專利名稱：一種新的人神經(jīng)分化因子的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)專業(yè)領(lǐng)域，涉及一種新的人神經(jīng)分化因子(neuronal differentiation factor-1，NDF-1)的cDNA序列和蛋白質(zhì)序列，以及該基因的功能線索。
目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)營養(yǎng)作用的細(xì)胞因子，構(gòu)成了神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，其作用主要是對神經(jīng)元的存活、生長、分化和功能維持起調(diào)控作用。主要包括神經(jīng)生長因子(NGF)在內(nèi)的神經(jīng)營養(yǎng)素(NT)家族、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)及近年發(fā)現(xiàn)的膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)等。在腦內(nèi)尋找具有神經(jīng)分化作用的因子是目前的主要工作，但是研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)系統(tǒng)之外的組織中所發(fā)現(xiàn)的一些細(xì)胞因子也同時能夠在腦內(nèi)表達(dá)而發(fā)揮作用，例如成纖維細(xì)胞生長因子(FGFs)、胰島素樣生長因子(IGFs)、轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)等都具有神經(jīng)營養(yǎng)活性。它們也具有一定的促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞分化作用。
本發(fā)明的目的是提供一種新的人神經(jīng)分化因子。該發(fā)明有可能為臨床上治療腦腫瘤提供新的治療途徑。
肝臟所分泌的細(xì)胞因子的種類繁多，尤其在胚胎時期的肝臟中更是如此。4-6月孕齡的人胎肝是造血、免疫、肝臟系統(tǒng)干祖細(xì)胞的主要來源，表達(dá)基因在各類組織中最為豐富，表明其中存在大量具有醫(yī)學(xué)價值的活性成分。因此，本發(fā)明以4-6月孕齡的人胎肝為研究材料，按照分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)，通過富集未知低豐度的mRNA，利用耐高溫反轉(zhuǎn)錄酶獲得全長cDNA并構(gòu)建文庫，對該文庫進(jìn)行大規(guī)模、長序列測定，最終對表達(dá)序列片段(EST)及新基因進(jìn)行功能預(yù)測與驗(yàn)證。在此基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了一條新的基因序列，其cDNA序列見說明書附1。該基因的表達(dá)產(chǎn)物序列見說明書附2。計(jì)算機(jī)分析表明，該序列所編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物與鼠源神經(jīng)分化因子TA20有50.8％的同源性，提示此二者的功能可能是相關(guān)的。計(jì)算機(jī)分析還發(fā)現(xiàn)，人神經(jīng)生長因子蛋白質(zhì)的分子量為22.423千道爾頓，等電點(diǎn)為12.58。
以4～6月孕齡的人胎肝為研究材料，通過富集未知低豐度的mRNA，利用耐高溫反轉(zhuǎn)錄酶獲得全長cDNA并構(gòu)建文庫，對該文庫進(jìn)行大規(guī)模、長序列測定，對表達(dá)序列片段(EST)通過Internet網(wǎng)使用BLAST軟件進(jìn)行同源性比較。具有功能線索的新基因進(jìn)行功能預(yù)測和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。該發(fā)明有可能為臨床上治療腦腫瘤提供新的治療途徑。
以下為結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明

圖1人神經(jīng)分化因子的cDNA序列圖2人神經(jīng)生長因子的蛋白質(zhì)序列圖3人神經(jīng)分化因子的cDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫全序列同源性比較結(jié)果圖4人神經(jīng)分化因子的cDNA序列與GenBank EST庫同源性比較結(jié)果圖5人神經(jīng)分化因子的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫同源性比較結(jié)果圖6人神經(jīng)分化因子蛋白質(zhì)序列與鼠源TA20蛋白質(zhì)序列的同源性比較結(jié)果圖7人神經(jīng)分化因子的Motif位點(diǎn)圖3為人神經(jīng)分化因子的cDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫全序列同源性比較結(jié)果，說明該基因的cDNA序列與線粒體基因具有較高的同源性。但是，并不能由此推斷NDF-1基因的功能與線粒體基因組功能相關(guān)。因?yàn)镹DF-1基因功能的發(fā)揮有賴于其所翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)物--NDF-1蛋白質(zhì)的作用。
圖4為人神經(jīng)分化因子的cDNA序列與GenBank EST庫同源性比較結(jié)果，說明該基因的cDNA序列與線粒體基因組具有較高的同源性。同樣，并不能由此推斷NDF-1基因的功能與線粒體基因組功能相關(guān)。
圖5為人神經(jīng)分化因子的氨基酸序列與GenBank數(shù)據(jù)庫同源性比較結(jié)果，說明NDF-1基因的蛋白質(zhì)序列與鼠源TA20基因的具有較高的同源性，那么，提示二者的功能也可能相關(guān)或相類似。考慮到TA20基因是作為一種神經(jīng)分化因子和神經(jīng)瘤抑制因子被分離得到的，那么，NDF-1基因也可能有類似作用。
圖6為人神經(jīng)分化因子蛋白質(zhì)序列與鼠源TA20蛋白質(zhì)序列的同源性比較結(jié)果，說明二者的同源性有50％，提示二者有較高的同源性，在功能上也可能是相關(guān)的，從而認(rèn)為該因子可能具有促神經(jīng)細(xì)胞分化作用和抑制神經(jīng)細(xì)胞腫瘤生長的作用。
圖7為使用Omiga軟件(1.10版)對NDF-1蛋白質(zhì)序列進(jìn)行分析的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在第94位有一個糖基化位點(diǎn)，在第28、42、68、121位各有一個蛋白激酶C(PKC)的磷酸化位點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明所提供的人神經(jīng)生長因子具有如下cDNA序列10 20 30 40 50 60gcaaactttc tacagtgaat atatattgtc tttataataa ggaaaaatga ttgaaataaa70 80 90100110120ttgagaggta taaaacaaaa ctataacaaa ctttcttttg tttattacca tccaacttaa130140150160170180agactgaaaa gtccaagaga tttggaggga tgcaccagta agatccatat tgaccgtaag190200210220230240agaatacaca aggggaatgg tacgctgccc gcacgtaccg cagcccctca ccgtctcagc250260270280290300accactgagg aatcgggctc ctgcacttgg agaccagcct ctgtgaaaca caggtgtagt310320330340350360gagtcatgag atacgctgac aaacgggatg tgaatatcat ggaagctcca aaactcccag370380390400410420taaaggcaaa aagaaaccag ttccccttga cctgtctcca catatcatgg ctctacgtgt430440450460470480gagaagagtt atcactcttt cttcaaagat ttccaggagg gaaggaagga aggaaggaaa490500510520530540gaaggaagga aggaaggaag gaagggaggg agggagggag ggagggaggg aaagaaggag550560570580590600gaagggaaag aaggaggaag ggaacaaaag aaaagggaga aagggaagga gggatggaaa610620630640650660atgtaaccct cataattaaa aaaaaatcaa attgttatta attgccaatt agatcaaagt670680690700710720ttctcacagt tacatttata taggaaaaaa atttaagtag cctaaatgcc caacagcatg730740750760770780agactgacag agaaaatctg ggagactgcc accaactggg gaacggggat accccaagtt790800810820830840tccatactac aagaagaacc agaaatctat gtgatctgtt ccattgagct gttatttctg850860870880890900ggccatgtat gagccagctt taataaaatt aattaaccac tcattcatcg acctccccac910920930940950960cccatccaac atctccgcAT GATGAAACTT CGGCTCACTC CTTGGCGCCT GCCTGATCCT970980990 1000 1010 1020CCAAATCACC ACAGGACTAT TCCTAGCCAT GCACTACTCA CCAGACGCCT CAACCGCCTT1030 1040 1050 1060 1070 1080TTCATCAATC GCCCACATCA CTCGAGACGT AAATTATGGC TGAATCATCC GCTACCTTCA1090 1100 1110 1120 1130 1140CGCCAATGGC GCCTCAATAT TCTTTATCTG CCTCTTCCTA CACATCGGGC GAGGCCTATA1150 1160 1170 1180 1190 1200TTACGGATCA TTTCTCTACT CAGAAACCTG AAACATCGGC ATTATCCTCC TGCTTGCAAC1210 1220 1230 1240 1250 1260TATAGCAACA GCCTTCATAG GCTATGTCCT CCCGTGAGGC CAAATATCAT TCTGAGGGGC1270 1280 1290 1300 1310 1320CACAGTAATT ACAAACTTAC TATCCGCCAT CCCATACATT GGGACAGACC TAGTTCAATG1330 1340 1350 1360 1370 1380AATCTGAGGA GGCTACTCAG TAGACAGTCC CACCCTCACA CGATTCTTTA CCTTTCACTT1390 1400 1410 1420 1430 1440CATCTTGCCC TTCATTATTA CAGCCCTAGC AGCACTCCAC CTCCTATTCT TGCACGAAAC1450 1460 1470 1480 1490 1500GGGATCAAAC AACCCCCTAG GAATCACCTC CCATTCCGAT AAaatcacct tccaccctta1510 1520 1530 1540 1550 1560ctacacaatc aaagacgccc tcggcttact tctcttcctt ctctccttaa tgacattaac1570 1580 1590 1600 1610 1620actattctca ccagacctcc taggcgaccc agacaattat accctagcca accccttaaa1630 1640 1650 1660 1670 1680cacccctccc cacatcaagc ccgaatgata tttcctattc gcctacacaa ttctccgatc1690 1700 1710 1720 1730 1740cgtcccnaac aaactaggag gcgtccttgc cctattacta tccatcctca tcctagcaat1750 1760 1770 1780 1790 1800aatccccatc ctccatatat ccaaacaaca aagcataata tttcgcccac taagccaatc1810 1820 1830 1840 1850 1860actttattga ctcctagccg cagacctcct cattctaacc tgaatcggag gacaaccagt1870 1880 1890 1900 1910 1920aagctaccct tttaccatca ttggacaagt agcatccgta ctatacttca caacaatcct1930 1940 1950 1960 1970 1980aatcctaata ccaactatct ccctaattga aaacaaaata ctcaaatgag cctaaaaaaa1990 2000 2010 2020 2030 2040aaaaaaaaaa
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人神經(jīng)生長因子具有如下蛋白質(zhì)序列10 20 30 40 50 60MMKLRLTPWR LPDPPNHHRT IPSHALLTRR LNRLFINRPH HSRRKLWLNH PLPSRQWRLN70 80 90100110120ILYLPLPTHR ARPILRIISL LRNLKHRHYP PACNYSNSLH RLCPPVRPNI ILRGHSNYKL130140150160170180TIRHPIHWDR PSSMNLRRLL SRQSHPHTIL YLSLHLALHY YSPSSTPPPI LARNGIKQPP190200210220230240RNHLPFR
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人神經(jīng)生長因子具有以下生物學(xué)特性人神經(jīng)生長因子蛋白質(zhì)的分子量為22.423千道爾頓，等電點(diǎn)為12.58。該因子具有促神經(jīng)細(xì)胞分化作用和抑制神經(jīng)細(xì)胞腫瘤生長的作用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的人神經(jīng)分化因子的cDNA序列及其所編碼的蛋白質(zhì)序列。其cDNA序列全長為1990個堿基。其蛋白質(zhì)序列全長為187個氨基酸。人神經(jīng)分化因子可能具有促神經(jīng)細(xì)胞分化和抑制神經(jīng)細(xì)胞腫瘤生長的作用。
文檔編號C12N15/12GK1247897SQ9811778
公開日2000年3月22日 申請日期1998年9月14日 優(yōu)先權(quán)日1998年9月14日
發(fā)明者賀福初, 魚詠濤, 張成崗, 張紹文, 歐陽曙光, 羅凌, 劉孟珉, 魏漢東, 吳祖澤 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所