人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測試劑，具體涉及人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑。
【背景技術】
[0002]人抗苗勒管激素(ant1-Mulerian hormone，AMH)是由兩個相同的70kb亞基組成的二聚糖蛋白，相對分子質量為140000，與抑制素、活化素、骨形態(tài)生成蛋白及生長分化因子等構成轉化生長因子β超家族。人類AMH基因位于第19號染色體短臂(19ρ13.3)，長
2.4?2.8 kb，有5個外顯子，編碼560個氨基酸的蛋白前體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑，該酶聯(lián)免疫檢測試劑可有效檢測人抗苗勒激素，檢測靈敏度達到0.lng/mlo
[0004]本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案為:人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括固相載體以及包被在固相載體上的抗體，抗體為抗原與孔戚血藍蛋白藕連，免疫新西蘭兔后純化得到，所述抗體為人抗苗勒激素抗體，所述抗原為人工合成的6條多肽，6條多肽的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06所示。
[0005]與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括固相載體以及包被在固相載體上的抗體，抗體為抗原與孔戚血藍蛋白藕連，免疫新西蘭兔后純化得到，該抗體為人抗苗勒激素抗體，該抗原為人工合成的6條多肽，6條多肽的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06所示；該酶聯(lián)免疫檢測試劑可有效檢測人抗苗勒激素，由于有6種抗原抗原的抗體，靈敏度較高，檢測靈敏度達到0.lng/ml，為人AMH的檢測提供了有效的檢測手段。
【具體實施方式】
[0006]以下結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細描述。
實施例
[0007]一、抗原的設計:從親水性、可及性、抗原性、可塑性、電荷分布、二級結構預測對AMH蛋白進行表位分析，設計、篩選出6條人工合成的多肽抗原(上海生工合成)，6條多肽抗原的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06所示，分別與孔戚血藍蛋白(KLH)藕連。
[0008]二、特異性抗體的制備:免疫程序:選13只2月齡、體重1.5?2.0kg的健康新西蘭大白兔，取I只作為陰性對照組，剩余12只為試驗組；將13只新西蘭大白兔子先適應性喂養(yǎng)2周，每只動物免疫前先于一側耳緣抽取2mL靜脈血，4°C靜置過夜，取血清作陰性對照試劑；另外在福氏完全佐劑或不完全佐劑加入上述6種KLH偶聯(lián)的抗原，其中福氏完全佐劑或不完全佐劑V:抗原溶液(6種抗原等量，總濃度SOOyg/ mL)V= 1:1，在漩渦振蕩器上乳化，直至將一滴乳劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散，得到免疫抗原試劑；初次免疫將免疫抗原試劑(抗原+完全弗氏完全佐劑)在大白兔背部多點注射，每只注射I mL。第28天用抗原+完全弗氏不完全佐劑的免疫抗原試劑大白兔肌肉注射I mL加強免疫，以后每14d加強免疫I次，第3次加強免疫后第7d,從大白兔耳緣靜脈采血，采用間接酶聯(lián)免疫法測定抗血清效價，若效價達不到要求，繼續(xù)飼養(yǎng)，重復加強免疫，直至獲得滿意的效價；效價達到要求后，頸動脈取血收獲抗血清。
[0009]三、抗體的純化:取12mL上述抗血清，加入等體積12mL PBS (濃度0.01M, pH7.8，下同)，混勻；邊攪拌邊加入硫酸銨飽和溶液24mL，使成50%飽和度，4°C放60min，1000rpm離心lOmin，棄上清，用飽和硫酸銨12 mL與PBS 12 mL混合后的溶液清洗沉淀二次，去上清；將沉淀溶于12mL PBS中，滴加飽和硫酸銨溶液6mL，4°C放30min，離心去上清，重復該步一次；沉淀中加入2.4mL生理鹽水，移入透析袋中，透析至析出液中沒有硫酸根離子，用質量百分濃度1%的BaCl2溶液滴定檢測，再換一次生理鹽水透析，制得純化抗體2.5mL。
[0010]四、純化抗體的標記:將1mg辣根過氧化物酶溶于0.2mL戊二醛(終質量百分濃度1.25%) + PBS (終濃度0.1M，pH6.8)溶液中，室溫作用18小時，透析去戊二醛。加生理鹽水至lmL，加5mg純化抗體，加入0.1mL IM碳酸鹽緩沖液(pH9.6)，4° C放24小時；加入0.1mL賴氨酸(濃度0.2M)，室溫作用2小時，于PBS (濃度0.15M，ρΗ7.2)中，充分透析，離心沉淀，上清即為辣根過氧化物酶標記的純化抗體，即為人抗苗勒激素ELISA檢測試劑。
[0011]五、人抗苗勒激素ELISA檢測試劑的建立及檢測:包被:用pH 9.5碳酸鹽緩沖液稀釋的人抗苗勒激素ELISA檢測試劑(體積比800: 1)，包被96孔的酶標板，100 μ L/孔，共88檢測孔，4°C包被過夜，陰性對照孔(用陰性對照試劑與碳酸鹽緩沖液稀釋包被)設4個/板，空白對照孔(碳酸鹽緩沖液)設4孔/板；洗板，用自動洗板機洗板三次，5分鐘/次，洗滌液TBS ;封閉:用質量百分濃度1%的BSA封閉酶標板上沒有結合上抗體的位點，200 μ L/孔，室溫作用I小時，洗板；加入樣品或標準蛋白稀釋液，10yL/孔，室溫作用I小時，檢測孔再加入pH 9.5碳酸鹽緩沖液稀釋的人抗苗勒激素ELISA檢測試劑(體積比600: 1)，100 μ L/孔；檢測:樣品(可以為人血清、尿液、培養(yǎng)細胞及培養(yǎng)細胞上清等，內(nèi)含3，3'，5，5'-四甲基聯(lián)苯胺)滴加入檢測孔、陰性對照孔、空白對照孔中，暗處反應20分鐘，加入2 N H2SO4，每孔50 μ L，終止反應，10分鐘后讀取OD49tl,空白管調零，樣品測出OD490后查標準曲線得出樣品中人抗苗勒激素的含量，由于有6種抗原的抗體共同作用，靈敏度較高，檢測靈敏度達到0.lng/ml?
【主權項】
1.人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括固相載體以及包被在固相載體上的抗體，抗體為抗原與孔戚血藍蛋白藕連，免疫新西蘭兔后純化得到，其特征在于所述抗體為人抗苗勒激素抗體，所述抗原為人工合成的6條多肽，6條多肽的氨基酸序列如SEQ ID NOl?SEQ ID N06 所示。
【專利摘要】本發(fā)明公開了人抗苗勒激素的酶聯(lián)免疫檢測試劑，包括固相載體以及包被在固相載體上的抗體，抗體為抗原與孔戚血藍蛋白藕連，免疫新西蘭兔后純化得到，該抗體為人抗苗勒激素抗體，該抗原為人工合成的6條多肽，6條多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO1～SEQ ID NO6所示；該酶聯(lián)免疫檢測試劑可有效檢測人抗苗勒激素，由于有6種抗原的抗體，靈敏度較高，檢測靈敏度達到0.1ng/ml，為人AMH的檢測提供了有效的檢測手段。
【IPC分類】G01N33-74
【公開號】CN104865391
【申請?zhí)枴緾N201510226042
【發(fā)明人】薛金鋒, 曾橋
【申請人】薛金鋒, 曾橋
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月6日