專利名稱：一種進行液體的生物學改變的裝置和方法
技術領域：
和背景本發(fā)明涉及進行液體的生物學改變的裝置和方法，更具體而言涉及輔助或替代正常進行液體的這種改變的器官的裝置和方法。
體內的許多器官如肝臟改變液體如血液。肝臟是特別復雜的器官，因為它既充當濾器又充當活性代謝單位。作為濾器，肝臟從血液中去除毒性物質。另外，肝臟行使許多生物化學功能，如將氨解毒為尿素、膽紅素代謝、糖原貯存、脂合成、藥物代謝、清蛋白分泌和凝血因子分泌。因此，肝臟在體內具有許多重要的功能，這使其成為必需的。如果肝臟衰竭，身體將不能繼續(xù)工作。
肝臟衰竭有許多原因，包括接觸毒性物質、肝炎和遺傳缺陷(Kasai等人，人造器官(Artif.Organs)，18348-54，1994)。當前，70％的急性肝臟衰竭患者由于未得到治療而死亡(Kasai等人，人造器官，18348-54，1994)。另外，10-30％的患者在等待供者的肝臟器官時死亡(LePage等人，美國危急護理雜志(Am.J.Crit.Care)，3224-7，1994；Sussman等人，人造器官，18390-6，1994；以及Uchino和Matsushita，Asaio J.4074-7；1994)。
一種能在肝臟衰竭期間暫時行使肝臟功能的護理生命支持裝置叫做體外肝臟輔助裝置(ELAD)。這種裝置的發(fā)展和商品化由于許多原因明顯地具有巨大的好處(Fox等人，美國胃腸病學雜志(Am.J.Gastroenterol)，881876-81，1993)。在美國一個ELAD每年使約2000名暴發(fā)性肝臟衰竭(FH)患者受益(Hoofnagle等人，肝臟病學(Hepatology)，21240-52；1995)。它也能作為肝臟移植的橋梁用于等待供者器官的患者。
可運行數(shù)周的ELAD另外能使患者自己的肝臟恢復正常功能。因為在損傷的肝臟中不可能每個肝細胞都被破壞，兩至三周的適當?shù)母闻K支持能使存活的肝細胞種群恢復損傷的肝臟。在致死性肝臟疾病的動物模型中種群恢復肝臟只需要少于十二個的肝細胞(Sandgren等人，細胞(Cell)，66245-56，1991)。90-95％肝臟壞死的患者應能夠恢復足夠的功能，僅在支持幾天后即獨立存活(Sussman等人，人造器官，18390-6，1994)。
在提供這種ELAD的嘗試中，發(fā)展了幾個純粹機械的、非生物學的血液處理裝置。以最基本的形式，這些裝置的目的是選擇性地去除毒素，并且通過具有相對小的孔徑的膜加入養(yǎng)分。HemocleanseTM發(fā)展了一種最先進的這類非生物學裝置，并在最近得到FDA的批準。在使用HemocleanseTM裝置的隨機化的、控制的臨床試驗中，代謝物的去除是有限的，對血氨水平?jīng)]有顯著影響(Hughes等人，國際人造器官雜志(Int.J.Artif.Org.)，17657-662，1994)。顯然，肝臟功能是非常復雜的，現(xiàn)在不可能用一個單獨的機械或化學裝置替代它。
當前可獲得的其它ELAD使用生物材料作為起點。例如，一種最常臨床試驗的ELAD使用轉化的人無限增殖細胞系作為肝細胞樣細胞的來源(Sussman等人，人造器官，18390-6，1994)。該裝置的最初試驗在“未經(jīng)批準的醫(yī)學裝置的緊急應用”或“研究性裝置豁免”下進行。未測定效能，但除可用藥物治療處理的凝血之外未觀察到嚴重不利的副作用。盡管由于無限增殖的人細胞系提供可增加的細胞來源因而其應用是便利的，但仍存在為什么它不是理想的兩個主要原因。首先，在臨床實踐中使用無限增殖細胞系有明顯的安全性和調控上的顧慮。其次，特別是在工業(yè)規(guī)模放大后，預期無限增殖細胞不能保留原代肝細胞的所有正常生理特征(Sussman等人，人造器官，1890-6，1994)。
獲得肝細胞來源用于ELAD的第二種普通方法是從完整肝臟中分離肝臟細胞或組織。在以前的嘗試中，通常使用酶如破壞肝臟正常微結構的膠原酶使肝臟的細胞分離。某些嘗試曾使用肝臟切片，但沒有為了最佳組織維持所必需的適當?shù)谋砻娣e體積比而設計這些切片的形狀(Lie等人，實驗醫(yī)學研究(Res Exp Med(Berl))185483-94，1985)。
當前的一個局限性是培養(yǎng)哺乳動物肝細胞的現(xiàn)有方法提供使細胞聚集為組織的條件的能力，這種組織模擬完整生物體中實際組織的立體三維形式。由于相似的原因，常規(guī)的組織培養(yǎng)方法限制了培養(yǎng)的組織表達高度功能性特化或分化狀態(tài)的能力，這種能力被認為對于哺乳動物細胞的分化和用于研究及藥物目的的特化生物活性分子的分泌是關鍵的。不象微生物，高等生物如哺乳動物的細胞自身形成高度有序的多細胞組織。盡管這種自我裝配的確切機制還不清楚，但在迄今研究的情況中，已發(fā)現(xiàn)細胞發(fā)育為組織依賴于細胞與細胞之間或與其它錨定底物之間的細胞的定向和/或某種物質如激素的存在或不存在?？傊?，至今用于器官輔助裝置的常規(guī)培養(yǎng)方法不能在體外實現(xiàn)細胞的適當功能的同時維持關鍵的細胞/細胞/底物相互作用和適當?shù)奈h(huán)境，以允許構建體內器官組織結構和功能的出色模型。
在肝臟中，與血管結構相符的不同細胞群和基質成分的獨特相鄰產(chǎn)生精巧的生態(tài)系統(tǒng)。因此肝細胞的標準細胞培養(yǎng)物不可能行使甚至最少的肝功能。如前所述，高等生物如哺乳動物的細胞自身形成高度有序的多細胞組織。細胞與非細胞底物(基質)間物理接觸的一個實例是上皮細胞與其基底層間的物理接觸。一個細胞與另一個細胞間功能性接觸的實例包括細胞間的電或化學通訊。例如，心肌細胞通過電脈沖與其它心肌細胞通訊。另外，許多細胞通過化學信息如激素與其它細胞通訊，激素可局部擴散(旁分泌信號傳導和自分泌信號傳導)，或由血管系統(tǒng)運送至更遠的位置(內分泌信號傳導)。細胞間旁分泌信號傳導的實例是消化道的多種細胞(稱為腸內分泌細胞)如分泌促生長素抑制素的幽門D細胞所產(chǎn)生的信息，促生長素抑制素隨后抑制附近的幽門胃泌素(G)細胞釋放胃泌素。
對于器官的組織外植塊在如不含外源血清或生長因子的基本培養(yǎng)基中的維持，微結構是非常重要的，因為在這種基本培養(yǎng)基中微器官內特異細胞相互作用產(chǎn)生的旁分泌和自分泌因子能維持肝組織。
美國專利申請系列號08/482,364中描述了這種微器官培養(yǎng)物的制備，在此引入作為參考。在微器官培養(yǎng)物的制備中，從肝臟分離組成外植塊的細胞群，所采用的方式保持了一個細胞對另一個細胞的天然親和力，例如，保持了對器官自身中存在的不同細胞的親和力。例如，在皮膚微器官培養(yǎng)物中，表皮的角質細胞與基質保持結合，并保持正常的組織結構包括毛囊和腺體。這種基本結構對于例如包含一種上皮成分的所有器官是共同的。而且，這種結合有利于細胞間的通訊。這在分化的細胞中是特別重要的，其中誘導被定義為一個組織或細胞(誘導的)與另一個(應答的)組織或細胞間的相互作用，因此應答的細胞經(jīng)歷分化方向的改變。此外，誘導性相互作用發(fā)生于胚胎和成熟細胞中，并能用來建立和維持形態(tài)發(fā)生模式以及誘導分化(Gurdon等人，細胞，68185-199，1992)。
此外，根據(jù)美國專利申請系列號08/482,364制備的微器官培養(yǎng)物，甚至在培養(yǎng)延長的一段時間后仍保持正常的肝結構。因為這些培養(yǎng)物能在受控制的和相同的條件下維持，并仍非常類似于體內組織，所以它們在體外提供功能性肝細胞的獨特連續(xù)來源。
不幸地，現(xiàn)有技術中的器官輔助裝置或現(xiàn)有技術中的相關裝置沒有一個使用微器官培養(yǎng)物來進行液體的生物學改變。
因此，本領域中明確地需要一種進行液體的生物學改變的裝置和方法，特別是用于輔助或替代患者的衰竭器官，該裝置能行使此器官的功能，其包括一種微器官培養(yǎng)物。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明，提供了一種進行液體的生物學改變的裝置，該裝置包括(a)一種腔，其具有一個用于液體進入的入口和一個用于液體流出的出口；和(b)進行液體的生物學改變的器官的微器官培養(yǎng)物集合，集合中的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內維持器官單位(例如肝臟的腺泡單位)的體內器官結構，微器官培養(yǎng)物集合位于腔內，并且微器官培養(yǎng)物集合可與至少一部分流經(jīng)該腔的液體接觸。
當在此使用時，術語“MC”指微器官培養(yǎng)物。
優(yōu)選地，該器官是肝臟。同樣優(yōu)選地，微器官培養(yǎng)物集合包含來源于該器官的細胞，以便保持細胞之間的細胞間接觸。最優(yōu)選地，每個微器官培養(yǎng)物集合特征在于至少約2.6mm-1的Aleph。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方案，基本用生物相容的多聚體片層封裝微器官培養(yǎng)物，該片層基本位于腔內。優(yōu)選地，該片層具有約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。同樣優(yōu)選地，以基本平行的方向將多個片層加入腔內，以使液體在片層之間自由流動。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方案，提供了一種進行患者液體的生物學改變的裝置，包括(a)一種腔，其具有一個用于液體進入的入口和一個用于液體流出的出口；(b)進行液體的生物學改變的微器官培養(yǎng)物集合，集合中的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內維持器官單位的體內器官結構，微器官培養(yǎng)物集合位于腔內，并且微器官培養(yǎng)物集合與至少一部分流經(jīng)該腔的液體接觸；(c)具有第一個和第二個末端的第一種管，第一個末端用于連接患者以接受患者的液體，第二個末端連接入口；以及(d)具有第一個和第二個末端的第二種管，第一個末端用于連接出口，第二個末端用于連接患者，以便在生物學改變后使液體返回患者。
根據(jù)本發(fā)明的另一種實施方案，提供了一種對來自患者的液體進行生物學改變的方法，該方法包括用患者的液體灌注包含微器官培養(yǎng)物集合的腔的步驟，以便微器官培養(yǎng)物集合進行液體的生物學改變，其中集合的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并且具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持器官單位的體內器官結構。
根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方案，提供了一種制備連續(xù)平面器官的方法。該方法包括步驟(a)獲得器官的單個微器官培養(yǎng)物集合，以使集合中的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并且具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持器官單位的體內器官結構；和(b)將來源于該器官的細胞懸液加入(例如涂層于)微器官培養(yǎng)物中，在微器官培養(yǎng)物集合存在下共培養(yǎng)細胞懸液，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和懸液中細胞的混合物形成連續(xù)平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的一種優(yōu)選實施方案，在肝微器官培養(yǎng)物集合存在下通過培養(yǎng)肝細胞形成的連續(xù)肝平面器官內提供了肝微器官培養(yǎng)物集合，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和肝細胞的混合物形成連續(xù)肝平面器官。
根據(jù)本發(fā)明的又一種實施方案，提供了一種制備連續(xù)肝平面器官的方法。該方法包括步驟(a)獲得單個肝微器官培養(yǎng)物集合，以使集合的每一單個微器官培養(yǎng)物包含肝細胞并且具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持腺泡單位的體內肝結構；和(b)將肝細胞懸液加入(例如涂層于)微器官培養(yǎng)物中，在肝微器官培養(yǎng)物集合的存在下共同培養(yǎng)細胞懸液，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和肝細胞的混合物形成連續(xù)平面肝器官。
本發(fā)明的其它特征在以下描述。
圖4是示范性操作線路的示意圖，其用于應用

圖1或圖3所示生物反應器的裝置；圖5顯示在幾種微器官培養(yǎng)物中細胞增殖的測定；圖6顯示微器官培養(yǎng)物中小鼠肝細胞產(chǎn)生的清蛋白的測定；圖7顯示在小鼠肝微器官培養(yǎng)物中由氨向尿素的轉化；圖8顯示人微器官肝培養(yǎng)物在很長一段時間內將大量氨轉化為尿素；圖9顯示人肝微器官培養(yǎng)物有代謝活性；圖10顯示凍藏的微器官肝培養(yǎng)物在37℃生長時仍具功能性；圖11顯示凍藏的人微器官肝培養(yǎng)物在37℃生長時仍具功能性；圖12顯示當被封裝于藻酸鹽片層時小鼠肝微器官培養(yǎng)物仍有代謝活性；圖13顯示在100％胎牛血清中培養(yǎng)時小鼠肝微器官培養(yǎng)物仍具功能性；圖14A和圖14B顯示當被封裝于藻酸鹽片層、冷凍、然后解凍時，大鼠肝微器官培養(yǎng)物仍有代謝活性；圖15顯示正常大鼠能安全地連接于本發(fā)明裝置的一個實例；以及圖16顯示小鼠肝微器官培養(yǎng)物的最佳厚度是450微米。
本發(fā)明的裝置包括來源于希望增強功能的組織的微器官培養(yǎng)物。待生物學改變的液體如全血或血漿進入本發(fā)明的裝置，并與微器官培養(yǎng)物相聯(lián)系。于是微器官培養(yǎng)物生物學改變該液體。例如，使用肝微器官培養(yǎng)物能增強解毒和肝臟的其它生物學活性。
此外，顯然根據(jù)微器官培養(yǎng)物的組織來源，能增強其它器官的功能。例如，使用胰微器官培養(yǎng)物能增強用于胰島素或胰高血糖素產(chǎn)生的旁分泌功能。類似地，能使用前葉垂體腺微器官培養(yǎng)物增加調節(jié)甲狀腺、生殖腺、腎上腺皮質和其它內分泌器官適當功能的激素的產(chǎn)量，后葉垂體腺微器官培養(yǎng)物能用來增加具有抗利尿和催產(chǎn)作用的激素的產(chǎn)量。
如以下進一步詳述的，這些微器官培養(yǎng)物的應用的一個顯著特征是保持了原始器官細胞微結構。本發(fā)明的裝置部分地基于這一發(fā)現(xiàn)，即在指定的環(huán)境下，器官外植塊的不同組織層如間充質和上皮層中細胞的生長可以被激活，以在培養(yǎng)中增殖、分化和發(fā)揮作用。在此使用時，術語“外植塊”指從器官中取出的組織。
此外，外植塊自身具有細胞-細胞和細胞-基質的相互作用足以支持細胞的穩(wěn)態(tài)，由此使器官的微結構和功能維持延長的一段時間。在此使用時，術語“穩(wěn)態(tài)”被定義為細胞增殖和細胞損失間的平衡。
細胞穩(wěn)態(tài)的保障維持了例如在來源器官中存在的細胞-細胞和細胞-基質的自然相互作用。因此，細胞與細胞之間或與其它錨定底物之間的細胞定向，以及調節(jié)物質如激素的存在與否，允許來源器官的生物化學和生物學活性適當?shù)乇３?。而且，能在培養(yǎng)中將微器官培養(yǎng)物維持相對長的一段時間，優(yōu)選地至少約24小時，而沒有明顯的壞死，盡管一般至少培養(yǎng)48天或更長。
盡管能使用本發(fā)明的裝置來輔助或替代生物學改變液體的任何器官的功能，但為了說明的目的以下討論完全集中于肝臟。用于微器官培養(yǎng)物的外植塊的來源為了在本發(fā)明的裝置中使用而能從中分離肝微器官培養(yǎng)物的動物的實例包括人和其它靈長類、豬如完全或部分近交的豬(例如小型豬和轉基因豬)、嚙齒類動物，等等。在一種優(yōu)選的實施方案中，肝組織的來源可以是同種異體的肝組織，如不適合移植但仍包含活肝細胞的人肝臟小葉。
在另一種優(yōu)選的實施方案中，一種更可靠的來源是異種的來源，包括但不限于母牛、山羊或優(yōu)選地豬的肝臟。盡管長期接觸異種抗原將導致免疫學反應，但在短期內在最初的臨床經(jīng)驗中免疫應答不是問題，因為患者的血細胞被阻止與肝微器官培養(yǎng)物接觸。生長介質存在大量的組織培養(yǎng)基用于培養(yǎng)來源于動物的細胞。其中一些是復雜的一些是簡單的。盡管預期肝微器官培養(yǎng)物可在復雜培養(yǎng)基中生長，但美國專利申請系列號08/482,364顯示，在簡單培養(yǎng)基如Dulbecco基本必需培養(yǎng)基中能維持培養(yǎng)物。此外，盡管培養(yǎng)物可生長于含血清或其它生物提取物如垂體提取物的培養(yǎng)基中，但美國專利申請系列號08/482,364顯示，血清和其它任何生物提取物都不是必需的。而且，在不含血清的情況下能將器官培養(yǎng)物維持延長的一段時間。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在體外培養(yǎng)物的維持過程中培養(yǎng)基中不包含生長因子。
關于在基本培養(yǎng)基中生長的觀點是重要的。目前，用于哺乳動物細胞延長生長的大多數(shù)培養(yǎng)基或系統(tǒng)摻入了不確定的蛋白質，或者使用飼養(yǎng)細胞提供維持這種生長所必需的蛋白質。因為這種不確定蛋白質的存在可干擾患者肝微器官培養(yǎng)物的預期最終用途，通常希望在使不確定蛋白質的存在減至最小的條件下培養(yǎng)外植塊。
在此使用時，術語“基本培養(yǎng)基”指化學確定的培養(yǎng)基，其僅包含細胞在培養(yǎng)中生存和增殖所需的養(yǎng)分。一般地，基本培養(yǎng)基不含生物提取物，例如生長因子、血清、垂體提取物或其它支持細胞群在培養(yǎng)中生存和增殖所不需要的物質。例如，基本培養(yǎng)基通常包含至少一種氨基酸、至少一種維生素、至少一種鹽、至少一種抗生素、至少一種指示劑如用來確定氫離子濃度的酚紅、葡萄糖和至少一種抗生素，以及細胞的生存和增殖必需的其它多種成分?；九囵B(yǎng)基是不含血清的。多種基本培養(yǎng)基可從Gibco BRL，Gaithersburg，MD購得，作為基本必需培養(yǎng)基。
然而，盡管生長因子和調節(jié)因子不必加入培養(yǎng)基中，但這些因子的加入或其它特化細胞的接種可用來增強、改變或調節(jié)培養(yǎng)物中的增殖和細胞成熟。多種生長因子可影響培養(yǎng)中細胞的生長和活性，如胰島素、生長激素、生長調節(jié)素、集落刺激因子、促紅細胞生成素、表皮生長因子、肝紅細胞生成因子(hepatopoietin)和肝細胞生長因子。調節(jié)增殖和/或分化的其它因子包括前列腺素、白細胞介素和天然發(fā)生的負生長因子、成纖維細胞生長因子和轉化生長因子-β家族的成員。培養(yǎng)容器微器官培養(yǎng)物可在任何合適的培養(yǎng)容器中維持，并可在37℃5％CO2中維持?？烧駬u培養(yǎng)物以改善通氣。
至于其中優(yōu)選地具有微器官培養(yǎng)物的培養(yǎng)容器，應當指出在一種優(yōu)選的實施方案中，這種培養(yǎng)容器通常可以是任何材料和/或任何形狀的。可使用許多不同的材料制成該容器，包括但不限于尼龍(聚酰胺)、滌綸(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE，特氟隆)、thermanox(TPX)、硝化纖維素、棉花、聚羥基乙酸(PGA)、腸線縫合線、纖維素、明膠、葡聚糖，等等。任何這些材料可編織成孔網(wǎng)。
當培養(yǎng)物要長期維持或凍藏時，不可降解的材料如尼龍、滌綸、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、特氟隆、棉花等等是優(yōu)選的。根據(jù)本發(fā)明能使用的一種便利的尼龍網(wǎng)是Nitex，它是具有210mm平均孔徑和90mm平均尼龍纖維直徑的一種尼龍濾網(wǎng)(#3-210/36，Tetko，Inc.，紐約)。外植塊的尺寸除分離保持原始組織的細胞-細胞、細胞-基體和細胞-基質結構的外植塊以外，外植塊的尺寸對于其中細胞的生存力是重要的，例如，當打算將微器官培養(yǎng)物維持延長的一段時間如7-21天或更長時。
因此，選擇組織外植塊的尺寸，以使適當?shù)酿B(yǎng)分和氣體如氧氣擴散至三維微器官中的每一個細胞，以及使細胞廢物擴散至外植塊外，以便將由于微器官中廢物的局部化引起的細胞毒性和伴隨死亡減至最小。因此，根據(jù)無特化輸運結構或合成底物存在下每個細胞可接近的最低水平的需要來確定外植塊的尺寸。
如美國專利申請系列號08/482,364所述，已發(fā)現(xiàn)如果表面積體積比指數(shù)降至一定范圍內則能維持這種可接近性。
所選表面積體積比指數(shù)的范圍使細胞通過有些類似于單層細胞的擴散方式而接近養(yǎng)分并進入廢物處理途徑。如果表面積體積比指數(shù)，在此稱為“Aleph或Aleph指數(shù)”，至少約2.6mm-1，那么能達到并保持這種可接近性的水平。在確定表面積體積比指數(shù)中忽視第三種尺寸，因為在第三種尺寸的變化引起體積和表面積的比例變化。然而，當確定Aleph時，a和x應當被定義為組織切片的兩個最小尺寸。
在此使用時，“Aleph”指通過公式1/x+1/a得出的表面積體積比指數(shù)，其中x＝組織厚度，a＝組織寬度，單位為mm。在優(yōu)選的實施方案中，外植塊的Aleph在約2.7mm-1到約25mm-1的范圍內，更優(yōu)選地在約2.7mm-1到約15mm-1的范圍內，甚至更優(yōu)選地在約2.7mm-1到約10mm-1的范圍內。
表1提供了Aleph的實例，其中，例如厚度(x)為0.1mm寬度(a)為1mm的組織具有11mm-1的Aleph指數(shù)。
表1表面積體積比指數(shù)“Aleph”的不同值，為a(寬度)和x(厚度)的函數(shù)，單位為mm-1
因此，例如，在單個微器官培養(yǎng)物或外植塊中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此保持體內結構，而同時確保沒有細胞距離氣體和養(yǎng)分來源大于約225微米。
一個世紀以來，認為肝臟的基本結構和功能單位是小葉，它是一個直徑約700微米、長約2mm的多邊形的單位。五十年代以來，公認一種稱為腺泡的更小單位是肝臟中的基本結構和功能單位。腺泡是大概卵球形的實質細胞的集群，排列于終動脈、小靜脈和從門管區(qū)橫向分支的膽管周圍。在腺泡的任一端是被稱為終端肝小靜脈的血管(在舊的小葉命名法中該血管被稱為中央靜脈)。腺泡是約300-450微米較小尺寸的小單位，它包括兩個相鄰的經(jīng)典小葉的部分。應當指出，自從該發(fā)現(xiàn)以來，已知腺泡是肝臟的最小結構和功能單位，并且也確定了任何肝細胞與氣體和養(yǎng)分來源的最大距離。因此，用腺泡說明的肝臟的微結構確定，肝臟內沒有細胞距離養(yǎng)分來源超過約150-225微米。實際上，對于任何其它身體器官這都是事實，因為顯然約150-225微米確定了氣體和養(yǎng)分有效擴散的上限。在任何組織學教科書中均能發(fā)現(xiàn)腺泡結構和功能的其它描述性數(shù)據(jù)。例如，《組織學教科書》，Bloom和Fawcett編，第12版，Chatman和Hall，紐約-倫敦，1994，652-656頁。
不受任何特殊理論所限，三維培養(yǎng)系統(tǒng)提供的許多因素可助于其成功。
首先，外植塊尺寸的適當選擇，例如通過以上Aleph計算的應用，提供適當?shù)谋砻娣e體積比，使養(yǎng)分向外植塊所有細胞充分擴散，以及細胞廢物向外植塊中所有細胞外充分擴散。
其次，由于外植塊的三維度，多種細胞持續(xù)活躍地生長，這與單層培養(yǎng)的細胞相反，后者生長至匯合，顯示接觸抑制，且停止生長和分裂。外植塊通過復制細胞的生長和調節(jié)因子的作用可部分地擔負刺激培養(yǎng)中的細胞增殖及調節(jié)其分化，例如，甚至對于總體積為靜態(tài)的微器官培養(yǎng)物也如此。
第三，外植塊的三維基質保留了細胞元件的空間分布，這十分近似于在體內對應器官中所發(fā)現(xiàn)的。
第四，細胞-細胞和細胞-基質的相互作用可允許有助于細胞成熟的局部微環(huán)境的建立。已認識到分化的細胞表型的維持不僅需要生長/分化因子，而且需要適當?shù)募毎嗷プ饔?。本發(fā)明有效地模擬了組織微環(huán)境。肝微器官培養(yǎng)物的生物學活性相信本發(fā)明的裝置包含的肝微器官培養(yǎng)物能行使所有種類的“肝臟特異性”生物學功能。示范性功能包括進行氨和尿素代謝以及清蛋白產(chǎn)生的能力。對將用于肝臟輔助裝置(LAD)的細胞，這些肝臟特異性生物學功能是特別重要的。
為了以相對短期的LADS形式支持患者，如暴發(fā)性肝衰竭(FHF)患者、等待肝臟移植的患者或無功能的肝臟移植患者，上述肝臟特異的生物學功能相信是十分重要的。然而，盡管以上所述，仍可以有同等重要的或更加重要的其它功能。用其它方法(如通過葡萄糖的供應和葡萄糖水平的監(jiān)測)可提供其它功能性不足，或者其不需要密切關注(例如，膽汁酸或膽色素產(chǎn)生的結合，或藥物代謝活性)。
“足以支持”患有肝衰竭或機能不全患者的肝臟特異生物學活性的水平，將產(chǎn)生正常或接近正常水平的血清蛋白質、氨向尿素的轉化、凝固因子、氨基酸和其它肝臟中產(chǎn)生的或肝臟代謝的代謝物。
可生物化學測定或根據(jù)患者臨床狀況的好轉確定這些改善。這些不同的分子、代謝和臨床參數(shù)和產(chǎn)物以及其濃度或水平的生理學和病理學范圍在本領域中眾所周知，并在例如Zakim和Boyer的《肝臟病學肝臟疾病教科書》，W.B.Saunders Company；Harcourt，Brace，JovanovichInc.，費城、倫敦、多倫多、蒙特利爾、悉尼、東京(1990)中有描述，該書在此引入作為參考。微器官培養(yǎng)物的貯存優(yōu)選地制備用作本發(fā)明一部分的微器官培養(yǎng)物，例如在10％DMSO(二甲亞砜)和20％血清存在下通過將其逐漸冷凍而凍藏，并貯存于-160℃待用。在一種優(yōu)選實施方案中，將肝微培養(yǎng)物封裝于一種半透性基質如藻酸鹽的片層內，如圖2B所示，并例如在標準培養(yǎng)基如含10％DMSO和20％血清的Ham’s F12存在下通過將其逐漸冷凍而凍藏。然后將冷凍的片層貯存于-160℃。作為一個實例，能將包含微器官培養(yǎng)物的平面片層插入無菌的合成塑料袋中，該塑料袋的所有側面密封并且具有非常類似于該片層的尺寸。該塑料袋包括一個在袋的一端的塑料管狀入口和一個在相對端的塑料管狀出口。然后用標準培養(yǎng)基如含10％DMSO和20％血清的Ham’s F12灌注這種包含具有微器官培養(yǎng)物的平面片層的塑料袋，逐漸冷凍并貯存于-160℃。
當需要時，解凍冷凍的片層或冷凍的微器官培養(yǎng)物，并裝配入本發(fā)明的裝置，優(yōu)選地就地裝配，然后與系統(tǒng)連接。微器官培養(yǎng)物形成連續(xù)人造平面器官的應用本發(fā)明基于如下發(fā)現(xiàn)，如果保持器官的微結構，并選擇條件(如其尺寸)以確保所有細胞都在與氣體和養(yǎng)分來源的合理距離內，那么細胞能離體地起作用，與其在體內類似。
在以下實施例部分(見實施例13)描述的實驗顯示肝MC培養(yǎng)物的行為為厚度的函數(shù)。根據(jù)當將外源基因轉導入離體培養(yǎng)物時，由肝MC培養(yǎng)物表達此外源基因的能力確定功能。清楚地顯示450微米厚的MC得出最佳結果。培養(yǎng)物的組織學檢查證實了該數(shù)據(jù)。
因此，能把根據(jù)本發(fā)明的MC片層看作平面器官，每個片層基本代表一個解旋的器官。當從體內取出時，正常成熟器官缺乏系統(tǒng)支持和為器官中每個細胞提供充分的養(yǎng)分和氣體交換所需的循環(huán)。另一方面，在此描述的離體的平面器官確保(i)保持器官結構，盡管是平面構型，而同時(ii)在器官中沒有細胞距離養(yǎng)分來源超過約150-225微米。
根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案，制備一種連續(xù)的平面器官，并用來實行根據(jù)本發(fā)明的方法和裝置。
如下制備連續(xù)的平面器官。將如述制備的單個微器官集合用作飼養(yǎng)或底物層，以支持或維持來源于相同器官但在懸液中生長的細胞。因此飼養(yǎng)層給懸液細胞提供了一個表面，細胞可粘附于其上、增殖和行使其生物學功能。來源于粘附細胞的細胞與單個MC的集合一起，最后產(chǎn)生平面器官的粘附的和連續(xù)的片層。例如，通過協(xié)同培養(yǎng)單個肝微器官培養(yǎng)物集合和肝細胞，制備一種連續(xù)的肝平面器官。
因此，連續(xù)的平面器官構成了一種重新改造的粘附器官，其中保持基本的器官微結構。由于其平面尺寸，根據(jù)本發(fā)明的連續(xù)平面器官確保沒有細胞距離養(yǎng)分來源超過約150-225微米，由此消除了對循環(huán)的需要。
應當理解，使用單層細胞作為飼養(yǎng)或底物層，使其它細胞型能在其上生長不是一個新的概念，在過去曾廣泛和成功地使用過。
然而，使用微器官集合作為飼養(yǎng)或底物層或者尤其是作為一種“飼養(yǎng)器官”卻是一個新的概念，并且具有幾個優(yōu)點，主要是給在飼養(yǎng)器官上生長的細胞提供非常復雜的底物的事實，這種底物更類似于當細胞在體內增殖時所遇到的底物。
參照以下給出的實施例、闡述和附圖能更好地理解本發(fā)明的裝置和方法。現(xiàn)在參看附圖，圖1A-1C顯示一種適合本發(fā)明的裝置使用的生物反應器。生物反應器2是一個腔4，具有一個灌注入口6和一個灌注出口24，其中間限定了液體的流動路徑。液體通過入口6流入，如箭頭8所示，并通過出口24流出，如箭頭10所示。優(yōu)選地，至少一個、優(yōu)選地多個灌注室18被置于腔4的流動路徑中。每個室18由至少一個、優(yōu)選地多個多孔膜19所圍成。每個室18包括至少一個、優(yōu)選地集合的微器官培養(yǎng)物20，如肝微器官培養(yǎng)物。有一個或多個托架16附著于固定夾板14，或在腔4的液體路徑中支持灌注室18的其它固定裝置。優(yōu)選地，導流板22在腔4內導流。腔4內的液流方向以箭頭指示。同樣優(yōu)選地，包括一種返回器21，用于將微器官培養(yǎng)物集合20的至少一種產(chǎn)物返回患者(未顯示)。
在圖1A-1C所述的實施方案中，每個灌注室18的流動路徑和壓力基本上是相同的。因此，簡單界面擴散原則如濃度梯度、布朗運動等等限制了通過多孔膜19向室18中的擴散。當這種擴散不足時，可增加液體向腔4中的液體滲透速度，例如通過應用跨過室18的壓差。例如，圖1D顯示圖1A的生物反應器2，它被改裝以在腔4中提供兩個獨立的流動路徑，“液體”室4A和“濾液”室4B，僅通過灌注室18并因此通過微器官培養(yǎng)物集合20發(fā)生液體聯(lián)系。在說明的生物反應器2中，例如，通過如使用閥門限制液體出口24A的下游流速，能形成跨過灌注室18的壓差。正壓差(P液體-P濾液)將形成從液體室4A向濾液室4B的液體流，允許液體通過腔4以與微器官培養(yǎng)物集合20聯(lián)系，并因而被其生物學改變。通常，優(yōu)選地在返回患者之前將濾液室4B的輸出物24B與液體室4A的輸出物24A再混合。
構成微器官灌注室的合適的基質材料包括聚酰胺，包括尼龍如聚己內酰胺和聚己二酸亞己基酯、聚酰胺-二酰亞胺、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯包括聚甲基丙烯酸甲酯和聚乙基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。對于某些應用，合適的基質材料也可以是不同類型的角蛋白(絲、毛、發(fā))、膠原蛋白、聚烯烴如聚乙烯、聚丙烯和聚丁烯、聚酯如聚對苯二甲酸乙二醇酯和聚己二酸亞乙基酯、聚尿烷如聚尿烷酯和聚尿烷醚、玻璃包括玻璃纖維、不銹鋼、聚硅氧烷、有機聚硅氧烷和石墨及其組合。角蛋白基質是角蛋白、含角蛋白或類似角蛋白的。其它材料在本領域中已知。見，例如，美國專利5,344,454；美國專利號4,883,666；美國專利號4,892,538和5,106,627；美國專利號4,391,909；和美國專利號4,353,888。
優(yōu)選地，將微器官培養(yǎng)物集合20封裝于半透性的基質中形成一個隔離的腔，例如可以由本領域已知的多種半透性材料構成。薄膜等允許在微器官培養(yǎng)物與所處理的液體之間的養(yǎng)分和必需的小分子包括氧、葡萄糖和激素通過，但不允許免疫系統(tǒng)的介質通過，如白細胞和如需要時的抗體。在此使用時，術語“顆?！卑ǚ肿?、細胞和蛋白質。
更具體而言，當微器官培養(yǎng)物來源于另一個動物種時(即，相對于被治療的患者是異種的)，孔徑必須足以阻止來自宿主的炎癥細胞和分子免疫原性因子兩者通過它進入植入物的組織腔。在本說明書中使用時，“分子免疫原性因子”指如抗體和補體的分子。足以阻止人的炎癥細胞和分子免疫原性因子兩者通過的孔徑處于約0.015微米的范圍內。當微器官培養(yǎng)物來源于相同動物種但具有不同遺傳組成時(即同種異體)，孔徑通常必須足以僅阻止來自宿主的炎癥細胞通過它進入植入物細胞腔。足以阻止人的炎癥細胞通過的孔徑處于低于約0.8微米的范圍內。在大多數(shù)實施方案中，希望在免疫隔離室中提供的微器官培養(yǎng)物，例如選擇孔徑和膜厚度以提供約40,000Da到約250,000Da的分子量(MW)截斷值，以使能通過的分子具有低于約40,000Da到約250,000Da的分子量。
作為這種免疫隔離室的一種說明性實施方案，圖2A顯示至少一個、優(yōu)選地集合的微器官培養(yǎng)物26，其被置于由兩個相對的半透膜片層30所構成的免疫隔離室28中。微器官培養(yǎng)物集合26置于兩個膜片層30之間，或如下所示直接封裝于膜片層中(圖2B)。例如通過螺絲34將相對的夾板32固定在一起，以便每個夾板32內面凸起的脊36能在微器官培養(yǎng)物26周圍形成基本上不透液體的密封。另外和優(yōu)選地，代替夾板32，能用膠、熱、超聲粘接或本領域適合的其它密封技術密封膜片層30的邊緣。
更優(yōu)選地，將微器官培養(yǎng)物集合26直接封裝于規(guī)定尺寸的平面藻酸鹽片層中。這種構造顯示于圖2B中，具有多個平面藻酸鹽片層38。作為一個實例，可制備具有約40cm的第一種尺寸、約60cm的第二種尺寸和約350微米的第三種尺寸的平面藻酸鹽片層。每個這種片層包含約1-2×1010個細胞。因此，為了獲得約相同數(shù)量的細胞作為人肝臟，例如，需要的片層數(shù)量將在約4個到約10個片層的范圍內。
顯然，患者生物反應器的液體/濾液實施方案的其它構型能用于多種灌注室系統(tǒng)。也可用上述片層構型之一的方式使用這些構型。
例如，圖3A-3C說明了一種基本柱體40，它能與其它柱體40串接，形成含多個灌注腔的生物反應器(未顯示)。在示范性實施方案中，微器官培養(yǎng)物集合20被置于灌注室18中。通過將灌注室18夾于兩個基板42和44之間，其間至少配備一個隔板46，在灌注室18的相對的兩側可形成一個液體室48和一個濾液室50。在操作中，通過至少一個、優(yōu)選地多個液體入口52進入的液體，能流經(jīng)液體室48，從而沿灌注室18的通透性表面流動，經(jīng)至少一個、優(yōu)選地多個液體管54流出液體室48，液體管54是穿過灌注室18的橫向連接的孔。液體管54提供的液體然后經(jīng)至少一個、優(yōu)選地多個液體出口56流出柱體40，出口56不允許與濾液室50中的任何液體接觸。進入至少一個、優(yōu)選地多個濾液入口58的濾出液，以相似的方式直接與至少一個、優(yōu)選地多個濾液管60聯(lián)系，而不接觸液體室48中的任何其它液體。
然而，濾液管60向濾液室50中釋放濾出液，在其中直接接觸灌注室18的另一個(通透性)表面。透析液經(jīng)至少一個、優(yōu)選地多個濾液出口62流出室50。從本描述中明顯地看出，從液體室48流出的液體也能透過灌注室18，被微器官培養(yǎng)物集合20作用，并作為代謝衍生物返回濾液室50。
實際上，通過將兩個相鄰柱體的第二個旋轉180°能串聯(lián)排列柱體40，以使第二個柱體40的液體入口52和濾液入口58分別對準第一個柱體40的液體出口56和濾液出口63。重復該裝配能提供許多順序連接的柱體40，其實際上具有中間排列有多個微器官培養(yǎng)物的一個液體腔和一個濾液腔。通過加蓋，或用其它方式密封該系列的第一個柱體40的濾液入口，濾液室提供的液體流是從灌注腔流出的處理后液體的產(chǎn)物。
圖4進一步說明了圖1-3的上述生物反應器2在本發(fā)明的裝置中的應用。為了便于理解，按照應用肝微器官培養(yǎng)物的肝臟輔助裝置(ELAD)描述了該優(yōu)選實施方案。然而，如上所述，用本發(fā)明的裝置能進行其它的器官增強。
圖4顯示本發(fā)明的裝置的另一種實施方案，其優(yōu)選地包括圖1D、2B或3A-3C的生物反應器2。該實施方案僅準備作為實例，而不意在限制。也列出了該實施方案的使用方法。
顯示了動脈管64，通過它從患者的雙腔靜脈導管(或類似物)輸送血液。優(yōu)選地例如通過蠕動泵66控制流入ELAD系統(tǒng)的血流。優(yōu)選地用注射器68將一種抗凝劑如肝素等輸送至動脈管64中。也可向血液中加入尿素、凝血因子、其它肝細胞衍生的蛋白質或轉化產(chǎn)物等等。血液進入動脈滴注腔70，在其中監(jiān)測前置柱壓力(PI)。血液流出滴注腔70進入生物反應器2，以致用患者的血液灌注生物反應器2(它是包含微器官培養(yǎng)物集合的腔)。如果希望，可在滴注腔70和生物反應器2之間放置一個濾器或類似物(例如，可商品獲得的1mm濾網(wǎng))以防止裝置堵塞。生物反應器2具有一個入口管狀裝置72，從動脈管64流出的含或不含抗凝劑的血液被輸送至該裝置中。生物反應器2，特別是其中包含的微器官培養(yǎng)物集合處理該血液。
在通過生物反應器2的過程中，優(yōu)選地大小為約10,000Da到約250,000Da、最優(yōu)選地為約60,000Da到約80,000Da的分子能穿過免疫隔離膜擴散，并接觸微器官培養(yǎng)物。血液中沒有細胞物質直接與微器官培養(yǎng)物接觸。低于分子量截斷值的小分子和蛋白質流回至血液中。
生物反應器2將處理的(例如改變的或解毒的)血液輸送至可以是血氣檢測器一部分的靜脈滴注腔74中，并輸送至靜脈管76。另外，該系統(tǒng)能監(jiān)測滴注腔74中的壓力，這是靜脈壓(Pv)。因此，能計算出柱壓力(PI-Pv)。
通過微器官培養(yǎng)物，優(yōu)選地同時使用通過生物反應器2的血流超濾血漿。泵78吸引血漿穿過微器官培養(yǎng)物腔，進入濾液腔，在此處集中，并進入濾液滴注腔80，然后通過細胞過濾單元82(例如0.45μm的濾膜)，裝備該單元是確保細胞或大分子不進入患者。測定該腔80中的壓力(P2)，于是提供了膜壓力(PI-P2)。濾器82檢測并包含細胞從微器官培養(yǎng)物的任何滲漏。然后將濾出液與從生物反應器2流出的血流再混合。
優(yōu)選地，濾器82的出口連接于第一個三通(如Y形或T形的)管狀裝置，該裝置在一端具有一個充氧器管線裝置，用于連接充氧器以對液體充氧。
因此圖4說明的過濾流程提供跨過微器官培養(yǎng)物室的正壓差，以便增加血清通過微器官培養(yǎng)物的流量。優(yōu)選地，在動脈管64和注射器68之間也能串聯(lián)放置一個壓力傳感器84。壓力傳感器84可監(jiān)測從患者抽至生物反應器2的動脈血的壓力。另外和優(yōu)選地，在將肝素或類似的抗凝劑抽至動脈管線中后，壓力傳感器可監(jiān)測與生物反應器2相連接的入口管處的壓力。其它壓力傳感器優(yōu)選地包含于出口靜脈管線中，以測定液體向患者的返回，以及為了增加的安全，包含于不同位置的再循環(huán)管狀裝置中。因此，壓力傳感器用于監(jiān)測患者的進入和返回壓力，以及通過該裝置的壓力，以檢測其堵塞或破裂的問題。此外，濾器82每一側的壓力傳感器能監(jiān)測細胞或大顆粒從該裝置中的任何釋放。
一個完整的管狀裝置86包括以上實施方案中使用的所有管。優(yōu)選地，管狀裝置86由模壓的聚氯乙烯(PVC)管或此等級的一類物質制成，這類物質一般用于在血液透析、治療性血漿交換和心臟直視手術中使用的系統(tǒng)中。優(yōu)選地設計該管的泵部分，使其以約100ml/分鐘到500ml/分鐘、優(yōu)選地250ml/分鐘的血流速度工作約120小時，而不發(fā)生導致患者失血的故障。在管狀裝置86中使用的模制部分可包含硬質PVC、Lexan HP樹脂或其它類似的材料，目的是在符合上述應用的環(huán)境中顯示與PVC管的長期高強度的結合。用于管狀裝置86的滅菌方法包括氧化乙烯以完成管狀裝置86的滅菌。
如圖4所進一步顯示的，控制系統(tǒng)88控制整個系統(tǒng)的工作。在單個綜合系統(tǒng)中控制系統(tǒng)88可包括許多組件，或作為分開的組件。其中一個組件操作雙泵系統(tǒng)。這種控制組件可以商業(yè)化獲得(例如，可從CGH，Inc.，Lakewood，Colo.商業(yè)化獲得的BSM-22雙泵血液安全組件)。
控制系統(tǒng)88的另一種組件是輔助監(jiān)控單元(AMU)，它用來監(jiān)控壓力、接受操作者通過鍵盤的警報設置等等，隨后，如果達到一定的警報限度則通報操作者。
控制系統(tǒng)88的第三種組件是靜脈壓力監(jiān)控器(VPM)，它在治療期間監(jiān)控體外循環(huán)中返回患者的靜脈壓力。也可從CGH，Inc.商業(yè)化獲得的VPM可包括兩種警報。第一種警報具有一個限制窗口，以便當壓力值比選擇的值低40mmHg或更低或高70mmHg或更高時觸發(fā)警報。第二種警報是所謂的“越界警報”，當壓力值高于+450mmHg或低于+10mmHg時觸發(fā)警報。當警報觸發(fā)時，血液泵停止。VPM包括壓力傳感元件和一個電源。
該說明性裝置的管及其連接優(yōu)選地能承受3個大氣壓(2,300mmHg)的正壓力(外部腔)和0.75個大氣壓的負壓力，而沒有災變性的故障或在管狀裝置的內部和外部之間發(fā)生滲漏。這種設計起因于以下考慮，用于體外處理的標準泵和管在約0.7個大氣壓的負壓力和1.5個大氣壓的正壓力時達到其運輸極限。制定的壓力限度與這些限度一起，提供了一個合理的安全限度。
血流速度優(yōu)選地是在0-500ml/分鐘范圍內可調節(jié)的。其基本原理有多種。非常確實的是，以150ml/分鐘的血流連續(xù)血液透析是有效的。這與約1000ml/分鐘的靜止正常腎流速形成對比。人們相信肝臟比腎臟具有更低的儲備容量，因此最大流速是約1500ml/分鐘的靜止正常肝血流速度的較高分數(shù)。同樣非常確實的是，使用標準血液進入裝置如單腔或雙腔鎖骨下導管，則這種體外流速是可達到的。使用更高的血流速度，可增強治療效果。
再循環(huán)管狀裝置的再循環(huán)流速如抽氣流速為約5ml/分鐘到約120ml/分鐘，優(yōu)選地為約20ml/分鐘到約80ml/分鐘。也可根據(jù)血流的分數(shù)限定流量。例如，抽出流速為血流速度的約5％到約30％，優(yōu)選地為血流速度的約10％到約20％。優(yōu)選地給操作者提供一張與血流速度相關的再循環(huán)流速表，或者另外預想能將其優(yōu)選地存儲于控制器88的存儲器中。
另外或備擇地，并且優(yōu)選地，如果血液是被生物學改變的液體，可在過濾線路中使用血紅蛋白檢測器，以指示穿過微器官培養(yǎng)物腔的任何滲漏。血紅蛋白檢測器也能用來指示細胞或顆粒從毛細管外間隙的任何丟失，因為這些細胞散射光線從而相應地減少了監(jiān)控器的輸出。進而，血紅蛋白監(jiān)控器能與不同的警報線路相結合，以指示需要操作者的注意。能將壓力傳感器加入類似的警報系統(tǒng)中，或具有在此專用的警報系統(tǒng)中。血紅蛋白檢測器和壓力傳感器兩者都能與控制器相結合，并能用來關閉閉環(huán)系統(tǒng)的一個或多個泵。光學血紅蛋白檢測器優(yōu)選地能檢測60份血漿中1份壓緊紅細胞的再循環(huán)線路中的血液丟失。這種檢測方法優(yōu)選地用于在檢測器中產(chǎn)生完整紅細胞的兩種丟失，或用于指定數(shù)量的完全溶血的細胞。
此外，能更改系統(tǒng)構造以包含動靜脈瘺管，其中去除了連接于動脈管64的泵。進而，通過在生物反應器2的任一端加入一個儲存器并在返回線路上包括一個血液泵，能使該構造適宜于以單針入口的方式使用。
為建立本發(fā)明的裝置的操作，施行普通醫(yī)學程序，認為設備裝配在普通技術人員掌握的知識之中。簡要地，負責設備裝配的操作者將管狀裝置86裝載于控制單元88上，將泵的集管適當?shù)卮┤氡?6和78中(如果存在)，把壓力監(jiān)控管附加于壓力監(jiān)控器74上(如果存在)，將警報裝置設置成對引發(fā)模式適當?shù)闹担靡?guī)定的肝素劑量充滿抗凝劑(例如肝素)注射器68，把肝素注射器68附加于管72上，將肝素注射器68固定于控制單元88，并向動脈管64中加入引發(fā)溶液。引發(fā)溶液可以是正常鹽水。
對于血液通路，負責該程序的醫(yī)生將建立適當?shù)某绦虿⑦M行血液進入。該血液通路必須能輸送達到希望的對患者的治療輸入所需的上述血流速度。必須如上所述用肝素或類似物適當?shù)乜鼓幚碓撗和贰１景l(fā)明的裝置的工作原理依賴于某些運載血液的物質向容納微器官培養(yǎng)物的灌注室的無阻礙通過，以及溶質從微器官培養(yǎng)物向血液的相似通過。要避免由于不適當?shù)目鼓鴵p害此運載能力。在循環(huán)開始時要特別關注的是準備過程中通路內由淤積引起的凝固。
進行的第一個連接是患者進入線路如動脈管64。以足夠確保返回管76和返回線路連接中不含殘存空氣的速度將引發(fā)溶液通入動脈管64中。當完成該連接時，停止引發(fā)溶液的流動，以便醫(yī)生能操縱該管，確保在連接處沒有不能接受的量的空氣。然后連接動脈管64。
起動泵66以開始該程序。松開靜脈管76，注射肝素。檢查壓力監(jiān)控室水平，必要時加以調節(jié)。繼續(xù)此程序，操作者和服務人員應定期檢查該裝置的滲漏、旁路管狀裝置的血細胞積累證據(jù)和監(jiān)控室的適當水平。如果監(jiān)控室水平從正常水平變化超過0.5cm，應當重新調節(jié)，正常水平是滴注室的50％或更高。特定監(jiān)控室水平的頻繁調節(jié)應使操作者充分檢查該管的細微滲漏。應對注射器68監(jiān)測剩余抗凝劑的量，并在適當時替換。
當該過程終止并且裝置停止時，依次停止泵66和肝素注射，并夾住動脈管64。使用液體或空氣置換使系統(tǒng)中剩余的血液返回每個方案中的患者，并夾住靜脈管76。在這一點上，具有附加的管狀裝置86和治療裝置的控制單元88能從使用它的重病監(jiān)護室或區(qū)域中移除。
以上描述集中于本發(fā)明的裝置和方法。以下是本發(fā)明的裝置和方法能使用的微器官培養(yǎng)物成功制備的實施例，以及本發(fā)明的裝置體內應用的一個實施例。這些實施例僅準備用于說明目的，并不是限制。
如以下說明性實施例所述，已分離了來源于肝臟的微器官培養(yǎng)物，并在培養(yǎng)中生長可達48天。然而，使培養(yǎng)物維持超過48天的延長的一段時間在本發(fā)明的范圍之內。
實施例1肝微器官培養(yǎng)物的制備如下制備小鼠的肝微器官培養(yǎng)物。取出器官，用剪子剪切為適當?shù)?mm寬、3mm長，并用組織刀或其它合適的剪切工具將其切成300微米厚的切片。將這些微器官置于24孔微量培養(yǎng)板中，在400ml不含胎牛血清(FCS)的Dulbeco基本必需培養(yǎng)基(DMEM)中，于5％CO237℃、12轉/分恒定振搖下放置1-8天。每孔生長20個微外植塊。
實施例2肝微器官培養(yǎng)物中細胞增殖的測定如實施例1所述，剖開來源于幾個小鼠器官的微器官培養(yǎng)物，使用微器官細胞培養(yǎng)技術，在不含血清的情況下將其在濕潤的培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)。使用標準方案測定含氚胸苷的摻入以評估細胞分裂(Kobayashi等人，1994，生物材料科學雜志，多聚體版(J Biomater Sci Polym Ed)6(4)325-42)。結果顯示DNA合成發(fā)生于培養(yǎng)期(圖5)。另外，如實施例1所述使小鼠肝微器官培養(yǎng)物生長14天，用溴脫氧尿苷脈沖標記4小時，固定，用抗溴脫氧尿苷的熒光抗體染色，以標記有絲分裂的核(Sigma Chemical)。在這些培養(yǎng)物中觀察到正在活躍地合成DNA的核(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例3在微器官培養(yǎng)物中小鼠肝細胞產(chǎn)生清蛋白如實施例1所述在微器官培養(yǎng)物中生長的原代小鼠肝細胞，保持功能性至少4周，正如通過清蛋白的分泌和尿素的產(chǎn)生而測定的(見圖6)。用Eliza和比色法(試劑盒631號，Sigma Chem.Co.St.LouisMo)檢測，微器官培養(yǎng)物中的小鼠肝細胞產(chǎn)生相對大量的清蛋白。以下所示的直方圖顯示了每小時每106個細胞分泌的清蛋白的量。注意到特別是與另外兩種常規(guī)培養(yǎng)條件相比，甚至在培養(yǎng)一個月后，清蛋白的產(chǎn)生率仍然很高。A是取自Nyberg等人(細胞移植(Cell Transplant)2441-52，1993)的數(shù)據(jù)，B數(shù)據(jù)來自Shatford等人(外科研究雜志(J.Surg.Res.)，53549-57，1992)。
實施例4在小鼠肝微器官培養(yǎng)物中氨向尿素的轉化如實施例1所述解剖小鼠肝臟，使用微器官細胞培養(yǎng)技術在不含血清或外源生長因子的情況下體外培養(yǎng)。使用尿素-氮試劑盒640-A號(Sigma Chem.Co.St.Louis Mo)用標準比色法測定上清液中的尿素和氨。圖7顯示的數(shù)據(jù)說明，甚至在培養(yǎng)48天后微器官培養(yǎng)物中的小鼠肝細胞仍產(chǎn)生大量的尿素。與此相對比，Dixit等人(移植(Transplantation)，55616-22，1993)曾報道對于體外微封裝的大鼠肝細胞，培養(yǎng)1天后尿素合成的值為14.6mg/小時/百萬個細胞，培養(yǎng)10天后值為11.7mg/小時/百萬個細胞。
實施例5人微器官肝培養(yǎng)物長期地將大量氨轉化為尿素如下制備人肝微器官培養(yǎng)物。由肝臟楔形活組織檢查獲得人肝臟切片，將這些切片剪切為適當?shù)?mm寬、3mm長，并用組織刀切成300微米厚的切片。將這些切片置于24孔微量培養(yǎng)板中，在0.4ml含或不含胎牛血清(FCS)的DMEM中，于5.5％CO237℃、12轉/分恒定振搖下。每孔生長20個微外植塊。每兩天更換培養(yǎng)基，并取出樣品進行尿素和氨的測定。圖8以主觀性單位描述了分泌至培養(yǎng)基中的尿素的量，但代表10-25微克尿素/小時/百萬個細胞的值。
人每天產(chǎn)生11.2克尿素，而在人的肝臟中有至少1011個肝細胞。因此人的肝細胞在體內產(chǎn)生約5mg/小時/百萬個細胞的尿素?？梢钥闯?，如果在體外以不高于正常體內環(huán)境中的肝細胞的速度，則人肝微器官培養(yǎng)物以大約相同的速度將氨轉化為尿素。
實施例6
人肝微器官培養(yǎng)物有代謝活性如實施例5所述制備人肝微器官培養(yǎng)物。結果顯示于圖9中。
實施例7凍藏的微器官肝培養(yǎng)物在37℃生長時仍具功能性如實施例1所述制備微器官小鼠肝培養(yǎng)物，在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉移至液氮中。幾天后，快速解凍微器官培養(yǎng)物，沖洗，并在10％FCS中生長數(shù)天。如下圖所示，根據(jù)其甚至在培養(yǎng)幾天后將氨轉化為尿素的能力確定，微器官培養(yǎng)物中的肝細胞仍存活并具功能性。獲得的值顯示于圖10中，并可與從相似條件下生長的新鮮微器官培養(yǎng)物所獲得的值相比。
實施例8凍藏的人微器官肝培養(yǎng)物在37℃生長時仍具功能性如實施例5所述制備微器官人肝培養(yǎng)物，在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉移至液氮中。幾天后，快速解凍微器官培養(yǎng)物，沖洗，并在10％FCS中生長幾天。如圖11所示，根據(jù)其甚至在培養(yǎng)幾天后將氨轉化為尿素的能力確定，微器官培養(yǎng)物中的肝細胞仍存活并具功能性。獲得的值可與從相似條件下生長的新鮮微器官培養(yǎng)物所獲得的值相比。
實施例9當封裝于藻酸鹽片層中時，肝微器官培養(yǎng)物仍有代謝活性如實施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)物。其中一半封裝于由藻酸鹽制成的薄片層中(約400微米厚)。將封裝于藻酸鹽片層中的微器官培養(yǎng)物在DMEM加10％FCS中離體地培養(yǎng)12天。每兩天更換培養(yǎng)基，并取出樣品進行尿素和氨的測定。圖12以主觀性單位描述了分泌至培養(yǎng)基中的尿素的量，代表10-15微克尿素/小時/百萬個細胞的值。左側為單獨的微器官培養(yǎng)物，右側為藻酸鹽中的微器官培養(yǎng)物。
實施例10當在100％胎牛血清中培養(yǎng)時，小鼠肝微器官培養(yǎng)物仍具功能性如實施例1所述制備微器官小鼠肝培養(yǎng)物。一半培養(yǎng)物在DMEM和10％FCS中生長(左)，另一半在100％FCS(右)中生長5天。每兩天更換培養(yǎng)基，并取出樣品進行氨和尿素的測定。結果顯示于圖13中，并且是特別相關的，因為它們確定肝微器官培養(yǎng)物不僅在體外條件下而且在100％血清存在下很好地工作，100％血清更接近于全血，在體外通常對細胞有毒性。
實施例11當封裝于平面藻酸鹽片層中、冷凍并貯存于-80℃、并進而在37℃培養(yǎng)時，大鼠肝微器官培養(yǎng)物仍具功能性如實施例1所述制備小鼠肝微器官培養(yǎng)物。其中一半封裝于由藻酸鹽制成的薄片層中(約400微米厚)。將微器官培養(yǎng)物和封裝于藻酸鹽片層中的微器官培養(yǎng)物在10％DMSO中逐漸冷凍至-80℃，然后轉移至液氮中。幾天后，快速解凍微器官培養(yǎng)物，沖洗，并在10％FCS中生長數(shù)天。每兩天更換培養(yǎng)基，并取出樣品進行尿素和氨的測定。圖14以主觀性單位描述了分泌至培養(yǎng)基中的尿素(a)和清蛋白(b)的量。
實施例12正常的體內大鼠能與包含藻酸鹽片層中肝微器官培養(yǎng)物的生物反應器安全地連接通過右頸動脈和左頸靜脈的導管插入將大鼠與上述樣機相連接。血液灌注數(shù)小時。監(jiān)測幾個生物化學參數(shù)，當然包括整個動物的健康。將微器官培養(yǎng)物處理的血液重新引入由蠕動泵輔助的頸靜脈中(見圖15，為清楚所見而略述的有大鼠的照片)。使動物在實驗期間保持存活，大約8小時。
實施例13
肝微器官培養(yǎng)物的最佳厚度的確定如下制備小鼠的肝微器官培養(yǎng)物。取出器官，用剪子剪切為適當?shù)?mm寬、3mm長，并用組織刀或其它合適的剪切工具將其切成厚度為150-700微米不等的切片。將這些微器官置于35mm培養(yǎng)皿中，在2ml含10％胎牛血清(FCS)的F12培養(yǎng)基中，于5％CO237℃、12轉/分恒定振搖下放置可達三周的時間。每個培養(yǎng)皿包含特定厚度的微器官培養(yǎng)物。每兩天取出樣品，處理后進行常規(guī)組織學觀察和尿素產(chǎn)生。另外，在培養(yǎng)6天后，用1千萬CFU/ml的腺衍生的病毒構建體轉導微器官，該構建體經(jīng)改造以轉錄lac-z基因(見臨床研究雜志(J.Clin.Invest)902598-2607，1992)。轉導兩周后，取出樣品，固定，處理后用于重組β-半乳糖苷酶衍生的β-半乳糖產(chǎn)生。圖16顯示β-半乳糖產(chǎn)生的量為厚度的函數(shù)。請注意當使用450微米厚的微培養(yǎng)器官時獲得最高水平的產(chǎn)量。同樣，與150、300和700微米厚的微培養(yǎng)器官相比，450微米厚的微培養(yǎng)器官在培養(yǎng)三周后測定的組織學和尿素產(chǎn)生都是最佳的。
權利要求
1.一種進行液體的生物學改變的裝置，該裝置包括(a)一種腔，其具有一個用于液體進入的入口和一個用于液體流出的出口；和(b)進行液體的生物學改變的肝微器官培養(yǎng)物集合，該集合中的每一單個肝微器官培養(yǎng)物包含肝細胞并具有尺寸，以使在單個肝培養(yǎng)物中定位最深的肝細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物中保持腺泡單位的體內肝結構，該肝微器官培養(yǎng)物集合位于所述腔內，并且該肝微器官培養(yǎng)物集合與至少一部分流經(jīng)該腔的液體接觸。
2.根據(jù)權利要求1的裝置，其中在連續(xù)肝平面器官內提供該肝微器官培養(yǎng)物集合，該器官是在該肝微器官培養(yǎng)物集合存在下通過協(xié)同培養(yǎng)肝細胞而形成的，以使由來源于該微器官培養(yǎng)物的細胞和所述肝細胞的混合物形成所述連續(xù)肝平面器官。
3.根據(jù)權利要求1的裝置，其中用生物相容的多聚體片層封裝肝微器官培養(yǎng)物集合，該片層位于所述腔內。
4.根據(jù)權利要求3的裝置，其中該片層具有范圍約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。
5.根據(jù)權利要求3的裝置，其中多個所述片層以基本平行的方向加入腔內。
6.根據(jù)權利要求1的裝置，其進一步包含一個基本位于腔內的多孔膜，該膜實現(xiàn)了所述液體與肝微器官培養(yǎng)物集合的接觸。
7.根據(jù)權利要求6的裝置，其中該膜允許分子量低于約40,000Da到約250,000Da的顆粒的通過。
8.根據(jù)權利要求6的裝置，其中該膜限制白細胞、紅細胞和免疫球蛋白的通過。
9.根據(jù)權利要求1的裝置，其進一步包括多個連接患者的管，管中包含待生物學改變的液體，該管中至少一個與入口連接，并且至少另一個管與出口連接。
10.根據(jù)權利要求1的裝置，其中所述肝微器官培養(yǎng)物集合的特征在于在置于腔內之前被凍藏。
11.根據(jù)權利要求3的裝置，其中該片層的特征在于在置于腔內之前被凍藏。
12.一種進行患者液體的生物學改變的裝置，包括(a)一種腔，其具有一個用于液體進入的入口和一個用于液體流出的出口；(b)進行液體的生物學改變的微器官培養(yǎng)物集合，該集合中的每一單個肝微器官培養(yǎng)物包含肝細胞并具有尺寸，以使在單個肝培養(yǎng)物中定位最深的肝細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持腺泡單位的體內肝結構，肝微器官培養(yǎng)物集合位于所述腔內，并且肝微器官培養(yǎng)物集合與至少一部分流經(jīng)該腔的液體接觸；(c)具有第一個和第二個末端的第一種管，其第一個末端用于連接患者以從患者接受液體，其第二個末端用于連接入口；以及(d)具有第一個和第二個末端的第二種管，其第一個末端用于連接出口，其第二個末端用于連接患者，以便在生物學改變后使液體返回患者。
13.根據(jù)權利要求12的裝置，其中在連續(xù)肝平面器官內提供該肝微器官培養(yǎng)物集合，該器官是在肝微器官培養(yǎng)物集合存在下通過協(xié)同培養(yǎng)肝細胞而形成的，以使由來源于所述微器官培養(yǎng)物的細胞和肝細胞的混合物形成該連續(xù)肝平面器官。
14.根據(jù)權利要求12的裝置，其中將多個片層以基本平行的方向加入腔內。
15.根據(jù)權利要求14的裝置，其中該片層具有范圍約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。
16.根據(jù)權利要求14的裝置，其中將多個片層以基本平行的方向加入腔內。
17.根據(jù)權利要求12的裝置，其進一步包含一個基本位于腔內的多孔膜，該膜實現(xiàn)了所述液體與肝微器官培養(yǎng)物集合的接觸。
18.根據(jù)權利要求17的裝置，其中該膜允許分子量低于約40,000Da到約250,000Da的顆粒的通過。
19.根據(jù)權利要求17的裝置，其中該膜限制白細胞、紅細胞和免疫球蛋白的通過。
20.根據(jù)權利要求17的裝置，其中該片層的特征在于在被基本上置于腔內之前被凍藏。
21.一種進行患者液體的生物學改變的方法，該方法包括用患者的液體灌注含肝微器官培養(yǎng)物集合的腔的步驟，以使該肝微器官培養(yǎng)物集合對液體進行生物學改變，其中該集合中每一單個肝微器官培養(yǎng)物包含肝細胞并且具有尺寸，以使在單個肝培養(yǎng)物中定位最深的肝細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持腺泡單位的體內肝結構。
22.權利要求21的方法，其中該液體是血液。
23.根據(jù)權利要求21的裝置，其中在連續(xù)肝平面器官內提供肝微器官培養(yǎng)物集合，該器官是在肝微器官培養(yǎng)物集合存在下通過協(xié)同培養(yǎng)肝細胞而形成的，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和肝細胞的混合物形成該連續(xù)肝平面器官。
24.根據(jù)權利要求21的方法，其中用生物相容的多聚體片層封裝肝微器官培養(yǎng)物集合，該片層位于所述腔內。
25.根據(jù)權利要求24的方法，其中該片層具有范圍約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。
26.根據(jù)權利要求24的方法，其中將多個片層以基本平行的方向加入腔內。
27.根據(jù)權利要求21的方法，其中該腔包含位于其中的多孔膜，該膜實現(xiàn)了所述液體與肝微器官培養(yǎng)物集合的接觸。
28.根據(jù)權利要求27的方法，其中該膜允許分子量低于約40,000Da到約250,000Da的顆粒的通過。
29.根據(jù)權利要求27的方法，其中該膜限制白細胞、紅細胞和免疫球蛋白的通過。
30.根據(jù)權利要求27的方法，其中該片層的特征在于在基本置于腔內之前被凍藏。
31.根據(jù)權利要求21的方法，其進一步包括使液體返回患者的步驟。
32.根據(jù)權利要求31的方法，其進一步包括使肝微器官培養(yǎng)物集合分泌的至少一種產(chǎn)物返回患者的步驟。
33.一種制備連續(xù)平面器官的方法，包括步驟(a)獲得器官的單個微器官培養(yǎng)物集合，以使該集合的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并且具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持體內結構；和(b)將來源于該器官的細胞懸液加入微器官培養(yǎng)物中，在微器官培養(yǎng)物集合存在下協(xié)同培養(yǎng)該細胞懸液，以便由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和懸液中細胞的混合物形成連續(xù)平面器官。
34.一種制備連續(xù)肝平面器官的方法，包括步驟(a)獲得單個肝微器官培養(yǎng)物集合，以使該集合的每一單個微器官培養(yǎng)物包含肝細胞并且具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持腺泡單位的體內肝結構；和(b)將肝細胞懸液加入肝微器官培養(yǎng)物中，在肝微器官培養(yǎng)物集合存在下協(xié)同培養(yǎng)該細胞懸液，以便由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和肝細胞的混合物形成連續(xù)平面肝器官。
35.一種進行液體的生物學改變的裝置，該裝置包括(a)一種腔，其具有一個用于液體進入的入口和一個用于液體流出的出口；和(b)進行液體的生物學改變的器官的微器官培養(yǎng)物集合，該集合中的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物中保持器官單位的體內器官結構，微器官培養(yǎng)物集合位于所述腔內，并且微器官培養(yǎng)物集合與至少一部分流經(jīng)該腔的液體接觸。
36.根據(jù)權利要求35的裝置，其中在連續(xù)平面器官內提供微器官培養(yǎng)物集合，該器官是在微器官培養(yǎng)物集合存在下通過協(xié)同培養(yǎng)來源于該器官的懸液中的細胞而形成的，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和懸液中細胞的混合物形成該連續(xù)平面器官。
37.根據(jù)權利要求35的裝置，其中用生物相容的多聚體片層封裝微器官培養(yǎng)物集合，該片層位于所述腔內。
38.根據(jù)權利要求37的裝置，其中該片層具有范圍約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。
39.根據(jù)權利要求37的裝置，其中將多個片層以基本平行的方向加入腔內。
40.根據(jù)權利要求35的裝置，其進一步包含一個基本位于腔內的多孔膜，該膜實現(xiàn)了所述液體與微器官培養(yǎng)物集合的接觸。
41.根據(jù)權利要求40的裝置，其中該膜允許分子量低于約40,000Da到約250,000Da的顆粒通過。
42.根據(jù)權利要求40的裝置，其中該膜限制白細胞、紅細胞和免疫球蛋白的通過。
43.根據(jù)權利要求35的裝置，其進一步包括多個用于連接患者的管，管中包含待生物學改變的液體，這些管中至少一個與入口連接，并且至少另一個管與出口連接。
44.根據(jù)權利要求35的裝置，其中微器官培養(yǎng)物集合的特征在于在置于腔內之前被凍藏。
45.根據(jù)權利要求37的裝置，其中該片層的特征在于在置于腔內之前被凍藏。
46.一種進行患者的液體的生物學改變的裝置，包括(a)一種腔，其具有一個用于液體進入的入口和一個用于液體流出的出口；(b)進行液體的生物學改變的器官的微器官培養(yǎng)物集合，該集合中的每一單個微器官培養(yǎng)物包含細胞并具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持器官單位的體內器官結構，微器官培養(yǎng)物集合位于腔內，并且微器官培養(yǎng)物集合與至少一部分流經(jīng)該腔的液體接觸；(c)具有第一個和第二個末端的第一種管，其第一個末端用于連接患者以從患者接受液體，其第二個末端用于連接入口；以及(d)具有第一個和第二個末端的第二種管，其第一個末端用于連接出口，其第二個末端用于連接患者，以便在生物學改變后使液體返回患者。
47.根據(jù)權利要求46的裝置，其中在連續(xù)平面器官內提供微器官培養(yǎng)物集合，該器官是在微器官培養(yǎng)物集合存在下通過協(xié)同培養(yǎng)來源于該器官的懸液細胞而形成的，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和懸液細胞的混合物形成該連續(xù)平面器官。
48.根據(jù)權利要求46的裝置，其中用生物相容的多聚體片層封裝微器官培養(yǎng)物集合，該片層位于所述腔內。
49.根據(jù)權利要求48的裝置，其中該片層具有范圍約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。
50.根據(jù)權利要求48的裝置，其中將多個片層以基本平行的方向加入腔內。
51.根據(jù)權利要求46的裝置，其進一步包含一個基本位于腔內的多孔膜，該膜實現(xiàn)了所述液體與微器官培養(yǎng)物集合的接觸。
52.根據(jù)權利要求51的裝置，其中該膜允許分子量低于約40,000Da到約250,000Da的顆粒通過。
53.根據(jù)權利要求51的裝置，其中該膜限制白細胞、紅細胞和免疫球蛋白的通過。
54.根據(jù)權利要求51的裝置，其中該片層的特征在于在基本上置于腔內之前被凍藏。
55.一種進行患者液體的生物學改變的方法，該方法包括用來自患者的液體灌注含器官的微器官培養(yǎng)物集合的腔的步驟，以使微器官培養(yǎng)物集合對液體進行生物學改變，其中該集合中每一單個肝微器官培養(yǎng)物包含細胞并且具有尺寸，以使在單個微器官培養(yǎng)物中定位最深的細胞與單個微器官培養(yǎng)物的最近表面距離至少約150微米并且不超過約225微米，由此在每一單個微器官培養(yǎng)物內保持器官單位的體內器官結構。
56.權利要求55的方法，其中該液體是血液。
57.根據(jù)權利要求55的裝置，其中在連續(xù)平面器官內提供微器官培養(yǎng)物集合，該器官是在微器官培養(yǎng)物集合存在下通過協(xié)同培養(yǎng)來源于該器官的懸液細胞而形成的，以使由來源于微器官培養(yǎng)物的細胞和懸液細胞的混合物形成該連續(xù)平面器官。
58.根據(jù)權利要求55的方法，其中用生物相容的多聚體片層封裝微器官培養(yǎng)物集合，該片層位于所述腔內。
59.根據(jù)權利要求58的方法，該片層具有范圍約30cm到約90cm的第一種尺寸、約30cm到約80cm的第二種尺寸和約300微米到約900微米的第三種尺寸。
60.根據(jù)權利要求58的方法，其中將多個片層以基本平行的方向加入腔內。
61.根據(jù)權利要求55的方法，其中該腔包含位于其中的多孔膜，該膜實現(xiàn)了所述液體與微器官培養(yǎng)物集合的接觸。
62.根據(jù)權利要求61的方法，其中該膜允許分子量低于約40,000Da到約250,000Da的顆粒通過。
63.根據(jù)權利要求61的方法，其中該膜限制白細胞、紅細胞和免疫球蛋白的通過。
64.根據(jù)權利要求61的方法，其中該片層的特征在于在基本上置于腔內之前被凍藏。
65.根據(jù)權利要求61的方法，其進一步包括使液體返回患者的步驟。
66.根據(jù)權利要求65的方法，其進一步包括使微器官培養(yǎng)物集合分泌的至少一種產(chǎn)物返回患者的步驟。
全文摘要
一種進行液體的生物學改變的裝置,特別是為了輔助或替代正常行使這種改變的器官的功能,它包含肝微器官培養(yǎng)物集合。本發(fā)明的裝置優(yōu)選地直接與患者相連接,以進行這種改變。
文檔編號C12M3/04GK1373800SQ98808474
公開日2002年10月9日 申請日期1998年1月9日 優(yōu)先權日1997年1月16日
發(fā)明者E·N·米特蘭尼 申請人:耶路撒冷希伯來語大學依蘇姆研究開發(fā)公司