本發(fā)明涉及的是一種酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)領(lǐng)域的技術(shù)，具體是一種基于移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定(moving reaction boundary‐electrophoresis titration,MRB‐ET)的定量酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

1971年Engvall和Perlmann介紹了一種酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme‐linked immune sorbentassay，ELISA)用于IgG定量檢測(cè)的方法，將之前用于抗原定位的酶標(biāo)抗體技術(shù)發(fā)展成液體標(biāo)本中微量物質(zhì)的檢測(cè)方法(E.Engvall,P.Perlmann,1971,Immunochemistry,8,871‐874.)。該方法的基本原理是：將一抗結(jié)合到某種固相載體表面；將酶與二抗連接成為酶標(biāo)抗體；檢測(cè)時(shí)，把受檢樣品和酶標(biāo)抗體按不同步驟與固相載體表面進(jìn)行反應(yīng)，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與樣品中待檢測(cè)抗原的量成一定比例；加入反應(yīng)底物后，底物在酶催化作用下變成顯色產(chǎn)物，其濃度與樣品中待測(cè)抗原濃度直接相關(guān)，故可通過(guò)顏色反應(yīng)的深淺程度進(jìn)行定性和定量分析(李志勇，2009，食品安全ELISA快速檢測(cè)技術(shù)，中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，P2‐3)。

ELISA中酶的催化頻率很高，可以極大地放大反應(yīng)效果，使該方法具有很高的靈敏度(C.M.Maragos,R.D.Plattner,S.D.Miklasz,1996,Food Additives&Contaminants,13,105‐113.)。但該方法對(duì)檢測(cè)裝置和檢測(cè)環(huán)境有一定要求，通常需要洗板機(jī)、酶標(biāo)儀、熒光檢測(cè)或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等較為復(fù)雜的儀器完成檢測(cè)。同時(shí)為了消除各種干擾，ELISA需要在穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中進(jìn)行檢測(cè)。上述因素使該方法無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)、床邊診斷和野外分析。針對(duì)這些問(wèn)題，已發(fā)展了ELISA分析新技術(shù)，包括：熒光探針微量顯色技術(shù)(G.C.Visor，S.G.Schulman,1981,Journal of Pharmaceutical Sciences,70,469‐475)和微流控芯片技術(shù)(N.N.Ye,J.H.Qin,W.W.Shi,X.Liu,B.C.Lin,2007,Lab onaChip,7,1696‐1704)等。以上技術(shù)能明顯減少酶反應(yīng)體系體積，向小型化邁出了重要一步。但上述方法仍基于傳統(tǒng)比色、熒光或化學(xué)發(fā)光儀器分析模式，檢測(cè)設(shè)備體積仍然龐大，限制了其在現(xiàn)場(chǎng)、床邊檢測(cè)和野外檢測(cè)分析中的應(yīng)用。

膠體金免疫層析法能夠?qū)崿F(xiàn)便攜式現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)分析(W.Faulk,G.M.Taylorn,1971,Immunochemistry,8,1081‐1087)。膠體金是由氯金酸在還原劑(如抗壞血酸、枸櫞酸鈉等)作用下聚合成一定大小的金納米顆粒，因靜電作用形成穩(wěn)定的帶負(fù)電的疏水膠體。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)、酶、毒素、激素、抗生素等正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域的免疫學(xué)分析。但膠體金免疫層析法只能實(shí)現(xiàn)定性或半定量檢測(cè)，不能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量檢測(cè)。

因此，亟待發(fā)展微型便攜式定量免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)。有關(guān)移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定的研究為上述問(wèn)題的解決提供了新原理和新途徑(H.Y.Wang,Y.T.Shi,J.Yan,J.Y.Dong,S.Li,H.Y.Xie,L.Y.Fan,C.X.Cao,2014,Analytical Chemistry,86,2888‐2894)。MRB‐ET是指堿性(酸性)待測(cè)物質(zhì)在電場(chǎng)作用下與電泳通道內(nèi)的酸性(堿性)溶液發(fā)生持續(xù)的中和反應(yīng)形成移動(dòng)反應(yīng)界面(MRB)，通過(guò)MRB移動(dòng)速度與待測(cè)物質(zhì)濃度之間的關(guān)系檢測(cè)待測(cè)物濃度的技術(shù)。MRB‐ET已用于乳品食品蛋白含量測(cè)定，解決了長(zhǎng)期困擾凱氏定氮技術(shù)的非蛋白氮(NPN)干擾的問(wèn)題(CN102680556,CN201310089084)以及乳品食品以次摻好定量分析的問(wèn)題(CN201510542254,CN105136953)。此外，MRB‐ET還成功的用于測(cè)定過(guò)氧化物酶活性，有效地對(duì)各項(xiàng)酶學(xué)指標(biāo)進(jìn)行快速測(cè)定(CN201610021350)。MRB‐ET最顯著的優(yōu)點(diǎn)是形成的MRB能夠用裸眼直接觀測(cè)，極大簡(jiǎn)化了檢測(cè)裝置，無(wú)需信號(hào)檢測(cè)儀器，為微型化免疫學(xué)定量分析創(chuàng)造了條件。目前為止，MRB‐ET技術(shù)尚未應(yīng)用到酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)分析中，因此有必要開(kāi)發(fā)一種通過(guò)MRB‐ET定量檢測(cè)酶催化產(chǎn)物濃度進(jìn)而定量檢測(cè)目標(biāo)抗體、抗原、或半抗原的新技術(shù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述不足，提出一種基于移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定的定量酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法，通過(guò)對(duì)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附‐移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定(ELISA‐MRB‐ET)檢測(cè)，得到MRB移動(dòng)距離與抗原濃度的數(shù)學(xué)模型并進(jìn)行校正，對(duì)樣品可根據(jù)其MRB移動(dòng)距離直接讀出其待測(cè)抗原濃度。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

本發(fā)明通過(guò)在相同條件下分別對(duì)抗原濃度不同且已知的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行ELISA‐MRB‐ET，從而建立移動(dòng)反應(yīng)界面的移動(dòng)距離與抗原濃度的數(shù)學(xué)模型，并沿電泳通道標(biāo)注抗原濃度標(biāo)尺；在測(cè)試階段通過(guò)對(duì)待測(cè)樣品在相同條件下進(jìn)行ELISA‐MRB‐ET，測(cè)得的移動(dòng)反應(yīng)界面的停留位置所應(yīng)的濃度刻度即為樣品中的抗原濃度。

所述的ELISA‐MRB‐ET包括：ELISA測(cè)定和移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定(MRB‐ET)，其中：MRB‐ET滴定通過(guò)滴定ELISA酶催化產(chǎn)物間接實(shí)現(xiàn)抗原濃度檢測(cè)，ELISA測(cè)定通過(guò)抗原與固相一抗結(jié)合，洗去未結(jié)合物質(zhì)后加入酶標(biāo)二抗進(jìn)行孵育，洗去未結(jié)合的酶標(biāo)二抗，形成的抗原抗體復(fù)合物，滴加底物后在酶的催化作用下形成帶有顏色的弱堿性/弱酸性的酶催化產(chǎn)物，酶催化產(chǎn)物生成發(fā)光或吸光產(chǎn)物。

所述的ELISA測(cè)定中的酶標(biāo)二抗的酶為辣根過(guò)氧化物酶；底物為魯米諾和過(guò)氧化氫組合。

所述的移動(dòng)反應(yīng)界面電泳滴定通過(guò)以下方式實(shí)現(xiàn)：弱堿性/弱酸性的酶催化產(chǎn)物在兩端施加電場(chǎng)的電泳通道內(nèi)向陽(yáng)極/陰極移動(dòng)，與電泳通道內(nèi)的填充介質(zhì)中的緩沖溶液相遇并發(fā)生中和反應(yīng)，發(fā)生明顯的顏色變化。

所述的電泳通道兩端分別設(shè)有陰極室和陽(yáng)極室。

所述的填充介質(zhì)為凝膠支持介質(zhì)或全液相介質(zhì)。

所述的凝膠支持介質(zhì)采用但不限于：瓊脂糖或聚丙烯酰胺。

所述的背景緩沖溶液為與弱堿性/弱酸性的酶催化產(chǎn)物相對(duì)應(yīng)的弱酸性/弱堿性溶液。

所述的移動(dòng)反應(yīng)界面還包括：移動(dòng)絡(luò)合界面、移動(dòng)氧化還原界面、移動(dòng)沉淀界面和移動(dòng)親和界面。

所述的數(shù)學(xué)模型具體為：其中：C_antigen為抗原濃度，d_MRB為MRB的移動(dòng)距離，t₁為電泳時(shí)間，在實(shí)驗(yàn)條件一致的情況下h、k和i為常數(shù)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度與對(duì)應(yīng)的MRB移動(dòng)距離擬合得到。

技術(shù)效果

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明省去了光密度、熒光、或化學(xué)發(fā)光檢測(cè)器，將各種光信號(hào)轉(zhuǎn)化成簡(jiǎn)單的可視化長(zhǎng)度度量，由裸眼或成像直接讀出，極大地簡(jiǎn)化了酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)，降低成本；并且由于電泳能夠?qū)嵭胁⑿嘘嚵屑夹g(shù)，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為陰極室內(nèi)酶聯(lián)免疫吸附的原理圖；

圖2為MRB‐ET滴定原理示意圖，t₁時(shí)未施加電場(chǎng)，施加電場(chǎng)t₂后MRB移動(dòng)距離為d；

圖3為SEB型腸毒素于標(biāo)有待濃度刻度的電泳通道陣列中的檢測(cè)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明，本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

如圖1～3所示，本實(shí)施例通過(guò)在相同條件下，對(duì)濃度不同且已知的SEB型腸毒素的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行ELISA‐MRB‐ET檢測(cè)，并建立MRB移動(dòng)距離與底物濃度的函數(shù)關(guān)系、沿電泳通道標(biāo)注濃度標(biāo)尺；在樣品檢測(cè)中，使用相同的條件進(jìn)行ELISA‐MRB‐ET檢測(cè)，形成的MRB的停留位置所應(yīng)的濃度刻度即為樣品中底物濃度；具體包括以下步驟：

步驟1、在電泳通道內(nèi)填充凝膠并進(jìn)行一抗包被和封閉。

所述的電泳通道為直型電泳通道，其長(zhǎng)寬高分別為20mm、1.0mm和0.5mm。

所述的電泳通道兩端分別設(shè)有陰極室和陽(yáng)極室。

所述的填充凝膠是指：將電泳通道依次使用100mM的氫氧化鈉溶液和去離子水各沖洗10min后在分離通道內(nèi)快速注入加熱融化的瓊脂糖，冷卻凝固。

所述的瓊脂糖凝膠內(nèi)含有100mM KCl，100mM Tris-HCl(pH 6.0)背景緩沖溶液。

所述的背景緩沖溶液在MRB‐ET過(guò)程中對(duì)酶催化產(chǎn)物能夠起到電遷移阻滯效應(yīng)。

所述的一抗包被是指：將10mg/L的200μL單抗1D2作為一抗在42℃的條件下孵育5h后包被陰極室，并用磷酸緩沖液清洗3次。

所述的封閉是指：使用200μL，1％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)封閉板上的空白位點(diǎn)，并在37℃的條件下孵育30min，用磷酸緩沖溶液清洗3次，洗凈未吸附物質(zhì)。

步驟2、配制標(biāo)準(zhǔn)樣品，在陰極室內(nèi)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附，并在電泳通道內(nèi)進(jìn)行MRB‐ET檢測(cè)。

所述的標(biāo)準(zhǔn)樣品通過(guò)以下方法配制：采用磷酸鹽緩沖液將SEB標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為10μg/L、5μg/L、2.5μg/L、1.25μg/L、0.625μg/L和0μg/L六個(gè)濃度。

所述的酶聯(lián)免疫吸附包括以下步驟：

S1：五個(gè)稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品中的抗原(SEB)分別與陰極室內(nèi)的固相一抗結(jié)合，100μL標(biāo)準(zhǔn)樣品和固相一抗的混合物在37℃的條件下孵育30min后用磷酸緩液清洗3次，洗去未結(jié)合物質(zhì)后加入1μg/mL、100μL辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的二抗2D1在37℃的條件下孵育15min后，用磷酸緩沖液清洗3次，形成抗原抗體復(fù)合物。

S2：各陰極室分別加入濃度為80mM的魯米諾和過(guò)氧化氫各50μL，反應(yīng)30min，形成弱堿性的酶催化產(chǎn)物。

所述的MRB‐ET檢測(cè)是指：對(duì)各標(biāo)準(zhǔn)樣品的酶催化產(chǎn)物施加12V的分離電壓，持續(xù)30s后停止電泳，讀取MRB移動(dòng)距離。

所述的MRB通過(guò)以下方式形成：帶有負(fù)電荷的酶催化產(chǎn)物(激發(fā)態(tài)魯米諾)在電泳通道內(nèi)向陽(yáng)極室移動(dòng)，與瓊脂糖凝膠中的酸性緩沖溶液相遇并發(fā)生中和反應(yīng)，激發(fā)態(tài)魯米諾猝滅發(fā)生顏色變化。

步驟3、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品的抗原濃度和對(duì)應(yīng)的MRB移動(dòng)距離，得到MRB的移動(dòng)距離與抗原濃度的散點(diǎn)圖，對(duì)散點(diǎn)圖按照MRB移動(dòng)距離與抗原濃度之間的函數(shù)公式進(jìn)行擬合，得到MRB移動(dòng)距離和抗原濃度的校正數(shù)學(xué)模型。

所述的MRB移動(dòng)距離與抗原濃度的數(shù)學(xué)模型為：其中：C_antigen為抗原濃度，d_MRB為MRB的移動(dòng)距離，t₁為電泳時(shí)間，相同的ELISA‐MRB‐ET的實(shí)驗(yàn)條件下h、k和i為常數(shù)。

所述的MRB移動(dòng)距離與抗原濃度的數(shù)學(xué)模型根據(jù)以下關(guān)系得到：在MRB‐ET檢測(cè)時(shí)，MRB以一定速度向陽(yáng)極移動(dòng)，其移動(dòng)速度(v_MRB)受到酶催化產(chǎn)物的濃度(C_prodcut)和電泳速度(v_prodcut)，以及氫離子成分濃度和成分速度的共同影響，即而電泳通道中的緩沖溶液恒定不變，且緩沖溶液中酸的濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶催化產(chǎn)物濃度，即存在：而在標(biāo)準(zhǔn)樣品和樣品檢測(cè)中均采用相同的實(shí)驗(yàn)條件，因此電場(chǎng)恒定不變，存在：v_product＝constant 3；結(jié)合上述方程，可得：C_product＝av_MRB+b，其中：a和b為常數(shù)。

在ELISA中，抗原濃度(C_antigen)與酶標(biāo)抗體濃度(即酶濃度C_enzyme)成正比，即存在：C_antigen∝C_enzyme；在酶催化中，底物濃度遠(yuǎn)大于酶催化能力；因此，在給定時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物濃度(C_prodcut)與酶濃度成正比關(guān)系，即存在：C_product∝C_enzyme；結(jié)合兩個(gè)公式，可得：C_antigen∝C_product。出于穩(wěn)妥考慮，采用二階方程表示C_antigen和C_product之間關(guān)系：其中：e、f和g為常數(shù)。

結(jié)合上述公式，可得：其中：h、k和i均為常數(shù)，由于MRB‐ET檢測(cè)采用相同的電泳時(shí)間，則t₁同樣可視為常數(shù)。

所述的標(biāo)注濃度標(biāo)尺是指按照校正后的公式對(duì)電泳通道上的所有刻度一一進(jìn)行標(biāo)注。

步驟4、在與標(biāo)準(zhǔn)樣品相同條件下通過(guò)ELISA‐MRB‐ET檢測(cè)樣品中的抗原濃度，電泳結(jié)束時(shí)，MRB的停留位置所對(duì)應(yīng)的濃度刻度即為樣品中待測(cè)抗原濃度。

所述的MRB還包括：移動(dòng)絡(luò)合界面、移動(dòng)氧化還原界面、移動(dòng)沉淀界面和移動(dòng)親和界面。

所述的樣品通過(guò)對(duì)金黃葡萄球菌污染的牛奶進(jìn)行培養(yǎng)，10000r/min離心15min取上清獲得。

所述的SEB型腸毒素為金黃葡萄糖球菌腸毒素的一種，金黃葡萄糖球菌腸毒素是引起食物中毒的致病因子之一，占細(xì)菌性食物中毒的第二位。

本實(shí)施例采用SEB雙克隆抗體免疫檢測(cè)。

實(shí)施例2

本實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)樣品為糖化血紅蛋白，采用雙抗體夾心法測(cè)定人全血中的HbA1C。

本實(shí)施例的一抗為10mg/L、200μL的觸珠蛋白，在4℃的條件包被陰極室過(guò)夜，并用磷酸緩沖液清洗3次。

本實(shí)施例的封閉是指：使用200μL、3％的BSA封閉板上的空白位點(diǎn)，并在37℃的條件下孵育1h，用磷酸緩沖溶液清洗3次，除去多余液體。

與實(shí)施例1相比的區(qū)別在于：本實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)樣品的倍比稀釋濃度分別為5μg/L、2.5μg/L、1.5μg/L、0.625μg/L、0.3125μg/L和0μg/L。

所述的糖化血紅蛋白可反映患者近8～12周的血糖控制情況，是糖尿病診斷新標(biāo)準(zhǔn)和治療監(jiān)測(cè)的”金標(biāo)準(zhǔn)”。

實(shí)施例3

本實(shí)施例的標(biāo)準(zhǔn)樣品為生菜上殘留的硫磷。

所述的硫磷為一種廣譜殺蟲(chóng)劑，我國(guó)要求農(nóng)產(chǎn)品的最大殘留量應(yīng)小于0.1mg/kg，而蔬菜和水果上不得檢出。

本實(shí)施例的一抗為羊抗兔抗體，按2000倍數(shù)稀釋?zhuān)?00μL和4℃的條件下包被陰極室過(guò)夜，并用磷酸緩沖液清洗3次。

與實(shí)施例1相比的區(qū)別在于：本實(shí)施例的硫磷標(biāo)準(zhǔn)樣品的稀釋濃度分別為500ng/mL、100ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.5ng/mL和0ng/mL。

本實(shí)施例的酶聯(lián)免疫吸附的實(shí)驗(yàn)條件為：10μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品，45mL的酶標(biāo)物和45mL的抗體在陰極室內(nèi)37℃孵育30min，用磷酸緩液清洗3次。

本實(shí)施例檢測(cè)的樣品通過(guò)以下方法獲得：取2g的生菜樣品，剪碎后用5mL的甲醇提取過(guò)夜，4000r/min離心20min，取上清，用氮?dú)獯蹈珊笥煤?0％的甲醇的磷酸鹽緩沖液重新溶解。