本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定性強的同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，屬于臨床體外檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：同型半胱氨酸（homocysteine,HCY）又稱高半胱氨酸,是蛋氨酸去甲基后形成的一種含硫氨基酸,屬于蛋氨酸循環(huán)的中間產(chǎn)物；是細胞內(nèi)甲硫氨酸轉(zhuǎn)甲基化過程中產(chǎn)生的一種含有巰基的氨基酸，Hcy經(jīng)過循環(huán)被運輸?shù)窖逯校逯械腍cy多數(shù)以氧化形式與血清中的白蛋白通過二硫鍵的形式結(jié)合形成Hcy-蛋白復(fù)合物，只有少量的以游離型和二硫鍵連接的Hcy-SS-Hcy的形式存在；同型半胱氨酸在代謝過程中形成半胱氨酸或蛋氨酸，在維生素B6的轉(zhuǎn)硫基途徑中，Hcy被不可逆轉(zhuǎn)地分解為半胱氨酸，而大多數(shù)Hcy在葉酸和維生素B12依賴的蛋氨酸合成酶作用下重新形成甲硫氨酸；同型半胱氨酸是蛋氨酸代謝產(chǎn)生的一種含硫氨基酸；Hcy水平與心血管疾病密切相關(guān)；血液中增高的Hcy因為刺激血管壁引起動脈血管的損傷，最終引起心臟血流受阻；高同型半胱氨酸尿癥患者，由于嚴重遺傳缺陷影響Hcy代謝，造成高Hcy血癥；輕微的遺傳缺陷或B族維生素營養(yǎng)缺乏會伴隨中度或輕度的Hcy升高，也會增加心臟病的危險；Hcy升高還可引起神經(jīng)管畸及先天性畸形等出生缺陷類疾病。目前血液同型半胱氨酸的檢測方法很多，主要有Refsum等在1985年建立的同位素檢測法，該法靈敏度高,特異性強，由于操作繁瑣且有放射污染,雖經(jīng)改良也未能推廣使用；1987年Stabler首先報告了氣相色譜-質(zhì)譜測定tHCY色譜檢測法，該方法測定精度和分析速度能用于大量樣本分析，但是成本較高；目前使用較多的免疫學(xué)法和酶法,這兩種方法具有方法簡單、準確度與精密度高的優(yōu)點，相對于免疫學(xué)法，酶法成本更低，使用更方便，能結(jié)合全自動生化分析儀，隨著目前酶法試劑中酶類提純水平的提高，該法檢測試劑的成本進一步降低，而酶法檢測血清同型半胱氨酸又分為兩種方法，一種是使用S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)水解酶（SAHase），因此叫水解酶法，而另一種是使用胱硫醚-β-合成酶(CBS)，也叫胱硫醚法，前者成本較高，而后者酶成本較低，更利于推廣，其檢測原理為同型半胱氨酸(氧化形式)被還原成游離的同型半胱氨酸,在胱硫醚-β-合成酶(CBS)的催化下和絲氨酸反應(yīng)生成L-胱硫醚,L-胱硫醚被胱硫醚-β-裂解酶分解成同型半胱氨酸和丙酮酸,丙酮酸參與NADH的顯色反應(yīng),生成的同型半胱氨酸再次參與第一步反應(yīng),如此循環(huán)進行，但是由于胱硫醚循環(huán)酶法檢測血清同型半胱氨酸需要加入NADH、胱硫醚-β-合成酶、胱硫醚-β-裂解酶等酶或者輔酶，這些酶類在液態(tài)的情況下容易衰減，尤其是在溫度偏高的環(huán)境下，非常容易衰減，因此市面上多為凍干粉的試劑，這給臨床使用帶來了很大的不便，因此能夠解決酶的穩(wěn)定性，提高試劑的穩(wěn)定性，對臨床的推廣具有較大的意義。因此本發(fā)明根據(jù)此問題發(fā)明了一種穩(wěn)定性強的胱硫醚循環(huán)酶法的雙試劑液體同型半胱氨酸檢測試劑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明涉及一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，以及檢測方法。本發(fā)明是通過以下步驟得到的：一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑試劑組成成分如下：試劑1（R1）：TRIS（三羥甲基氨基甲烷）-HCL100mmol/LNADH0.47mmol/lLDH3KU/L絲氨酸0.76mmol防腐劑0.5-1g/LTCEP(三氯乙基磷酸酯)2.9mmol/L保護劑2-5ml/L表面活性劑1-2ml/L重金屬離子螯合劑1-5mmol/L底物穩(wěn)定劑3-5g/L試劑2（R2）：TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)緩沖液100mmol/L防腐劑0.5g/L保護劑13-6m/L保護劑210-20g/L表面活性劑1-2ml/L保護劑30.5-1g/LCBS0.5KU/LCBL3KU/L。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R1中緩沖液為25℃，pH為7.8的100mmol/L的TRIS（三羥甲基氨基甲烷）-HCL緩沖液。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R2中緩沖液為25℃，pH為7.8的100mmol/L的TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)緩沖液。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述防腐劑為MIT（甲基異噻唑啉酮）。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R1中保護劑為聚乙二醇400。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述表面活性劑為吐溫-405。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R1中重金屬離子螯合劑為EDTA.NA2。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R1中底物穩(wěn)定劑為CCD(上海西寶)。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R2中保護劑1為乙二醇。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R2中保護劑2為β-環(huán)糊精。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述試劑R2中保護劑3為黃原膠。一種穩(wěn)定性強的雙試劑液態(tài)同型半胱氨酸（HCY）檢測試劑，所述的同型半胱氨酸檢測試劑來檢測同型半胱氨酸的檢測方法，使用全自動生化分析儀利用速率法進行測定，檢測主波長為340nm。所述的檢測方法，R1試劑和R2試劑的比例為48:13。本發(fā)明的有益效果：1）本發(fā)明在試劑R1中加入了保護劑聚乙二醇400和底物穩(wěn)定劑能有效的保護LDH和NADH；2）采用MIT（甲基異噻唑啉酮），能有效的防止菌類的生長，阻止試劑的腐敗，并且不會對試劑中酶類產(chǎn)生抑制作用；3）采用吐溫-405表面活性劑，能夠有效的提高試劑檢測結(jié)果的精密度；4）為了提高試劑R2中CBS和CBL兩種酶的穩(wěn)定性，在試劑中添加了乙二醇、β-環(huán)糊精以及黃原膠，他們的協(xié)同作用能非常好的提高酶的穩(wěn)定性，從而有效的提高試劑的穩(wěn)定性。附圖說明圖1為實施例2與氣相色譜-質(zhì)譜法的相關(guān)性圖；圖2為實施例3與氣相色譜-質(zhì)譜法的相關(guān)性圖；圖3為15天開瓶穩(wěn)定性監(jiān)測跟蹤圖；圖4為7天37℃穩(wěn)定性檢測跟蹤圖；圖5為實施例1試劑檢測方法，其中計算：HCY含量（umol/L）＝（?A測定÷?A標準）×C標準；圖6為實施例2試劑檢測方法，其中計算：HCY含量（umol/L）＝（?A測定÷?A標準）×C標準；圖7為實施例3試劑檢測方法，其中計算：HCY含量（umol/L）＝（?A測定÷?A標準）×C標準；圖8為表4實施例試劑與市場常見并得到認可的尿素測定試劑盒對比檢測結(jié)果。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步說明：實施例1一種市面上現(xiàn)有的的雙試劑的HCY檢測試劑的配置方案：R1：NADH(0.47mM),LDH(38KU/L)，絲氨酸(0.76mM)，Tris緩沖液（50mM），NaN3(＜1%)，TCEP（2.9mM）；R2：CBS（0.748KU/L）；CBL（16.4KU/L）NaN3（＜1%）。本實施例試劑的使用方法：本實施例描述的HCY檢測試劑，在使用時采用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，如日立7180全自動分析儀等，利用固定時間法進行測定。將R1和R2按照48:13的比例放置到對應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對應(yīng)位置放置好蒸餾水、標準品和樣本，操作如圖5。實施例2本實施例描述的是一種穩(wěn)定性強的液態(tài)雙試劑的HCY檢測試劑，組成成分：試劑1（R1）：TRIS三羥甲基氨基甲烷100mmol/LNADH0.47mmol/lLDH3KU/L絲氨酸0.76mmol/LMIT（甲基異噻唑啉酮）0.5g/LTCEP(三氯乙基磷酸酯)2.9mmol/L聚乙二醇4002ml/L曲拉通-4051ml/L乙二胺四乙酸二鈉1mmol/LCCD(上海西寶)3g/L試劑2（R2）：TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)緩沖液100mmol/LMIT（甲基異噻唑啉酮）0.5g/L乙二醇3m/Lβ-環(huán)糊精10g/L曲拉通-4051ml/L黃原膠0.5g/LCBS0.5KU/LCBL3KU/L。本實施例試劑的使用方法：本實施例描述的HCY檢測試劑，在使用時采用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，如日立7180全自動分析儀等，利用固定時間法進行測定。將R1和R2按照48:13的比例放置到對應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對應(yīng)位置放置好蒸餾水、標準品和樣本，操作如圖6。實施例3本實施例描述的一種關(guān)鍵保護成分增加后的穩(wěn)定性強的液態(tài)雙試劑HCY檢測試劑的試劑組成成分：試劑1（R1）：TRIS三羥甲基氨基甲烷100mmol/LNADH0.47mmol/lLDH3KU/L絲氨酸0.76mmol/LMIT（甲基異噻唑啉酮）1g/LTCEP(三氯乙基磷酸酯)2.9mmol/L聚乙二醇4005ml/L曲拉通-4052ml/L乙二胺四乙酸二鈉5mmol/LCCD(上海西寶)5g/L試劑2（R2）：TES(N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸)緩沖液100mmol/LMIT（甲基異噻唑啉酮）1g/L乙二醇6m/Lβ-環(huán)糊精20g/L曲拉通-4052ml/L黃原膠1g/LCBS0.5KU/LCBL3KU/L。本實施例試劑的使用方法：本實施例描述的HCY檢測試劑，在使用時采用具有雙試劑功能的全自動生化分析儀，如日立7180全自動分析儀等，利用固定時間法進行測定。將R1和R2按照48:13的比例放置到對應(yīng)的試劑位上，在樣品盤的對應(yīng)位置放置好蒸餾水、標準品和樣本，操作如圖7。相關(guān)性實驗：利用實施例2、3中的配方配制試劑，與氣相色譜-質(zhì)譜法檢測血清同型半胱氨酸，同時檢測了20個臨床血清樣本，檢測結(jié)果如圖8所示。并獲得了兩種試劑的相關(guān)性曲線（如圖1和圖2所示），通過檢測結(jié)果顯示，實施例2、實施例3與氣相色譜-質(zhì)譜法檢測結(jié)果的相關(guān)性分別為0.9980和0.9985，說明了實施例2、實施例3與氣相色譜-質(zhì)譜法有極大的相關(guān)性。穩(wěn)定性比較試劑穩(wěn)定性驗證具體操作方法：關(guān)于試劑的穩(wěn)定性驗證，將分為試劑的15天開瓶穩(wěn)定性和7天37℃熱穩(wěn)定性驗證。首先將本實施例中的檢測試劑和實施例1、實施例2和實施例3中的檢測試劑，按照配方配置好，分別取相同的兩組，一組做15天開瓶穩(wěn)定性測試，將試劑開瓶放置在儀器的2-8℃冷藏箱中（15天不取出），作為15天開瓶穩(wěn)定性檢測；另一組做37℃熱穩(wěn)定性測試，封閉放置在37℃恒溫水浴鍋中（每天僅在檢測的時候取出，檢測完畢后，依然封口放回37℃水浴鍋中，連續(xù)7天），作為7天37℃熱穩(wěn)定性驗證；將試劑同時在日立7180全自動生化分析儀器上，按照如下圖5方法進行檢測，并在儀器上建立標準曲線；分別取高、低值樣本，各自平均分成15份，4℃儲存，每天高、低值樣本各取一個，并且跟蹤檢測結(jié)果，其跟蹤監(jiān)測趨勢如附圖2和附圖3。通過驗證，本試劑與氣相色譜-質(zhì)譜法對比相關(guān)性好，臨床檢測樣本結(jié)果一致，能夠達到市場對產(chǎn)品的應(yīng)用要求，是一種更加穩(wěn)定、良好的HCY檢測試劑。當(dāng)前第1頁1 2 3