專利名稱：一種固相逐個(gè)堿基核酸分析方法和儀器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體說涉及一種固相多模板逐個(gè)堿基核酸序列分析方法和儀器。
核酸序列分析不僅是核酸結(jié)構(gòu)與功能研究的基礎(chǔ)，同時(shí)，也是人類認(rèn)識生命奧秘的關(guān)鍵。人類基因組計(jì)劃(HGP)正是為實(shí)現(xiàn)這一目的而進(jìn)行的一項(xiàng)偉大工程。核酸序列分析則是該工程的主體。根據(jù)原理，核酸序列分析可分五類一是雙脫氧法；二是化學(xué)法；三是雜交法(SBH)；四是質(zhì)譜法；五是單分子法。目前通用的核酸序列分析技術(shù)主要是雙脫氧法，該法的基本原理是以待測序列為模板采用四種雙脫氧核苷在酶的作用下進(jìn)行延伸-終止反應(yīng)，產(chǎn)生一系列僅差一個(gè)堿基的合成DNA片段，通過電泳分離后，讀出其測定模板的序列。雙脫氧法可通過自動(dòng)或手動(dòng)完成，信號可采用同位素或熒光素標(biāo)記分子。雜交法是通過標(biāo)記DNA分子與固定在芯片上的寡核苷酸探針陣列雜交而實(shí)現(xiàn)的?；瘜W(xué)降解法是利用堿基對特定化學(xué)試劑的敏感性差異對模板進(jìn)行化學(xué)降解，電泳分離后分析出測定模板的序列。質(zhì)譜法是利用質(zhì)譜儀對酶法部分水解的核酸片段進(jìn)行分析，根據(jù)片段組合計(jì)算出核酸的序列。單分子序列分析技術(shù)是將單分子DNA標(biāo)記后固定在固相載體上，然后邊酶解邊分離和檢測酶解的單核苷酸，從而測定出單分子DNA的序列，目前該技術(shù)仍處于研究階段，距離實(shí)用還有很長的一段時(shí)間。上述方法雖各有特點(diǎn)，但仍然存在許多問題，如操作繁瑣、分析樣本數(shù)少、自動(dòng)化程度低等。因此，并不太適合大規(guī)模核酸序列分析。研究開發(fā)新的大規(guī)模核酸序列分析技術(shù)仍是核酸序列分析工作面臨的一個(gè)重要的課題。
本發(fā)明的目的提供一種新的大規(guī)模核酸序列分析方法和儀器。與以往技術(shù)比較，該技術(shù)具有原理新、靈敏度高、規(guī)模大、使用范圍廣和便于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明的技術(shù)方案是通過以下原理實(shí)現(xiàn)的將已與測序引物結(jié)合的待測序模板固定在一種固相材料上，依次加入含有酶、酶反應(yīng)緩沖液及熒光物或同位素等標(biāo)記dNTPs的A、G、C及T四種反應(yīng)池中分別進(jìn)行延伸反應(yīng)。每次更換反應(yīng)池后對延伸反應(yīng)后的模板進(jìn)行洗滌并分析標(biāo)記信號強(qiáng)度，根據(jù)檢測信號的變化即可分析出待測模板的序列。如，當(dāng)加入G反應(yīng)池后，如測定的信號有增加說明模板一定是C，因?yàn)橹挥心０迨荂，G才能被酶摻入到新合成的DNA分子，同時(shí)檢測出熒光信號的增加，而A、C、T均不能摻入，因此無熒光信號的增加，這樣依次進(jìn)行A、G、C、T四種循環(huán)反應(yīng)，每一種循環(huán)包括反應(yīng)、洗滌和檢測三步，每一輪循環(huán)反應(yīng)即可測定一個(gè)堿基序列。當(dāng)有多種模板同時(shí)固定在一種固相載體如芯片上時(shí)，可對固定在載體上的所有模板同時(shí)測序。結(jié)合附圖進(jìn)一步說明本發(fā)明的具體步驟如下

圖1.固相多模板逐個(gè)堿基核酸序列分析方法的原理圖1中各部件名稱如下1固相載體；2核酸序列分析模板3核酸序列分析引物4熒光/同位素標(biāo)記ATP；5熒光/同位素標(biāo)記dGTP；6熒光/同位素標(biāo)記dCTP；7熒光/同位素標(biāo)記dTTP；8摻入的熒光/同位素標(biāo)記dG；9摻入的熒光/同位素標(biāo)記dA；10摻入的熒光/同位素標(biāo)記dC；11摻入的熒光/同位素標(biāo)記dT；1.模板固定模板固定載體1可采用芯片、光導(dǎo)纖維、玻璃片、塑料片、紙片、多孔板等。模板2和引物3以氫鍵結(jié)合。1與2的連接可采用共價(jià)或非共價(jià)的方法。2.延伸反應(yīng)根據(jù)模板多少、載體大小和種類、自動(dòng)或手動(dòng)方式不同可選擇模板移動(dòng)或反應(yīng)池移動(dòng)的延伸反應(yīng)方式。延伸反應(yīng)池應(yīng)包括合適的反應(yīng)體系，相應(yīng)的標(biāo)記dNTPs(4-7)，DNA多聚酶(12)等。DNA多聚酶可以是逆轉(zhuǎn)錄酶、耐高溫酶、T7、T4、Klenow等。酶的濃度，緩沖體系中各種離子的濃度，引物濃度，dNTPs的濃度等可進(jìn)行優(yōu)化。3.信號標(biāo)記dNTPs(4-7)的信號標(biāo)記是該技術(shù)的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)。可采用熒光染料或同位素標(biāo)記。熒光染料標(biāo)記無同位素問題，便于自動(dòng)化。但可能的問題是摻入率、位阻及熒光信號飽和及淬滅。摻入率可通過以下途徑解決選擇合適的熒光標(biāo)記染料；加入適量相應(yīng)的非標(biāo)記dNTP；熒光信號飽和的問題可通過改進(jìn)儀器設(shè)計(jì)、減少模板或標(biāo)記dNTP用量，及信號淬滅的途徑解決。相鄰標(biāo)記dNTP間熒光淬滅的問題可通過選擇發(fā)射和吸收波長相差較大的熒光標(biāo)記物。利用淬滅還可在一定程度上解決飽和的問題。同位素標(biāo)記突出的特點(diǎn)是不存在位阻問題。不利因素是相應(yīng)的同位素問題。4.信號檢測及處理熒光信號檢測可用CCD技術(shù)，熒光掃描成像技術(shù)，熒光多孔板檢測技術(shù)，激光共聚焦顯微技術(shù)等。同位素信號的檢測采用相應(yīng)的檢測技術(shù)及設(shè)備即可。上述檢測技術(shù)最好能定量，特別是大片段測序，小片段可不用定量，采用本底校正即可。信號處理可采用計(jì)算機(jī)及配套分析軟件。5.自動(dòng)化儀器與其它自動(dòng)測序技術(shù)比較該技術(shù)更易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化分析。結(jié)合圖2說明如下圖2.固相多模板逐個(gè)堿基核酸序列分析儀器圖2中各部件名稱如下1多通道控制器；2固相載體；3反應(yīng)腔4信號采集裝置；5數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和處理裝置；6-7反應(yīng)液輸入/輸出管路；8-9數(shù)據(jù)傳輸電纜；10洗滌液；11熒光/同位素等標(biāo)記dATP；12熒光/同位素等標(biāo)記dGTP；13熒光/同位素等標(biāo)記dCTP；14熒光/同位素等標(biāo)記dTTP；各反應(yīng)液(11-14)、洗滌液(10)及廢液(15)通過受數(shù)據(jù)處理裝置(5)控制的多通道控制器及輸液管路(6-7)送入反應(yīng)腔(3)，反應(yīng)液反應(yīng)后送回原反應(yīng)池(11-14)供以后反應(yīng)用，洗滌液(10)則直接送至廢液池(15)。洗滌液(10)可采用與反應(yīng)池相同的緩沖體系。固定好模板的載體(2)置于一個(gè)可控溫的密封反應(yīng)腔(3)，然后再將其固定于CCD鏡頭或其它類似信號采集裝置前。信號采集裝置(4)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(5)連接。本發(fā)明具有以下術(shù)特點(diǎn)1.原理新不用雙脫氧核苷、不用進(jìn)行電泳、不用制備單鏈分子、 不用化學(xué)降解、不用制備寡核苷酸芯片2.靈敏度高由于充分利用了模板，因此靈敏度可大大提高，理論上ng模板即可。
3.適用范圍廣可測定緊接引物的核酸序列及重復(fù)序列。
4.規(guī)模大可同時(shí)測定大量的DNA序列，理論上在載體上可以固定多少種模板，就可同時(shí)測定多少序列。
5.便于自動(dòng)化結(jié)合CCD技術(shù)及自動(dòng)雜交等技術(shù)即可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模自動(dòng)化分析。實(shí)施例
權(quán)利要求
1.一種核酸序列分析新技術(shù)，其特征在于，模板和引物在固相反應(yīng)，引物或模板固定在一種固相載體上。反應(yīng)體系中加入聚合酶和適當(dāng)?shù)木彌_液，每一種核苷分別放置在反應(yīng)體系中，依次在酶的催化下?lián)饺氲叫潞铣傻暮怂徭溨?，核苷酸上?biāo)記有同位素或熒光物質(zhì)等標(biāo)記物，每一種核苷酸每一次酶促反應(yīng)后即進(jìn)行摻入信號的檢測，檢測可用同位素檢測設(shè)備也可用熒光，化學(xué)發(fā)光及顯色等檢測設(shè)備或技術(shù)；具體操作時(shí)，將已與測序引物結(jié)合的待測序模板固定在一種固相材料上，依次加入含有酶、酶反應(yīng)緩沖液及熒光物或同位素等標(biāo)記dNTPs的A、G、C及T四種反應(yīng)池中分別進(jìn)行延伸反應(yīng)，每次更換反應(yīng)池后對延伸反應(yīng)后的模板進(jìn)行洗滌并分析標(biāo)記信號強(qiáng)度，根據(jù)檢測信號的變化即可分析出待測模板的序列。如，當(dāng)加入G反應(yīng)池后，如測定的信號有增加說明模板一定是C，因?yàn)橹挥心０迨荂，G才能被酶摻入到新合成的DNA分子，同時(shí)檢測出熒光信號的增加，而A、C、T均不能摻入，因此無熒光信號的增加，這樣依次進(jìn)行A、G、C、T四種循環(huán)反應(yīng)，每一種循環(huán)包括反應(yīng)、洗滌和檢測三步，每一輪循環(huán)反應(yīng)即可測定一個(gè)堿基序列，當(dāng)有多種模板同時(shí)固定在一種固相載體如芯片上時(shí)，可對固定在載體上的所有模板同時(shí)測序。
2.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)，其中固相載體可以是玻璃片、硅片、塑料片、紙片、多孔板或小塑料管等固相材料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)，其中序列分析的核酸模板可以是DNA/RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)，其中可以采用引物與載體連接或模板與載體連接的途徑；模板或引物可以通過共價(jià)或非共價(jià)的方式與固相載體連接。
5.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)，其中核苷酸可以是核糖核酸或脫氧核糖核酸，其標(biāo)記物可以是放射性標(biāo)記或非放射性標(biāo)記。
6.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)，其中標(biāo)記信號可采用CCD技術(shù)，激光共聚焦顯微技術(shù)，熒光掃描技術(shù)或化學(xué)發(fā)光等進(jìn)行檢測，也可采用放射性檢測技術(shù)進(jìn)行信號檢測。
7.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)，其中聚合酶可采用DNA聚合酶或RNA聚合酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求1中的技術(shù)可實(shí)現(xiàn)部分或全部自動(dòng)化核酸序列分析操作(見附圖2)；該自動(dòng)化儀器中各反應(yīng)液(11-14)、洗滌液(10)及廢液(15)通過受數(shù)據(jù)處理裝置(5)控制的多通道控制器及輸液管路(6-7)送入反應(yīng)腔(3)，反應(yīng)液反應(yīng)后送回原反應(yīng)池(11-14)供以后反應(yīng)用，洗滌液(10)則直接送至廢液池(15)；洗滌液(10)可采用與反應(yīng)池相同的緩沖體系；固定好模板的載體(2)置于一個(gè)可控溫的密封反應(yīng)腔(3)，然后再將其固定于CCD鏡頭或其它類似信號采集裝置前，2和4的距離可調(diào)整；信號采集裝置(4)與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(5)連接。
9.根據(jù)權(quán)利要求8中的儀器，其中1可采用電磁閥或數(shù)控泵。
10.根據(jù)權(quán)利要求8中的儀器，其中10-15可以是金屬或非金屬材料制作的任何形狀的可儲液裝置。
11.根據(jù)權(quán)利要求8中的儀器，其中4可根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)，采用同位素或非同位素?cái)?shù)據(jù)采集裝置。
12.根據(jù)權(quán)利要求8中的儀器，其中5可以是計(jì)算機(jī)或其它數(shù)據(jù)處理裝置。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種與新的核酸序列分析技術(shù),包括技術(shù)的方法原理和儀器,該技術(shù)原理與以往的核酸序列分析技術(shù)原理不同,它可實(shí)現(xiàn)核酸的大規(guī)模序列分析和突變檢測等。該技術(shù)的實(shí)施對基因組計(jì)劃的完成,遺傳病分析,基因診斷和基因結(jié)構(gòu)分析等研究領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號C12Q1/00GK1245218SQ9811740
公開日2000年2月23日 申請日期1998年8月19日 優(yōu)先權(quán)日1998年8月19日
發(fā)明者王升啟 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所