽。
補(bǔ)充性融合多肽優(yōu)選是靶-SNARE或t-SNARE (Jahn et al., Annu. Rev. Biochem. 863-91 1 (1999))。優(yōu)選的t-SNARE多肽例如Ssol或Sso2,或 其同源體(定位于質(zhì)膜)或Sed5或其同源體(定位于Golgi復(fù)合體)(如 前文所述的Brosius et al.)。其它優(yōu)選的補(bǔ)充性融合多肽是Sec9 (涉及在 質(zhì)膜的融合)或Bosl、 Gosl、 Betl或其同源體(涉及在Golgi復(fù)合體的融 合)(如前文所述的Brosius etal.)。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,融合多肽和補(bǔ)充性融合多肽被暴露或以化 學(xué)計(jì)量的量過(guò)量表達(dá),這意味著融合多肽和補(bǔ)充性融合多肽之間的多肽相 互作用盡可能接近于生理比例或天然化學(xué)計(jì)量(如前文所述的Brosius et al.)。化學(xué)計(jì)量共暴露預(yù)計(jì)能進(jìn)一步協(xié)助過(guò)氧化物酶體與受體膜結(jié)構(gòu)(例 如質(zhì)膜)的融合。該化學(xué)計(jì)量共表達(dá)優(yōu)選通過(guò)使用基本相同拷貝數(shù)的相同 的表達(dá)盒來(lái)獲得。優(yōu)選地,t-sNARE基因的內(nèi)源拷貝保留不變,使得從內(nèi) 源拷貝獲得的t-SNARE的量對(duì)于與分泌途徑的天然泡囊的融合來(lái)說(shuō)是可利 用的。
根據(jù)本發(fā)明的一種實(shí)施方式,真核細(xì)胞含有能與細(xì)胞的質(zhì)膜以及 Golgi復(fù)合體融合的過(guò)氧化物酶體。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,所有選出的融合多肽以及可選的補(bǔ)充性融 合多肽,以及將被表達(dá)的過(guò)氧化物酶體膜多肽對(duì)于選用的真核宿主細(xì)胞來(lái) 說(shuō)是天然的。
本發(fā)明還包括對(duì)根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞的改進(jìn),使得真核細(xì)胞能滿足 根據(jù)本發(fā)明的具有提高的效率的活性。
例如,過(guò)氧化物酶體向質(zhì)膜的耙向以及隨后的膜融合可通過(guò)使用 Golgi來(lái)源的泡囊的耙向機(jī)制來(lái)增強(qiáng)。修飾可允許該機(jī)制對(duì)過(guò)氧化物酶體 有效。
修飾該機(jī)制以對(duì)過(guò)氧化物酶體有效的例子是對(duì)Sec4或其同源體進(jìn)行工
程改造,使得其與過(guò)氧化物酶體可操作地相連。這將導(dǎo)致過(guò)氧化物酶體向
質(zhì)膜(胞質(zhì)外(exocyst))中分泌復(fù)合物的靶向,此外,將增加 SNAPEpin的形成,以增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體與質(zhì)膜融合的效率。通常,Sec4 在GDP可溶狀態(tài)和GRP結(jié)合分泌泡囊膜聯(lián)接狀態(tài)之間循環(huán)。已表明 (Ossig et al 1995. EMBO Journal 3645-3653.),永久性聯(lián)接的Sec4是具有 生物活性的,Sec4的膜聯(lián)接通常通過(guò)對(duì)兩個(gè)C末端半胱氨酸殘基進(jìn)行櫳牛 兒基櫳牛兒基化來(lái)獲得。為允許Sec4向過(guò)氧化物酶體膜的永久聯(lián)接,Sec4 的兩個(gè)C末端半胱氨酸殘基可被缺失或被不同的氨基酸取代,包含過(guò)氧化 物酶體膜多肽或其一部分的嵌合多肽可被工程改造為與已描述過(guò)的包含融 合多肽和過(guò)氧化物酶體膜多肽的嵌合多肽類似。
此外,過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的融合可 通過(guò)下述方法提高制造對(duì)與融合多肽的相互作用更敏感的補(bǔ)充性融合多 肽。這可以以下文所述的多種方法來(lái)進(jìn)行。
融合多肽以及可選地,補(bǔ)充性融合多肽的組成性活性突變體可被制 備,并且(過(guò)量)暴露于過(guò)氧化物酶體以及可選地,受體膜結(jié)構(gòu)(例如質(zhì) 膜)的表面。組成性活性突變體的例子是補(bǔ)充性融合多肽(優(yōu)選地,t-SNARE,更優(yōu)選地,Ssol或其同源體)的去磷酸化的突變體(Marash M, Gerst JE. t-SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast. EMBO J. 2001 Feb 1 ;20(3):411 -21)。
還可能通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)對(duì)SNARE的調(diào)控子基因加以 失活。此類調(diào)控子例如是v-SNARE主體(master) (VSM-1或其同源 體),其與磷酸化的Ssol結(jié)合,對(duì)Ssol的閉合的、失活的構(gòu)象加以穩(wěn)定 (Marash M, Gerst JE. Mol Biol Cell. 2003 Aug;14 (8):3114-25)。
還可能對(duì)已知能活化SNARE相互作用的酶過(guò)量表達(dá)。優(yōu)選地,神經(jīng) 酰胺活化的磷酸酶蛋白(CAPP)或其同源體過(guò)量表達(dá)(FishbeinJD,Dobrowsky RT, Bielawska A, Garrett S, Hannun YA. Ceramide-mediated growth inhibition and CAPP are conserved in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1993 May 5;268(13):9255-61)。
還可能以使得過(guò)氧化物酶體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)受到影響的方式對(duì)真核細(xì)胞加以 修飾。此類修飾可包括,提高過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生的速率和/或降低過(guò)氧 化物酶體降解的速率,這是較之根據(jù)本發(fā)明的真核細(xì)胞來(lái)源的親本細(xì)胞的 過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生和/或降解而言的。
根據(jù)一種更優(yōu)選的實(shí)施方式,己通過(guò)下述方法對(duì)真核細(xì)胞進(jìn)行了遺傳 修飾(WO 00/71579所述)
(a) 對(duì)涉及過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生的基因過(guò)量表達(dá),所述基因例如 pexll和/或pex3或其同源體,和/或
(b) 對(duì)過(guò)氧化物酶體降解涉及的基因負(fù)調(diào),所述基因例如vpsl5禾口/ 或pddl和/或APG或其同源體。
pex3和pexll多肽在過(guò)氧化物酶體生物發(fā)生中的作用已被描述 (Baerends RJ, et al Yeast. 1997 Dec;13(15):1449-63 and WO 00/71579)。 Apg和Vpsl5多肽在過(guò)氧化物酶體降解中的作用也已被描述(Wang CW et al. J Biol Chem. 2001 Aug 10;276(32):30442-51 and Hutchins MU, et al. J Cell Sci. 1999 Nov; 112 (Pt22):4079-87)。
或者,或與上述方法組合,含有能與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜 結(jié)構(gòu)融合的過(guò)氧化物酶體的真核細(xì)胞可通過(guò)使用合適的篩選方法進(jìn)行經(jīng)典 菌株改進(jìn)來(lái)獲得。優(yōu)選的篩選方法使用模型多肽,例如GFP在細(xì)胞過(guò)氧化 物酶體中的表達(dá)來(lái)進(jìn)行,優(yōu)選地,使用促進(jìn)模型蛋白的過(guò)氧化物酶體定位 的信號(hào),按照下文所述測(cè)量模型多肽在細(xì)胞外的存在。GFP在細(xì)胞外的存 在可通過(guò)但不限于熒光和/或western雜交印跡來(lái)測(cè)定。
本發(fā)明的真核細(xì)胞可被遺傳修飾,以獲得較之野生型細(xì)胞展示出更低 的蛋白表達(dá)和/或分泌的表型。此類表型可通過(guò)對(duì)蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子的 缺失和/或修飾和/或失活來(lái)獲得。此類轉(zhuǎn)錄調(diào)控子例如prtT。用于通過(guò)調(diào) 節(jié)prtT降低蛋白酶表達(dá)的技術(shù)描述于US2004/0191864A1中。
對(duì)將按照本發(fā)明修飾的宿主細(xì)胞的選擇將在很大程度上取決于編碼感興趣多肽的核酸序列的來(lái)源或者取決于將生產(chǎn)的代謝產(chǎn)物的同一性。優(yōu)選 地,真核細(xì)胞是哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、真菌或藻類細(xì)胞。優(yōu)選的哺乳動(dòng)
物細(xì)胞包括中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、COS細(xì)胞、293細(xì)胞、PerC6細(xì) 胞和雜交瘤細(xì)胞。優(yōu)選的昆蟲細(xì)胞包括Sf9和Sf21細(xì)胞及其衍生物。更優(yōu) 選地,真核細(xì)胞是真菌細(xì)胞,即酵母細(xì)胞,例如K/acfe或X ceMv&'M或 //^m"eww/a ; o(y附o^ /w!或尸/c/n'a/ ^ton'51,或有絲真菌細(xì)胞。根據(jù)一禾中最tfe 選的實(shí)施方式,真核細(xì)胞是有絲真菌細(xì)胞。
"有絲真菌"包括Eumycota和Oomycota亞門的所有有絲形式(如前 文Hawksworth et al., 1995所定義)。有絲真菌的特征在于幾丁質(zhì)、纖維 素、葡聚糖、脫乙酰幾丁質(zhì)、甘露聚糖和其它復(fù)雜多糖構(gòu)成的菌絲體壁。 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)通過(guò)菌絲延長(zhǎng)進(jìn)行,碳代謝是專性需氧的。有絲真菌菌株包括但 不限于,Jcre淤ow'w附、v45/ erg/〃M 、 v4wreo6as7V/,Mm 、 CV7ptoc0cc船、 /^//Z (XS7.(i/m附 、Fwsfln.wm 、//wm/co/a 、MagwopoWAe 、Mwcor 、
P/rowyces1 、 /Sc/ /zo/ /^〃mw 、 Zh/arom_yc&s" 、 77 e環(huán)oosci^ 、 77n'e/aWa 、 7b(ypoc/a<i/wm禾口 7>/c//ocferma白勺菌株。
優(yōu)選的有絲真菌細(xì)胞屬于Jwerg/〃M、 Pe"/c/〃z'wm或rn'c/wflfew7a屬的 禾中, 最優(yōu)選地,y4^erg77/^ "/ger 、 爿s/ ^g/〃w-S" sq/ae 、 y^/ ergZ〃m51
cA^TOgewwm的禾中。
公眾可以從大量培養(yǎng)集合物,例如American Type Culture Collection (ATCC)、 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) 、 Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS)禾口 Agricultural Research Service Patent Culture Collection 、 Northern Regional Research Center (NRRL)容易地獲得若干種有絲真菌菌株j^ ergz7/^ m'ger CBS 513.88、 j印erg/〃w o/^zae ATCC 20423、 IFO 4177、 ATCC 1011、 ATCC 9576、 ATCC14488-14491 、 ATCC 11601、 ATCC12892、尸.c/ o^。ge聽m CBS 455.95、 尸em'c/〃/wm c"r/wwm ATCC 38065、 尸ew/c/〃/wm c/ ^ysogewwm P2、 ^4cre歸w'國(guó)cA,ogew畫ATCC 36225或ATCC 48272、 7V/c/zoJe環(huán)a
"eye/ ATCC 26921或ATCC 56765或ATCC 26921 、爿^ wg/〃w sq/Vze ATCC11906、 C7 o^o^o"'"附/w^:"owmse ATCC44006及其衍生物。
多肽
在第二個(gè)方面,本發(fā)明涉及用于制備第一個(gè)方面的真核細(xì)胞的新穎的 多肽。特別地,本發(fā)明提供了如上文定義的融合多肽、嵌合多肽(其中, 融合多肽與過(guò)氧化物酶體膜多肽可操作地相連)、過(guò)氧化物酶體膜多肽和 補(bǔ)充性融合多肽。
在一種實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了展示出v-SNARE功能的多肽,所 述多肽選自下述組,所述組由(a)具有根據(jù)SEQ ID NO: 13的氨基酸序 列的多肽;(b)具有展示出與SEQ ID NO: 13的氨基酸序列至少85%同 一性,優(yōu)選至少90。/。,更優(yōu)選至少93%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%,進(jìn)一步 更優(yōu)選至少97%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少99%同一性 的氨基酸序列的多肽;以及(c) (a)或(b)定義的多肽的功能片段構(gòu) 成。
在另一種實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了選自下述組的過(guò)氧化物酶體膜多 肽,所述組由(a)具有根據(jù)SEQIDNO: 16的氨基酸序列的多肽;(b) 具有展示出與SEQIDNO: 16的氨基酸序列至少85%同一性,優(yōu)選至少 90%,更優(yōu)選至少93%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%,進(jìn)一歩更優(yōu)選至少 97%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少99%同一性的氨基酸序 列的多肽;以及(c) (a)或(b)定義的多肽的功能片段構(gòu)成。
在又一種實(shí)施方式中,本發(fā)明提供了一種嵌合多肽,其適合用于獲得 下述氨基酸序列在過(guò)氧化物酶體表面的暴露,所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)于在供 體膜結(jié)構(gòu)表面暴露的融合多肽的氨基酸序列,其中,所述嵌合多肽包含與 過(guò)氧化物酶體膜多肽或其一部分可操作地相連的融合多肽或其一部分。
優(yōu)選地,嵌合多肽的融合多肽組分包含v-SNARE多肽的從其N末端 到第一個(gè)(最N末端的)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸。更優(yōu)選地,融合多肽組分 包含選自下述組的氨基酸序列,所述組由(a)對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 13的 l至95位的序列和(b)展示出與(a)定義的序列具有至少50%,優(yōu)選至
少60%,更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少90%同一 性程度的同源序列構(gòu)成。
還優(yōu)選地,嵌合多肽的過(guò)氧化物酶體膜蛋白組分包含選自下述組的氨 基酸序列,所述組由(a)對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 16的2至224位的序列, 優(yōu)選地,對(duì)應(yīng)于3或4或5或6或7或8或9或10或11或12或13或14 或15或16或17或18或19或20或21或22或23或24或25或26或27 或28或29或30或31或32或33或34或35或36或37或38或39或40 位至224位,和(b)展示出與(a)定義的序列具有至少50%,優(yōu)選至少 60%,更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少90%同一性 程度的同源序列構(gòu)成。
更優(yōu)選地,嵌合多肽具有根據(jù)SEQIDNO: 24的氨基酸序列。 因此本發(fā)明的一種優(yōu)選的嵌合多肽包含(a)在分泌途徑供體膜胞質(zhì) 表面暴露的融合多肽結(jié)構(gòu)域;以及(b)靶向過(guò)氧化物酶體膜并與過(guò)氧化 物酶體膜相連的結(jié)構(gòu)域;其中,結(jié)構(gòu)域(a)和(b)可操作地相連,并且 其中,嵌合多肽在包含過(guò)氧化物酶體的宿主細(xì)胞中的表達(dá)賦予過(guò)氧化物酶 體與宿主細(xì)胞分泌途徑受體膜融合的能力。優(yōu)選地,結(jié)構(gòu)域(a)和(b)
存在于單一的開放讀碼框中,其中,結(jié)構(gòu)域(a)較之結(jié)構(gòu)域(b)與多肽 的N末端更為接近。優(yōu)選地,結(jié)構(gòu)域(a)來(lái)自v-SNARE。更優(yōu)選地,結(jié) 構(gòu)域(a)包含來(lái)自v-SNARE的從N末端跨越至v-SNARE的第一個(gè)跨膜 結(jié)構(gòu)域或包括該第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的片段。在根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選 的嵌合多肽中,結(jié)構(gòu)域(a)中的片段包含對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO: 13的1至 95位的序列或展示出與SEQ ID NO: 13具有至少50%,優(yōu)選至少60%, 更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%,最優(yōu)選至少90%同一性程度的 同源序列。該片段可跨越v-SNARE的N末端直到第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨 基酸的至少70%, 80%, 90%或95%。
在根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選的嵌合多肽中,結(jié)構(gòu)域(b)包含跨膜結(jié)構(gòu) 域和將該結(jié)構(gòu)域靶向至過(guò)氧化物酶體膜的序列。優(yōu)選地,最接近結(jié)構(gòu)域 (a)的跨膜結(jié)構(gòu)域N末端朝向胞質(zhì)定位。優(yōu)選地,結(jié)構(gòu)域(b)包含來(lái)自 過(guò)氧化物酶體膜蛋白的序列。更優(yōu)選地,結(jié)構(gòu)域(b)來(lái)自下述過(guò)氧化物
酶體膜多肽,所述多肽的N末端天然暴露于過(guò)氧化物酶體的胞質(zhì)側(cè),或者 所述多肽具有至少一個(gè)其N末端朝向胞質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。最優(yōu)選地,結(jié)構(gòu)
域(b)來(lái)自下述過(guò)氧化物酶體膜多肽,其N末端已被從最N末端的跨膜 結(jié)構(gòu)域(具有朝向胞質(zhì)的其N末端)去除了多達(dá)至少IO個(gè)氨基酸。結(jié)構(gòu) 域(b)可取自下述過(guò)氧化物酶體膜多肽,所述過(guò)氧化物酶體膜多肽選自 Pmp22、 Pmp34、 Pmp47、 Pmp70、 Pex3、 Pexll、 Pexl4禾口 Pex22。在一禾中 優(yōu)選的實(shí)施方式中,根據(jù)本發(fā)明的嵌合蛋白結(jié)構(gòu)域(b)是對(duì)應(yīng)于SEQID NO: 16的2至224位的序列,優(yōu)選地,對(duì)應(yīng)于3或4或5或6或7或8或 9或10或11或12或13或14或15或16或17或18或19或20或21或22 或23或24或25或26或27或28或29或30或31或32或33或34或35 或36或37或38或39或40位至224位,或展示出與SEQ ID NO: 16具 有至少50%,優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%, 最優(yōu)選至少90%同一性程度的同源序列。最優(yōu)選地,嵌合蛋白具有根據(jù) SEQIDNO: 24的氨基酸序列。
就本發(fā)明的目的而言,兩條氨基酸序列間的同一性程度指兩條序列鍵 相同氨基酸的百分比。首先,使用Basic Local Alignment Search Tool
(BLAST)算法來(lái)檢索同源多肽序列,該算法被描述于Altschul, et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)中。用以開展BLAST分析的軟件可以通過(guò)國(guó) 家生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information , http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)為公眾所獲得。BLAST算法的參數(shù)W、 B和 E確定了比對(duì)的敏感性和速度。BLAST程序缺省使用的字長(zhǎng)度(word length, W)為3, BLOSUM62分?jǐn)?shù)矩陣(見Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989))比對(duì)(B)為50,期望值
(expectation, E)為10, M=5, N=-4。
接著,使用CLUSTALW比對(duì)算法(Higgins D. et al (1994). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680)對(duì)同源序列的同一性程度(按上文定義的)進(jìn)行
測(cè)定,其中使用下述參數(shù)缺口大小5,缺口開放11,缺口延伸1, 錯(cuò)配-15,字長(zhǎng)3。
多核苷酸
在第三個(gè)方面,本發(fā)明涉及多核苷酸,其包含編碼第二個(gè)方面任何多 肽的核酸序列。
本發(fā)明包括下述核酸序列,其編碼如上文定義的融合多肽、嵌合多肽 (其中,融合多肽與過(guò)氧化物酶體膜多肽可操作地相連)、過(guò)氧化物酶體 膜多肽和補(bǔ)充性融合多肽。
選出將根據(jù)本發(fā)明被修飾的真核細(xì)胞后,可以確定融合多肽、作為過(guò) 氧化物酶體膜錨發(fā)揮作用的多肽以及可選地,補(bǔ)充性融合多肽的身份(來(lái) 源)。例如,編碼第二個(gè)方面的多肽的核酸序列的來(lái)源可取決于選出的真 核細(xì)胞的身份。優(yōu)選地,編碼第二個(gè)方面的多肽的核酸序列對(duì)于將按照本 發(fā)明修飾的真核細(xì)胞來(lái)說(shuō)是內(nèi)源的。
本發(fā)明還提供了一種核酸構(gòu)建體,其包含編碼按照上文定義的多肽的 核酸序列,其與指導(dǎo)合適宿主中多肽表達(dá)的一種或多種控制序列可操作地 相連。
表達(dá)應(yīng)被理解為包括對(duì)多肽的生產(chǎn)中涉及的任何步驟,其包括但不限 于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修飾、翻譯、翻譯后修飾。
"核酸構(gòu)建體"在本文中被定義為單鏈或雙鏈的核酸分子,其是從天 然存在的基因分離出的,或己經(jīng)過(guò)修飾以含有以自然界中不存在的方式組 合及并置的核酸片斷。當(dāng)核酸構(gòu)建體含有編碼序列表達(dá)所需的所有控制序 列時(shí),術(shù)語(yǔ)核酸構(gòu)建體與術(shù)語(yǔ)表達(dá)盒同義。
術(shù)語(yǔ)"控制序列"在本文中被定義為包括對(duì)于多肽表達(dá)來(lái)說(shuō)必須或有 利的所有組分。每種控制序列可以是編碼多肽的核酸序列天然的或外源 的。此類控制序列包括但不限于,啟動(dòng)子、引導(dǎo)序列、最優(yōu)翻譯起始序列
(如Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266:19867-19870所述)、聚腺苷化序列、 前肽(propeptide)序列、轉(zhuǎn)錄終止子。就最小程度而言,控制序列包括 啟動(dòng)子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號(hào)。
術(shù)語(yǔ)"可操作地相連"在本文中被定義為下述構(gòu)象,其中,控制序列 以相對(duì)于DNA序列的編碼序列的下述位置被合適地放置,所述位置使得 控制序列能指導(dǎo)多肽的表達(dá)。
控制序列可以是合適的啟動(dòng)子序列,其在細(xì)胞中顯示出轉(zhuǎn)錄活性,包 括突變的、截短的和雜交的啟動(dòng)子,其可從編碼對(duì)細(xì)胞來(lái)說(shuō)同源(天然) 或異源(外源)的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)多肽的基因獲得。
啟動(dòng)子可以是與將表達(dá)的編碼序列天然相連的啟動(dòng)子。啟動(dòng)子還可以 是對(duì)將表達(dá)的編碼序列來(lái)說(shuō)外源的組成型或可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。用于哺乳動(dòng)物
的合適的啟動(dòng)子的例子在例如Sambrook and Russell (2001 ) "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd edition), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York中有所描述。用于酵母中的 合適的啟動(dòng)子的例子是例如糖分解啟動(dòng)子。
可使用的優(yōu)選的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子的例子是淀粉可誘導(dǎo)、銅可誘導(dǎo)、油酸 可誘導(dǎo)啟動(dòng)子。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式,如果基因必須在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中過(guò) 量表達(dá),例如CAPP,那么使用強(qiáng)的可誘導(dǎo)啟動(dòng)子,例如Am'ger的葡糖 淀粉酶啟動(dòng)子或A o^yzfle的TAKA淀粉酶啟動(dòng)子。
控制序列還可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列,這是能被有絲真菌細(xì)胞識(shí) 別用來(lái)終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與編碼多肽的核酸序列的3'末端可操 作地連接。在細(xì)胞中具有功能的任何終止子可用于本發(fā)明。
優(yōu)選用于有絲真菌細(xì)胞的終止子可從編碼TAKA-淀粉酶、 Am'gw葡糖淀粉酶、A mVMfl"5鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶、A m'ger alpha葡 糖苷酶、trpC基因和F^an'Mm ac"/wrMm胰蛋白酶類似蛋白酶的基因獲 得。
控制序列還可以是合適的引導(dǎo)序列,這是mRNA的非翻譯區(qū)域,其對(duì) 于通過(guò)有絲真菌細(xì)胞的翻譯來(lái)說(shuō)是重要的。引導(dǎo)序列與編碼多肽的核酸序 列的5'末端可操作地連接。在細(xì)胞中具有功能的任何引導(dǎo)序列都可用于本 發(fā)明。
優(yōu)選用于有絲真核細(xì)胞的引導(dǎo)序列可從編碼Ao^zae TAKA-淀粉酶和 A "/^/a朋丙糖磷酸酯異構(gòu)酶和A m'gw葡糖淀粉酶的基因獲得。
控制序列還可以是聚腺苷化序列,這是與核酸序列3'末端可操作地相 連,并且當(dāng)被轉(zhuǎn)錄時(shí)能被有絲真菌細(xì)胞作為信號(hào)識(shí)別以向經(jīng)轉(zhuǎn)錄mRNA加
上聚腺苷殘基的序列。在細(xì)胞中起作用的任何聚腺苷化序列都可用于本發(fā) 明。
優(yōu)選用于有絲真核細(xì)胞的聚腺苷化序列從編碼Ao^yz"e TAKA-淀粉 酶、A"&er葡糖淀粉酶、A mV/w/a朋鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶、Fw^m'wm 胰蛋白酶類似蛋白酶和Aalpha葡糖苷酶的基因獲得。
控制序列還可以是前肽編碼區(qū)域,其編碼位于多肽氨基末端的氨基酸 序列。得到的多肽已知為前酶或前多肽(在某些情況下,酶原)。
核酸構(gòu)建體可與載體或表達(dá)載體相同或在其中克隆。
重組表達(dá)載體可以是能方便地經(jīng)歷重組DNA過(guò)程并能導(dǎo)致編碼融合 多肽(或補(bǔ)充性融合多肽)的核酸序列表達(dá)的任何載體(例如質(zhì)粒或病 毒)。典型地,對(duì)載體的選擇將取決于載體與載體將被引入的真核細(xì)胞之 間的兼容性。載體可以是線性的或閉合環(huán)狀的質(zhì)粒。載體可以是自主復(fù)制 載體,即作為其復(fù)制不依賴染色體復(fù)制的染色體外主體存在,例如,質(zhì) 粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。自主保持的克隆載體可包 含AMAl-序歹U (見,例如Aleksenko and Clutterbuck (1997), Fungal Genet Biol. 21 : 373-397)。
或者,載體可以是下述載體,當(dāng)其被引入細(xì)胞時(shí),其整合進(jìn)基因組, 與其已整合進(jìn)的染色體一起復(fù)制。整合型載體可在宿主細(xì)胞的染色體中隨 機(jī)整合或在預(yù)定耙位點(diǎn)整合。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選的實(shí)施方式中,整合型載體包含下述DNA片 段,該片段與宿主細(xì)胞基因組中預(yù)定靶基因座中的、用于將克隆載體整合 到預(yù)定基因座上的DNA序列同源。為促進(jìn)定位整合,優(yōu)選在轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞之前對(duì)載體進(jìn)行線性化。線性化優(yōu)選進(jìn)行至如下程度使得克隆載體的 至少一端,但優(yōu)選地,任意一端側(cè)翼有與靶基因座同源的序列。靶基因座 側(cè)翼的同源序列的長(zhǎng)度取決于宿主細(xì)胞的身份。對(duì)真菌而言,該長(zhǎng)度優(yōu)選 為至少30 bp,優(yōu)選地,至少50 bp,進(jìn)一步優(yōu)選地,至少0.1 kb,進(jìn)一步 優(yōu)選地,至少0.2 kb,更優(yōu)選地,至少0.5 kb,進(jìn)一步更優(yōu)選地,至少1 kb,最優(yōu)選地,至少2 kb。優(yōu)選地,載體中與靶基因座同源的DNA序列 是從高度表達(dá)的基因座獲得的,這意味著,其是從能在宿主細(xì)胞中高水平 表達(dá)的基因獲得的。能高水平表達(dá)的基因,即,高度表達(dá)的基因在本文中
被定義為其mRNA占細(xì)胞總mRNA的至少0.5% (w/w)的基因,例如, 在誘導(dǎo)條件下的;或者其基因產(chǎn)物占細(xì)胞總蛋白的至少1% (w/w)的基 因,(如EP 357 127所述)。大量?jī)?yōu)選的高度表達(dá)的真菌基因的例子是 來(lái)自A^wg/仏'或7Wc力o&mz的淀粉酶、葡糖淀粉酶、醇脫氫酶、木聚糖 酶、磷酸甘油醛脫氫酶或纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase)基因。用于 這些目的的最優(yōu)選的高度表達(dá)的基因是葡糖淀粉酶基因(優(yōu)選A 葡 糖淀粉酶基因)、A w7zM TAKA-淀粉酶基因、A 基因、 7Wc/ ^/emm reew/ cM基因。這種類型的表達(dá)載體高度適用于在本發(fā)明的 真核細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)給定的基因,例如CAPP,或融合多肽或補(bǔ)充性融合 多肽的野生型或組成性活性突變體(ssol)。
或者,可通過(guò)使用與基因核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列進(jìn)行已建立起來(lái) 的反義技術(shù),來(lái)對(duì)基因修飾或失活。更具體地,可通過(guò)引入與核酸序列互 補(bǔ)的核苷酸序列(其可在細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄,并且能與細(xì)胞中產(chǎn)生的mRNA雜 交)來(lái)降低或去除有絲真菌細(xì)胞對(duì)基因的表達(dá)。在允許互補(bǔ)反義核苷酸序 列與mRNA雜交的條件下,翻譯出的蛋白質(zhì)的量由此減少或消失。表達(dá)反 義RNA的例子展示于Appl Environ Microbiol. 2000 Feb;66(2):775-82.
(Characterization of a foldase, protein disulfide isomerase A, in the protein secretory pathway of Aspergillus niger. Ngiam C, Jeenes DJ, Punt PJ, Van Den Hondel CA, Archer DB)或(Zrenner R, Willmitzer L, Sonnewald U. Analysis of the expression of potato uridinediphosphate-glucose pyrophosphorylase and its inhibition by antisense RNA. Planta. (1993);190(2):247- 52.)中。
此外,可通過(guò)RNA干擾(RNAi)技術(shù)(FEMS Microb. Lett. 237 (2004): 317-324)來(lái)獲得對(duì)基因的修飾、負(fù)調(diào)或失活。在該方法中,核苷 酸序列(其表達(dá)待受到影響的)的同樣的正義或反義部分被依次克隆,中 間是核苷酸間隔,并且插入到表達(dá)載體中。此種分子轉(zhuǎn)錄后,小的(21-23) 核苷酸片段的形成將導(dǎo)致待受影響的mRNA的定位降解。對(duì)特定mRNA 的去除可進(jìn)行至多種不同的程度。WO2005/05672A1和/或 WO2005/026356A1描述的RNA干擾技術(shù)可用于對(duì)基因的負(fù)調(diào)、修飾或失
活。
如果必須被失活的宿主的基因是VSM1,優(yōu)選通過(guò)下述方法來(lái)進(jìn)行
按照EP 635 574所述的技術(shù),設(shè)計(jì)出失活載體,將載體靶向到將被失活的 基因的基因座上。
編碼融合(可選地,補(bǔ)充性融合)多肽的核酸序列的超過(guò)一個(gè)拷貝可 被插入到宿主細(xì)胞中,以增加對(duì)基因產(chǎn)物的生產(chǎn)。這可以優(yōu)選通過(guò)整合進(jìn) DNA序列的基因組拷貝來(lái)進(jìn)行,更優(yōu)選地,通過(guò)將DNA序列的整合靶向 到高度表達(dá)的基因座(優(yōu)選地,葡糖淀粉酶或淀粉酶基因座)來(lái)進(jìn)行。或 者,或者,這可以通過(guò)將可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因加入核酸序列來(lái)進(jìn)行,其 中可通過(guò)在合適的選擇試劑存在的情況下培養(yǎng)所述細(xì)胞來(lái)對(duì)含有選擇標(biāo)記 基因的擴(kuò)增拷貝以及由此核酸序列的額外拷貝的細(xì)胞加以選擇。為進(jìn)一步 增多將被過(guò)量表達(dá)的DNA序列的拷貝數(shù),可以使用W098/46772所述的 基因轉(zhuǎn)化技術(shù)。這種類型的表達(dá)載體還高度適用于在本發(fā)明的宿主細(xì)胞中 過(guò)量表達(dá)給定的基因,例如CAPP。
用于有絲真菌細(xì)胞的選擇標(biāo)記可選自包括但不限于am^/S (乙酰胺
酶)、wgB (鳥氨酸氨甲酰基轉(zhuǎn)移酶)、Mr (草丁膦轉(zhuǎn)移酶)、/^gB (潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、"/"D (硝酸還原酶)、p,G (乳清酸核苷-5'-磷 酸脫羧酶)、sC (硫酸腺苷轉(zhuǎn)移酶)和^ C (鄰氨基苯甲酸鹽/酯合酶) 基因以及來(lái)自其它物種的等同物的組。用于A^erg///^細(xì)胞的優(yōu)選者是A mV/w/朋s或A 。^zae的awc/S (EP 635574 Bl、 WO 97/06261)禾卩pyrG基 因,以及iS^eptow^c" Z^groscop/cMS的6tzr基因。更4尤選地,使用am^S基 因,進(jìn)一步更優(yōu)選地,使用來(lái)自A w/^/朋s或A 07zae的amdS基因。最 優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是與A m'(iM/a朋gp(iA啟云力子融合的A mV/w/a朋a附(iS 編碼序列(EP 635574 Bl中公開的)。來(lái)自其它有絲真菌的a/m/S基因也 可使用(WO 97/06261)。來(lái)自^reptoa〃ote/c/n^/n'"^^tom^的We基因也 可使用,如 Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance. Drocourt D, Calmels T, Reynes JP, Baron M, Tiraby G. Nucleic Acids Res. 1990 Jul 11 ;18(13):4009所述。
用于將上述元件連接起來(lái)構(gòu)建本發(fā)明的重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域
技術(shù)人員公知的(見,例如上文所述的Sambrooketal., 1989)。
載體系統(tǒng)可以是單個(gè)載體或質(zhì)粒,或兩個(gè)或多個(gè)載體或質(zhì)粒,它們一 起含有將被引入到有絲真菌細(xì)胞中的總DNA或轉(zhuǎn)座子。載體優(yōu)選含有一 種或多種選擇標(biāo)記,其允許對(duì)經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行容易的選擇。選擇標(biāo)記是 下述基因,其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對(duì)重金屬的抗性、針對(duì)營(yíng)養(yǎng) 缺陷型的原營(yíng)養(yǎng)型等。
使用通常己知的技術(shù)來(lái)將表達(dá)載體或核酸構(gòu)建體引入細(xì)胞。其可能涉 及由以本身已知的手段進(jìn)行的原生質(zhì)體形成、對(duì)原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞 壁重建構(gòu)成的方法。用于轉(zhuǎn)化^^^&7/^細(xì)胞的合適方法見£ 238 023和 Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470- 1474所述。用于轉(zhuǎn)化Fw^n^m的種的合適的方法由Malardier et. al., 1989, Gene 78 : 147156或WO 96/00787所述??蓱?yīng)用其它方法,例如使用 基因槍(biolistic)轉(zhuǎn)化的方法,如Biolistic transformation of the obligate plant pathogenic fungus, Erysiphe graminis f.sp. hordei. Christiansen SK, Knudsen S, Giese H. Curr Genet. 1995 Dec; 29(l):100-2所述。然后針對(duì)過(guò)氧 化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)(例如質(zhì)膜)融合的能力 對(duì)選出的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞加以分析。
對(duì)細(xì)胞是否獲得了過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié) 構(gòu)融合的能力進(jìn)行分析的若干種方法是可獲得的。
根據(jù)一種實(shí)施方式,使用過(guò)氧化物酶體特異性標(biāo)簽(用于過(guò)氧化物酶 體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的融合的可視化),在電子或熒
光顯微鏡下研究細(xì)胞的形態(tài)。過(guò)氧化物酶體特異性標(biāo)簽的例子是
*硫解酶標(biāo)簽,如Simon M, Binder M, Adam G, Hartig A, Ruis H Control of peroxisome proliferation in Saccharomyces cerevisiae by ADR1 , SNF1 (CAT1 , CCR1 ) and SNF4 (CAT3). Yeast. 1992 Apr;8(4):303-9所述,或
* GFP標(biāo)簽,如Monosov EZ, Wenzel TJ, Luers GH, Heyman JA, Subramani S Labeling of peroxisomes with green fluorescent protein in
living P. pastoris cells. J Histochem Cytochem. 1996 Jun;44(6):581 -9
所述,或
*過(guò)氧化氫酶標(biāo)簽,如Kunce CM, Trelease RN, Turley RB. Purification and biosynthesis of cottonseed (Gossypium hirsutum L) catalase. Biochem J. 1988 Apr 1 ;251 (1》147-55所述。
根據(jù)另一種實(shí)施方式,通過(guò)在細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中表達(dá)模型多肽并 測(cè)量培養(yǎng)基中模型多肽的存在來(lái)監(jiān)測(cè)過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及 的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)的融合,優(yōu)選地,使用促進(jìn)模型多肽的過(guò)氧化物酶體定位 的信號(hào)。優(yōu)選的模型多肽是綠色熒光蛋白(GFP),因?yàn)槠湓诎l(fā)酵培養(yǎng)基 中的存在可通過(guò)熒光顯現(xiàn),并可通過(guò)western雜交印跡來(lái)監(jiān)測(cè)。其它模型 多肽可以是具有酶活性的細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì),其與過(guò)氧化物酶體定位信號(hào)可操 作地相連,例如乙酰胺酶,或天然的過(guò)氧化物酶體定位蛋白,例如過(guò)氧化 氫酶、阿馬多里酶(amadoriase)或硫解酶。
優(yōu)選地,第一個(gè)方面的真核細(xì)胞展示出下述程度的過(guò)氧化物酶體融合 效率,所述程度為產(chǎn)生的多肽總量中的至少10%在培養(yǎng)期間在給定的時(shí) 間點(diǎn)分泌進(jìn)培養(yǎng)基,更優(yōu)選地,產(chǎn)生的多肽中的至少40%分泌進(jìn)培養(yǎng)基, 進(jìn)一步更優(yōu)選地,產(chǎn)生的多肽中的至少60%分泌進(jìn)培養(yǎng)基,進(jìn)一步更優(yōu)選 地,產(chǎn)生的多肽中的至少70%分泌進(jìn)培養(yǎng)基,進(jìn)一歩更優(yōu)選地,產(chǎn)生的多 肽中的至少80%分泌進(jìn)培養(yǎng)基,最優(yōu)選地,產(chǎn)生的多肽中的至少90%分泌 進(jìn)培養(yǎng)基。產(chǎn)生的多肽的總量被定義為培養(yǎng)基中存在的多肽的量,其 中,培養(yǎng)基被定義為由生物物質(zhì)部分和培養(yǎng)基的部分構(gòu)成的。分泌的多肽 的量可用模型多肽來(lái)估計(jì)。該模型多肽可以是下述綠色熒光蛋白 (GFP),其具有經(jīng)工程改造的促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的信號(hào)(例如PTS-1)(例如GFP-SKL),這在下文中有定義。培養(yǎng)基的部分中GFP-SKL的 濃度可用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)來(lái)測(cè)定(例如熒光測(cè)量、吸光度測(cè) 量、Western雜交印跡)。使用測(cè)定出的模型多肽的濃度,分泌的模型多 肽的部分可被計(jì)算為產(chǎn)生的模型多肽的總量的百分比。
生產(chǎn)感興趣的化合物
本發(fā)明還涉及一種方法,其用于在第一個(gè)方面的真核細(xì)胞中生產(chǎn)感興 趣的化合物,其中,所述化合物存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中。所述方法 包括如下步驟
(a) 在給定的培養(yǎng)基中,在有益于感興趣的化合物表達(dá)的條件下, 培養(yǎng)第一個(gè)方面的真核細(xì)胞,以及
(b) 可選地,對(duì)感興趣的化合物進(jìn)行純化。 根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,從培養(yǎng)基中回收感興趣的化合物,可選
地,對(duì)其進(jìn)行純化。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式,感興趣的化合物是多肽。
更優(yōu)選地,第一個(gè)方面的真核細(xì)胞額外包含下述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載 體,其包含編碼感興趣的多肽的核酸序列,該序列與編碼下述信號(hào)的核酸 序列可操作地相連,所述信號(hào)能促進(jìn)感興趣的多肽的過(guò)氧化物酶體定位。
促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的信號(hào)可以是任何信號(hào),只要其允許相連的多 肽在過(guò)氧化物酶體中的定位和/或積累。
優(yōu)選地,促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的信號(hào)選自如下物質(zhì)構(gòu)成的組
(a) —種三肽,其中,N至C末端方向上的第一個(gè)氨基酸是A、 C、 H、 K、 N、 P、 S或T, N至C末端方向上的第二個(gè)氨基酸是H、 K、 N、 Q、 R或S, N至C末端方向上的第三個(gè)氨基酸是A、 F、 I、 L、 M或V, 以及
(b )定義為如下所示的肽(R/K) (L/V/I/Q) XX (L/V/I/H/Q) (L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F),其中X可以是任何氨基酸。
更優(yōu)選地,(a)中定義的三肽也被稱為PTS-1,其作為將在過(guò)氧化物 酶體中生產(chǎn)的多肽的C末端延伸存在。因此,編碼促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位 的信號(hào)的DNA序列被克隆于編碼感興趣的多肽的DNA序列下游,并與其 可操作地相連。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,(a)中定義的三肽是[PAS]-[HKR]-[L]的 變體,如/" w7/co prediction of the peroxisomal proteome in fungi, plants and animals. Olof Emanuelsson, Ame Elofsson, Gunnar von Heijne and Susana Cristo' bal. J. Mol. Biol. (2003) 330, 443-456所述。根據(jù)一種更為優(yōu)選的實(shí)施方式,(a)中定義的三肽是SKL或PRL。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式,(a)中定義的三肽PTS-1的前面有允 許該三肽序列被移除,或者允許該三肽序列與該三肽序列之前的序列一起 從感興趣的多肽的C末端被移除(一旦多肽分泌到細(xì)胞外)的序列。此類 序列可以例如是合適的序列特異性蛋白酶或肽酶的識(shí)別序列。
(b)中定義的肽還被稱為PTS2信號(hào)(Swinkels, B et al 1991. EMBO Journal 3255-3262; Petriv O.I. et al 2004. The Journal of molecular Biology 119-134)。優(yōu)選地,它們存在于多肽的N末端部分。
如果感興趣的多肽已經(jīng)含有促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的信號(hào),優(yōu)選地, 該天然信號(hào)被用于促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位?;蛘?,人們可以選擇用不同的 信號(hào)來(lái)置換掉促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的天然信號(hào)?;蛘撸藗兛梢赃x擇用 編碼前文所定義的促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的序列的DNA序列之一來(lái)置換 促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的天然DNA序列。
在一種實(shí)施方式中,本發(fā)明涉及對(duì)過(guò)氧化物酶體中存在的感興趣的蛋 白進(jìn)行的分階段(phased)細(xì)胞外生產(chǎn)。在第一個(gè)階段,感興趣的多肽在 過(guò)氧化物酶體中積累,在第二個(gè)階段,通過(guò)向培養(yǎng)基中加入特定誘導(dǎo)劑來(lái) 誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)本發(fā)明嵌合多肽(可選地,補(bǔ)充性融合多肽)表達(dá)的可誘導(dǎo)的啟 動(dòng)子,其進(jìn)而將導(dǎo)致過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的受體膜 結(jié)構(gòu)的融合。這將導(dǎo)致對(duì)感興趣的多肽的細(xì)胞外生產(chǎn)。
或者,分階段生產(chǎn)的其它類型是可能的首先,生產(chǎn)感興趣的多肽, 然后誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖,最后一步,誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途 徑所涉及的細(xì)胞的受體膜結(jié)構(gòu)融合。
多肽可以是對(duì)宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)天然或異源的任何多肽。術(shù)語(yǔ)"異源多 肽"在本文中被定義為給定的細(xì)胞天然不生產(chǎn)的多肽。術(shù)語(yǔ)"多肽"在本 文中不用來(lái)指特定長(zhǎng)度的被編碼產(chǎn)品,因此其包括肽、寡肽和蛋白。
第一個(gè)方面的真核細(xì)胞高度適合用于生產(chǎn)需要還原環(huán)境用于突變的多 肽,例如,細(xì)胞內(nèi)多肽。因此,根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,感興趣的多肽 是細(xì)胞內(nèi)多肽。因此,使用第一個(gè)方面的真核細(xì)胞的本發(fā)明的方法是能以 工業(yè)規(guī)模在培養(yǎng)基中生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)多肽的第一個(gè)方法。
優(yōu)選的多肽是過(guò)氧化物酶體中天然生產(chǎn)的酶,例如阿馬多里酶
(amadoriase)、過(guò)氧化氫酶、酰基-CoA氧化酶、亞油酸鹽/酯異構(gòu)酶、反 式-2-烯?;?ACP還原酶、單端孢霉烯3-0-乙酰轉(zhuǎn)移酶、醇脫氫酶、肉堿 消旋酶、D-扁桃酸鹽/酯脫氫酶、烯?;鵆oA水合酶、果糖基胺氧氧化還 原酶、2-羥基庚-2,4-二烯-l,7-二酸鹽/酯異構(gòu)酶、NADP-依賴型蘋果酸鹽/酯 脫氫酶、氧化還原酶、醌還原酶。所有這些酶都含有C末端SKL序列。
其它細(xì)胞內(nèi)的酶是神經(jīng)酰胺酶、環(huán)氧化物水解酶、氨肽酶、?;D(zhuǎn)移 酶、醛縮酶、羥化酶、氨肽酶。
在另一種實(shí)施方式中,多肽是抗體或其一部分、抗原、凝血因子、細(xì) 胞外酶、激素或激素變體、受體或其一部分、調(diào)控蛋白、結(jié)構(gòu)蛋白、報(bào)道 蛋白或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式,將被生產(chǎn)的多肽是重組的已用包含下 述DNA序列的表達(dá)構(gòu)建體或核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化過(guò)第一個(gè)方面的真核細(xì)胞, 所述DNA序列能促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位,并且與編碼將被生產(chǎn)的多肽的 DNA序列可操作地相連。
本發(fā)明因此有利地允許對(duì)多肽進(jìn)行細(xì)胞外生產(chǎn),這在細(xì)胞的正常分泌 途徑中會(huì)遭遇困難。例如,生產(chǎn)的感興趣的多肽是細(xì)胞外多肽,其可能不 含超過(guò)20個(gè)半胱氨酸,不含超過(guò)IO個(gè)的半胱氨酸,不含超過(guò)6個(gè)半胱氨 酸或者不含超過(guò)2個(gè)半胱氨酸。此類多肽可能是宿主細(xì)胞天然的或異源 的。這些多肽優(yōu)選對(duì)于宿主細(xì)胞來(lái)說(shuō)是重組的。此類多肽的例子是下述這 些來(lái)自A^erg///^ ;^oem'd的草酸鹽/酯脫羧酶,其不含半胱氨酸,
(APOXD,在WO 9842827-A2中有所描述);來(lái)自J^ergWi^ m'ger的曲 霉蛋白酶(aspergillopepsin) II,其不含半胱氦酸(The gene and deduced protein sequences of the zymogen of Ape,7/船m'ger acid proteinase A, Inoue et al" J Biol Chem. 1991 Oct 15; 266(29): 19484-19489);來(lái)自丄e^/ww"/fl me;dca船的分泌的酸性磷酸酶2,其不含半胱氨酸(Ser/Thr-rich repetitive motifs as targets for phosphoglycan modifications in Leishmania mexicana secreted add phosphatase, Wiese et al., EMBO J. 1995 Mar 15; 14(6): 1067-1074);來(lái)自Sc/ero"w'a w/erarionwi的非天冬氨酸蛋白酶,其不含半胱氨
酸(Regulation of acpl, encoding a non-aspartyl acid protease expressed during pathogenesis of sc/m^or騰,Poussereau et al., Microbiology. 2001
Mar;147(Pt 3):717-726);來(lái)自A^ergz7/^ m'gw的木聚糖酶A,其含1個(gè)半 胱氨酸(專利申請(qǐng)WO 200068396-A2中描述的xynA);來(lái)自Mws m^cw/w的硫酰胺酶(sulphamidase),其含有2個(gè)半胱氨酸(Gene encoding the mouse sulphamidase: cDNA cloning, structure, and chromosomal mapping, Costanzi et al., Mamm Genome. 2000 Jun;ll (6):436-439)。感興趣 的多肽還可以是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、過(guò)氧化氫酶、纖維素 酶、幾丁質(zhì)酶、角質(zhì)酶、脫氧核糖核酸酶、環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶、酯酶、 alpha-半乳糖苷酶、beta-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、alpha-葡糖苷酶、beta-葡糖苷酶、鹵素過(guò)氧化物酶、水解酶、轉(zhuǎn)化酶、異構(gòu)酶、漆酶、連接酶、 脂肪酶、脂加氧酶、裂合酶、甘露糖苷酶、變構(gòu)酶(mutanase)、氧化 鎂、加氧酶、氧化還原酶、果膠酶、過(guò)氧化物酶、磷脂酶、植酸酶、多酚 氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、轉(zhuǎn)移酶、轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶或木聚糖酶。編碼 感興趣的多肽的核酸可以從任何原核、真核或其它來(lái)源獲得。就木發(fā)明的 目的而言,術(shù)語(yǔ)"從……獲得"在本文中與給定的來(lái)源一起使用時(shí)將表 示,多肽是通過(guò)該來(lái)源或通過(guò)已插入了來(lái)自該來(lái)源的基因的細(xì)胞生產(chǎn)的。
本發(fā)明的方法有利地允許在培養(yǎng)過(guò)程終點(diǎn),生產(chǎn)出至少0.01 g/1的多 肽。優(yōu)選地,生產(chǎn)出至少0.05 g/1的多肽,進(jìn)一步更優(yōu)選地,至少0.5/1, 最優(yōu)選地,至少lg/1。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式,感興趣的化合物是代謝產(chǎn)物。優(yōu)選的代 謝產(chǎn)物是,紫杉醇,類異戊二烯(包括類胡蘿卜素),青霉素,頭孢菌素 (包括生物堿)、斯達(dá)汀(包括洛伐他汀)和抗氧化劑。根據(jù)第一種優(yōu)選 的實(shí)施方式,第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞被用于生產(chǎn)內(nèi)源過(guò)氧化物酶體代謝產(chǎn) 物。內(nèi)源過(guò)氧化物酶體代謝產(chǎn)物的例子是異丁酸、異戊酸和a-甲基丁酸。 根據(jù)第二種優(yōu)選的實(shí)施方式,使用第一個(gè)方面的真核細(xì)胞作為宿主細(xì)胞來(lái) 生產(chǎn)代謝產(chǎn)物,其中所述真核細(xì)胞額外包含含有下述核酸序列的核酸構(gòu)建 體或表達(dá)載體,所述序列編碼代謝產(chǎn)物合成過(guò)程所涉及的酶,并且與編碼 下述信號(hào)的核酸序列可操作地相連,所述信號(hào)能促進(jìn)代謝產(chǎn)物合成過(guò)程所
涉及的酶的過(guò)氧化物酶體定位。促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的信號(hào)可以是任何 信號(hào),只要其允許前文所述的、過(guò)氧化物酶體中相關(guān)多肽的定位和/或積 累。代謝產(chǎn)物合成過(guò)程所涉及的酶的例子是下述這些
-類胡蘿卜素合成八氫番茄紅素-^胡蘿卜素合酶CrtYB和CrtE、
crtl、 crtY、 crtB禾口 crtZ。
-紫杉醇生物合成紫杉垸13 Q!-羥化酶和紫杉二烯合酶。 -青霉素合成?;D(zhuǎn)移酶。 -頭孢菌素合成擴(kuò)環(huán)酶。
-生物堿合成S)-去甲烏藥堿(Norcoclaurine)合酶(NCS) -斯達(dá)汀聚酮(polyketide)合酶香葉醇10-羥化酶。 根據(jù)又一種實(shí)施方式,本發(fā)明涉及對(duì)過(guò)氧化物酶體中存在的代謝產(chǎn)物 的細(xì)胞外分階段生產(chǎn)。在第一個(gè)階段,代謝產(chǎn)物在過(guò)氧化物酶體中積累, 在第二個(gè)階段,通過(guò)向培養(yǎng)基中加入特定誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)驅(qū)動(dòng)本發(fā)明嵌合多 肽(可選地,補(bǔ)充性融合多肽)表達(dá)的可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子,其進(jìn)而將導(dǎo)致過(guò) 氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的受體膜結(jié)構(gòu)的融合。這將導(dǎo)致 對(duì)感代謝產(chǎn)物的細(xì)胞外生產(chǎn)。
或者,分階段生產(chǎn)的其它類型是可能的首先,生產(chǎn)代謝產(chǎn)物,然后 誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖,最后一步,誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體與細(xì)胞分泌途徑所 涉及的細(xì)胞的受體膜結(jié)構(gòu)融合。
培養(yǎng)條件
使用本領(lǐng)域已知的方法,在適合用于生產(chǎn)感興趣的化合物的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng) 基中培養(yǎng)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞。例如,可通過(guò)在合適的培養(yǎng)基中、允許 感興趣的化合物被表達(dá)和/或分離的條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)、實(shí)驗(yàn)室或工業(yè)發(fā) 酵罐中的小規(guī)模或大規(guī)模的發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補(bǔ)料分批或固態(tài)發(fā) 酵)來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)發(fā)生于包含碳源和氮源以及無(wú)機(jī)鹽的合適的營(yíng)養(yǎng)培 養(yǎng)基中,使用本領(lǐng)域已知的方法來(lái)進(jìn)行(見,例如Bennett, J. W. and LaSure, L.,eds" More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991)。合適的培養(yǎng)基可從商業(yè)供貨商處獲得,或者使用公開的組合物
(例如,American Type Culture Collection目錄中的)來(lái)制備。
本發(fā)明還提供了一種改進(jìn)的生產(chǎn)方法,用于生產(chǎn)感興趣的化合物。根 據(jù)第一種優(yōu)選的實(shí)施方式,在培養(yǎng)基中培養(yǎng)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞,其 中,向培養(yǎng)基中進(jìn)料合適量的氧,以保持培養(yǎng)物處于氧受限的條件下。更 優(yōu)選地,氧受限的培養(yǎng)條件在下述培養(yǎng)基中進(jìn)行,其中,在培養(yǎng)期間的至 少一部分,所有營(yíng)養(yǎng)物都以過(guò)量提供。進(jìn)一步更優(yōu)選地,在培養(yǎng)期間的至 少一部分意味著培養(yǎng)期間的一半,更優(yōu)選地,培養(yǎng)期間的2/3,進(jìn)一步更 優(yōu)選地,培養(yǎng)期間的4/5,進(jìn)一步更優(yōu)選地,培養(yǎng)期間的5/6,最優(yōu)選地, 整個(gè)培養(yǎng)期間。
"以過(guò)量提供"表示在培養(yǎng)期間,所有營(yíng)養(yǎng)物都以足夠避免對(duì)本發(fā) 明宿主細(xì)胞的生長(zhǎng)造成限制的量提供。明顯地,營(yíng)養(yǎng)物不應(yīng)以會(huì)導(dǎo)致抑制 或毒性效果的量提供。
向培養(yǎng)基中進(jìn)料合適量的氧,以將培養(yǎng)物保持在氧受限的條件下。因 此,在本發(fā)明的上下文中,合適量的氧被定義為能實(shí)現(xiàn)在培養(yǎng)期間氧受 限的氧的量。為將培養(yǎng)基保持為氧受限,進(jìn)料到培養(yǎng)基中的氧的量不應(yīng)超 過(guò)被宿主細(xì)胞消耗的氧的量。換句話說(shuō),OTR應(yīng)當(dāng)與OUR基本相同。 OTR (氧轉(zhuǎn)移速率)被定義為氧從氣相轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基液相的速率。OTR以 每單位時(shí)間的氧量(例如摩爾/h)表示??蓮倪M(jìn)入培養(yǎng)設(shè)備的氧的量和在 氣體出口測(cè)量的氧的量之間的差異來(lái)方便地測(cè)定OTR。 OUR (氧吸收速 率)被定義為宿主細(xì)胞消耗進(jìn)料至培養(yǎng)基中的氧的速率。"基本相同"表 示,OTR與OUR相同,偏差為正負(fù)5%。優(yōu)選地,OTR盡可能的高, 即,被例如培養(yǎng)設(shè)備構(gòu)造和/或氣體進(jìn)料中的氧濃度所允許的高,前提條件 是宿主細(xì)胞能立刻消耗氧。但是,對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō),明顯還可能 在OTR低于可達(dá)到的最大OTR的氧受限條件下(例如,OTR最大值的80 或90%)開展培養(yǎng)過(guò)程。
在OTR與OUR基本相同的情況下,典型地,培養(yǎng)基中的溶解氧濃度 將是恒定的,如果氧受限控制培養(yǎng),溶解氧將為零或接近零。用于測(cè)定培 養(yǎng)過(guò)程中是否存在氧受限的一種方便的方法是檢驗(yàn)攪拌速度的輕微降低 (例如5%)對(duì)OTR的影響。如果OTR也降低,那么確實(shí)存在氧受限。
如果OTR未降低并且/或者僅溶解氧的濃度降低,那么不存在氧受限。另
一種替代性方法是測(cè)定營(yíng)養(yǎng)物進(jìn)料的增加對(duì)OTR的影響。如果營(yíng)養(yǎng)物進(jìn) 料的增加不伴隨OTR的增加,那么存在氧受限。
根據(jù)第二種優(yōu)選的實(shí)施方式,對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)包括在
培養(yǎng)過(guò)程期間改變培養(yǎng)基的pH,以實(shí)現(xiàn)分階段的對(duì)感興趣的化合物的細(xì) 胞外生產(chǎn)。典型地,可在有益于宿主細(xì)胞和感興趣的化合物的任何pH下 來(lái)進(jìn)行對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。分階段細(xì)胞外生產(chǎn)可增加該方法 的總產(chǎn)量。在第一個(gè)階段,在最有益于第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的pH下, 感興趣的化合物在過(guò)氧化物酶體中積累。在第二個(gè)階段,改變培養(yǎng)基的 pH。更優(yōu)選地,在對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞進(jìn)行的培養(yǎng)的第一個(gè)和第二個(gè) 階段之間的過(guò)渡階段中,以線性過(guò)程改變pH。對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞 的培養(yǎng)過(guò)程的總持續(xù)時(shí)間通過(guò)下述等式定義Tc = a + t + b,其中
Tc=以小時(shí)計(jì)的培養(yǎng)過(guò)程的總持續(xù)時(shí)間,
a=以小時(shí)計(jì)的第一個(gè)培養(yǎng)階段的持續(xù)時(shí)間,
t=以小時(shí)計(jì)的過(guò)渡階段的持續(xù)時(shí)間,
b=以小時(shí)計(jì)的第二個(gè)培養(yǎng)階段的持續(xù)時(shí)間。
根據(jù)另一種更優(yōu)選的實(shí)施方式,該等式滿足下述條件 97《Tc = a + t + b《240,其中 72《a《120, 1《t《24, 24《b《96
進(jìn)一步更優(yōu)選地,該等式滿足下述條件
128《Tc = a + t + b《216,其中 72《a《96, 8《t《24, 48《b《96
又進(jìn)一步更優(yōu)選地,該等式滿足下述條件
160《Tc = a + t + b《216,其中 72《a《96,16《t《24, 72《b《96
最優(yōu)選地,該等式滿足下述條件 Tc = a + t + b《192,其中 a《72, t《24, b《96
優(yōu)選地,第一個(gè)階段,在4.5至6.0之間的pH范圍內(nèi)對(duì)宿主細(xì)胞加以 培養(yǎng),在第二個(gè)階段,在5.5至7.0的范圍內(nèi)培養(yǎng)。最優(yōu)選地,第一個(gè)階 段,在pH6.0對(duì)宿主細(xì)胞加以培養(yǎng),第二個(gè)階段,pH6,7。
根據(jù)第三種優(yōu)選的實(shí)施方式,對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)包括在 培養(yǎng)過(guò)程期間對(duì)培養(yǎng)基溫度的改變,以實(shí)現(xiàn)分階段的對(duì)感興趣的化合物的 細(xì)胞外生產(chǎn)。典型地,可在有益于宿主細(xì)胞和感興趣的化合物的任何溫度 下來(lái)進(jìn)行對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)。分階段細(xì)胞外生產(chǎn)可增加該方 法的總產(chǎn)量。在第一個(gè)階段,在最有益于第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的溫度 下,感興趣的化合物在過(guò)氧化物酶體中積累。在第二個(gè)階段,改變培養(yǎng)基 的溫度。優(yōu)選地,第一個(gè)階段,在30。C至37。C范圍內(nèi)的溫度下對(duì)宿主細(xì) 胞進(jìn)行培養(yǎng),第二個(gè)階段,在34。C和38。C范圍內(nèi)的溫度下培養(yǎng)。最優(yōu)選 地,第一個(gè)階段在30。C對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng),第二個(gè)階段,36°C。
或者,以及根據(jù)一種進(jìn)一步更優(yōu)選的實(shí)施方式,對(duì)第一個(gè)方面的宿主 細(xì)胞的培養(yǎng)在下述條件下進(jìn)行
*其中,在培養(yǎng)期間的至少一部分,向培養(yǎng)基中進(jìn)料合適量的氧, 以保持培養(yǎng)物處于氧受限的條件下,和/或
*其中,在培養(yǎng)過(guò)程期間改變培養(yǎng)基的pH,以實(shí)現(xiàn)分階段的對(duì)感興 趣的化合物的細(xì)胞外生產(chǎn),和/或
其中,在培養(yǎng)過(guò)程期間改變培養(yǎng)基的溫度,以實(shí)現(xiàn)分階段的對(duì)感 興趣的化合物的細(xì)胞外生產(chǎn),和/或
*其中,第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞是A^e/^7/w的種,最優(yōu)選地,
A; erg77/as1 的菌株。
最優(yōu)選地,對(duì)第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)在下述條件下進(jìn)行
*其中,在培養(yǎng)期間的至少一部分,向培養(yǎng)基中進(jìn)料合適量的氧,
以保持培養(yǎng)物處于氧受限的條件下,和/或 其中,在培養(yǎng)過(guò)程期間改變培養(yǎng)基的pH,以實(shí)現(xiàn)分階段的對(duì)感興
趣的化合物的細(xì)胞外生產(chǎn),其中,上述總培養(yǎng)時(shí)間的等式滿足下
述條件Tc = a + t + b《168,其中a《72, t《24, b《96,
以及其中,第一個(gè)階段的pH為6.0,第二個(gè)階段的pH為6.7,禾口/ 或
*其中,在培養(yǎng)過(guò)程期間改變培養(yǎng)基的溫度,以實(shí)現(xiàn)分階段的對(duì)感 興趣的化合物的細(xì)胞外生產(chǎn),以及其中,第一個(gè)階段的溫度為 30°C,第二個(gè)階段的溫度為36°C,和/或
*其中,第一個(gè)方面的宿主細(xì)胞是A^erg///^的種,最優(yōu)選地, A/ erg77/Ms 的菌株。
可針對(duì)將被生產(chǎn)的有興趣的化合物和所選用的真核細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基加以 改造。
根據(jù)一種優(yōu)選的實(shí)施方式,培養(yǎng)基包含神經(jīng)酰胺活化的磷酸酶蛋白 (CAPP)的激活劑。該磷酸酶已知能通過(guò)對(duì)t-SNARE進(jìn)行去磷酸化從而 激活SNARE相互作用(Marash M, Gerst JE :t- SNARE dephosphorylation promotes SNARE assembly and exocytosis in yeast. EMBO J. 2001 Feb 1 ;20(3):41 1-21) 。 CAPP的激活劑的一個(gè)例子是神經(jīng)酰胺,例如二氫-C2 神經(jīng)酰胺或另一種C2-神經(jīng)酰胺(Calbiochem, SIGMA)。優(yōu)選地,在培養(yǎng) 開始時(shí),在培養(yǎng)基中存在1至100 ^M神經(jīng)酰胺。更優(yōu)選地,在培養(yǎng)開始 時(shí),在培養(yǎng)基中存在5至50 pM神經(jīng)酰胺。進(jìn)一步更優(yōu)選地,在培養(yǎng)開始 時(shí),在培養(yǎng)基中存在大約10 ^M神經(jīng)酰胺。根據(jù)一種最優(yōu)選的實(shí)施方式, 在整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程中,對(duì)神經(jīng)酰胺的濃度加以監(jiān)測(cè),以將其保持為上述的 值。如果需要的話,可在培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)加入新鮮的神經(jīng)酰胺。
根據(jù)另一種優(yōu)選的實(shí)施方式,培養(yǎng)基包含能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的 物質(zhì),例如通過(guò)正常定位于過(guò)氧化物酶體中的至少一種酶代謝產(chǎn)生的物 質(zhì),優(yōu)選地,脂肪酸,更優(yōu)選地,油酸,這如以前所述(Yasuyoshi Sakai
et al, Regulation of Peroxisomal Proteins and Organelle Proliferation by Multiple Carbon Sources in the Methylotrophic Yeast, Candida boidinii. Yeast 14, 1175-1 187 (1998))。按照之前所述,脂肪酸也可用于獲得過(guò)氧化物酶 體的增殖(Intrasuksri U, et al, Mechanisms of peroxisome proliferation by perfluorooctanoic acid and endogenous fatty acids. Gen Pharmacol. 1998 Aug;31 (2):187-97.)。能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量被定義為培養(yǎng) 基中可獲得的碳的百分比(例如,培養(yǎng)基的碳源由10%的過(guò)氧化物酶體增 殖誘導(dǎo)物質(zhì)+ 90%葡萄糖構(gòu)成)。優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物 質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的0.1%至100%的范圍內(nèi)。更優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化 物酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的1%至50%的范圍內(nèi)。進(jìn)一步更優(yōu) 選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的2%至40%的 范圍內(nèi)。進(jìn)一步更優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基 碳源的3%至30%的范圍內(nèi)。進(jìn)一步更優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖 的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的4%至25%的范圍內(nèi)。進(jìn)一步更優(yōu)選地,能誘 導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的5%至20%的范圍內(nèi)。進(jìn) 一步更優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的6% 至18%的范圍內(nèi)。進(jìn)一步更優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量 在培養(yǎng)基碳源的7%至15%的范圍內(nèi)。進(jìn)一步更優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物 酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的8%至13%的范圍內(nèi)。進(jìn)一歩更優(yōu)選 地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量在培養(yǎng)基碳源的9%至12%的范 圍內(nèi)。最優(yōu)選地,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)的量等于培養(yǎng)基碳源的 10%。根據(jù)一種最優(yōu)選的實(shí)施方式,能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì)是油 酸鈉和/或油酸,培養(yǎng)基中存在的油酸鈉和/或油酸的量等于培養(yǎng)基碳源的 10%。
根據(jù)一種更優(yōu)選的實(shí)施方式,培養(yǎng)基包含CAPP的激活劑和能誘導(dǎo)過(guò) 氧化物酶體的物質(zhì),它們都以前文段落所述的優(yōu)選的量存在。
可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法,從培養(yǎng)基中分離出得到的感興趣的化合 物。例如,可通過(guò)傳統(tǒng)方法,包括但不限于,離心、過(guò)濾、萃取、噴霧干 燥、蒸發(fā)或沉淀,從培養(yǎng)基分離出感興趣的化合物。然后可通過(guò)本領(lǐng)域巳 知的大量方法對(duì)經(jīng)分離的多肽加以進(jìn)一步純化,所述方法包括但不限于, 色譜(例如,離子交換、親和、疏水、層析聚焦和尺寸排除)、電泳方法
(例如制備等電聚焦)、差異溶解度(例如硫酸銨沉淀)或萃取(見,例
如Protein Purification, J. -C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989)。
感興趣的化合物在過(guò)氧化物酶體中的積累
在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種方法,用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)以及 可選地,分離多肽,優(yōu)選地,在有絲真菌細(xì)胞中進(jìn)行,其中所述宿主細(xì)胞 包含核酸構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含能促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位 的DNA序列,該序列與編碼將被生產(chǎn)的多肽的DNA序列可操作地相連。 在另一個(gè)方面,本發(fā)明提供了一種方法,用于在宿主細(xì)胞中生產(chǎn)以及可選 地,分離代謝產(chǎn)物,優(yōu)選地,在有絲真菌細(xì)胞中進(jìn)行,其中所述宿主細(xì)胞 包含核酸構(gòu)建體或表達(dá)構(gòu)建體,所述構(gòu)建體包含能促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位 的DNA序列,該序列與編碼代謝產(chǎn)物合成過(guò)程所涉及的酶的DNA序列可 操作地相連。所有這些元件都已在前文中定義。在最后這兩個(gè)方面,所述 宿主細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體的內(nèi)穩(wěn)態(tài)優(yōu)選按前文所定義的那樣被影響。在最 后這兩個(gè)方面,培養(yǎng)基優(yōu)選包含前文定義的能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體的物質(zhì)。 在最后這兩個(gè)方面,隨后可從細(xì)胞裂解物的過(guò)氧化物酶體回收感興趣的化 合物。對(duì)感興趣的化合物的回收優(yōu)選按照已有的描述來(lái)進(jìn)行(Visualization and purification of yeast peroxisomes. Erdmann R, Gould SJ. Methods Enzymol. 2002;351:365-81)。在最后這兩個(gè)方面,所述宿主細(xì)胞的培養(yǎng)條件(氧受 限和/或培養(yǎng)基的pH值和/或培養(yǎng)基的溫度)優(yōu)選按本說(shuō)明書前文所定義。
本發(fā)明還將由下述實(shí)施例加以描述,所述實(shí)施例不應(yīng)被理解為限制本 發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1
實(shí)施例1使用C末端SKL標(biāo)簽將乙酰胺酶(amdS)蛋白靶向到 J,rg/腸m'ggr禾口 A7"vvgr函vcw /acto的過(guò)氧化物酉每體
使用的Aspergillus niger菌株(CBS 513.88)和K.lactis菌株(CBS 685.97 )都已被保藏。在這些菌株中,使用如Molecular Cloning: A Laboratoy Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbour Press, 1989所述的經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù),對(duì)若干種基因加以過(guò)量表達(dá),并且按照 下文所述測(cè)定被編碼的蛋白的活性。
1.1克隆具有或不具有SKL標(biāo)簽的A. niger乙酰胺酶基因以及在A. niger和K.lactis中的表達(dá)
在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使用 SEQIDNO: l禾BSEQIDNO: 2,得到SEQ ID NO: 4所示的編碼序列。 此外,在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使 用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 3,得到SEQ ID NO: 5所示的編碼序 列。所有PCR反應(yīng)、cDNA合成、連接以及轉(zhuǎn)化都按照上文所述的 Molecular Cloning所述來(lái)進(jìn)行。按照廠商說(shuō)明書,用Pacl和Ascl對(duì)得到的 PCR片段(SEQIDNO: 4禾Q SEQ ID NO: 5)進(jìn)行切割,將其各自連接進(jìn) 用Pacl、 Ascl線性化過(guò)的圖1所示的A. niger表達(dá)載體,得到兩個(gè)構(gòu)建 體,其中,每種乙酰胺酶基因(具有和不具有SKL的)被放置于glaA啟 動(dòng)子的控制下。表達(dá)載體被用于轉(zhuǎn)化A.niger。
此外,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使用SEQ ID NO: 6禾B SEQ ID NO: 7,得到SEQ ID NO: 9所示的編碼序列。此外, 來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使用SEQ ID NO: 6和 SEQIDNO: 8,得到SEQIDNO: 10所示的編碼序列。按照廠商說(shuō)明 書,用Pacl和Ascl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 9和SEQ ID NO: 10)進(jìn)行切割,將其各自連接進(jìn)用Pacl、 Ascl線性化過(guò)的圖2所示的K. lactis表達(dá)載體,得到兩個(gè)構(gòu)建體,其中,每種A. niger乙酰胺酶基因(具 有和不具有SKL的;分別為SEQIDNO: 9和SEQ ID NO: 10)被放置于 lac4啟動(dòng)子的控制下。表達(dá)載體被用于轉(zhuǎn)化K. lactis。
將得到的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化進(jìn)A. niger CBS 513.88或K. lactis CBS 685.97。對(duì)A. niger的轉(zhuǎn)化按照(Kelly JM, Hynes MJ Transformation ofAspergillus niger by the amdS gene of Aspergillus nidulans. EMBO J. 1985 Feb;4(2):475-9)來(lái)進(jìn)行,對(duì)K. lactis的轉(zhuǎn)化按照(Sreekrishna K, Webster TD, Dickson RC, Transformation of Kluyveromyces lactis with the kanamycin (G418) resistance gene of Tn903. Gene. 1984 Apr;28(l):73畫81 )來(lái)進(jìn)行。
1.2對(duì)A. niger和K.lactis轉(zhuǎn)化子的培養(yǎng)以及對(duì)細(xì)胞內(nèi)乙酰胺酶活性的
測(cè)定
通過(guò)PCR來(lái)檢查A. niger轉(zhuǎn)化子中表達(dá)盒的存在。將選出的轉(zhuǎn)化子在 30°C和250 rpm下培養(yǎng)五天,這在500 ml帶擋板錐形搖瓶中的100 ml下 述培養(yǎng)基中進(jìn)行,所述培養(yǎng)基為150 g/1麥芽糖、60 g/1大豆胨、1 g/1 Na2HP04、 15 g/1 (NH4)2S04、 1 g/1 MgS04'4H20、 0.08 g/1 Tween 80、 0.02 g Basildon、 20 g碼啉乙磺酸(MES) 、 1 g L-精氨酸。收獲細(xì)胞,通過(guò)在液 氮下碾磨進(jìn)行破碎。通過(guò)將25 mg經(jīng)碾磨的生物物質(zhì)懸浮于0.5 ml磷酸緩 沖過(guò)的D20中(氘水,Cambridge Isoteope Laboratories,氖pD 7.0),來(lái) 獲得細(xì)胞裂解物。隨后加入0.5mlD2O中的10mg/ml底物(丙酰胺),在 37。C溫育4天,并離心(終濃度為5 mg/ml底物禾卩25 mg/mL提取物)。 對(duì)參照細(xì)胞CBS 513.88和經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中乙酰胺酶活性的測(cè)量按照廠商說(shuō)明 書通過(guò)核磁共振來(lái)進(jìn)行(圖3)。在Bruker DRX-600 (運(yùn)行于600 MHz的 質(zhì)子頻率以及300 K的探針溫度下)上記錄1H NMR譜。使用5 mm三共 振探針和自保護(hù)(self-shielded)梯度。獲得所有對(duì)照化合物的& NMR 譜,表明涉及的所有的化合物都具有獨(dú)特的NMR信號(hào),基于此它們能被 鑒定和定量(未示出)。為對(duì)每種相關(guān)化合物都產(chǎn)生完美的對(duì)照譜,在 D20中制備每種化合物的10 mg/ml的貯液。通過(guò)稱量底物或?qū)φ栈衔铮?以及加入D20,制備出濃度為10 mg/ml的貯液。從這些貯液中取500 ]Ld, 與500 /il 0.5 M的磷酸鹽緩沖液(pH 6.96) (KH2P04/K2HP04)混合。隨 后在27°C, D20中,于600 MHz收集每種化合物(即,丙烯酰胺、丙烯 酸、乙酰胺、乙酸、丙酰胺和丙酸)的1HNMR譜(D20中,終濃度5 mg/ml的底物或?qū)φ栈衔?。針對(duì)每種化合物,鑒定出不與其它化合物 導(dǎo)致的信號(hào)重疊的獨(dú)特的化學(xué)位移。此外,檢測(cè)每種對(duì)照的純度,證實(shí)了
可能污染物不存在。
化合物具有下述特征信號(hào)
丙烯酰胺(目錄號(hào)8.00830, lot 4202056, Merck NJ USA) : 5.82 (dd, Hb, J = 10.3 Hz, 1 .2 Hz), 6.22 (dd, He, J = 17.2 Hz, 1 .2 Hz), 6.28 (d, Ha, J = 10.3 Hz), 6.31 (d, Ha, J = 10.3 Hz) ppm。
丙烯酸(目錄號(hào)14,723-0, lot S17163-034,Aldrich,Wl USA) : 5.65 (dd, Hb, J = 10.4 Hz, 1.6 Hz), 6.01 (dd, He, J = 17.4 Hz, 1.6 Hz), 6.1 1 (d, CH2=CH, 3J = 10.3 Hz), 6.14 (d, CH2=CH, 3J = 10.3 Hz)。
乙酰胺(目錄號(hào)12,263-7, lotl6813BA-453, Aldrich, Wl USA) : 1 .99 (s, CH3)ppm。
乙酸(目錄號(hào)1 .00063, lot K31668363, Merck NJ USA) : 1 .90 (s, CH3) ppm。
丙酰胺(目錄號(hào)14,393-6, lot 25009JB-413,Aldrich,Wl USA) : l.lO(t, CH3), 2.27 (q, CH2) ppm。
丙酸(目錄號(hào)P-1386, lot 083 K3404, Sigma, St Louis, Mo USA): 1 .09 (t, CH3), 2.37 (q, CH2) ppm。
在100 ml YEPD (酵母提取物10 g/l、蛋白胨20 g/l、糊精20 g/1) 中,于30°C、 250 rpm下,在帶擋板的500 ml錐形搖瓶中對(duì)得到的K. lactis轉(zhuǎn)化子(通過(guò)PCR檢查的)進(jìn)行3天的培養(yǎng)。收獲細(xì)胞,通過(guò)在液 氮中碾磨進(jìn)行破碎。通過(guò)將經(jīng)碾磨的生物物質(zhì)重新溶解于20 mM磷酸鈉緩 沖液(pH 7.4) 、 1 mM EDTA、 2 mM DTT以及蛋白酶抑制劑(由Roche 完成,目錄號(hào)1873580)中來(lái)獲得細(xì)胞提取物。按照Skouloubris et al., Molecular Microbiology (2001 ) 40(3), 596-609所述,在對(duì)照K. lactis細(xì)胞以 及經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中測(cè)定乙酰胺酶活性(圖4)。
如圖3和4清楚地顯示,C末端SKL標(biāo)簽的加入(其促進(jìn)乙酰胺酶蛋 白的過(guò)氧化物酶體定位)增加了 A. niger和K. lactis中的細(xì)胞內(nèi)乙酰胺酶 活性。
實(shí)施例2向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入油酸鹽以增加過(guò)氧化物酶體的增殖
通過(guò)用油酸鈉(目錄號(hào)26125, Riedel-de Haen, Hannover, Germany)和 Tween-40 (目錄號(hào)93775, Fluka, Buchs, Switzerland)補(bǔ)充培養(yǎng)基,來(lái)介導(dǎo) 每個(gè)細(xì)胞中過(guò)氧化物酶體數(shù)量的增加以及由此導(dǎo)致的A. niger過(guò)氧化物酶 體儲(chǔ)備體積(storage volume)的增加。使用具有經(jīng)工程改造的C末端SKL 標(biāo)簽的綠色熒光蛋白(GFP) (Chalfie, M et al., Science (1994) 263(5148): 802-805),通過(guò)熒光顯微方法來(lái)展示過(guò)氧化物酶體的增加數(shù)量。C末端 SKL標(biāo)簽被工程改造為廣泛使用的、能被很好表征的GFP基因,這是按照 實(shí)施例1所述使用PCR方法實(shí)現(xiàn)的。將得到的GFP-SKL基因克隆進(jìn)A. niger表達(dá)載體,使用實(shí)施例1所述的方法將其轉(zhuǎn)化至A. niger CBS 513.88。
在最小程度富集Aspergillus培養(yǎng)基(MEAM ,在專利申請(qǐng)WO 98/46772中描述過(guò))中,于30°C和250 rpm,使用軌道振蕩器在搖瓶中, 對(duì)獲得的過(guò)量表達(dá)具有連接SKL的C末端的GFP的A. mger菌株進(jìn)行培 養(yǎng)。48小時(shí)的預(yù)培養(yǎng)后,收獲菌絲體,洗滌,隨后將其轉(zhuǎn)移至補(bǔ)充有 0.18% (w/v)油酸鈉和0.02% (w/v) Tween-40的新鮮培養(yǎng)基(MEAM) 中。在沒有補(bǔ)充油酸鈉和Tween-40的MEAM中對(duì)對(duì)照培養(yǎng)物加以培養(yǎng)。 26小時(shí)的培養(yǎng)后,使用Zeiss熒光顯微鏡,用藍(lán)光激發(fā)(490 nm)分析樣 品。代表性樣品用于使用Fujicolor800ASA彩色膠片進(jìn)行的熒光顯影。
從圖5可以觀察到,在不包含油酸鈉和Tween-40的培養(yǎng)基中對(duì)過(guò)量表 達(dá)GFP-SKL的菌株的培養(yǎng)導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體極少。如圖6清 楚展示,在補(bǔ)充有油酸鈉和Tween-40的發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)同樣的細(xì)胞, 就能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖,導(dǎo)致每個(gè)細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體數(shù)量增加。
實(shí)施例3通過(guò)過(guò)氧化物酶體與質(zhì)膜的融合使過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物(GFP-SKL) 釋放到細(xì)胞外 3.1在過(guò)氧化物酶體表面上克隆和表達(dá)融合多肽
將沒有跨膜結(jié)構(gòu)域的A. niger v-SNARE ScnA (其基因組、cDNA和蛋 白質(zhì)序列分別示為SEQ ID NO: 11、 12和13)與過(guò)氧化物酶體膜蛋白22 (Pmp22)(其基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQ ID NO: 14、
15和16)融合。在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板,使用SEQ ID NO: 17禾B SEQ ID NO: 18,得到編碼SEQ ID NO: 19。此外,在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板,使用SEQ ID NO: 20和SEQ ID NO: 21,得到編碼SEQ ID NO: 22。隨后,在PCR反應(yīng)中,SEQ ID NO: 19和SEQIDNO: 22被用 作為模板,使用SEQ ID NO: 17和SEQIDNO: 21,得到SEQ ID NO: 23。按照廠商說(shuō)明書,用Pacl和Ascl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 23)進(jìn)行消化,將其連接進(jìn)用Pacl、 Ascl線性化過(guò)的圖1所示的A. niger 表達(dá)載體。這產(chǎn)生了下述構(gòu)建體,其中,編碼具有過(guò)氧化物酶體膜錨的融 合多肽(SncA/Pmp-22)的基因被放置于glaA啟動(dòng)子的控制下。該基因的 表達(dá)產(chǎn)生了包含過(guò)氧化物酶體膜錨的嵌合蛋白,如SEQ ID NO: 24所示。 SncA/Pmp-22表達(dá)載體與GFP-SKL表達(dá)載體一起用于共轉(zhuǎn)化A. niger。所 有PCR反應(yīng)、連接以及轉(zhuǎn)化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
3.2培養(yǎng)共轉(zhuǎn)化子用于分析過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物的釋放 使用PCR,對(duì)前文段落獲得的過(guò)量表達(dá)GFP-SKL和SncA/Pmp-22的 A. mger菌株的若干克隆進(jìn)行選擇,選出含有每種基因的單拷貝的克隆。 在含或不含10 MM C2-神經(jīng)酰胺(N-乙?;?D-鞘氨醇目錄號(hào)A7191, Sigma, St. Louis Missouri USA)的MEAM緩沖過(guò)的培養(yǎng)基(在專利申請(qǐng) WO 98/46772中詳細(xì)描述過(guò))中,于30°C和250 rpm,使用軌道振蕩器在 搖瓶中,對(duì)選出的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。含有單基因拷貝的過(guò)量表達(dá)GFP-SKL 的菌株(實(shí)施例2中描述的構(gòu)建)以及空宿主菌株(CBS513.88)被用作 對(duì)照。在24和48小時(shí)的時(shí)間點(diǎn)取樣。通過(guò)離心來(lái)澄清上清液樣品,通過(guò) 經(jīng)0.45拜過(guò)濾器(目錄號(hào)4614, Pall, Ann Arbor, Mo USA)進(jìn)行超濾將其 與殘余的細(xì)胞殘骸分開。
3.3對(duì)過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物向細(xì)胞外的釋放進(jìn)行SDS-PAGE分析;對(duì) 作為釋放促進(jìn)劑的C2-神經(jīng)酰胺的分析
通過(guò)SDS-PAGE對(duì)來(lái)自3.2的上清液樣品進(jìn)行分析。按照廠商說(shuō)明 書,使用NuPAGE Novex高效預(yù)鑄凝膠(pre-cast gel) (4-12% Bis-Tris梯 度凝膠,Invitrogen, Paisley, UK)來(lái)進(jìn)行SDS-PAGE。按照廠商說(shuō)明書,將 樣品(20 Ad)與2.0 /zl還原劑和6.0 /il樣品緩沖液混合,隨后在上樣到凝 膠上之前,在70°C加熱10分鐘。電泳之后,按照廠商說(shuō)明書,使用 Simply Blue Safe染料(Invitrogen, Paisley, UK)對(duì)凝膠染色。
在圖7中,可清楚觀察到GFP-SKL向細(xì)胞外的釋放。通過(guò)54kD處的 內(nèi)源條帶觀察到的,所有樣品含有等量的內(nèi)源蛋白。相反,第4、 5、 6和 7道含有比第1、 2和3道明顯更多的GFP-SKL。此外,還顯示,C2-神經(jīng) 酰胺還誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物(即GFP-SKL)向細(xì)胞外的釋放;第5和 7道(MEAM+C2-神經(jīng)酰胺)分別比第4和6道含有更多的GFP-SKL。
3.4對(duì)過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物向細(xì)胞外的釋放進(jìn)行Western雜交印跡分 析;對(duì)作為釋放促進(jìn)劑的C2-神經(jīng)酰胺的分析
通過(guò)Western雜交印跡對(duì)來(lái)自3.2的上清液樣品進(jìn)行分析。按照與3.3 相同的方法進(jìn)行SDS-PAGE,按照廠商說(shuō)明書,使用XCeII II Blot Module (Invitrogen, Paisley, UK)來(lái)進(jìn)行Western雜交印跡。電泳之后,在30伏 特,在預(yù)先切割的硝酸纖維素膜(Invitrogen)上對(duì)NuPage凝膠進(jìn)行印跡 雜交。在Tris緩沖鹽水(TBS, 20 mM Tris-HCI pH 7.4, 0.9% w/v NaCl;目 錄號(hào)T5912, Sigma) +2%脫脂奶中,室溫(rT)下對(duì)雜交印跡進(jìn)行1小 時(shí)的封閉。將商業(yè)上可獲得的抗GFP抗體(anti-GFP , Eurogentec, Belgium,目錄號(hào)MMS-118P)稀釋至1/10,000,將雜交印跡與該抗體溫 育1小時(shí)。。隨后,用MilliQ水和TBS + 0.2。/。脫脂奶對(duì)雜交印跡洗三次, 每次5分鐘。洗滌之后,將雜交印跡與山羊抗兔過(guò)氧化物酶(目錄號(hào) 31460, Pierce Rock Ford Illinois USA)的1/5000稀釋液一起在室溫下溫 育。再洗雜交印跡,用檢測(cè)液(ECL直接核酸標(biāo)記和檢測(cè)系統(tǒng),
Amersham biosciences, Buckinghamshire, UK)浸泡。最后,將雜交印跡暴 露給AGFA Curix Blue HC-S plus膠片(AGFA Mortsel, Belgium)。
在圖8中,可觀察到GFP-SKL向細(xì)胞外的釋放。在第5、 6、 7和8道 中存在有GFP-SKL。相反,在第3、 4禾H 9、 10道中不存在細(xì)胞外GFP-SKL。
3.5對(duì)A. niger培養(yǎng)物的a-特異性裂解的分析
為展示出3.1-3.4所述的過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物被觀察到的釋放不是a-特 異性裂解介導(dǎo)的,通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物上清液中細(xì)胞內(nèi)乙酰胺酶(amdS)的活性 加以測(cè)量來(lái)測(cè)定培養(yǎng)物的裂解程度。乙酰胺酶測(cè)量按照Skouloubris et al., Molecular Microbiology (2001) 40 (3), 596-609來(lái)進(jìn)行。將10 /xl來(lái)自培養(yǎng)物 的上清液加入到磷酸EDTA緩沖液(PEB, 100 mM磷酸鈉,pH 7.4, 10 mM EDTA)中的100 mM乙酰胺(目錄號(hào)A0500, Sigma Missouri USA)中。 37°C溫育90分鐘之后,加入400 /xl苯酚硝普(目錄號(hào)P6994, Sigma Missouri USA)和400 /xl堿性次氯酸鹽溶液(0.2%,目錄號(hào)A1727, Sigma Missouri USA)并混合。將混合物在55°C溫育6分鐘。隨后,按照廠商說(shuō) 明書,在Ultraspec 2000 UV/VIS Spectrophotometer ( Pharmacia Biotech, Sweden)中于635 nm測(cè)量吸光度。從標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算樣品中amdS的量, 其被指定為相對(duì)單位/ml培養(yǎng)物上清液。
結(jié)果示于圖10中,可清楚觀察到,24小時(shí)的培養(yǎng)之后,培養(yǎng)物上清 液中不存在amdS活性,這表明沒有發(fā)生裂解。48小時(shí)的培養(yǎng)之后,所有 樣品含有等量的amdS活性,這表明所有培養(yǎng)物中的裂解程度都是相同 的。這些結(jié)果清楚顯示,在3.1至3.4中的培養(yǎng)物上清液中觀察到的GFP-SKL 的存在由過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物向細(xì)胞外的積極釋放引起,而非由對(duì)細(xì) 胞的a-特異性裂解引起。
實(shí)施例4 Pmp22可被用于改裝具有重組(多)肽的過(guò)氧化物酶體
為證實(shí)Pmp22可用作為過(guò)氧化物酶體膜錨,構(gòu)建嵌合基因,其中綠色 熒光蛋白(GFP)與Pmp22的N末端融合,并在A. niger中表達(dá)。熒光顯 微揭示了強(qiáng)烈的綠色球形細(xì)胞內(nèi)微體。
4.1克隆和表達(dá)GFP/Pmp22嵌合構(gòu)建體
將SEQ ID NO: 25和26示出的GFP與過(guò)氧化物酶體膜蛋白22 (Pmp22)(示為SEQIDNO: 14、 15和16)融合。
在PCR反應(yīng)中,GFP DNA (SEQ ID NO: 25)被用作為模板,使用 SEQ ID NO: 27禾n SEQ ID NO: 28,得到SEQ ID NO: 29。此外,在 PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使用SEQ ID NO: 30禾B SEQIDNO: 31,得到編碼SEQIDNO: 32。隨后,在PCR 反應(yīng)中,SEQ ID NO: 29和SEQIDNO: 32被用作為模板,使用SEQ ID NO: 27禾口 SEQ ID NO: 31,得到SEQ ID NO: 33。按照廠商說(shuō)明書,用 Pacl和Ascl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 33)進(jìn)行消化,將其連接 進(jìn)用Pacl、 Ascl線性化過(guò)的圖1所示的A. niger表達(dá)載體。這產(chǎn)生了下述 構(gòu)建體,其中,編碼具有過(guò)氧化物酶體膜錨的GFP (GFP/Pmp-22)的基因 被放置于glaA啟動(dòng)子的控制下。該基因的表達(dá)產(chǎn)生了包含過(guò)氧化物酶體膜 錨的GFP,如SEQ ID NO: 34所示。GFP/Pmp-22表達(dá)載體被用于轉(zhuǎn)化A. niger。所有PCR反應(yīng)、連接以及轉(zhuǎn)化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
在最小程度富集Aspergillus培養(yǎng)基(MEAM ,在專利申請(qǐng)WO 98/46772中描述過(guò))中,于30。C和250 rpm,使用軌道振蕩器在搖瓶中, 對(duì)獲得的過(guò)量表達(dá)GFP/Pmp-22的A. niger菌株進(jìn)行培養(yǎng)。使用相同培養(yǎng) 條件,對(duì)過(guò)量表達(dá)有或沒有連接SKL的C末端的GFP的對(duì)照培養(yǎng)物加以 培養(yǎng)。18小時(shí)的培養(yǎng)后,使用Zeiss熒光顯微鏡,用藍(lán)光激發(fā)(490 nm) 分析樣品。代表性樣品用于使用Fujicolor 800ASA彩色膠片進(jìn)行的熒光顯 影。
如可從圖9A觀察到的,過(guò)量表達(dá)GFP/Pmp22嵌合蛋白的A. niger顯 示出與過(guò)量表達(dá)GFP-SKL的A. niger (圖9B)(其中,GFP-SKL通過(guò)C 末端的SKL耙向至過(guò)氧化物酶體)相同的強(qiáng)烈的綠色球形細(xì)胞內(nèi)微體點(diǎn)狀 圖案。相反,過(guò)量表達(dá)野生型GFP (即沒有C末端SKL)的A. niger在細(xì) 胞的整個(gè)胞質(zhì)中都顯示普通的綠色熒光(圖9C)。
組合結(jié)果清楚顯示,Pmp-22可用作為過(guò)氧化物酶體膜錨,以改裝具有 本發(fā)明所述重組(多)肽例如GFP或融合肽的過(guò)氧化物酶體。
實(shí)施例5使用用融合多肽改裝過(guò)的過(guò)氧化物酶體來(lái)構(gòu)建能分泌細(xì)胞內(nèi)化
合物的A w/g^宿主細(xì)胞 5.1在A m'ger宿主細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體表面上克隆和表達(dá)融合多肽 將沒有跨膜結(jié)構(gòu)域的A "/gwv-SNARE ScnA (其基因組、cDNA和蛋 白質(zhì)序列分別示為SEQ ID NO: 11、 12和13)與過(guò)氧化物酶體膜蛋白22
(Pmp22)(其基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQ ID NO: 14、 15和16)融合。在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板,使用SEQ ID NO: 18禾B SEQ ID NO: 35,得到編碼SEQ ID NO: 36。此外,在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作 為模板,使用SEQ ID NO: 20禾卩SEQ ID NO: 37,得到編碼SEQ ID NO: 38。隨后,在PCR反應(yīng)中,SEQ ID NO: 36和SEQIDNO: 38被用 作為模板,使用SEQ ID NO: 35和SEQ ID NO: 37,得到SEQ ID NO: 39。按照廠商說(shuō)明書,用Pacl和Acl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 39)進(jìn)行消化,將其連接進(jìn)用尸acl、 Jscl線性化過(guò)的圖ll所示的A m'ga 表達(dá)載體(pGBFIN-5)。這產(chǎn)生了下述構(gòu)建體,其中,編碼具有過(guò)氧化物 酶體膜錨的融合多肽(SncA/Pmp-22)的基因被放置于glaA啟動(dòng)子的控制 下。該基因的表達(dá)產(chǎn)生了包含過(guò)氧化物酶體膜錨的嵌合蛋白,如SEQ ID NO: 40所示(SncA/Pmp22蛋白)。SncA/Pmp-22表達(dá)載體被用于轉(zhuǎn)化過(guò) 量表達(dá)GFP-SKL的A CBS 513.88 (如實(shí)施例2所述)。通過(guò)PCR,
針對(duì)表達(dá)構(gòu)建體SncA/Pmp-22和GFP-SKL的存在對(duì)得到的A m'ger轉(zhuǎn)化子 進(jìn)行分析。按照實(shí)施例3.2和3.3所述,通過(guò)培養(yǎng)和SDS-PAGE對(duì)包含這
兩種表達(dá)構(gòu)建體的若干種克隆進(jìn)行分析,分析針對(duì)過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物的 釋放進(jìn)行。在實(shí)施例6和7中對(duì)表現(xiàn)最好的克隆進(jìn)行進(jìn)一步分析。所有
PCR反應(yīng)、連接以及轉(zhuǎn)化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al" New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
5.2對(duì)能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的A m'gw宿主細(xì)胞進(jìn)行加工處理 將前文段落獲得的、并在實(shí)施例6和7中進(jìn)一步分析的表現(xiàn)最好的克 隆被選用來(lái)進(jìn)行GFP-SKL表達(dá)的加工處理。得到的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物 的A m'gw宿主細(xì)胞在實(shí)施例8和9中被用作為能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通 用A r宿主o
在MEAM緩沖過(guò)的培養(yǎng)基(在專利申請(qǐng)WO 98/46772中詳細(xì)描述 過(guò))中,于30。C和250 rpm,使用軌道振蕩器在搖瓶中,對(duì)選出的克隆進(jìn) 行培養(yǎng)。將該克隆的培養(yǎng)物涂布到含有PDA培養(yǎng)基(Difco, France)的平 板上,以便在自發(fā)的重組事件中丟失GFP-SKL表達(dá)載體。針對(duì)GFP-SKL 的表達(dá),使用UV-發(fā)光在Geldoc 2000系統(tǒng)(Bio-Rad, Italy)上于315 nm 處,對(duì)總共IOO,OOO個(gè)菌落進(jìn)行分析。展示出最少的GFP表達(dá)的菌落被用 于另一輪培養(yǎng)和涂布。兩輪選擇之后,具有最小的GFP-SKL表達(dá)的科隆 被選出。PCR展示出,該菌株仍然含有SncA/Pmp22表達(dá)載體,同時(shí)保留 有GFP-SKL表達(dá)盒的至少一個(gè)拷貝。得到的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的A 宿主細(xì)胞在實(shí)施例8和9中被用作為能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A m'ggr宿主o
實(shí)施例6 以10L規(guī)模的發(fā)酵罐來(lái)進(jìn)行細(xì)胞外GFP-SKL生產(chǎn) 菌株
按照實(shí)施例5.1所述構(gòu)建出過(guò)量表達(dá)GFP-SKL以及SncA/Pmp22的A m'gerCBS513.88。將菌株的孢子貯藏于-80。C (5 x 107個(gè)可見孢子/管)
接種程序?qū)⒁粋€(gè)孢子管的內(nèi)含物加入到帶擋板的2L搖瓶(20 g/L酵母提取物、 20 g/L葡萄糖,pH 6.8 (用KOH) , 300 mL培養(yǎng)基,在121°C蒸汽滅菌 20分鐘)中的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中。該預(yù)培養(yǎng)物在30°C和220 rpm下被培養(yǎng) 40小時(shí)。
補(bǔ)料分批發(fā)酵
使用本領(lǐng)域已知的程序(W093/37179中描述的),在包含碳和氮源 以及無(wú)機(jī)鹽的合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。所用的生長(zhǎng)條件如下所示 過(guò)程中的pH在培養(yǎng)的最初72個(gè)小時(shí)被控制為6.0,之后24小時(shí)內(nèi)逐步增 加至6.7,保持為這個(gè)值。溫度被控制為30°C。工作體積為10 L,總發(fā)酵 時(shí)間為192小時(shí)。對(duì)培養(yǎng)基的受控進(jìn)料施加氧受限條件。遵循指數(shù)曲線 (速率增加為0.025 h—4的通過(guò)攪拌來(lái)控制氧吸收速率。將含有葡萄糖的 進(jìn)料調(diào)節(jié)至在培養(yǎng)基中保持超過(guò)10 g/L的葡萄糖濃度。必要的時(shí)候停止。 使用分光光度分析,針對(duì)GFP-SKL對(duì)上清液樣品進(jìn)行分析。使用200 pi 樣品,在室溫下,用490 nm處的激發(fā)、510nm處的發(fā)射、495 nm處的截 止點(diǎn)(cut-off)、自動(dòng)獲取(gain automatic)禾Q 61000 M-1cm"的488 nm 處的摩爾消光系數(shù)來(lái)測(cè)量相對(duì)熒光。用于熒光測(cè)量的樣品被稀釋于含有5 mM Na2EDTA的5 mM Tris HC1緩沖液(pH 8.0)中。將濾出物稀釋2至 640倍,這取決于預(yù)期的eGFP濃度。
如圖12所示,在培養(yǎng)的最初72小時(shí)(pH 6.0),生物物質(zhì)濃度迅速 增加,然后直到發(fā)酵終點(diǎn)都保持幾乎恒定,這是由于對(duì)培養(yǎng)基的連續(xù)進(jìn)料 導(dǎo)致的稀釋效果造成的。在該時(shí)間段內(nèi)(最初72小時(shí)),細(xì)胞外僅發(fā)現(xiàn) 了非常低的GFP-SKL水平(大約0.25 g/L) 。 pH從6.0變?yōu)?.7之后(在 第72至第96小時(shí)間實(shí)現(xiàn)),細(xì)胞外GFP-SKL濃度持續(xù)增加,直到發(fā)酵 終點(diǎn),在192小時(shí)達(dá)到3.3 g/L的值。這清楚表明,使用上述過(guò)程條件,在 10 L規(guī)模的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中以超過(guò)3.0 g/L的產(chǎn)率生產(chǎn)出了 GFP-SKL。
實(shí)施例7在葡萄糖受限和氧受限條件下采用相同培養(yǎng)情況來(lái)進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)
GFP-SKL生產(chǎn)
菌株
按照實(shí)施例5.1所述構(gòu)建出過(guò)量表達(dá)GFP-SKL以及SncA/Pmp22的A "&wCBS513.88。將菌株的孢子貯藏于-80。C (5 x 107個(gè)可見孢子/管)
接種程序
將一個(gè)孢子管的內(nèi)含物加入到帶擋板的2L搖瓶(20 g/L酵母提取物、 20 g/L葡萄糖,pH 6.8 (用KOH) , 300 mL培養(yǎng)基,在121°C蒸汽滅菌 20分鐘)中的預(yù)培養(yǎng)培養(yǎng)基中。該預(yù)培養(yǎng)物在30°C和220 rpm下被培養(yǎng) 40小時(shí)。
補(bǔ)料分批發(fā)酵
使用本領(lǐng)域己知的程序(W093/37179中描述的),在包含碳和氮源 以及無(wú)機(jī)鹽的合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
所用的生長(zhǎng)條件如下所示過(guò)程中的pH被控制為5.5,溫度被控制為 30°C。工作體積為10 L,總發(fā)酵時(shí)間為144小時(shí)。氣流為1 vvm (每分鐘 每體積培養(yǎng)基的空氣體積)。對(duì)于葡萄糖受限的培養(yǎng)物,應(yīng)用速率增加為 0.025 h-'的指數(shù)補(bǔ)料曲線。對(duì)于氧受限的培養(yǎng)物,遵循速率增加為0.025 h-1的指數(shù)曲線通過(guò)攪拌來(lái)控制氧吸收速率。將含有葡萄糖的進(jìn)料調(diào)節(jié)至在 培養(yǎng)基中保持超過(guò)10g/L的葡萄糖濃度。必要的時(shí)候停止。取樣,制備不 含細(xì)胞的提取物。按照實(shí)施例6所述的方法,針對(duì)GFP-SKL對(duì)樣品進(jìn)行 分析。
如圖13所示,氧受限條件下,細(xì)胞內(nèi)GFP-SKL的生產(chǎn)要比葡萄糖受 限條件下高得多。在發(fā)酵終點(diǎn)(144小時(shí)),使用氧受限條件時(shí),細(xì)胞內(nèi) 的GFP-SKL生產(chǎn)較之葡萄糖受限的條件為大約20倍高。該具體例子清楚 表明,在10 L規(guī)模的補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中,氧受限條件對(duì)于GFP-SKL的 過(guò)氧化物酶體/細(xì)胞內(nèi)積累來(lái)說(shuō)是有好處的。
實(shí)施例8通過(guò)過(guò)氧化物酶體與質(zhì)膜的融合使過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物(乙酰
胺酶)釋放到細(xì)胞外 8.1 A m'ger乙酰胺酶的克隆和表達(dá)
使用A m'gw乙酰胺酶AmdS (其基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示 為SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 42和SEQ ID NO: 43)。在PCR反應(yīng) 中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使用SEQ ID NO: 44 和SEQ ID NO: 45,得到編碼SEQ ID NO: 46。按照廠商說(shuō)明書,用 和Acl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 46)進(jìn)行消化,將其連接 進(jìn)用ftzcl、 Acl線性化過(guò)的圖1所示的A m'ger表達(dá)載體。這產(chǎn)生了下述 構(gòu)建體,其中,編碼j. m'gw乙酰胺酶的基因被放置于glaA啟動(dòng)子的控制 下。
此外,在PCR反應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模 板,使用SEQ ID NO: 44禾卩SEQ ID NO: 47,得到編碼SEQ ID NO: 48。按照廠商說(shuō)明書,用Pacl和Acl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 48)進(jìn)行消化,將其連接進(jìn)用尸acl、 Acl線性化過(guò)的圖1所示的A m'ger 表達(dá)載體(pGBFIN-5)。這產(chǎn)生了下述構(gòu)建體,其中,編碼具有經(jīng)工程改 造的C末端SKL尾巴的A m'ger乙酰胺酶的基因被放置于glaA啟動(dòng)子的 控制下。該構(gòu)建體的表達(dá)產(chǎn)生SEQ ID NO: 49所示的多肽。所有PCR反 應(yīng)、連接以及轉(zhuǎn)化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用 經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。
得到的編碼具有或不具有C末端SKL的A m'gw乙酰胺酶的表達(dá)構(gòu)建 體被用于轉(zhuǎn)化來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A m'ger宿主和 CBS 513.88。針對(duì)SncA/Pmp22表達(dá)構(gòu)建體以及乙酰胺酶構(gòu)建體的存在, SncA/Pmp22表達(dá)構(gòu)建體以及乙酰胺酶-SKL構(gòu)建體的存在,分別通過(guò)PCR 對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析。選出的克隆在實(shí)施例8.3中被進(jìn)一步分析。
8.2對(duì)A m'^z/a朋乙酰胺酶的克隆和表達(dá)
對(duì)該實(shí)驗(yàn)而言,使用公知的A "/^fe朋乙酰胺酶基因(Tilburn et al, 1983, Gene 26:205-221),其基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別示為SEQ ID NO: 50、 SEQ ID NO: 51禾卩SEQ ID NO: 52。在PCR反應(yīng)中,來(lái)自含 有A m'甴/"朋AmdS (描述于EP13211523中)的表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA被
用作為模板,使用SEQID NO: 53和SEQID NO: 54,得到編碼SEQ ID NO: 55。按照廠商說(shuō)明書,用尸"cl和Acl對(duì)得到的PCR片段(SEQID NO: 55)進(jìn)行消化,將其連接進(jìn)用尸acl、 Acl線性化過(guò)的圖1所示的A m'gw表達(dá)載體。這產(chǎn)生了下述構(gòu)建體,其中,編碼A mWw/a朋乙酰胺酶的 基因被放置于glaA啟動(dòng)子的控制下。
此外,在PCR反應(yīng)中,來(lái)自含有A AmdS (描述于
EP13211523中)的表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA被用作為模板,使用SEQ ID NO: 53和SEQ ID NO: 56,得到編碼SEQ ID NO: 57。按照廠商說(shuō)明 書,用ftzcl和Acl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 57)進(jìn)行消化,將 其連接進(jìn)用尸flcl、 Acl線性化過(guò)的圖1所示的A m'gw表達(dá)載體。這產(chǎn)生 了下述構(gòu)建體,其中,編碼具有經(jīng)工程改造的C末端SKL尾巴的A m'^/a朋乙酰胺酶的基因被放置于glaA啟動(dòng)子的控制下。該構(gòu)建體的表達(dá) 產(chǎn)生SEQ ID NO: 58所示的多肽。所有PCR反應(yīng)、連接以及轉(zhuǎn)化都按照 上文所述白勺Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經(jīng)典分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn) 行。得到的編碼具有或不具有C末端SKL的A m'^z/a朋乙酰胺酶的表達(dá) 構(gòu)建體被用于轉(zhuǎn)化來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A "/ger宿 主和CBS 513.88。針對(duì)SncA/Pmp22表達(dá)構(gòu)建體以及乙酰胺酶構(gòu)建體的存 在,SncA/Pmp22表達(dá)構(gòu)建體以及乙酰胺酶-SKL構(gòu)建體的存在,分別通過(guò) PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析。選出的克隆在實(shí)施例8.3中被進(jìn)一步分析。
8.3培養(yǎng)來(lái)自實(shí)施例8.1和8.2的轉(zhuǎn)化子,用于分析細(xì)胞內(nèi)乙酰胺酶的
釋放
將具有或不具有SKL的A m'gw AmdS以及具有或不具有SKL的A m'甴/a朋AmdS轉(zhuǎn)化進(jìn)能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A m'ger宿主(實(shí)施例 5.2中構(gòu)建的)和CBS 513.88 (作為陰性對(duì)照)。使用PCR選出含有乙酰 胺酶表達(dá)盒單個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化子。在MEAM緩沖過(guò)的培養(yǎng)基(在專利申請(qǐng) WO 98/46772中詳細(xì)描述過(guò))中,于30。C和250 rpm,使用軌道振蕩器在 搖瓶中,對(duì)8種類型的克隆進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始之后120和144小時(shí)的 時(shí)間點(diǎn),取上清液樣品。通過(guò)離心來(lái)澄清上清液樣品,通過(guò)經(jīng)0.45/mi過(guò) 濾器(目錄號(hào)4614, Pall, Ann Arbor, Mo USA)進(jìn)行超濾將其與殘余的細(xì)胞 殘骸分開。在實(shí)施例8.4中針對(duì)乙酰胺酶活性對(duì)上清液樣品進(jìn)行分析。
8.4乙酰胺酶試驗(yàn)
通過(guò)測(cè)量樣品中的游離氨,針對(duì)乙酰胺酶活性對(duì)來(lái)自8.3的上清液樣 品進(jìn)行分析。游離氨是乙酰胺酶活性的指標(biāo)(如Skouloubris et al., Molecular Microbiology (2001 ) 40(3), 596-609所述)。CBS 513.88的所有
選出并分析為經(jīng)轉(zhuǎn)化的克隆沒有產(chǎn)生可檢測(cè)到的游離氨(數(shù)據(jù)未示出)。 在圖14中,展示了通過(guò)實(shí)施例5.2的菌株的四種類型的轉(zhuǎn)化子產(chǎn)生的游離 氨。如圖14清楚所示,含有C末端SKL延伸(即靶向過(guò)氧化物酶體)的 構(gòu)建體較之不含C末端SKL延伸的構(gòu)建體產(chǎn)生更高的細(xì)胞外乙酰胺酶活 性。這種更高的乙酰胺酶活性是過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物的釋放導(dǎo)致的。在圖 14中,當(dāng)將方塊2 (具有SKL的A w/ger乙酰胺酶)和4 (具有SKL的A mV/M/fl朋乙酰胺酶)與對(duì)應(yīng)的方塊1 (不具有SKL的A 乙酰胺酶) 和3 (不具有SKL的A mV/M/fl,w乙酰胺酶)進(jìn)行比較時(shí),可以清楚地觀察 到具有和不具有SKL的分泌到細(xì)胞外的乙酰胺酶之間的差異;在具有 SKL的乙酰胺酶的上清液中,存在多得多的乙酰胺酶活性。
實(shí)施例9通過(guò)過(guò)氧化物酶體與質(zhì)膜的融合使過(guò)氧化物酶體內(nèi)含物(阿馬
多里酶)釋放到細(xì)胞外 9.1 A m'ggr阿馬多里酶-SRL的克隆和表達(dá)
使用A m'ger阿馬多里酶-SRL (其基因組、cDNA和蛋白質(zhì)序列分別 示為SEQ ID NO: 59、 SEQ ID NO: 60和SEQ ID NO: 61)。在PCR反 應(yīng)中,來(lái)自CBS 513.88的基因組DNA被用作為模板,使用SEQ ID NO: 62和SEQ ID NO: 63,得到編碼SEQ ID NO: 64。按照廠商說(shuō)明書,用 Pad和Acl對(duì)得到的PCR片段(SEQ ID NO: 64)進(jìn)行消化,將其連接 進(jìn)用戶flcl、 Jwl線性化過(guò)的圖ll所示的A m'gw表達(dá)載體。這產(chǎn)生了下述 構(gòu)建體,其中,編碼阿馬多里酶的基因被放置于glaA啟動(dòng)子的控制下。按
照廠商說(shuō)明書,用PflCl和乂Kl對(duì)得到的質(zhì)粒DNA進(jìn)行消化,將其連接進(jìn)
用&cl、 ^ cl線性化過(guò)的圖1所示的A w&w表達(dá)載體。所有PCR反應(yīng)、 連接以及轉(zhuǎn)化都按照上文所述的Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., New York: Cold Spring Harbor Press, 1989所述使用經(jīng)典分 子生物學(xué)技術(shù)來(lái)進(jìn)行。得到的編碼A w扭r阿馬多里酶-SRL的表達(dá)構(gòu)建體 被用于轉(zhuǎn)化來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A m'gw宿主和 CBS 513.88 (作為陰性對(duì)照)。針對(duì)SncA/Pmp22表達(dá)構(gòu)建體以及阿馬多 里酶-SRL構(gòu)建體的存在,分別通過(guò)PCR對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行分析。選出的克隆 在實(shí)施例9.2中被進(jìn)一步分析。
9.2培養(yǎng)來(lái)自實(shí)施例9.1的轉(zhuǎn)化子,用于分析細(xì)胞內(nèi)阿馬多里酶的釋放 將A m'gw阿馬多里酶-SRL轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化 合物的通用A剛'gw宿主和CBS 513.88 (作為陰性對(duì)照)。使用PCR選出 含有阿馬多里表達(dá)盒單個(gè)拷貝的轉(zhuǎn)化子。對(duì)2種類型的轉(zhuǎn)化子(實(shí)施例 5.2的A m'ger和CBS 513.88,每種都包含阿馬多里酶-SRL)的代表性克 隆進(jìn)行選擇,并在MEAM緩沖過(guò)的培養(yǎng)基(在專利申請(qǐng)WO 98/46772中 詳細(xì)描述過(guò))中,于30°C和250 rpm,使用軌道振蕩器在搖瓶中對(duì)它們進(jìn) 行培養(yǎng)。在培養(yǎng)開始之后96小時(shí)的時(shí)間點(diǎn),取上清液樣品。通過(guò)離心來(lái) 澄清上清液樣品,通過(guò)經(jīng)0.45 過(guò)濾器(目錄號(hào)4614, Pali, Ann Arbor, Mo USA)進(jìn)行超濾將其與殘余的細(xì)胞殘骸分開。在實(shí)施例9.3中針對(duì)阿馬 多里活性對(duì)上清液樣品進(jìn)行分析。
9.3阿馬多里酶試驗(yàn)
通過(guò)酶試驗(yàn)來(lái)分析來(lái)自9.2的上清液樣品。阿馬多里酶活性試驗(yàn)如 Monnier VM et al, J Biol Chem. 1997 Feb 7;272(6):3437- 43所述。用果糖基 丙胺(Monnier教授友情提供)作為底物,通過(guò)與鄰苯二胺的顯色反應(yīng)測(cè) 量得到的葡糖醛酮的釋放來(lái)監(jiān)測(cè)酶活性。該試驗(yàn)基于對(duì)120分鐘反應(yīng)時(shí)間 之后形成的葡糖醛酮的終點(diǎn)測(cè)量。反應(yīng)混合物含有20 mM磷酸鈉(pH 7.4) 、 10 mM OPD、 10 mM果糖基丙胺以及來(lái)自實(shí)施例9.3的上清液樣
品,最終體積為1 ml。在37。C溫育2小時(shí)后,測(cè)量320 nm處的吸光度。 結(jié)果展示于圖15中。結(jié)果清楚地顯示,較之用阿馬多里酶-SRL基因轉(zhuǎn)化 過(guò)的對(duì)照菌株CBS 513.88,來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用 A "/gw宿主在培養(yǎng)基中能產(chǎn)生至少三倍多的阿馬多里酶-SRL。
實(shí)施例10過(guò)氧化物酶體代謝產(chǎn)物的增加的排出 進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以證實(shí)來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A 宿主較之陰性對(duì)照菌株CBS513.88展示出增加的對(duì)過(guò)氧化物酶體代 謝產(chǎn)物的分泌。
按照實(shí)施例6所述,培養(yǎng)來(lái)自實(shí)施例5.2的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通 用A w'ger宿主和CBS513.88。在培養(yǎng)開始之后138小時(shí)的時(shí)間點(diǎn),取上 清液樣品。通過(guò)離心來(lái)澄清上清液樣品,通過(guò)經(jīng)0.45 pm過(guò)濾器(目錄號(hào) 4614,Pall, Ann Arbor, Mo USA)進(jìn)行超濾將其與殘余的細(xì)胞殘骸分開。隨 后,通過(guò)1HNMR,針對(duì)過(guò)氧化物酶體的beta氧化代謝產(chǎn)物(David E Metzler, Biochemistry, 2nd edition, Academic Press 2001) X寸豐羊品進(jìn)行分析。
用4 N HC1將2 ml上清液酸化至pH 2,用4 ml氯仿進(jìn)行萃取。從澄 清的氯仿層(離心之后)萃取回3 ml進(jìn)入2 ml水(用0.01 N NaOH調(diào)節(jié) 為pH7.5)中。離心之后,取1.5ml水層,凍干,重新溶解進(jìn)0.5 ml D20
(気zK , Cambridge Isotope Laboratories )。 在 600 MHZ , 在Bruker Avance 600核磁疑上測(cè)量1H NMR。通過(guò)二維NMR測(cè)量法,將展示出濃 度以2的因子增加的化合物鑒定為帶支鏈脂肪酸異丁酸(a)、異戊酸
(b)和a-甲基丁酸(c)。已知它們來(lái)自對(duì)帶支鏈異異脂肪酸和ante-異脂 肪酸的beta氧化(分別針對(duì)a+b禾n c的)(David E Metzler, Biochemistry, 2nd edition, Academic Press 2001 )。
對(duì)這些酸之間的定量比較通過(guò)將它們?cè)贜MR譜中的特征性甲基共振
(對(duì)a來(lái)說(shuō),1.114 ppm,對(duì)b來(lái)說(shuō),0.928,對(duì)c來(lái)說(shuō),0.885禾B 1.089 ppm)加以整合來(lái)進(jìn)行。對(duì)所有三種代謝產(chǎn)物而言,對(duì)于來(lái)自實(shí)施例5.2 的能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A m'gw宿主,測(cè)量到了較之陰性對(duì)照菌株 CBS 513.88而言的以2為因子的增加。結(jié)果清楚顯示,來(lái)自實(shí)施例5.2的
能分泌細(xì)胞內(nèi)化合物的通用A 宿主可被用作為宿主菌株,用于對(duì)感
興趣的過(guò)氧化物酶體代謝產(chǎn)物進(jìn)行細(xì)胞外生產(chǎn)。
本文描述和要求保護(hù)的本發(fā)明不限于本文公開的具體實(shí)施方式
的范 圍,因?yàn)檫@些實(shí)施方式僅用于闡述本發(fā)明的若干方面。任何等同的實(shí)施方 式都在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上,除了本文所展示和描述的之外,本領(lǐng) 域技術(shù)人員可從前述說(shuō)明書明顯獲得對(duì)本發(fā)明的多種改變。此類改變也在 所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。在有沖突的情況下,以本文的公開內(nèi)容為準(zhǔn),包 括定義。
權(quán)利要求
1.一種真核細(xì)胞,其含有過(guò)氧化物酶體,所述過(guò)氧化物酶體能與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)融合。
2. 如權(quán)利要求1所述的真核細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞分泌途徑所涉及的 細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)選自質(zhì)膜、Golgi復(fù)合體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)構(gòu)成的組。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的真核細(xì)胞,其中,融合多肽或其一部分在 所述過(guò)氧化物酶體的表面暴露。
4. 如權(quán)利要求3所述的真核細(xì)胞,其中,所述融合多肽的一部分暴 露,其通常在供體膜結(jié)構(gòu)的表面暴露。
5. 如權(quán)利要求3或4所述的真核細(xì)胞,其中,所述融合多肽或其一部 分與過(guò)氧化物酶體膜多肽或其一部分融合或可操作地相連。
6. 如權(quán)利要求5所述的真核細(xì)胞,其中,所述過(guò)氧化物酶體膜多肽的 所述部分包含至少一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域。
7. 如權(quán)利要求3至7中任意一項(xiàng)所述的真核細(xì)胞,其中,所述融合多 肽為v-SNARE。
8. 如權(quán)利要求7所述的真核細(xì)胞,其中,所述v-SNARE是Sncl、 Sn2 或其同源體,優(yōu)選地,SncA。
9. 如權(quán)利要求5或6所述的真核細(xì)胞,其中,所述過(guò)氧化物酶體膜多 肽是Pmp22或其同源體。
10. 如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的真核細(xì)胞,其中,補(bǔ)充性融合多 肽或其一部分在受體膜結(jié)構(gòu)上過(guò)量表達(dá)。
11. 如權(quán)利要求IO所述的真核細(xì)胞,其中,所述受體膜結(jié)構(gòu)是質(zhì)膜。
12. 如權(quán)利要求10或11所述的真核細(xì)胞,其中,所述補(bǔ)充性融合多 肽是t-SNARE。
13. 如權(quán)利要求3至12中任意一項(xiàng)所述的真核細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞 胞含下述核酸構(gòu)建體,所述核酸構(gòu)建體包含編碼與過(guò)氧化物酶體膜多肽或 其一部分可操作地相連的融合多肽或其一部分的核酸序列。
14. 如權(quán)利要求13所述的真核細(xì)胞,其中,所述核酸構(gòu)建體包含編碼具有根據(jù)SEQIDNO: 24的氨基酸序列的嵌合多肽的核酸序列,優(yōu)選地, 根據(jù)SEQIDNO: 23的核酸序列。
15. 如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的真核細(xì)胞,其中,所述細(xì)胞還包 含下述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體,所述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包含編碼感興 趣的多肽的DNA序列,所述DNA序列與能促進(jìn)所述感興趣的多肽的過(guò)氧 化物酶體定位的DNA序列可操作地相連。
16. 如權(quán)利要求15所述的真核細(xì)胞,其中,所述能促進(jìn)過(guò)氧化物酶體 定位的信號(hào)是選自如下物質(zhì)構(gòu)成的組的氨基酸序列(a) —種三肽,其 中,N至C末端方向上的第一個(gè)氨基酸是A、 C、 H、 K、 N、 P、 S或T, N至C末端方向上的第二個(gè)氨基酸是H、 K、 N、 Q、 R或S, N至C末端 方向上的第三個(gè)氨基酸是A、 F、 I、 L、 M或V,以及(b)定義為如下所 示的肽(R/K)(L/V/I/Q)XX(L/V/I/H/Q)(L/S/G/A/K)X(H/Q)(L/A/F),其中 X可以是任何氨基酸。
17. 如前述任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的真核細(xì)胞,其中,所述真核細(xì)胞 是哺乳動(dòng)物、昆蟲、植物、真菌或藻類細(xì)胞。
18. 如權(quán)利要求17所述的真核細(xì)胞,其中,所述真菌細(xì)胞是酵母細(xì) 胞,優(yōu)選地,K/acto或》S. c度由'ae。
19. 如權(quán)利要求17所述的真核細(xì)胞,其中,所述真菌細(xì)胞是有絲真菌 細(xì)胞,優(yōu)選地,屬于爿印erg/〃Ms、尸ew/c/肌w附或7Wc/ ocferma屬的種的細(xì) 胞。
20. 如權(quán)利要求19所述的真核細(xì)胞,其中,所述有絲真菌細(xì)胞屬于或<formula>formula see original document page 3</formula>附的禾中。
21. —種方法,用于在根據(jù)權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)所述的真核細(xì) 胞中生產(chǎn)感興趣的多肽,其中,所述感興趣的多肽存在于所述細(xì)胞的過(guò)氧 化物酶體中,所述方法包括在給定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述真核細(xì)胞,以及可 選地,純化所述多肽。
22. 如權(quán)利要求21所述的方法,其中,所述培養(yǎng)基包含CAPP的激活 劑,優(yōu)選地,神經(jīng)酰胺,和/或能誘導(dǎo)過(guò)氧化物酶體增殖的物質(zhì),例如油酸 鹽/酯。
23. 如權(quán)利要求21或22所述的方法,其中,生產(chǎn)至少0.01 g/1的所述 感興趣的多肽。
24. —種方法,用于在根據(jù)權(quán)利要求1至20中任意一項(xiàng)所述的真核細(xì) 胞中生產(chǎn)代謝產(chǎn)物,其中,所述代謝產(chǎn)物存在于所述細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體 中,所述方法包括在給定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述真核細(xì)胞,以及可選地,純 化所述代謝產(chǎn)物。
25. 如權(quán)利要求24所述的方法,用于生產(chǎn)代謝產(chǎn)物,其中,所述真核 細(xì)胞還包含下述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體,所述核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體包含 編碼所述代謝產(chǎn)物合成過(guò)程所涉及的酶的DNA序列,所述DNA序列與能 促進(jìn)所述酶的過(guò)氧化物酶體定位的DNA序列可操作地相連。
26. 如權(quán)利要求21至25中任意一項(xiàng)所述的方法,用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)感興趣的化合物,其中,培養(yǎng)所述真核細(xì)胞,將適當(dāng)量的氧進(jìn)料至培 養(yǎng)物以保持所述培養(yǎng)物處于氧受限的條件下。
27. 如權(quán)利要求21至26中任意一項(xiàng)所述的方法,用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)感興趣的化合物,其中,在所述培養(yǎng)過(guò)程中改變所述培養(yǎng)基的pH。
28. 如權(quán)利要求21至27中任意一項(xiàng)所述的方法,用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)感興趣的化合物,其中,所述培養(yǎng)過(guò)程的總持續(xù)時(shí)間為192小時(shí),其 由以下階段構(gòu)成* 72小時(shí)的第一個(gè)階段,其中,所述培養(yǎng)基的pH為6.0,* 24小時(shí)的過(guò)渡階段,其中,所述培養(yǎng)基的pH以線性過(guò)程從6.0變 為6.7,以及* 96小時(shí)的第二個(gè)階段,其中,所述培養(yǎng)基的pH為6.7。
29. 如權(quán)利要求21至28中任意一項(xiàng)所述的方法,用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)感興趣的化合物,在所述培養(yǎng)過(guò)程中改變所述培養(yǎng)基的溫度。
30. 如權(quán)利要求21至29中任意一項(xiàng)所述的方法,用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)感興趣的化合物,其中,所述培養(yǎng)基的溫度在所述培養(yǎng)過(guò)程中從30°C 變?yōu)?6°C。
31. 如權(quán)利要求26至30中任意一項(xiàng)所述的方法,用于在真核細(xì)胞中 生產(chǎn)感興趣的化合物,其中,所述真核細(xì)胞是有絲真菌,優(yōu)選地,屬于爿^e/^'〃Ms的禾中,更優(yōu)選地,爿5perg/〃iw w〖ger菌株。
32. 展示出v-SNARE功能的多肽,其選自下述組,所述組由(a)具 有根據(jù)SEQIDNO: 13的氨基酸序列的多肽;(b)具有展示出與SEQID NO: 13的氨基酸序列至少85%同一性,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少 93%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少95%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少97%,進(jìn)一步更優(yōu)選至 少98%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少99%的氨基酸序列的多肽;以及(c) (a)或(b)定義的多肽的功能片段構(gòu)成。
33. 選自下述組的過(guò)氧化物酶體膜多肽,所述組由(a)具有根據(jù)SEQ ID NO: 16的氨基酸序列的多肽;(b)具有展示出與SEQ ID NO: 16的 氨基酸序列至少85%同一性,優(yōu)選至少90%,更優(yōu)選至少93%,進(jìn)一步更 優(yōu)選至少95%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少97%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少98%,進(jìn)一步 更優(yōu)選至少99%的氨基酸序列的多肽;以及(c) (a)或(b)定義的多 肽的功能片段構(gòu)成。
34. 嵌合多肽,其適合用于實(shí)現(xiàn)下述氨基酸序列在過(guò)氧化物酶體表面 的暴露,所述氨基酸序列對(duì)應(yīng)于在供體膜結(jié)構(gòu)表面暴露的融合多肽的氨基 酸序列,其中,所述嵌合多肽包含與過(guò)氧化物酶體膜多肽或其一部分可操 作地相連的融合多肽或其一部分。
35. 嵌合多肽,其包含(a) 在分泌途徑供體膜胞質(zhì)表面暴露的融合多肽的結(jié)構(gòu)域;以及(b) 靶向過(guò)氧化物酶體膜并與過(guò)氧化物酶體膜相連的結(jié)構(gòu)域;其中,結(jié)構(gòu)域(a)和(b)可操作地相連,并且其中,所述嵌合多肽 在包含過(guò)氧化物酶體的宿主細(xì)胞中的表達(dá)賦予所述過(guò)氧化物酶體與所述宿 主細(xì)胞分泌途徑受體膜融合的能力。
36. 如權(quán)利要求35所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(a)和(b)存在 于單個(gè)的開放讀碼框中,其中,結(jié)構(gòu)域(a)較之結(jié)構(gòu)域(b)與所述多肽 的N末端更為接近。
37. 如權(quán)利要求35或36所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(a)來(lái)自v-SNARE。
38. 如權(quán)利要求37所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(a)包含來(lái)自v-SNARE的從N末端跨越至v-SNARE的第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域或包括該第一個(gè) 跨膜結(jié)構(gòu)域在內(nèi)的片段。
39. 如權(quán)利要求38所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(a)中的片段包含 對(duì)應(yīng)于SEQIDNO: 13的l至95位的序列或展示出與SEQIDNO: 13具 有至少50%,優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選至少80%, 最優(yōu)選至少90%同一性程度的同源序列。
40. 如權(quán)利要求38或39所述的嵌合多肽,其中,所述片段跨越v-SNARE的N末端直到第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的氨基酸的至少70%,優(yōu)選 80%,更優(yōu)選90%,最優(yōu)選95%。
41. 如權(quán)利要求35-40中任意一項(xiàng)所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域 (b)包含跨膜結(jié)構(gòu)域和將所述結(jié)構(gòu)域靶向至所述過(guò)氧化物酶體膜的序列。
42. 如權(quán)利要求41所述的嵌合多肽,其中,最接近結(jié)構(gòu)域(a)的跨膜 結(jié)構(gòu)域N末端朝向胞質(zhì)定向。
43. 如權(quán)利要求42或43所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(b)包含來(lái) 自過(guò)氧化物酶體膜蛋白的序列。
44. 如權(quán)利要求43所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(b)來(lái)自下述過(guò) 氧化物酶體膜多肽,所述多肽的N末端天然暴露給所述過(guò)氧化物酶體的胞 質(zhì)側(cè),或者所述多肽具有至少一個(gè)其N末端朝向胞質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域。
45. 如權(quán)利要求44所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(b)來(lái)自下述過(guò) 氧化物酶體膜多肽,所述多肽的N末端已被從最N末端的跨膜結(jié)構(gòu)域去除 了多達(dá)至少IO個(gè)氨基酸,所述最N末端的跨膜結(jié)構(gòu)域具有朝向胞質(zhì)的其 N末端。
46. 如權(quán)利要求45所述的嵌合多肽,其中,結(jié)構(gòu)域(b)來(lái)自下述過(guò) 氧化物酶體膜多肽,所述過(guò)氧化物酶體膜多肽選自Pmp22、 Pmp34、 Pmp47、 Pmp70、 Pex3、 Pexll、 Pexl4禾卩Pex22。
47. 如權(quán)利要求46所述的嵌合蛋白,其中,結(jié)構(gòu)域(b)是對(duì)應(yīng)于 SEQIDNO: 16的2至224位的序列,優(yōu)選地,對(duì)應(yīng)于3或4或5或6或 7或8或9或10或ll或12或13或14或15或16或17或18或19或20 或21或22或23或24或25或26或27或28或29或30或31或32或33 或34或35或36或37或38或39或40位至224位,或展示出與SEQ ID NO: 16具有至少50%,優(yōu)選至少60%,更優(yōu)選至少70%,進(jìn)一步更優(yōu)選 至少80%,最優(yōu)選至少90%同一性程度的同源序列。
48. 如權(quán)利要求47所述的嵌合蛋白,其具有根據(jù)SEQ ID NO: 24的氨 基酸序列。
49. 編碼如權(quán)利要求35-48中任意一項(xiàng)定義的嵌合蛋白的核苷酸序列。
50. 表達(dá)構(gòu)建體,其包含權(quán)利要求49定義的核苷酸序列,所述核苷酸 序列與啟動(dòng)子可操作地連接。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有過(guò)氧化物酶體的真核細(xì)胞,所述過(guò)氧化物酶體能與細(xì)胞分泌途徑所涉及的細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)融合。以這種方式,真核細(xì)胞能將過(guò)氧化物酶體的內(nèi)含物釋放到細(xì)胞外。本發(fā)明還涉及一種方法,用于在所述真核細(xì)胞中生產(chǎn)感興趣的化合物,其中,感興趣的化合物存在于細(xì)胞的過(guò)氧化物酶體中。所述感興趣的化合物將通過(guò)促進(jìn)過(guò)氧化物酶體定位的信號(hào)在過(guò)氧化物酶體中積累。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是有絲真菌細(xì)胞。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101180396SQ200580035370
公開日2008年5月14日 申請(qǐng)日期2005年10月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月15日
發(fā)明者帕那吉帝斯·薩拉帝諾普羅斯, 彼得呂斯·約翰尼斯·費(fèi)瑞德瑞克·漢福特·頓, 科尼利斯·瑪麗亞·雅各布斯·沙吉, 約翰尼斯·翰德里克·溫德·德 申請(qǐng)人:帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司
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