生長(zhǎng)分化因子15 (gdf-15)多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供GDF15多肽、包含GDF15的構(gòu)建體以及其突變體。在各個(gè)實(shí)施方案中，所述GDF15多肽、包含GDF15的構(gòu)建體以及其突變體可具有治療或改善代謝障礙的用途。在各個(gè)實(shí)施方案中，所述代謝疾病或障礙是2型糖尿病、肥胖癥、血脂異常、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平以及糖尿病性腎病。
【專利說明】生長(zhǎng)分化因子15(GDF-15)多肽
[0001] 序列表
[0002] 本申請(qǐng)含有序列表，所述序列表已以ASCII格式通過EFS-Web提交并且由此以引 用的方式整體并入本文。2013年1月28日創(chuàng)建的所述ASCII副本命名為A1682W0P. txt并 且大小為253, 155字節(jié)。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及⑶F15多肽、包含⑶F15的多肽以及其產(chǎn)生和用途。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 生長(zhǎng)分化因子15(⑶F15)為TGFP超家族的分支成員。它也稱為巨噬細(xì)胞抑 制細(xì)胞因子 l(MICl)(Bootcov MR, 1997, Proc Natl Acad Sci 94:11514-9·)、胎盤骨形 態(tài)發(fā)生因子（PLAB)(Hromas R 1997, Biochim Biophys Acta. 1354:40-4)、胎盤轉(zhuǎn)化生長(zhǎng) 因子 β (PTGFB) (Lawton LN 1997, Gene. 203:17-26)、前列腺衍生因子（PDF) (Paralkar VM 1998, J Biol Chem. 273:13760-7)以及非甾體類抗炎藥物活化基因（NAG-1) (Baek SJ 2001，J Biol Chem. 276:33384-92)。
[0006] 人⑶F15基因位于染色體19pl3. 2-13. 1上；大鼠⑶F15基因位于染色體16上； 并且小鼠⑶F15基因位于染色體8上。⑶F15開放閱讀框跨越兩個(gè)外顯子（Bottner Μ 1999, Gene. 237:105-11和NCBI)。成熟⑶F15肽與其它家族成員共有低同源性（Katoh Μ 2006, Int J Mol Med. 17:951-5.)。
[0007] GDF15被合成為大的前體蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在雙堿性切割位點(diǎn)（dibasic cleavage site)上被切割以釋放羧基端成熟肽。小鼠和大鼠⑶F15前體肽原均含有303 個(gè)氨基酸。人全長(zhǎng)前體含有308個(gè)氨基酸。嚙齒類動(dòng)物成熟肽在于RGRR(SEQ ID NO: 1)切 割位點(diǎn)加工后含有115個(gè)氨基酸。人成熟肽在于RGRRRAR(SEQ ID N0:2)切割位點(diǎn)加工后 含有112個(gè)氨基酸。人成熟⑶F15肽與大鼠和小鼠成熟⑶F15肽共有66. 1 %和68. 1%的 序列相似性（Bottner Μ 1999, Gene. 237:105-11 ;Bauskin AR 2000，EMB0 J. 19:2212-20; NCBI)。在成熟GDF15肽中不存在糖基化位點(diǎn)。
[0008] 成熟GDF15肽含有形成半胱氨酸結(jié)基序（具有三個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵）所需的七個(gè)保守 半胱氨酸殘基和對(duì)于TGFi3超家族成員常見的單個(gè)鏈間二硫鍵。成熟GDF15肽進(jìn)一步含有 形成第四鏈內(nèi)二硫鍵的兩個(gè)另外的半胱氨酸殘基。生物活性GDF15是通過一個(gè)鏈間二硫鍵 共價(jià)連接的成熟肽的25KD的同二聚體。
[0009] 已報(bào)道⑶F15循環(huán)水平在多種病理和生理狀況，最明顯地懷孕（Moore AG 2000. J Clin Endocrinol Metab 85:4781-4788)、β-地中海貧血（Tanno T 2007, Nat Med 13:1096-101) (Zimmermann MB, 2008 Am JClin Nutr 88:1026-31)以及先天性紅細(xì)胞生成 障礙性貧血（Tamary H2008, Blood. 112:5241-4)中升高。在文獻(xiàn)報(bào)道中，⑶F15還與多種生 物活性有關(guān)。⑶F15敲除和轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明⑶F15可防止局部缺血/再灌注或過載 誘發(fā)的心臟損傷（Kempf T, 2006, Circ Res. 98:351-60) (XuJ, 2006, Circ Res. 98:342-50)、 防止年齡相關(guān)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元和感覺神經(jīng)元損失（Strelau J, 2009, J Neurosci. 29:13640-8)、 適度防止腎的代謝性酸中毒，并且可引起癌癥患者的惡病質(zhì)（Johnen H2007 Nat Med. 11:1333-40)。許多小組還研究了⑶F15在細(xì)胞凋亡和增殖中的作用，并且使用不同的 細(xì)胞培養(yǎng)物和異種移植模型報(bào)道了有爭(zhēng)議的結(jié)果。關(guān)于轉(zhuǎn)基因小鼠的研究顯示⑶F15防止 致癌物或Ape突變誘導(dǎo)的腸和肺中的瘤形成（Baek SJ 2006, Gastroenterology. 131:1553 -60 ；Cekanova Μ 2009, Cancer Prev Res 2:450-8)〇
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 本文提供一種包含⑶F15多肽和一個(gè)或多個(gè)Fc序列的構(gòu)建體。在一個(gè)實(shí)施方案 中，所述構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)Fc序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列 獨(dú)立地包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID N0:18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、 109和111。在另一個(gè)實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)所述Fc序列締合。在另一個(gè)實(shí)施方案中， 所述GDF15多肽和一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列形成連續(xù)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述GDF15 多肽和Fc序列通過接頭連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含選自由以下組成的組 的序列：SEQ ID勵(lì):44、50、57、61、65、69、74、79、84、95和104。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu) 建體進(jìn)一步包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID N0:18、19、85、86、89、90、91、99、100、 108、109和110。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種包含本文所述的構(gòu)建體的二聚體。在一個(gè) 具體實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含：（a)包含SEQ ID N0:18的序列和包含SEQ ID N0:44的 序列；（b)包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO: 50的序列；（c)包含SEQ ID NO: 18 的序列和包含SEQ ID N0:57的序列；（d)包含SEQ ID N0:86的序列和包含SEQ ID N0:61 的序列；（e)包含SEQ ID NO :86的序列和包含SEQ ID NO :65的序列；（f)包含SEQ IDN0:86 的序列和包含SEQ ID NO :69的序列；（g)包含SEQ ID NO :86的序列和包含SEQ ID NO :74的 序列；（h)包含SEQ ID NO :86的序列和包含SEQ ID NO :79的序列；⑴包含SEQ ID NO :86 的序列和包含SEQ ID N0:84的序列；（j)包含SEQ ID N0:91的序列和包含SEQ ID N0:95 的序列；或（k)包含SEQ ID NO: 100的序列和包含SEQ ID NO: 104的序列，以及包含所述構(gòu) 建體的二聚體。
[0012] 本文還提供一種包含⑶F15多肽和兩個(gè)或更多個(gè)Fc序列的構(gòu)建體，其中一個(gè)或多 個(gè)Fc序列獨(dú)立地包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID N0:23、110、114和115。在一個(gè) 實(shí)施方案中，兩個(gè)或更多個(gè)Fc序列締合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述GDF15多肽和一個(gè)或多 個(gè)所述Fc序列形成連續(xù)序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述GDF15多肽和Fc序列通過接頭 連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含SEQ ID N0:113。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供 一種包含本文所述的構(gòu)建體的二聚體。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含：包含SEQ ID N0:110的序列和包含SEQ ID N0:113的序列，以及包含所述構(gòu)建體的二聚體。
[0013] 本文還提供一種包含⑶F15多肽和兩個(gè)或更多個(gè)Fc序列的構(gòu)建體，其中所述Fc 序列包含SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:30。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述兩個(gè)Fc序列通過接頭 連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID N0:87、88 和131。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一 Fc序列的C末端與第二Fc序列的N末端相連接。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，所述GDF15多肽和一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列形成連續(xù)序列。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，所述⑶F15多肽和Fc序列通過接頭連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述接頭包含SEQ ID N0:31。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供一種包含本文所述的構(gòu)建體的二聚體的構(gòu)建體。在 一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述構(gòu)建體包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID N0:33、123和 128,以及包含所述構(gòu)建體的二聚體。
[0014] 附圖簡(jiǎn)述
[0015] 圖 1 為描繪帶成對(duì)電荷的（delHinge)構(gòu)建體DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc( +)(圖認(rèn)）、帶成對(duì)電荷的構(gòu)建體0?11^(-)-(6 45)4-60?15:0?11^(+)(圖18)以及1^1^構(gòu)建 體？(：-(6 45)84(^5(645)4-60?15(圖1〇的布置的一系列圖形。圖1公開了"（6 45)4"彼0 ID N0:20)、"GS(G4S)4"（SEQ ID N0:31)和 "（G4S)8"（SEQ ID N0:34)。
[0016] 圖2為示出攝食過度的ob/ob小鼠的食物攝入測(cè)定結(jié)果的表，在所述小鼠 中對(duì)以下⑶F15構(gòu)建體的二聚體進(jìn)行研究：DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+) 、DhCpmFc (+) - (G4S) 4-GDF15 : DhCpmFc (-)、DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15 : DhCpmFc (+)、D hCpmFc (+) - (G4S) 4-GDF15 (H6D) : DhCpmFc (-)、DhCpmFc (+) - (G4S) 4-GDF15 (N3Q) : DhCp mFc (-)、DhCpmFc (+) -GDF15 : DhCpmFc (-)、DhCpmFc (+) -G4-GDF15 : DhCpmFc (-)、DhCpm Fc (+) - (G4S) 2-GDF15 : DhCpmFc (-)、DhCpmFc (+) - (G4Q) 4-GDF15 : DhCpmFc (-)、DhCpmFc (+) - (IK)-GDF15: DhCpmFc (-)、DhCpmFc (+) (L351C)-G4-GDF15 : DhCpmFc (-) (L351C)、 DhCpmFc (+) (S354C) -G4-GDF15: DhCpmFc (-) (Y349C)、CpmFc (+) - (G4S) 4-⑶F15: CpmFc (-)、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15,Fc-(G 4S)3-Fc-GS(G4S)4-GDF15, Fc-(G4S)5-Fc-GS(G4S)4-GDF15、⑶F15以及⑶F15(H6D)變體。
[0017] 圖3為示出使用DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量 變化（l〇g[g蛋白質(zhì)/kgBW])的ob/ob小鼠食物攝入（g食物/g體重（BW))的影響的曲線 圖。
[0018] 圖4為示出使用DhCpmFc (+)-(G4S)4-GDF 15: DhCpmFc (-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量 變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0019] 圖5為示出使用DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量 變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0020] 圖 6 為示出使用 DhCpmFc (+) - (G4S) 4-GDF15 (H6D) :DhCpmFc (-)構(gòu)建體的二聚體對(duì) 隨劑量變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0021] 圖 7 為示出使用 DhCpmFc (+) -(G4S)4-GDF15 (N3Q) :DhCpmFc (-)構(gòu)建體的二聚體對(duì) 隨劑量變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0022] 圖8為示出使用DhCpmFc (+)-GDF 15: DhCpmFc (-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量變化的 ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0023] 圖9為示出使用DhCpmFc(+)-G4-GDF15:DhCpmFc(-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量變 化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0024] 圖10為示出使用DhCpmFc (+)-(G4S)2-GDF15:DhCpmFc (-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑 量變化的ob/ob小鼠的食物攝入的影響的曲線圖。
[0025] 圖11為示出使用DhCpmFc (+) - (G4Q) 4-GDF15:DhCpmFc (-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑 量變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0026] 圖12為示出使用DhCpmFc(+)-(lK)-GDF15:DhCpmFc(-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量 變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0027] 圖 13 為示出使用 DhCpmFc(+) (L351C)-G4-GDF15:DhCpmFc(_) (L351C)構(gòu)建體的二 聚體對(duì)隨劑量變化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0028] 圖 14 為示出使用 DhCpmFc(+) (S354C)-G4-⑶F15:DhCpmFc(_) (Y349C)構(gòu)建體的二 聚體對(duì)隨劑量變化的〇b/〇b小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0029] 圖15為示出使用CpmFc(+)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(-)構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量變 化的ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0030] 圖16為示出使用Fc-G (G4S) 8-Fc-GS (G4S) 4-GDF15構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量變化的 ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0031] 圖17為示出使用Fc-G (G4S) 3-Fc-GS (G4S) 4-GDF15構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量變化的 ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0032] 圖18為示出使用Fc-G (G4S) 5-Fc_GS (G4S) 4_GDF15構(gòu)建體的二聚體對(duì)隨劑量變化的 ob/ob小鼠食物攝入的影響的曲線圖。
[0033] 圖19為示出使用天然成熟⑶F15二聚體對(duì)隨劑量變化的ob/ob小鼠食物攝入的 影響的曲線圖。
[0034] 圖20為示出使用天然成熟h⑶F15二聚體對(duì)隨劑量變化的ob/ob小鼠食物攝入的 影響的曲線圖。
[0035] 圖21為示出使用成熟h⑶F15 (H6D)變體二聚體對(duì)隨劑量變化的ob/ob小鼠食物 攝入的影響的曲線圖。
[0036] 圖22為脂質(zhì)耐受性測(cè)定結(jié)果的條形圖，其示出天然成熟GDF15二聚體（lmg/kg，靜 脈注射（i· V.))、Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體（lmg/kg，靜脈注射）以及 對(duì)照對(duì)甘油三酯（mg/dL)的影響。
[0037] 圖23為使用DhCpmFC(-)-(G4S)4-GDF15 :DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體的脂質(zhì)耐受 性測(cè)定結(jié)果的曲線圖，其示出對(duì)隨劑量變化（l〇g[g構(gòu)建體/kg BW])的甘油三酯（mg/dL) 的影響。
[0038] 圖24為示出使用天然成熟hGDF15的二聚體的脂質(zhì)耐受性測(cè)定的結(jié)果的曲線圖。
[0039] 圖25為示出使用成熟hGDF15 (H6D)變體的二聚體的脂質(zhì)耐受性測(cè)定的結(jié)果的曲 線圖。
[0040] 圖 26 為示出使用 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)在DI0(飲食誘導(dǎo)性肥 胖）小鼠中執(zhí)行的兩周0GTT的結(jié)果的曲線圖。
[0041] 圖27為以AUC數(shù)據(jù)的形式總結(jié)圖26的數(shù)據(jù)的條形圖。
[0042] 圖 28 為示出使用 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)執(zhí)行的五周0GTT的結(jié) 果的曲線圖。
[0043] 圖29為以AUC數(shù)據(jù)的形式總結(jié)圖28的數(shù)據(jù)的條形圖。
[0044] 圖 30 為示出 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)DI0小鼠體重（g)的 影響的曲線圖。
[0045] 圖 31 為示出 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)DI0小鼠的食物攝 入（g食物/動(dòng)物/天）的影響的曲線圖。
[0046] 圖 32 為示出 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后的DI0 小鼠的葡萄糖水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0047] 圖 33 為示出 DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后的DI0 小鼠的胰島素水平（ng/mL)的影響的曲線圖。
[0048] 圖 34 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食過夜后的DI0小鼠的 胰島素水平（ng/mL)的影響的條形圖。
[0049] 圖 35 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后的DI0 小鼠的甘油三酯水平（mg/dL)的影響的曲線圖。
[0050] 圖 36 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食過夜后的DI0 小鼠的甘油三酯水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0051] 圖 37 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后的DI0 小鼠的總膽固醇水平（mg/dL)的影響的曲線圖。
[0052] 圖 38 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食過夜后的DI0 小鼠的總膽固醇水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0053] 圖39為示出在禁食4小時(shí)后對(duì)給以DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建 體的二聚體、CpmF C(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)的 DI0小鼠執(zhí)行的兩周0GTT的結(jié)果的曲線圖。
[0054] 圖40為以AUC數(shù)據(jù)的形式總結(jié)圖39的數(shù)據(jù)的條形圖。
[0055] 圖41為示出在禁食過夜后對(duì)給以DhCpmFc(-)-(G4S)4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體 的二聚體、〇?11^(-)-(6 45)4-60?15你11^(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮〇?〇出的010 小鼠執(zhí)行的五周0GTT的結(jié)果的曲線圖。
[0056] 圖42為以AUC數(shù)據(jù)的形式總結(jié)圖41的數(shù)據(jù)的條形圖。
[0057] 圖 43 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)DI0小鼠體重 的影響的曲線圖。
[0058] 圖 44 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)DI0小鼠食物 攝入的影響的曲線圖。
[0059] 圖 45 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后 的DI0小鼠的葡糖糖水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0060] 圖 46 為示出給以 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后 的DI0小鼠的胰島素水平（ng/mL)的影響的曲線圖。
[0061] 圖 47 為示出使用 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)自由進(jìn)食的DI0 小鼠的胰島素水平的影響的條形圖。
[0062] 圖 48 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食過夜后的 DI0小鼠的胰島素水平（ng/ml)的影響的條形圖。
[0063] 圖 49 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后 的DI0小鼠的甘油三酯水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0064] 圖 50 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)自由進(jìn)食的DI0 小鼠的甘油三酯水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0065] 圖 51 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食過夜后的 DI0小鼠的甘油三酯水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0066] 圖 52 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食4小時(shí)后 的DI0小鼠的總膽固醇水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0067] 圖 53 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)自由進(jìn)食的DI0 小鼠的總膽固醇水平（mg/dL)的影響的曲線圖。
[0068] 圖 54 為示出 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體、 CpmFC(-)-(G4S)4-GDF15:CpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及羅格列酮（Rosi)對(duì)禁食過夜后的 DI0小鼠的總膽固醇水平（mg/dL)的影響的條形圖。
[0069] 圖55為圖形化地描繪用于使用Fc- (G4S) 8-Fc-GS (G4S) 4_GDF15構(gòu)建體的二聚體和 DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體在肥胖的食蟹猴中執(zhí)行的五周治療 的研究設(shè)計(jì)的示意圖。
[0070] 圖56為示出所研究的食蟹猴中Fc-(G4S)8-Fc-GS(G 4S)4-GDF15構(gòu)建體的二聚體和 DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體的血清水平（ng/mL)的曲線圖。
[0071] 圖57為以葡萄糖AUC數(shù)據(jù)的形式示出在禁食過夜之后使用 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-⑶F15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc(-)-(G4S)4-⑶F15:DhCpmFc(+)構(gòu) 建體的二聚體以及媒介物對(duì)食蟹猴執(zhí)行的適應(yīng)0GTT(acclimati 〇n0GTT)的結(jié)果的條形圖。
[0072] 圖58為以葡萄糖AUC數(shù)據(jù)的形式示出在施用Fc-(G4S)8-Fc-GS(G 4S)4-GDF15構(gòu)建 體的二聚體、DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDFl5: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物2周之后， 在禁食過夜后對(duì)食蟹猴執(zhí)行的0GTT的結(jié)果的條形圖。
[0073] 圖59為以葡萄糖AUC數(shù)據(jù)的形式示出在施用Fc-(G4S)8-Fc-GS(G 4S)4-GDF15構(gòu)建 體的二聚體、DhCpmFc (-)-(G4S)4-GDFl5: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物5周之后， 在禁食過夜后對(duì)食蟹猴執(zhí)行的OGTT的結(jié)果的條形圖。
[0074] 圖60為以葡萄糖AUC數(shù)據(jù)的形式示出在禁食過夜后在使用 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-⑶F15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc(-)-(G4S)4-⑶F15:DhCpmFc(+)構(gòu) 建體的二聚體以及媒介物的4周洗脫（washout)之后對(duì)食蟹猴執(zhí)行的0GTT的結(jié)果的條形 圖。
[0075] 圖61為以胰島素 AUC數(shù)據(jù)的形式示出在禁食過夜后使用 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-⑶F15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc(-)-(G4S)4-⑶F15:DhCpmFc(+)構(gòu) 建體的二聚體以及媒介物對(duì)食蟹猴執(zhí)行的馴化0GTT的結(jié)果的條形圖。
[0076] 圖62為以胰島素 AUC數(shù)據(jù)的形式示出在施用Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S) 4-GDF15構(gòu)建 體的二聚體、DhCpmFC(-)-(G4S) 4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物2周之后， 在禁食過夜后對(duì)食蟹猴執(zhí)行的0GTT的結(jié)果的條形圖。
[0077] 圖63為以胰島素 AUC數(shù)據(jù)的形式示出在施用Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S) 4-GDF15構(gòu)建 體的二聚體、DhCpmFC(-)-(G4S) 4-GDF15:DhCpmFc(+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物5周之后， 在禁食過夜后對(duì)食蟹猴執(zhí)行的0GTT的結(jié)果的條形圖。
[0078] 圖64為以胰島素 AUC數(shù)據(jù)的形式示出對(duì)禁食過夜后在4周的 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-⑶F15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc(-)-(G4S)4-⑶F15:DhCpmFc(+)構(gòu) 建體的二聚體以及媒介物的洗脫的食蟹猴執(zhí)行的0GTT的結(jié)果的條形圖。
[0079] 圖 65 為在使用 Fc- (G4S) 8-Fc-GS (G4S) 4-GDF15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc (-) - (G4S) 4-GDF15 :DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物對(duì)食蟹猴執(zhí)行前一個(gè)月、30天治療期間以 及隨后洗脫期收集的體重（kg)隨時(shí)間（天）變化的曲線圖。
[0080] 圖 66 為在使用 Fc- (G4S) 8-Fc-GS (G4S) 4-GDF15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc (-) - (G4S )4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物對(duì)食蟹猴執(zhí)行前一周、5周治療期間以及 隨后的4周洗脫期收集的食物攝入（g)隨時(shí)間（天）變化的曲線圖。
[0081] 圖 67 為在使用 Fc-(G4S)8-Fc-GS(G4S)4-GDF15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc(-)-(G4S )4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物對(duì)食蟹猴執(zhí)行前一周、5周治療期間以及 隨后的4周洗脫期收集的空腹甘油三酯（mg/dL)隨時(shí)間（天）變化的曲線圖。
[0082] 圖 68 為在使用 Fc- (G4S) 8-Fc-GS (G4S) 4-GDF15 構(gòu)建體的二聚體、DhCpmFc (-) - (G4S )4-GDF15: DhCpmFc (+)構(gòu)建體的二聚體以及媒介物對(duì)食蟹猴執(zhí)行前一周、5周治療期間以及 隨后的4周洗脫期收集的空腹胰島素（ng/dL)隨時(shí)間（天）變化的曲線圖。
[0083] 發(fā)明詳述
[0084] 本公開提供⑶F15多肽和包含⑶F15多肽的構(gòu)建體。還提供所公開的分子的產(chǎn)生 以及（例如）在治療代謝障礙（如2型糖尿病、升高的葡萄糖水平、升高的胰島素水平、血 脂異?；蚍逝职Y）中的用途。
[0085] 本文使用的包括在實(shí)施例中的重組多肽和核酸方法通常為在Sambrook 等，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)或 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 等編著，Green Publishers Inc.和Wiley and Sons 1994)中列出的那些，所述文獻(xiàn)均出于任何目的以引 用的方式并入本文。
[0086] I. 一般定義
[0087] 按照慣例，除非另外明確指出，否則如本文所使用，"一個(gè)/種（a和an) "意指"一 個(gè)/種或多個(gè)/種"。
[0088] 如本文所使用，術(shù)語"氨基酸"和"殘基"可互換使用，并且，當(dāng)用于肽或多肽的情 形中時(shí)，是指天然存在的和合成的氨基酸，以及氨基酸類似物、氨基酸模擬物以及在化學(xué)上 與天然存在的氨基酸相似的非天然存在的氨基酸。
[0089] 術(shù)語"天然存在的氨基酸"和"天然編碼的氨基酸"可互換使用并且是指由遺傳 密碼編碼的氨基酸，以及合成后被修飾的由遺傳密碼編碼的那些氨基酸，例如，羥脯氨酸、 Y -羧基谷氨酸和〇-磷酸絲氨酸。
[0090] "氨基酸類似物"是與天然存在的氨基酸具有相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)（即與氫、羧基、 氨基和R基團(tuán)結(jié)合的α碳）的化合物，例如，高絲氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亞砜、甲硫氨酸 甲基锍。所述類似物可具有修飾的R基團(tuán)（例如，正亮氨酸）或修飾的肽骨架，但將保留與 天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。
[0091] "氨基酸模擬物"是具有與氨基酸的一般化學(xué)結(jié)構(gòu)不同的結(jié)構(gòu)，但以與天然存在的 氨基酸類似的方式起作用的化合物。實(shí)例包括酰胺、β-、γ-、s-亞氨酸（如哌啶-4-羧 酸）等的甲基丙烯?；虮；苌?。
[0092] 術(shù)語"非天然存在的氨基酸"和"非天然編碼的氨基酸"可互換使用并且是指具有 與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)，但未被翻譯復(fù)合物并入正在生長(zhǎng)的多肽鏈中的 化合物。"非天然存在的氨基酸"還包括但不限于通過天然編碼的氨基酸（包括但不限于20 個(gè)常用氨基酸）的修飾（例如，翻譯后修飾）產(chǎn)生的，但其自身不被翻譯復(fù)合物天然地并入 正在生長(zhǎng)的多肽鏈中的氨基酸?？杀徊迦攵嚯男蛄谢蛉〈嚯男蛄兄械囊吧蜌埢姆翘?然存在的氨基酸的實(shí)例的非限制性列表包括β-氨基酸、高氨基酸、環(huán)狀氨基酸和具有衍 生側(cè)鏈的氨基酸。實(shí)例包括（呈L-型或D-型；如括號(hào)中縮寫的）：瓜氨酸（Cit)、高瓜氨 酸（hCit)、Na-甲基瓜氨酸（NMeCit)、Na-甲基高瓜氨酸（Να-MeHoCit)、鳥氨酸（Orn)、 Να -甲基鳥氨酸（Να -MeOrn或NMeOrn)、肌氨酸（Sar)、高賴氨酸（hLys或hK)、高精氨酸 (hArg或hR)、高谷氨酰胺（hQ)、Να -甲基精氨酸（匪eR)、Να -甲基亮氨酸（Να-MeL或 匪eL)、N-甲基高賴氨酸（匪eHoK)、Να -甲基谷氨酰胺（匪eQ)、正亮氨酸（Nle)、正纈氨酸 (Nva)、1，2, 3, 4-四氫異喹啉（Tic)、八氫吲哚-2-羧酸（Oic)、3-(1_萘基）丙氨酸（1-Nal)、 3-(2-萘基）丙氨酸（2-Nal)、l，2,3,4-四氫異喹啉（Tic)、2-茚滿基甘氨酸（Igl)、對(duì)-吲 哚苯丙氨酸（pI-Phe)、對(duì)-氨基苯丙氨酸（4AmP或4-氨基-Phe)、4_胍基苯丙氨酸（Guf)、 甘氨酰賴氨酸（縮寫"Κ(Ν ε -甘氨酰）"或"K(甘氨酰）"或"K(gly) "）、硝基苯丙氨酸（硝 基phe)、氨基苯丙氨酸（氨基phe或氨基-Phe)、節(jié)基苯丙氨酸（節(jié)基phe)、γ -羧基谷氨 酸（Y -羧基glu)、羧脯氨酸（輕基pro)、對(duì)羧基-苯丙氨酸（Cpa)、α -氨基己二酸（Aad)、 Να -甲基纟顏氨酸（NMeVal)、Ν-α -甲基亮氨酸（NMeLeu)、Να -甲基正亮氨酸（NMeNle)、 環(huán)戊基甘氨酸（Cpg)、環(huán)己基甘氨酸（Chg)、乙酰精氨酸（乙酰arg)、α，β-二氨基丙酸 (Dpr)、α，γ -二氨基丁酸（Dab)、二氨基丙酸（Dap)、環(huán)己基丙氨酸（Cha)、4-甲基-苯丙 氨酸（MePhe)、β，β -二苯基-丙氨酸（BiPhA)、氨基丁酸（Abu)、4_苯基-苯丙氨酸（或 二苯基丙氨酸；4Bip)、α-氨基-異丁酸（Aib)、β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基 己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、鎖鏈素、二氨基庚二酸、Ν-乙基甘氨酸、Ν-乙基天冬酰胺、羥 賴氨酸、別-羥賴氨酸、異鎖鏈素、別-異亮氨酸、Ν-甲基甘氨酸、Ν-甲基異亮氨酸、Ν-甲 基纈氨酸、4-羥脯氨酸（Hyp)、γ -羧基谷氨酸、ε -N, N, N-三甲基賴氨酸、ε -N-乙酰賴氨 酸、〇-磷酸絲氨酸、N-乙酰絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-輕賴氨酸、ω -甲 基精氨酸、4-氨基-0-鄰苯二甲酸（4ΑΡΑ)、Ν-乙酰葡糖胺基-L-絲氨酸、Ν-乙酰葡糖基胺 基-L-蘇氨酸、0-磷酸酪氨酸以及其它類似氨基酸，以及明確列出的那些氨基酸中的任一 種的衍生形式。
[0093] "非天然存在的氨基酸"的定義中還包括的是包含以下結(jié)構(gòu)的任何氨基酸：
[0094]
【權(quán)利要求】
1. 一種包含⑶F15多肽以及一個(gè)或多個(gè)Fc序列的構(gòu)建體。
2. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含兩個(gè)或更多個(gè)Fc序列。
3. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列獨(dú)立地包含選自由以下組 成的組的序列：SEQ ID N0:18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109 和 111。
4. 如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建體，其中兩個(gè)或更多個(gè)所述Fc序列締合。
5. 如權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體，其中所述GDF15多肽與一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列形成連 續(xù)序列。
6. 如權(quán)利要求5所述的構(gòu)建體，其中所述GDF15多肽與Fc序列通過接頭連接。
7. 如權(quán)利要求6所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID 勵(lì)：44、50、57、61、65、69、74、79、84、95和104。
8. 如權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體進(jìn)一步包含選自由以下組成的組的序 列：SEQ ID N0:18、19、85、86、89、90、91、99、100、108、109 和 110。
9. 一種包含如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建體的二聚體。
10. 如權(quán)利要求1所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含選自由以下組成的組的構(gòu)建體： (a) 包含SEQ ID NO: 18的序列和包含SEQ ID NO:44的序列； (b) 包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:50的序列； (c) 包含SEQ ID NO: 18的序列和包含SEQ ID NO:57的序列； ⑷包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:61的序列； (e)包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:65的序列； ⑴包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:69的序列； (g) 包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:74的序列； (h) 包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:79的序列； (i) 包含SEQ ID NO:86的序列和包含SEQ ID NO:84的序列； (j) 包含SEQ ID NO:91的序列和包含SEQ ID NO:95的序列；或 (k) 包含SEQ ID NO: 100的序列和包含SEQ ID NO: 104的序列。
11. 一種包含二聚體的構(gòu)建體，所述二聚體包含如權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體。
12. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)Fc序列獨(dú)立地包含選自由以下組成 的組的序列：SEQ ID NO:23、110、114 和 115。
13. 如權(quán)利要求12所述的構(gòu)建體，其中兩個(gè)或更多個(gè)Fc序列締合。
14. 如權(quán)利要求13所述的構(gòu)建體，其中所述GDF15多肽與一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列形成 連續(xù)序列。
15. 如權(quán)利要求14所述的構(gòu)建體，其中所述GDF15多肽與Fc序列通過接頭連接。
16. 如權(quán)利要求15所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含SEQ ID NO: 113。
17. -種包含如權(quán)利要求16所述的構(gòu)建體的二聚體。
18. 如權(quán)利要求12所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含：包含SEQ ID NO: 110的序列 和包含SEQ ID NO: 113的序列。
19. 一種包含如權(quán)利要求18所述的構(gòu)建體的二聚體。
20. 如權(quán)利要求2所述的構(gòu)建體，其中一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列獨(dú)立地包含選自由以下 組成的組的序列：SEQ ID N0:28和30。
21. 如權(quán)利要求20所述的構(gòu)建體，其中兩個(gè)或更多個(gè)所述Fc序列通過接頭連接。
22. 如權(quán)利要求21所述的構(gòu)建體，其中所述接頭包含選自由以下組成的組的序列：SEQ ID NO:87、88 和 131。
23. 如權(quán)利要求22所述的構(gòu)建體，其中第一 Fc序列的C末端與第二Fc序列的N末端 相連接。
24. 如權(quán)利要求23所述的構(gòu)建體，其中所述GDF15多肽與一個(gè)或多個(gè)所述Fc序列形成 連續(xù)序列。
25. 如權(quán)利要求24所述的構(gòu)建體，其中所述GDF15多肽與Fc序列通過接頭連接。
26. 如權(quán)利要求25所述的構(gòu)建體，其中所述接頭包含SEQ ID NO:31。
27. -種包含如權(quán)利要求26所述的構(gòu)建體的二聚體。
28. 如權(quán)利要求20所述的構(gòu)建體，其中所述構(gòu)建體包含選自由以下組成的組的序列： SEQ ID NO:33、123 和 128。
29. -種包含如權(quán)利要求28所述的構(gòu)建體的二聚體。
【文檔編號(hào)】C12P21/08GK104204218SQ201380006982
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2013年1月28日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月26日
【發(fā)明者】熊玉梅, Y.張, J.Z.盛, A.E.漢伯格, M.維尼安特-埃利森, G.施馬莫托, 閔小山, 王主倫, J.唐, G.肯南, K.W.沃克, B.勒蒙 申請(qǐng)人:安姆根有限公司