產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法和組合物的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供了用于將多個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因座位堆疊進(jìn)植物的基因組中的組合物和方法。組合物包括包含在基因組窗口內(nèi)的不同基因組位點(diǎn)整合的至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和至少一個目的基因組座位的植物、種子或植物細(xì)胞。可采用植物育種技術(shù)使得所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位可繁育在一起。以該方式，可在基因組窗口內(nèi)產(chǎn)生多個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因整合以產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座。對所述復(fù)合性狀基因座進(jìn)行設(shè)計使得所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位可彼此獨(dú)立地分開，從而提供通過以育種方法添加和以育種方法移除特定元件來變更復(fù)合性狀基因座的有益效果。還可采用各種方法來修飾所述靶位點(diǎn)使得它們含有多種目的多核苷酸?！緦＠f明】產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法和組合物[0001]對通過EFS-WEB作為文本文件提交的序列表的引用[0002]通過EFS-Web以電子方式將序列表的正式副本作為ASCII格式的序列表提交，該文件名稱為428063SEQLIST.txt，創(chuàng)建日期為2013年1月7日，文件大小為12KB，并且該文件與本說明書同時提交。該ASCII格式文檔中所含的序列表是本說明書的一部分，并且全文以引用的方式并入本文?！?br>技術(shù)領(lǐng)域：
】[0003]本發(fā)明涉及植物分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體地講，提供了用于變更植物的基因組的方法和組合物?！?br>背景技術(shù)：
】[0004]重組DNA技術(shù)已使得可以將外來DNA序列插入進(jìn)生物體的基因組中，從而變更該生物體的表型。最常用的植物轉(zhuǎn)化方法是土壤桿菌（Agrobacterium)感染和生物彈射粒子轟擊，在所述方法中轉(zhuǎn)基因以隨機(jī)方式和以不可預(yù)測的拷貝數(shù)整合進(jìn)植物基因組中。[0005]遺憾的是，與這些方法相關(guān)的問題可導(dǎo)致農(nóng)藝經(jīng)濟(jì)性減低、進(jìn)一步研究需要額外的費(fèi)用、產(chǎn)生額外的轉(zhuǎn)基因事件以及得到產(chǎn)物時間較慢。因而，需要更有效的用于將目的序列的插入靶向進(jìn)所需的基因組位置、容易地修飾所靶向的多核苷酸和/或在所需整合位點(diǎn)附近堆疊額外的目的多核苷酸的方法?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]提供了在植物中在包含至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和至少一個目的基因組座位的基因組窗口（genomicwindow)中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法和組合物。該組合物提供在其基因組中具有長度約10cM的基因組窗口的植物或種子，其中該目的基因組座位以及該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)并且以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可包含至少第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，并且該第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)相對于彼此是相異的。該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可還包含目的多核苷酸并且可通過位點(diǎn)特異性整合方法來變更。[0007]另外提供的是在植物的基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，該方法包括對在其基因組中具有約10cM的基因組窗口的第一植物應(yīng)用植物育種技術(shù)，該基因組窗口帶有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。該方法包括將所述第一植物與在基因組窗口中包含目的第一基因組座位的第二植物進(jìn)行育種，并選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的第一基因組座位的子代，其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。使用這種方法，可將各種轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的多核苷酸引入基因組窗口中。還提供的是通過利用各種育種技術(shù)或通過采用位點(diǎn)特異性重組技術(shù)來添加、移除或替換轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位或目的多核苷酸來變更復(fù)合性狀基因座的方法。[0008]另外提供的是包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫和制備該文庫的方法。該文庫包含植物、種子或植物細(xì)胞的群體，各包含具有不同基因組插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，并且所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)當(dāng)組合進(jìn)單個植物基因組中時彼此獨(dú)立地分開。還提供的是該文庫的亞群，其中每個成員在給定基因組窗口內(nèi)包含具有不同基因組插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，并且所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)在存在于相同基因組中時以約10%至約0.1%的比率獨(dú)立地分開。該文庫的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可在整個給定基因組窗口以確定的間隔定位，使得所述給定基因組窗口內(nèi)用于轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)插入的所有可能位置由該文庫群體的成員代表。因而，可將育種技術(shù)應(yīng)用于所述文庫的給定亞群以在植物中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座?！緦＠綀D】【附圖說明】[0009]圖1:A)和B):示出了通過雜交和/或重轉(zhuǎn)化（retransformation)產(chǎn)生的復(fù)合性狀基因座的非限制性示例設(shè)計。GI指示目的基因，TG表示轉(zhuǎn)基因。A至D是10cM基因組區(qū)。[0010]圖2:示出了SSI平臺II變體a)pPHP35557和b)pPHP44290的T-DNA區(qū)。這些質(zhì)粒是土壤桿菌雙元載體中間體的衍生物，該載體中間體與Komari等人（1996)中公布的用于玉米轉(zhuǎn)化的PSB11相關(guān)。選擇標(biāo)記基因位于T-DNA左邊界序列（LB)附近。供添加性狀基因的多克隆位點(diǎn)（未示出）（PHP35557)或Gateway目的位點(diǎn)（destinationsite)(PHP4429〇)添加在右T-DNA邊界（RB)附近。性狀添加區(qū)位于一對ΙοχΡ位點(diǎn)之間，該對ΙοχΡ位點(diǎn)具有做CRE/lox切除的能力。位點(diǎn)特異性整合（SSI)能力通過在選擇標(biāo)記基因周圍設(shè)置FRT位點(diǎn)FRT1和FRT87來賦予。[0011]圖3:質(zhì)粒PHP44556的概略示意圖。[0012]圖4:連接介導(dǎo)的巢式PCR(LMnPCR)的概略示意圖。自源于轉(zhuǎn)化程序的T0轉(zhuǎn)基因植物的葉組織提取基因組DNA，然后使用機(jī)械力進(jìn)行隨機(jī)剪切。DNA剪切產(chǎn)生大量的隨機(jī)片段，該隨機(jī)片段的小的子集含有新插入的轉(zhuǎn)基因的一部分，其中該轉(zhuǎn)基因與基因組DNA鄰接。帶有轉(zhuǎn)基因序列的基因組DNA片段代表基因組插入位點(diǎn)，并且該插入位點(diǎn)旁側(cè)序列(FS)由其中基因組DNA與轉(zhuǎn)基因序列鄰接的區(qū)域限定。將確定的DNA接頭連接至隨機(jī)基因組片段的末端以方便使用PCR方法來擴(kuò)增相對稀有的轉(zhuǎn)基因插入片段。使用與該轉(zhuǎn)基因的末端雜交的引物和與該DNA接頭雜交的引物設(shè)計PCR。擴(kuò)增的PCR條帶應(yīng)該含有FS，并將其提交進(jìn)行序列分析，然后確認(rèn)。序列結(jié)果的確認(rèn)涉及針對玉蜀黍基因組序列數(shù)據(jù)庫對所擴(kuò)增的PCR序列進(jìn)行BLAST分析。[0013]圖5:A)用于玉蜀黍1號染色體上的復(fù)合性狀基因座CTL3A的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（TTS)和插入位點(diǎn)（IS)候選。B)用于玉蜀黍6號染色體上的復(fù)合性狀基因座CTL6A的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（TTS)候選。[0014]圖6:玉蜀黍物理圖譜上與目的基因組窗口（TRAIT3A)和公共BACS相關(guān)的CTL3A復(fù)合性狀基因座的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（TTS)和插入位點(diǎn)（IS)的示意圖。[0015]圖7:包含供位點(diǎn)特異性整合（SSI)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因玉蜀黍事件中的位點(diǎn)特異性整合。[0016]圖8:復(fù)合性狀基因座CTL3A中TTS-3A2處的重組酶介導(dǎo)的盒交換（RMCE)。[0017]圖9:玉蜀黍物理圖譜上與目的基因組窗口（TRAIT6A)和公共BACS相關(guān)的CTL6A復(fù)合性狀基因座的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（TTS)和插入位點(diǎn)的示意圖。[0018]圖10:對一個基因組位置處的數(shù)個插入的表達(dá)分析。[0019]圖11:用于基因槍大豆轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因位點(diǎn)特異性整合（SSI)靶事件的QC599ADNA片段的示意圖譜。標(biāo)出了用于qPCR測定法的FRT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)以及用于反向PCR的三個獨(dú)特限制位點(diǎn)六打11、他丨1、？(^1。61-541^?1?0具有由實(shí)線指示的內(nèi)含子。[0020]圖12:大豆中FLP重組酶介導(dǎo)的盒交換的示意性描述。在瞬時表達(dá)的FLP重組酶的幫助下，事先整合在大豆基因組中的靶DNA與供體DNA在FRT1和FRT87兩個位點(diǎn)重組。旁側(cè)為FRT1和FRT87位點(diǎn)的靶DNA盒被替換為旁側(cè)為FRT1和FRT87位點(diǎn)的供體DNA盒，從而導(dǎo)致該供體DNA盒被位點(diǎn)特異性整合至靶標(biāo)的完全相同的基因組位點(diǎn)。[0021]圖13:含有轉(zhuǎn)基因靶標(biāo)位點(diǎn)的SSI靶株系的鑒別。將單拷貝靶事件的基因組DNA分別用三種限制酶AflII、NsiI和Pcil消化，這三種酶均切割QC599A轉(zhuǎn)基因僅一次以及附近旁側(cè)的基因組邊界DNA，例如Pcil消化。將所得的混合的基因組邊界和QC599A轉(zhuǎn)基因DNA片段通過自我連接環(huán)化、PCR擴(kuò)增并測序。將使用兩組引物（用于5'邊界和3'邊界每一者）進(jìn)行的兩輪PCR擴(kuò)增用于特異性擴(kuò)增邊界-QC599ADNA片段。[0022]圖14:包含大豆19號染色體上的復(fù)合性狀基因座CTL-LA的基因組窗口中的轉(zhuǎn)基因SSI靶位點(diǎn)TTS-LA1和TTS-LA2以及一個目的基因（TRAITLA)的遺傳位置。SSI靶位點(diǎn)TTS-LA1和TTS-LA2獨(dú)立地產(chǎn)生并通過雜交合在一起?！揪唧w實(shí)施方式】[0023]下文將參考附圖更完整地描述本發(fā)明，其中示出了本發(fā)明的一些但并非全部實(shí)施例。事實(shí)上，這些發(fā)明可以多種不同形式呈現(xiàn)，不應(yīng)理解為受限于本文所述的實(shí)施例；更確切地說，提供這些實(shí)施例以使得本公開將滿足適用的法律要求。同樣的編號在全文中是指同樣的要素。[0024]本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員借助于上述說明和相關(guān)附圖中所展示的教導(dǎo)內(nèi)容，將想到本文闡明的本發(fā)明的許多修改形式和其他實(shí)施例。因此，應(yīng)理解，本發(fā)明不應(yīng)限于所揭示的具體實(shí)施例，而是意在將修改形式和其它實(shí)施例包括在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。雖然本文中采用特定術(shù)語，但所述術(shù)語僅在一般性和描述性意義上使用而并非用于限制目的。[0025]I.概沭[0026]提供了用于將多個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因座位堆疊進(jìn)植物的基因組中的組合物和方法。組合物包括包含在基因組窗口內(nèi)的不同基因組位點(diǎn)處整合的至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和至少一個目的基因組座位的植物、種子或植物細(xì)胞?？刹捎弥参镉N技術(shù)使得該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和該至少一個目的基因組座位可繁育為單個復(fù)合性狀基因座。以該方式，可在基因組窗口內(nèi)產(chǎn)生多個獨(dú)立的轉(zhuǎn)基因整合以產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座。如本文所用，"復(fù)合性狀基因座"是確定的基因組窗口內(nèi)的染色體片段，其包含至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和至少一個目的基因組座位，其中該靶位點(diǎn)和該目的基因組座位在該確定的基因組窗口內(nèi)具有不同的基因組插入位點(diǎn)。對該復(fù)合性狀基因座進(jìn)行設(shè)計使得在減數(shù)分裂期間該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位可彼此獨(dú)立地分開。這使得性狀能在繁育中增添進(jìn)復(fù)合性狀基因座中以及在繁育中從復(fù)合性狀基因座中消除。因而，本文所述的方法提供了能夠通過在繁育中增添和消除復(fù)合性狀基因座的特定元件來變更復(fù)合性狀基因座的有益效果。還可采用多種方法來進(jìn)一步修飾該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因座使得它們含有多種目的多核苷酸。[0027]II.鉬合物[0028]A.某閔纟目窗口[0029]本文提供在其基因組中具有基因組窗口的植物或種子。如本文所用，"基因組窗口"是植物基因組中的希望產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的染色體片段，或者包含通過本文提供的方法產(chǎn)生的復(fù)合性狀基因座的染色體片段。在基因組窗口中產(chǎn)生復(fù)合轉(zhuǎn)基因性狀基因座之前，基因組窗口可包括例如一種或多種性狀。如本文所用，"性狀"是指由具體基因或基因群組賦予的表型。[0030]基因組窗口長度可以是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多厘摩(cM)?；蛘撸蚪M窗口長度可以是約l-10cM、約2-8cM、約2-5cM、約3-10cM、約3-6cM、約4-10cM、約4-7cM、約5-10cM、約5-8cM、約6-10cM、約6-9cM、約7-10cM、約8-10cM或約9-10cM。在一個實(shí)施例中，基因組窗口長度為約10厘摩（cM)或長度為約5cM。"厘摩"(cM)或者"圖距單位（mapunit)"是兩個連接的基因、標(biāo)記、靶位點(diǎn)、目的基因組座位、基因座或者它們的任何配對之間的距離，其中1%的減數(shù)分裂產(chǎn)物是重組的。因此，一厘摩與等于兩個連接的基因、標(biāo)記、靶位點(diǎn)、基因座、目的基因組座位或者它們的任何配對之間的1%平均重組頻率的距離相當(dāng)。[0031]基因組窗口可包含多種組分。這類組分可包括例如轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、天然基因、目的基因組座位、重組位點(diǎn)和目的多核苷酸?；蚪M窗口可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，使得每個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)在基因組窗口內(nèi)具有不同的基因組插入位點(diǎn)。此外，基因組窗口可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個目的基因組座位，各個目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。所謂"不同的基因組插入位點(diǎn)"意指基因組窗口的各組分（即轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位）在不同的位置處插入進(jìn)基因組中并因此各組分可彼此獨(dú)立地分開。例如，基因組窗口可包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位的組合，使得每個靶位點(diǎn)或目的基因組座位在基因組窗口內(nèi)具有不同的基因組插入位點(diǎn)。[0032]本文提供的基因組窗口的組分具有不同的基因組插入位點(diǎn)并因而可彼此獨(dú)立地分開。如本文所用，"獨(dú)立地分開"用于指在減數(shù)分裂期間任何兩個或更多個基因、轉(zhuǎn)基因、天然基因、突變基因、靶位點(diǎn)、目的基因組座位、標(biāo)記等彼此遺傳分開。測量兩個遺傳元件是否獨(dú)立地分開的測定法是本領(lǐng)域已知的。照此，本文提供的基因組窗口內(nèi)的任何兩個或更多個基因、轉(zhuǎn)基因、天然基因、突變基因、靶位點(diǎn)、目的基因組座位、標(biāo)記等具有彼此以適當(dāng)距離定位的基因組插入位點(diǎn)，從而它們通常以約10%或更低的比率獨(dú)立地分開。因而，本文提供的基因組窗口的組分可以約1〇%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0·9%、0·8%、0·7%、0·6%、0·5%、0·4%、0·3%、0·2%或0·1%的比率彼此獨(dú)立地分開?；蛘?，本文提供的基因組窗口的組分可以約10-0.1%、約10-0.5%、約10-1%、約10-5%、約9-0.1%、約9-0.5%、約9-1%、約9-5%、約8-0.1%、約8-0.5%、約8-1%、約8-4%、約7-0.1%、約7-0.5%、約7-1%、約7-4%、約6-0.1%、約6-1%、約6-0.5%、約6-3%、約5-0.1%、約5-1%、約5-0.5%、約4-0.1%、約4-1%、約4-0.5%、約3-0.1%、約3-1%、約3-0.5%、約2-0.1%、約2-0.5%、約1-0.1%或約1-0.5%的比率彼此獨(dú)立地分開。例如，如果基因組窗口包含彼此相距約5cM的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位，則轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位將以約5%的比率獨(dú)立地分開。[0033]在一個實(shí)施例中，基因組窗口包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和至少一個目的基因組座位，其中轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位每一者具有不同的基因組插入位點(diǎn)并且以約10%至約〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0034]任何給定的基因組窗口可還包含至少一個變更的靶序列，該變更的靶序列起源于被雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑識別和切割的對應(yīng)靶序列。如本文所用，"雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑"是指任何能在靶序列中產(chǎn)生雙鏈斷裂的核酸酶。"靶序列"是指植物細(xì)胞基因組中的包含雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑的識別序列的多核苷酸序列，雙鏈斷裂是在該識別序列處誘導(dǎo)。"變更的靶序列"是指當(dāng)與未變更的靶序列相比時包含至少一個變更的靶序列。"變更"可包括例如：（i)置換至少一個核苷酸，（ii)缺失至少一個核苷酸，（iii)插入至少一個核苷酸，或者（iv)(i)-(iii)的任何組合。照此，可在任何給定的基因組窗口中產(chǎn)生用于基因組窗口的各種組分（即轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或目的基因組座位）的插入位點(diǎn)。產(chǎn)生變更的靶序列的方法是已知的，并且在2011年3月23日提交的美國臨時申請No.61/466,602中公開，將該專利申請以引用的方式全文并入本文。[0035]在具體的實(shí)施例中，基因組窗口旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和第二標(biāo)記。玉米的1號染色體上的這類標(biāo)記的非限制性例子包括例如UMC1160、UMC2224、NP1579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1、UMC1166、AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1和IDP7169。表2示出了玉米1號染色體上的標(biāo)記的公共IBM2遺傳圖譜位置。玉米6號染色體上的標(biāo)記的非限制性例子包括例如UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)、UMC2313、CD0545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006和RZ444E。表6A示出了玉米6號染色體上的標(biāo)記的公共IBM2遺傳圖譜位置。大豆的19號染色體上的這類標(biāo)記的非限制性例子包括例如SATT613、SATT284、S60414-TB、SATT462、SATT481、SATT156和SCT_010。表11示出了大豆19號染色體上的標(biāo)記的公共遺傳圖譜位置。[0036]B.某閔纟目窗口的鉬分[0037]i.轉(zhuǎn)某閔靶位點(diǎn)和奪審方法[0038]轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可包含多種組分。如本文所用，所謂"靶位點(diǎn)"是指包含具有至少一個重組位點(diǎn)的核苷酸序列的多核苷酸。所謂"轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)"意指這樣的靶位點(diǎn)：其對于植物基因組而言在序列上和/或在基因組位置上都是非天然的。在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可包含至少1、2、3、4、5、6或更多個重組位點(diǎn)供位點(diǎn)特異性重組。在一個實(shí)施例中，轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)。在這類實(shí)施例中，所述第一和第二重組位點(diǎn)可相對于彼此是相異的，或者相對于彼此可以是相異的并且具有降低的相容性。當(dāng)提供以適當(dāng)?shù)闹亟M酶時，這類第一和第二重組位點(diǎn)能夠與它們對應(yīng)的或相同的重組位點(diǎn)重組。[0039]-條或多條間插序列可存在于靶位點(diǎn)的重組位點(diǎn)之間。特別關(guān)注的間插序列將包括接頭、銜接子、選擇性標(biāo)記、目的多核苷酸、其他重組位點(diǎn)、啟動子和/或其他有助于載體構(gòu)建或分析的位點(diǎn)。在重組位點(diǎn)之間則可采用各種目的多核苷酸。變更靶位點(diǎn)的方法在本文別的地方更詳細(xì)地論述。此外，靶位點(diǎn)的重組位點(diǎn)可位于多種位置，包括例如內(nèi)含子序列、編碼序列或非翻譯區(qū)內(nèi)。[0040]本文提供的方法和組合物中采用的重組位點(diǎn)可以是"對應(yīng)的"位點(diǎn)或"相異的"位點(diǎn)。所謂"對應(yīng)的重組位點(diǎn)"或"一組對應(yīng)的重組位點(diǎn)"意指重組位點(diǎn)具有相同的或?qū)?yīng)的核苷酸序列。一組對應(yīng)的重組位點(diǎn)在存在適當(dāng)重組酶時將會有效地彼此重組（即對應(yīng)的重組位點(diǎn)是會引起重組的（recombinogenic))。[0041]在其他實(shí)施例中，重組位點(diǎn)是相異的。所謂"相異的重組位點(diǎn)"或"一組相異的重組位點(diǎn)"意指重組位點(diǎn)是不同的（即，具有至少一個核苷酸不同）。[0042]"一組相異的重組位點(diǎn)"內(nèi)的重組位點(diǎn)可相對于于彼此是會引起重組的或者相對于彼此具有降低的相容性。所謂"會引起重組的"意指該組重組位點(diǎn)能夠彼此重組。[0043]在其他實(shí)施例中，一組相異的重組位點(diǎn)可包含相對于彼此具有降低的相容性的重組位點(diǎn)組。所謂"降低的相容性"意指該組重組位點(diǎn)在存在適當(dāng)?shù)闹亟M酶時，與在它們的同種（cognate)位點(diǎn)上所見到的重組效率相比將具有降低的重組效率。在一些實(shí)施例中，相容性降低將導(dǎo)致位點(diǎn)之間不重組。在其他實(shí)施例中，相容性降低將導(dǎo)致位點(diǎn)之間的重組水平極低。因而，用于本文所提供的方法和組合物中的彼此之間相容性降低的合適重組位點(diǎn)包括那些彼此以低于90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、15%、10%、5%、4%或3%的頻率重組（或切除）的位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，彼此之間的相容性降低的重組位點(diǎn)彼此以低于切除測定法中標(biāo)準(zhǔn)條件下的可檢測限值、低于2%、1.5%、1%、0.75%、0.5%、0.25%、0.1%、0.075、0.005%、0.001%的頻率重組（或切除）。"相異重組位點(diǎn)組"內(nèi)的每個重組位點(diǎn)是生物活性的并因而可與相同位點(diǎn)重組。[0044]在一些實(shí)施例中，基因組窗口包含具有彼此相異的第一和第二重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和具有彼此相異的第三和第四重組位點(diǎn)的第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。在其他實(shí)施例中，基因組窗口包含具有彼此相異且相容性降低的第一和第二重組位點(diǎn)的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和具有彼此相異且相容性降低的第三和第四重組位點(diǎn)的第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。在一些情況下，第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。因而，本文提供的各個靶位點(diǎn)中的任一個均可以約10-0.1%、約10-0.5%、約10-1%、約10-5%、約9-0.1%、約9-0.5%、約9-1%、約9-5%、約8-0.1%、約8-0.5%、約8-1%、約8-4%、約7-0.1%、約7-0.5%、約7-1%、約7-4%、約6-0.1%、約6-0.5%、約6-1%、約6-3%、約5-0.1%、約5-0.5%、約5-1%、約4-0.1%、約4'05%、約4-1%、約3-0.1%、約3-0.5%、約3-1%、約2-0.1%、約2-0.5%、約1-0.1%或約1-0.5%的比率彼此獨(dú)立地分開。本文提供的各個靶位點(diǎn)在基因組窗口中可彼此相距約〇.1，〇.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7，0.8,0.9，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10〇11或更多?；蛘?，各個靶位點(diǎn)在基因組窗口中可彼此相距約0·5-10cM、約l-10cM、約2-10cM、約2-5cM、約3-10cM、約3-6cM、約4-10cM、約4-7cM、約5-10cM、約5-8cM、約6-10cM、約6-9cM、約7-10cM、約8-10cM、約9-10cM、約0·1-0.5cM、約0·1-lcM、約0·l-2cM、約0·l-3cM、約0·l-4cM、約0·l-5cM、約0·l-6cM、約0·l-7cM、約0·l-8cM、約0·l-9cM或約0·l-10cM。[0045]在一特定的實(shí)施例中，第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的重組位點(diǎn)與第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的相異位點(diǎn)不同?；蛘撸诙D(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可包含與第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)相同的相異位點(diǎn)。在另一實(shí)施例中，基因組窗口包含具有彼此相異的第五和第六重組位點(diǎn)的第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。在又一實(shí)施例中，基因組窗口包含具有彼此相異且相容性降低的第五和第六重組位點(diǎn)的第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。在所有這類情況下，第一、第二和第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)。[0046]各種重組位點(diǎn)可應(yīng)用于本文提供的方法和組合物中（即應(yīng)用于本文所公開的各個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或目的基因組座位中）。所謂"重組位點(diǎn)"意指重組位點(diǎn)及其活性變體。許多重組系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將知道要與目的重組系統(tǒng)一起使用的適當(dāng)重組位點(diǎn)。如本文別的地方更詳細(xì)論述的，可采用重組位點(diǎn)的各種組合，包括相異位點(diǎn)組和對應(yīng)的重組位點(diǎn)和/或相異重組位點(diǎn)和/或彼此相異且相容性降低的位點(diǎn)可用于本文提供的各種方法和組合物中。因此，任何合適的重組位點(diǎn)或重組位點(diǎn)組可用于本文，包括FRT位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)的生物活性變體（即突變型FRT位點(diǎn)）、L0X位點(diǎn)、L0X位點(diǎn)的生物活性變體（即突變型L0X位點(diǎn)）、它們的任何組合或本領(lǐng)域已知的重組位點(diǎn)的任何其他組合。FRT位點(diǎn)的例子包括例如野生型FRT位點(diǎn)（FRT1)(SEQIDN0:1)以及各種突變型FRT位點(diǎn)，包括但不限于FRT5(SEQIDNO:2)、FRT6(SEQIDNO:3)、FRT7(SEQIDNO:4)、FRT12(SEQIDNO:5)和FRT87(SEQIDNO:6)。參見例如美國專利No.6,187,994。還可參見美國公開No.2011-0047655,將其以引用的方式并入本文。[0047]還可使用來自Cre/Lox位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的重組位點(diǎn)。這類重組位點(diǎn)包括例如，野生型L0X位點(diǎn)和突變型L0X位點(diǎn)。對突變型L0X位點(diǎn)的重組活性的分析在Lee等人(1998)Gene(《基因》)216:55-65中給出，將該文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。還可參見例如，Schlake和Bode(1994)Biochemistry(《生物化學(xué)》）33:12746-12751;Huang等人（1991)NucleicAcidsResearch(《核酸研究》）19:443-448;Sadowski(1995)，載于ProgressinNucleicAcidResearchandMolecularBiology(《核酸研究與分子生物學(xué)進(jìn)展》）第51卷，第53-91頁；Cox(1989)，載于MobileDNA(《移動DNA》），Berg和Howe(編輯）美國微生物學(xué)會（AmericanSocietyofMicrobiology)，華盛頓哥倫比亞特區(qū)，第116-670頁；Dixon等人（1995)Mol.Microbiol.(《分子微生物學(xué)》）18:449-458;Umlauf和Cox(1988)ΕΜΒ0(歐洲分子生物學(xué)組織）7:1845-1852;Buchholz等人（1996)NucleicAcidsResearch(《核酸研究》）24:3118-3119;Kilby等人（1993)TrendsGenet.(《遺傳學(xué)趨勢》）9:413-421;Rossant和Geagy(1995)Nat.Med.(《自然醫(yī)學(xué)》）1:592-594;Albert等人（1995)ThePlantJ.(《植物雜志》)7:649-659;Bayley等人（1992)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）18:353-361;0dell等人（1990)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》）223:369-378;Dale和0w(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）88:10558-10562;Qui等人（1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）91:1706-1710;Stuurman等人(1996)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）32:901-913;Dale等人（1990)Gene(《基因》）91:79-85;Albert等人（1995)ThePlantJ.(《植物雜志》）7:649-659以及W001/00158;所有這些文獻(xiàn)均以引用方式并入本文。[0048]在一特定的實(shí)施例中，第一和第二重組位點(diǎn)中的至少一者包含F(xiàn)RT1(SEQIDN0:1)、FRT5(SEQIDNO:2)、FRT6(SEQIDNO:3)、FRT7(SEQIDNO:4)、FRT12(SEQIDNO:5)或FRT87(SEQIDNO:6)。在一特定的實(shí)施例中，靶位點(diǎn)的第一和第二重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)。[0049]重組位點(diǎn)的活性變體和片段（即SEQIDN0:1-6)也為本文提供的組合物和方法所涵蓋。重組位點(diǎn)的片段保留了該重組位點(diǎn)的生物活性并因而有利于適當(dāng)重組酶存在下的重組事件。因而，重組位點(diǎn)的片段可為至少約5、10、15、20、25、30、35、40個核苷酸，以及最多至該重組位點(diǎn)的全長?；钚宰凅w可與天然重組位點(diǎn)具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，其中該活性變體保留生物活性并因而有利于適當(dāng)重組酶存在下的重組事件。測量重組位點(diǎn)的生物活性的測定法是本領(lǐng)域已知的。參見例如Senecoll等人（1988)(《分子生物學(xué)雜志》）2〇1:4〇6_421;Voziyanov等人（2〇〇2)NucleicAcidResearch(《核酸研究》）3〇:7;美國專利No.6,187,994;TO/01/00158;以及Albert等人（1995)ThePlantJournal(《植物雜志》）7:649-659。[0050]在本文所提供的方法和組合物中也采用重組酶。所謂"重組酶"意指催化相容的重組位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組的天然多肽。關(guān)于位點(diǎn)特異性重組酶的綜述，參見；Sauer(1994)CurrentOpinioninBiotechnology(《生物技術(shù)新見》）5:521-527;以及Sadowski(1993)FASEB(美國實(shí)驗(yàn)生物學(xué)學(xué)會聯(lián)合會）7:760-767;將這兩篇文獻(xiàn)的內(nèi)容以引用的方式并入本文。本方法中所用的重組酶可以是天然存在的重組酶或該重組酶的生物活性片段或變體。可用于本方法和組合物中的重組酶包括來自整合酶和解離酶家族的重組酶、其生物活性變體和片段以及任何其他天然存在的或重組產(chǎn)生的可催化指定的DNA重組位點(diǎn)之間的保守位點(diǎn)特異性重組的酶或其變體。[0051]重組酶的整合酶家族具有超過一百個成員并且包括例如FLP、Cre、Int和R。關(guān)于整合酶家族的其他成員，參見例如Esposito等人（1997)NucleicAcidResearch(《核酸研究》）25:3605-3614以及Abremski等人（1992)ProteinEngineering(《蛋白質(zhì)工程》）5:87-91，將這兩篇文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。其他重組系統(tǒng)包括例如：鏈霉菌噬菌體phiC31(Kuhstoss等人（1991)J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》）20:897-908);來自芝田硫化葉菌（Sulfolobusshibatae)的SSV1位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)（Maskhelishvili等人（1993)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》)237:334-342);以及基于逆轉(zhuǎn)錄病毒整合酶的整合系統(tǒng)（Tanaka等人（1998)Gene(《基因》)17:67-76)。在其他實(shí)施例中，重組酶是不需要輔因子和超螺旋底物的重組酶。這類重組酶包括Cre(SEQIDN0:7)、FLP(SEQIDN0:8)或它們的活性變體或片段（SEQIDNO:9和10)。[0052]FLP重組酶是催化這樣的位點(diǎn)特異性反應(yīng)的蛋白質(zhì)，該反應(yīng)涉及在DNA復(fù)制過程中擴(kuò)增釀酒酵母（S.cerevisiae)的兩微米質(zhì)粒的拷貝數(shù)。如本文所用，F(xiàn)LP重組酶是指催化兩個FRT位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組的重組酶。已經(jīng)克隆并表達(dá)了FLP蛋白。參見例如Cox(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(《美國科學(xué)院院刊》）80:4223-4227。供在本方法中使用和與本組合物一起使用的FLP重組酶可源于酵母屬（Saccharomyces)。還可使用植物偏好的密碼子合成構(gòu)成重組酶的多核苷酸以便在目的植物中最佳表達(dá)。催化位點(diǎn)特異性重組事件的由包含玉蜀黍偏好的密碼子的核苷酸序列編碼的重組FLP酶（FLPm)(SEQIDN0:10)是已知的。參見例如美國專利5,929,301，將該專利以引用的方式并入本文。FLP的另外的功能變體和片段是已知的。參見例如，Buchholz等人（1998)Nat.Biotechnol.(《自然生物技術(shù)》）16:617-618;Hartung等人（1998)J.Biol.Chem.(《生物化學(xué)雜志》）273:22884-22891;Saxena等人（1997)BiochimBiophysActa(《生物化學(xué)和生物物理雜志》）1340(2):187-204;以及Hartley等人（1980)Nature(《自然》）286:860-864，將以上所有文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。[0053]噬菌體重組酶Cre可催化兩個lox位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組。Cre重組酶是本領(lǐng)域已知的。參見例如Guo等人（1997)Nature(《自然》)389:40-46;Abremski等人（1984)J.Biol.Chem.(《生物化學(xué)雜志》）259:1509-1514;Chen等人（1996)Somat.CellMol.Genet.(《體細(xì)胞和分子遺傳學(xué)》）22:477-488;Shaikh等人（1977)J.Biol.Chem.(《生物化學(xué)雜志》）272:5695-5702;以及Buchholz等人（1998)Nat.Biotechnol.(《自然生物技術(shù)》）16:617-618,將以上所有文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。Cre多核苷酸序列也可用植物偏好的密碼子合成。這類序列（moCre)在WO99/25840(將其以引用的方式并入本文）中進(jìn)行描述并在SEQIDNO:9中示出。[0054]還認(rèn)識到，嵌合重組酶可用于本方法。所謂"嵌合重組酶"意指能夠催化來源于不同重組系統(tǒng)的重組位點(diǎn)之間的位點(diǎn)特異性重組的重組融合蛋白。也就是說，如果一組功能重組位點(diǎn)（特征為彼此相異）被用于本方法和組合物中并且包含F(xiàn)RT位點(diǎn)和LoxP位點(diǎn)，則將需要嵌合FLP/Cre重組酶或其活性變體或片段，或者作為另一種選擇，可能要分別提供兩種重組酶。這類嵌合重組酶或其活性變體或片段的制備和使用方法在W099/25840中描述，將該專利以引用的方式并入本文。[0055]通過利用本文所提供的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)中的重組位點(diǎn)的各種組合，本方法提供了目的多核苷酸被位點(diǎn)特異性整合進(jìn)植物基因組中的特定位點(diǎn)中的機(jī)制。本方法還允許另外的目的多核苷酸后續(xù)插入進(jìn)該特定基因組位點(diǎn)中。[0056]如本文所用，所謂"提供"意指任何允許氨基酸序列和/或多核苷酸與所敘述的組分合在一起的方法。將核苷酸序列引入進(jìn)植物中的多種方法是本領(lǐng)域已知的。任何手段均可用于將重組系統(tǒng)的各種組分（即轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和適當(dāng)?shù)闹亟M酶）合在一起，包括例如轉(zhuǎn)化和有性雜交。另參見W099/25884,將該專利以引用的方式并入本文。此外，可通過將多肽或mRNA引入進(jìn)細(xì)胞中來提供重組酶。[0057]重組酶（即FLP或Cre)的活性變體或片段也為本文提供的組合物和方法所涵蓋。這類活性變體可與天然重組酶具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性，其中所述活性變體保留生物活性并因而實(shí)現(xiàn)重組事件。重組酶活性的測定法是已知的，通常是測量該酶對含有重組位點(diǎn)的DNA底物的總體活性。例如，為了測定FLP活性，含有兩個反向FRT位點(diǎn)的環(huán)狀質(zhì)粒中的DNA序列的反轉(zhuǎn)可檢測為限制酶位點(diǎn)的位置的改變。該測定法在Vetter等人（1983)PNAS(《美國國家科學(xué)院院刊》)80:7284中描述?；蛘?，可測定由該酶引起的DNA從線性分子切除或者分子間的重組頻率，如例如以下文獻(xiàn)中所描述的：Babineau等人（1985)JournalofBiologicalChemistry(《生物化學(xué)雜志》）260:12313;Meyer_Leon等人（1987)NucleicAcidRes(《核酸研究》）15:6469;以及Gronostajski等人（1985)JournalofBiologicalChemistry(《生物化學(xué)雜志》)260:12328?；蛘?，還可通過切除旁側(cè)為會引起重組的FRT位點(diǎn)的序列來測定重組酶活性，在移除時將激活可測定的標(biāo)記基因。[0058]ii.目的某閔纟目座位[0059]如本文所用，"目的基因組座位"包含遺傳在一起的一組特定的多態(tài)性。給定的基因組座位可包含但不限于轉(zhuǎn)基因、天然基因或額外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，該額外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可包含相異的重組位點(diǎn)對或彼此相異且相容性降低的重組位點(diǎn)對。[0060]目的基因組座位可以是例如任何賦予性狀如轉(zhuǎn)基因或天然性狀的修飾。在一個實(shí)施例中，目的基因組座位包含天然性狀。如本文所用，"天然性狀"是指自然界中存在的性狀。在另一個實(shí)施例中，目的基因組座位包含轉(zhuǎn)基因。[0061]可雜交進(jìn)植物的基因組窗口中的目的基因組座位的數(shù)目是至少1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個。任何所需性狀均可在給定的目的基因組座位處引入進(jìn)基因組中。這類性狀包括但不限于賦予昆蟲抗性、病害抗性、除草劑耐受性、雄性不育、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物或涉及位點(diǎn)特異性重組的序列的性狀。[0062]在具體的實(shí)施例中，給定的目的基因組座位與植物中所需的和/或有利的表型相關(guān)聯(lián)。例如，賦予昆蟲抗性、病害抗性或除草劑耐受性的性狀將是植物中所需的。在其他實(shí)施例中，該基因組座位與影響植物的農(nóng)藝特性的性狀不相關(guān)聯(lián)。[0063]給定的目的基因組座位在基因組窗口內(nèi)具有其自己的基因組插入位點(diǎn)。例如，基因組窗口內(nèi)的目的基因組座位和轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)將在基因組內(nèi)具有不同的基因組插入位點(diǎn)。給定的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可距離目的基因組座位在約10cM、9cM、8cM、7cM、6cM、5cM、4cM、3cM、2cM、lcM、0.9cM、0.8cM、0.7cM、0.6cM、0.5cM、0.4cM、0.3cM、0.2cM或0·lcM以內(nèi)，使得該靶位點(diǎn)和目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。或者，給定的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可距離目的基因組座位在約〇·5-10cM、約l-10cM、約2-10cM、約2-5cM、約3-10cM、約3-6cM、約4-10cM、約4-7cM、約5-10cM、約5-8cM、約6-10cM、約6-9cM、約7-10cM、約8-10cM、約9-10cM、約0·1-0.5cM、約0·Ι-lcM、約0·l-2cM、約0·l-3cM、約0·l-4cM、約0·l-5cM、約0.l-6cM、約0.l-7cM、約0.l-8cM、約0.l-9cM或約0.l-10cM以內(nèi)，使得該靶位點(diǎn)和目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。在一特定的實(shí)施例中，第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距離目的基因組座位在約5cM以內(nèi)。在又一個實(shí)施例中，第一或第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距離目的基因組座位在2cM或lcM以內(nèi)。在其中基因組窗口包含第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的這類情況中，該第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)可距離目的基因組座位在約5cM以內(nèi)。[0064]在一些實(shí)施例中，第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%、4%、3%、2%、1%、(λ9%、(λ8%、(λ7%、(λ6%、(λ5%、(λ4%、(λ3%、0·2%或(λ1%的比率與目的基因組座位獨(dú)立地分開?；蛘?，第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5-0.1%、約5-1%、約5-0.5%、約4-0.1%、約4-0.5%、約4-1%、約3-0.1%、約3'05%、約3-1%、約2-0.1%、約2-0.5%、約1-0.1%或約1-0.5%的比率與目的基因組座位獨(dú)立地分開。[0065]C.目的多核苷酸[0066]可通過本文其他地方論述的轉(zhuǎn)化方法或育種方法在本文所公開的方法和組合物的目的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或基因組座位中將任何目的多核苷酸（即，"目的多肽"或"目的基因"）提供給植物細(xì)胞。已經(jīng)認(rèn)識到任何目的多核苷酸均可提供、整合進(jìn)植物基因組中的基因組窗口內(nèi)并在植物中表達(dá)。目的多核苷酸或目的基因可包含例如轉(zhuǎn)基因或天然基因。本文所公開的方法可使至少1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種或更多種目的多核苷酸整合進(jìn)基因組窗口中。[0067]有多種表型變化是值得關(guān)注的，包括修飾植物中的脂肪酸組成、變更植物的氨基酸含量、變更植物的病原體防御機(jī)制等等。這些結(jié)果可通過在植物中表達(dá)異源產(chǎn)物（即目的多核苷酸）、在植物中增加內(nèi)源產(chǎn)物的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)?；蛘?，這些結(jié)果可通過在植物中減少一種或多種內(nèi)源產(chǎn)物（特別是酶或輔因子）的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)。這些改變導(dǎo)致轉(zhuǎn)化植物的表型變化。[0068]目的多核苷酸反映出作物開發(fā)的參與者的商業(yè)市場和利益。目的作物和市場在變化，并且隨著發(fā)展中國家打開世界市場，也將出現(xiàn)新的作物和技術(shù)。另外，隨著我們對農(nóng)藝性狀和特性如產(chǎn)量和雜種優(yōu)勢的理解的增加，對用于轉(zhuǎn)化的基因的選擇將會相應(yīng)變化。目的基因的大體類別包括例如涉及信息的那些基因（如鋅指）、涉及通信的那些基因（如激酶）和涉及看家的那些基因（如熱休克蛋白）。轉(zhuǎn)基因的更具體類別例如包括編碼對農(nóng)藝學(xué)、昆蟲抗性、病害抗性、除草劑抗性、不育性、籽粒特性和商業(yè)產(chǎn)品重要的性狀的基因。一般而言，目的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或營養(yǎng)物質(zhì)代謝的那些基因以及影響仁大小、蔗糖載量等的那些基因。[0069]目的多核苷酸/多肽包括但不限于除草劑耐受性編碼序列、殺昆蟲編碼序列、殺線蟲編碼序列、抗微生物編碼序列、抗真菌編碼序列、抗病毒編碼序列、非生物和生物脅迫耐受性編碼序列、或修飾植物性狀例如產(chǎn)量、籽粒質(zhì)量、營養(yǎng)成分、淀粉質(zhì)量和數(shù)量、固氮和/或氮利用、以及含油脂含量和/或油組成的序列。更具體的目的多核苷酸包括但不限于：改善作物產(chǎn)量的基因、改善作物合意性的多肽、變更磷含量的基因（如植酸酶編碼基因）、變更抗氧化劑含量或組成的基因（如變更生育酚和三烯生育酚含量的基因）、變更碳水化合物的基因、編碼賦予非生物脅迫（如干旱、氮、溫度、鹽度、毒性金屬或痕量元素）抗性的蛋白質(zhì)的基因，或賦予對毒素如殺蟲劑和除草劑的抗性、或?qū)ι锩{迫如真菌、病毒、細(xì)菌、昆蟲和線蟲的攻擊以及與這些生物體相關(guān)的病害發(fā)展的抗性的那些基因。[0070]目的多核苷酸還可以是產(chǎn)生供進(jìn)行位點(diǎn)特異性DNA整合的位點(diǎn)的基因。這包括引入可用于FLP/FRT系統(tǒng)的FRT位點(diǎn)和/或可用于Cre/Loxp系統(tǒng)的Lox位點(diǎn)。這些系統(tǒng)及其他系統(tǒng)在本文其他地方進(jìn)行了詳細(xì)的描述。[0071]"除草劑抗性蛋白"或由"除草劑抗性編碼核酸分子"表達(dá)生成的蛋白質(zhì)包括這樣的蛋白質(zhì)，其賦予細(xì)胞與未表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞相比耐受更高濃度除草劑的能力，或賦予細(xì)胞與未表達(dá)該蛋白質(zhì)的細(xì)胞相比對某種濃度除草劑耐受更長時間的能力。除草劑抗性性狀可通過如下基因引入進(jìn)植物中：編碼對起到抑制乙酰乳酸合酶（ALS)的作用的除草劑（特別是磺酰脲類除草劑）的抗性的基因、編碼對起到抑制谷氨酰胺合酶的作用的除草劑如膦絲菌素或basta的抗性的基因（如bar基因）、編碼對草甘膦的抗性的基因（如EPSP合酶基因和GAT基因）、編碼對HPH)抑制劑的抗性的基因（如HPH)基因）或本領(lǐng)域已知的其他這類基因。參見例如美國專利No.7,626,077、No.5,310,667、No.5,866,775、No.6,225,114、No.6,248,876、No.7,169,970、No.6,867,293和美國臨時申請No.61/401，456,將所述專利每一者以引用的方式并入本文。[0072]除了使用傳統(tǒng)的育種方法之外，還可通過遺傳方式變更農(nóng)藝上重要的性狀如油脂含量、淀粉含量和蛋白質(zhì)含量。修飾包括增加油酸、飽和油和不飽和油的含量、提高賴氨酸和硫的水平、提供必需氨基酸以及對淀粉進(jìn)行改性。美國專利No.5,703,049、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,990,389中描述了Hordothionin蛋白修飾，將這些專利以引用的方式并入本文。另外的例子是美國專利No.5,850,016中描述的由大豆2S白蛋白編碼的富含賴氨酸和/或硫的種子蛋白以及Williamson等人，（1987)Eur.J.Biochem.(《歐洲生物化學(xué)雜志》）165:99-106中描述的來自大麥的胰凝乳蛋白酶抑制劑，將上述專利和文獻(xiàn)的公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。[0073]還可在目的多核苷酸上編碼可增加例如用于乙醇生產(chǎn)的淀粉，或提供蛋白質(zhì)的表達(dá)的商業(yè)性狀。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物的另一個重要商業(yè)用途是生產(chǎn)聚合物和生物塑料，如美國專利No.5,602,321中所述。諸如β-酮硫解酶、PHB酶（聚羥基丁酸酯合酶）和乙酰乙酰輔酶A還原酶（參見Schubert等人（1988)J.Bacteriol.(《細(xì)菌學(xué)雜志》）170:5837-5847)之類的基因有利于聚羥基烷酸酯（PHA)的表達(dá)。[0074]可通過定點(diǎn)誘變產(chǎn)生編碼序列的衍生物來增加預(yù)選氨基酸在所編碼的多肽中的水平。例如，編碼大麥高賴氨酸多肽（BHL)的基因源自大麥胰凝乳蛋白酶抑制劑（1996年11月1日提交的系列號為08/740,682的美國申請和W098/20133,將它們的公開內(nèi)容以引用方式并入本文）。其他蛋白質(zhì)包括富含甲硫氨酸的植物蛋白質(zhì)，如來自葵花籽的蛋白質(zhì)（Lilley等人（1989)ProceedingsoftheWorldCongressonVegetableProteinUtilizationinHumanFoodsandAnimalFeedstuffs(《植物蛋白在人類食品和動物飼料中的利用世界大會會議錄》），Applewhite編輯（美國油脂化學(xué)家協(xié)會（AmericanOilChemistsSociety),伊利諾州香檳市（Champaign,Illinois))，第497-502頁；將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文）；來自玉米的蛋白質(zhì)（Pedersen等人（1986)J.Biol.Chem.(《生物化學(xué)雜志》）261:6279;Kirihara等人（1988)Gene(《基因》）71:359;將這兩篇文獻(xiàn)均以引用方式并入本文）；以及來自水稻的蛋白質(zhì)（Musumura等人（1989)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）12:123,將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文）。其他農(nóng)藝上重要的基因編碼膠乳、Floury2、生長因子、種子貯藏因子和轉(zhuǎn)錄因子。[0075]改善作物產(chǎn)量的多核苷酸包括矮化基因，如Rhtl和Rht2(Peng等人（1999)Nature(《自然》）400:256-261)以及增加植物生長的那些，如銨誘導(dǎo)型谷氨酸脫氫酶。改善作物合意性的多核苷酸包括例如允許植物具有減少的飽和脂肪含量的那些多核苷酸、提高植物營養(yǎng)價值的那些多核苷酸、以及增加籽粒蛋白的那些多核苷酸。改善鹽耐受性的多核苷酸是增加或允許植物在與已引入耐鹽基因的該植物的天然環(huán)境相比更高鹽度的環(huán)境中生長的那些多核苷酸。[0076]不育基因也可編碼在表達(dá)盒中，為物理去雄提供備選方案。以這種方式使用的基因的例子包括雄性組織偏好的基因和具有雄性不育表型的基因（如QM)，在美國專利No.5,583,210中有描述。其他基因包括激酶和編碼對雄性或雌性配子體發(fā)育有毒的化合物的那些。[0077]影響氨基酸生物合成的多核苷酸/多肽包括例如鄰氨基苯甲酸合酶（AS;EC4.1.3.27)，該酶催化植物、真菌和細(xì)菌中從芳族氨基酸途徑分支到色氨酸生物合成的第一反應(yīng)。在植物中，色氨酸生物合成的化學(xué)過程處于葉綠體區(qū)室中。參見例如美國專利公開20080050506,將其以引用的方式并入本文。另外的目的序列包括分支酸丙酮酸裂解酶(CPL)，其是指編碼催化分支酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸和ρΗΒΑ的酶的基因。表征最充分的CPL基因已從大腸桿菌中分離并具有GenBank登錄號Μ96268。參見美國專利No.7,361，811，將其以引用的方式并入本文。[0078]該目的多核苷酸序列可編碼涉及提供病害或害蟲抗性的蛋白質(zhì)。所謂"病害抗性"或"害蟲抗性"意指植物避開作為植物-病原體相互作用的后果的有害癥狀。害蟲抗性基因可編碼對嚴(yán)重影響產(chǎn)量的害蟲如根蟲、切根蟲、歐洲玉蜀黍螟等的抗性。病害抗性基因和昆蟲抗性基因，如用于抗細(xì)菌保護(hù)的溶菌酶或天蠶抗菌肽（cecropin)，或者用于抗真菌保護(hù)的蛋白質(zhì)如防御素、葡聚糖酶或幾丁質(zhì)酶，或者用于防治線蟲或昆蟲的蘇云金芽孢桿菌（Bacillusthuringiensis)內(nèi)毒素、蛋白酶抑制劑、膠原酶、凝集素或糖苷酶，都是可用的基因產(chǎn)物的例子。編碼病害抗性性狀的基因包括解毒基因，如對伏馬毒素（fumonosin)的解毒基因（美國專利No.5,792,931);無毒力（avr)和病害抗性（R)基因（Jones等人(1994)Science(《科學(xué)》）266:789;Martin等人（1993)Science(《科學(xué)》）262:1432;以及Mindrinos等人（1994)Cell(《細(xì)胞》）78:1089)等等。[0079]此外，已經(jīng)認(rèn)識到目的多核苷酸可還包含與所靶向的目的基因序列的信使RNA(mRNA)的至少一部分互補(bǔ)的反義序列。構(gòu)建反義核苷酸以與對應(yīng)的mRNA雜交?？蓪Ψ戳x序列作出修飾，只要該序列能雜交對應(yīng)的mRNA并干擾其表達(dá)。以此方式，可使用與對應(yīng)的反義序列具有70%、80%或85%序列同一性的反義構(gòu)建體。此外，反義核苷酸的部分可用來破壞靶基因的表達(dá)。一般而言，可使用至少50個核苷酸、100個核苷酸、200個核苷酸或者更多個核苷酸的序列。[0080]另外，目的多核苷酸還可以以有義取向使用來抑制植物中的內(nèi)源基因的表達(dá)。用有義取向的多核苷酸抑制植物中的基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域已知的。該方法通常涉及用包含這樣的啟動子的DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，該啟動子有效連接至對應(yīng)于該內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物的核苷酸序列的至少一部分，能驅(qū)動在植物中的表達(dá)。通常，這種核苷酸序列與內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄物的序列具有實(shí)質(zhì)的序列同一性，通常高于約65%的序列同一性、約85%的序列同一性或高于約95%的序列同一性。參見美國專利No.5,283,184和No.5,034,323;將這些專利以引用方式并入本文。[0081]目的多核苷酸還可以是表型標(biāo)記。表型標(biāo)記是可篩選或可選擇的標(biāo)記，其包括可視標(biāo)記和選擇標(biāo)記，無論它是陽性還是陰性選擇標(biāo)記?？墒褂萌魏伪硇蜆?biāo)記。具體地講，可選擇的或可篩選的標(biāo)記包含這樣的DNA區(qū)段，該DNA區(qū)段使得可以常常在特定條件下鑒別或選取或者不選取含有它的分子或細(xì)胞。這些標(biāo)記可編碼活性，例如但不限于RNA、肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生，或者可為RNA、肽、蛋白質(zhì)、無機(jī)和有機(jī)化合物或者組合物等提供結(jié)合位點(diǎn)。[0082]選擇標(biāo)記的例子包括但不限于：包含限制酶位點(diǎn)的DNA區(qū)段；編碼能提供對抗原本有毒的化合物的抗性的產(chǎn)物的DNA區(qū)段，所述有毒化合物包括抗生素如壯觀霉素、氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、Basta、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(ΝΕ0)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(ΗΡΤ));編碼原本在受體細(xì)胞中缺乏的產(chǎn)物的DNA區(qū)段（如tRNA基因、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記）；編碼可容易鑒別的產(chǎn)物的DNA區(qū)段（例如表型標(biāo)記如β-半乳糖苷酶、GUS;熒光蛋白如綠色熒光蛋白（GFP)、青色熒光蛋白（CFP)、黃色熒光蛋白（YFP)、紅色熒光蛋白（RFP)，以及細(xì)胞表面蛋白）；PCR新引物位點(diǎn)的產(chǎn)生（如兩個之前不并置的DNA序列的并置）、限制性內(nèi)切核酸酶或其他DNA修飾酶、化學(xué)劑等不作用或者作用的DNA序列的加入；以及使其得以鑒定的特定修飾（如甲基化）所需的DNA序列的加入。[0083]另外的選擇標(biāo)記包括能賦予對除草化合物如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4_二氯苯氧乙酸（2,4-0)的抗性的基因。參見例如￥31'四111:〇11，（1992)(]111'1'(^;[1113;[(^6(311(《生物技術(shù)新見》）3:506-11;Christopherson等人，（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）89:6314-8;Yao等人，（1992)Cell(《細(xì)胞》）71:63-72;Reznikoff，（1992)MolMicrobiol(《分子微生物學(xué)》)6:2419-22;Hu等人，（1987)Cell(《細(xì)胞》)48:555-66;Brown等人，（1987)Cell(《細(xì)胞》）49:603-12;Figge等人，（1988)Cell(《細(xì)胞》）52:713-22;Deuschle等人，（1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）86:5400-4;Fuerst等人，（1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）86:2549-53;Deuschle等人，(1990)Science(《科學(xué)》）248:480-3;Gossen,(1993)博士論文，海德堡大學(xué)（UniversityofHeidelberg);Reines等人，（1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）90:1917-21;Labow等人，（1990)MolCellBiol(《分子細(xì)胞生物學(xué)》）10:3343-56;Zambretti等人，（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》)89:3952-6;Baim等人，（1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》)88:5072-6;Wyborski等人，（1991)NucleicAcidsRes(《核酸研究》）19:4647-53;Hillen和Wissman,(1989)TopicsMolStrucBiol(《分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)專題》）10:143-62;Degenkolb等人，（1991)AntimicrobAgentsChemother(《抗微生物劑化學(xué)療法》）《抗微生物劑和化學(xué)療法》)35:1591-5;Kleinschnidt等人，（1988)Biochemistry(《生物化學(xué)》)27:1094-104;Bonin，（1993)博士論文，海德堡大學(xué)；Gossen等人，（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》)89:5547-51;01iva等人，（1992)AntimicrobAgentsChemother(《抗微生物劑化學(xué)療法》)36:913-9;Hlavka等人，（I985)HandbookofExperimentalPharmacology(《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊》），第78卷（柏林斯普林格出版社（Springer_Verlag，Berlin));Gill等人，（1988)Nature(《自然》）334:721-4。[0084]還提供了目的多核苷酸/多肽的活性變體或片段。這種活性變體可與天然的目的多核苷酸/多肽具有至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98(%、99(%或更高的序列同一性，其中該活性變體保留天然多核苷酸/多肽的生物活性。[0085]D.棺物[0086]還涵蓋在其基因組中具有本文提供的基因組窗口的植物、植物細(xì)胞或種子。還提供包含至少一個復(fù)合性狀基因座的植物、植物細(xì)胞或種子。所述植物、植物細(xì)胞或種子的基因組窗口和復(fù)合性狀基因座可包含任何本文描述的各種轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位或目的多核苷酸的任何組合。[0087]如本文所用，術(shù)語植物包括植物細(xì)胞、植物原生質(zhì)體、從中可再生出植物的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、在植物或植物部分中完好的植物塊和植物細(xì)胞如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、仁、穗、穗軸、殼、莖、根、根尖、花藥等。谷粒旨在表示由商業(yè)種植者出于栽培或繁殖物種之外的目的所生產(chǎn)的成熟種子。再生的植物的子代、變體和突變體也包括在本文內(nèi)，只要這些部分包含所述的DNA構(gòu)建體。[0088]本文所提供的轉(zhuǎn)化植物或轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞是其中已針對目的基因?qū)崿F(xiàn)了遺傳變更(如轉(zhuǎn)化）的植物或植物細(xì)胞，或者是從經(jīng)如此變更的植物或細(xì)胞遺傳下來并包含該變更的植物或植物細(xì)胞。"轉(zhuǎn)基因"是已經(jīng)通過轉(zhuǎn)化程序引入基因組中的基因。因此，"轉(zhuǎn)基因植物"是含有轉(zhuǎn)基因的植物，而不論該轉(zhuǎn)基因是通過轉(zhuǎn)化還是通過育種引入該特定植物中的；從而，該定義涵蓋了最初轉(zhuǎn)化植物的后代。"對照"或"對照植物"或"對照植物細(xì)胞"提供測量主題（subject)植物或植物細(xì)胞的表型變化的參考點(diǎn)。對照植物或植物細(xì)胞可例如包括：(a)野生型植物或細(xì)胞，即具有與用于進(jìn)行遺傳變更的起始材料相同的基因型的植物或細(xì)胞，該遺傳變更會得到主題植物或細(xì)胞；(b)具有與起始材料相同的基因型但已用無效構(gòu)建體（即，用不表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的構(gòu)建體，如包含標(biāo)記基因的構(gòu)建體）轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞；（c)為主題植物或植物細(xì)胞的子代中的非轉(zhuǎn)化分離子的植物或植物細(xì)胞；（d)在遺傳上與主題植物或植物細(xì)胞相同但不暴露于會引起轉(zhuǎn)基因的表達(dá)的條件或刺激因素的植物或植物細(xì)胞；或者（e)處于構(gòu)建體不被表達(dá)的條件下的主題植物或植物細(xì)胞本身。[0089]已被轉(zhuǎn)化而具有任何本文提供的各種組分（即轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位、位點(diǎn)特異性重組酶、重組位點(diǎn)、目的多核苷酸或其任何活性變體或片段）植物細(xì)胞可培養(yǎng)成全植物。從單一植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化體或從各種轉(zhuǎn)化的外植體再生、發(fā)育和培育植物是本領(lǐng)域熟知的。參見例如McCormick等人（1986)PlantCellReports(《植物細(xì)胞報道》）5:81-84;Weissbach和Weissbach，載于：MethodsforPlantMolecularBiology(《植物分子生物學(xué)方法》），（編輯），美國學(xué)術(shù)出版社公司（AcademicPress，Inc.)，加州圣地亞哥市（SanDiego,Calif.)，1988年）。該再生和生長方法通常包括以下步驟：選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，將那些個體化的（individualized)細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)過胚發(fā)育的通常階段經(jīng)過生根小植株階段。類似地再生轉(zhuǎn)基因胚和種子。之后將所得的轉(zhuǎn)基因生根苗種植在適當(dāng)?shù)闹参锷L培養(yǎng)基如土壤中。優(yōu)選地，使再生的植物自花授粉以提供純合的轉(zhuǎn)基因植物。另外，將從再生的植物獲得的花粉與農(nóng)藝上重要的株系的種子培育植株進(jìn)行雜交。反過來，用來自這些重要株系的植物的花粉對再生的植物進(jìn)行授粉。可以培育兩代或更多代以確保所需表型特性的表達(dá)得到穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。這樣，本文給出的組合物提供了轉(zhuǎn)化種子（也稱為"轉(zhuǎn)基因種子"），其在其基因組中穩(wěn)定整合了本文所提供的多核苷酸，例如轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0090]本文提供的各種組分（即轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位、位點(diǎn)特異性重組酶、重組位點(diǎn)、目的多核苷酸或其任何活性變體或片段）可用于任何植物物種（包括但不限于單子葉植物和雙子葉植物）的轉(zhuǎn)化。目的植物物種的例子包括但不限于玉米（玉蜀黍）(Zeamays)、蕓苔屬（Brassica)物種（如，甘藍(lán)型油菜（B.napus)、蕪菁（B.rapa)、芥菜(B.juncea))，尤其是可用作種子油來源的那些蕓苔屬物種、苜猜（Medicagosativa)、水稻（Oryzasativa)、黑麥（Secalecereale)、高梁（Sorghumbicolor,Sorghumvulgare)、粟（如，珍珠粟(Pennisetumglaucum)、黃米（Panicummiliaceum)、谷子(Setariaitalica)、龍爪稷（Eleusinecoracana))、向日葵（Helianthusannuus)、紅花（Carthamustinctorius)、小麥(Triticumaestivum)、大豆(Glycinemax)、煙草(Nicotianatabacum)、馬鈴薯（Solanumtuberosum)、落花生（Arachishypogaea)、棉花（海島棉(Gossypiumbarbadense)、陸地棉（Gossypiumhirsutum))、甘薯（Ipomoeabatatus)、木薯（Manihotesculenta)、咖啡（Coffeaspp·)、椰子（Cocosnucifera)、菠蘿（Ananascomosus)、柑橘（Citrusspp.)、可可（Theobromacacao)、茶（Camelliasinensis)、香蕉（Musaspp·)、鱷梨（Perseaamericana)、無花果（Ficuscasica)、番石槽（Psidiumguajava)、芒果(Mangiferaindica)、撤攬（Oleaeuropaea)、木瓜(Caricapapaya)、腰果（Anacardiumoccidentale)、澳洲堅(jiān)果（Macadamiaintegrifolia)、杏樹（Prunusamygdalus)、糖用甜菜（Betavulgaris)、甘鹿（Saccharumspp.)、燕麥、大麥、蔬菜、觀賞植物和針葉樹。[0091]蔬菜包括番爺（Lycopersiconesculentum)、萵苣（如Lactucasativa)、青豆(Phaseolusvulgaris)、利馬豆（Phaseoluslimensis)、豌豆（Lathyrusspp.)和黃瓜屬(Cucumis)的成員如黃瓜（C.sativus)、香瓜（C.cantalupensis)和甜瓜（C.melo)。觀賞植物包括杜胃$(Rhododendronspp·)、八仙花（Macrophyllahydrangea)、朱權(quán)（Hibiscusrosasanensis)、玫瑰（Rosaspp.)、郁金香（Tulipaspp.)、水仙（Narcissusspp.)、矮牽牛(Petuniahybrida)、康乃馨（Dianthuscaryophyllus)>一品紅（Euphorbiapulcherrima)和菊花。[0092]可采用的針葉樹包括例如松樹如火炬松（Pinustaeda)、沼澤松（Pinuselliotii)、美國黃松（Pinusponderosa)、黑松（Pinuscontorta)和蒙特利松（Pinusradiata);花方萁松(Pseudotsugamenziesii);西鐵杉(Tsugacanadensis);北美云杉（Piceaglauca);紅杉（Sequoiasempervirens);揪樹（truefirs)如銀揪（Abiesamabilis)和膠揪（Abiesbalsamea);以及雪松如西方紅雪松（Thujaplicata)和阿拉斯加黃雪松（Chamaecyparisnootkatensis)。在具體的實(shí)施例中，植物是作物植物（例如玉米、苜蓿、向日葵、蕓苔、大豆、棉花、紅花、花生、高粱、小麥、小米、煙草等等）。在其他實(shí)施例中，玉米和大豆植物是最佳的，在另外其他實(shí)施例中，玉米植物是最佳的。[0093]其他的目的植物包括提供目的種子的谷物植物、油料種子植物和豆科植物。目的種子包括谷物種子，如玉米、小麥、大麥、水稻、高粱、黑麥等。油料種子植物包括棉花、大豆、紅花、向日葵、蕓苔、玉蜀黍、苜蓿、棕櫚、椰子等。豆科植物包括莢果類（beans)和豌豆。莢果類包括瓜爾豆、槐豆、胡蘆巴、大豆、四季豆、豇豆、綠豆、利馬豆、蠶豆、小扁豆、鷹嘴豆等等。[0094]已經(jīng)認(rèn)識到具有穩(wěn)定摻入的DNA構(gòu)建體的植物可進(jìn)一步就位點(diǎn)特異性整合潛能、農(nóng)藝潛能和拷貝數(shù)目進(jìn)行表征。參見美國專利No.6,187,994。[0095]取決于摻入進(jìn)基因組窗口中的目的多核苷酸，包含本文提供的目的多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物、植物細(xì)胞或種子可具有表型變化，包括但不限于變更的病原體或昆蟲防御機(jī)制、增加的對一種或多種除草劑的抗性、增加的抵抗脅迫性環(huán)境條件的能力、經(jīng)修飾的產(chǎn)生淀粉的能力、經(jīng)修飾的淀粉產(chǎn)生的水平、變更的油脂含量和/或組成、變更的碳水化合物含量和/或組成、變更的脂肪酸含量和/或組成、變更的磷含量和/或組成、變更的抗氧化劑含量和/或組成、經(jīng)修飾的利用、分配和/或儲存氮的能力等等。[0096]III.產(chǎn)牛和奪審復(fù)合件狀某閔座的方法[0097]A.形成復(fù)合件狀某閔座[0098]基因組窗口的組分（即轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位）可通過多種方法合在一起。一個這種方法是使包含在給定基因組窗口中具有不同基因組插入位點(diǎn)的各種靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位的植物雜交，并選擇已經(jīng)經(jīng)歷重組事件使得轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位的所需組合存在于同一植物中的植物?？蓮亩捎眠@類育種技術(shù)來在植物中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座。[0099]如本文所用，"育種"是對活生物體的遺傳操縱。通過利用植物的授粉方法的技術(shù)將植物進(jìn)行育種。如果花粉從一朵花轉(zhuǎn)移至相同植株的同一朵花或另一朵花，則植物是自花授粉。當(dāng)相同家系或株系內(nèi)的個體用于授粉時，則植物是近緣授粉。如果花粉來自不同家系或株系的不同植株上的花時，則植物是異花授粉。在育種應(yīng)用中，育種者最初選擇兩株或更多株親本植株并使其雜交。視上下文而定，本文所用的"雜交"可指簡單的XXY雜交或指回交過程。[0100]本文提供了使用育種技術(shù)來建立復(fù)合性狀基因座或來使復(fù)合性狀基因座分開的方法。例如，可使在基因組窗口內(nèi)包含第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植株（并且該第一植株不包含第一目的基因組座位）與在同一基因組窗口內(nèi)包含第一目的基因組座位的第二植株(并且該第二植株在基因組窗口內(nèi)不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)）雜交。然后選擇在基因組窗口內(nèi)包含第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位二者的子代植株。選擇包含靶位點(diǎn)和目的基因組座位二者的子代植株可通過多種方法進(jìn)行。例如，可進(jìn)行表型分析，據(jù)此檢測子代植株中標(biāo)記或所引入的序列的活性。測定對目的基因組座位和靶位點(diǎn)有特異性的標(biāo)記的備選方法包括諸如PCR、雜交、同工酶電泳、限制性片段長度多態(tài)性（RFLPs)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPDs)、任意引物PCR(AP-PCR)、DNA擴(kuò)增指紋分析（DAF)、序列特征化擴(kuò)增區(qū)域(SequenceCharacterizedAmplifiedRegion，SCARs)、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLPs)、簡單序列重復(fù)（SSRs)和單核苷酸多態(tài)性（SNPs)之類的技術(shù)。[0101]在非限制性的實(shí)施例中，復(fù)合性狀基因座可包含（1)在所述基因組窗口中具有不同基因組插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位；（2)在所述基因組窗口中具有不同基因組插入位點(diǎn)的2個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和一個目的基因組座位；（3)在所述基因組窗口中具有不同基因組插入位點(diǎn)的2個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和2個目的基因組座位；（4)包含一種或多種目的多核苷酸的目的基因組座位和靶位點(diǎn)，其中所述目的基因組座位和轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（5)包含轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（6)包含天然性狀的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（7)包含第一和第二相異重組位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，和目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（8)目的基因組座位、包含第一和第二相異重組位點(diǎn)的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和包含第三和第四相異重組位點(diǎn)的第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中所述目的基因組座位、第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)每一者具有不同的基因組插入位點(diǎn)；(9)目的基因組座位、包含第一和第二相異重組位點(diǎn)的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、包含第三和第四相異重組位點(diǎn)的第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和包含第五和第六相異重組位點(diǎn)的第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中所述目的基因組座位、第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（10)第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（其中第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含與第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)不同的相異重組位點(diǎn)）以及目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（11)第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（其中第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含與第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)相同的相異重組位點(diǎn)）和目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（12)第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（其中相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT位點(diǎn)和突變型FRT位點(diǎn)）和目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；（13)第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（其中相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT5、FRT6、FRT7、FRT12或FRT87位點(diǎn)）和目的基因組座位，各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；或者（14)第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（其中相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT1和FRT87位點(diǎn)）以及目的基因組座位，各具有不同的基因組整合位點(diǎn)。[0102]可在植物基因組中的基因組窗口內(nèi)產(chǎn)生包含多個靶位點(diǎn)、目的基因組座位和/或目的多核苷酸的復(fù)合性狀基因座。圖1提供了兩種性狀如何可以以例如彼此相距5cM的遺傳距離被堆疊進(jìn)基因組中的非限制性例子。使在基因組窗口內(nèi)包含第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)并且不具有第一目的基因組座位的第一植株與在基因組窗口內(nèi)的不同基因組插入位點(diǎn)包含目的基因組座位的第二轉(zhuǎn)基因植株（并且第二植株不包含第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)）雜交。約5%的來自該雜交的植物子代將具有在基因組窗口內(nèi)的不同基因組插入位點(diǎn)整合的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位二者?？墒乖谙薅ǖ幕蚪M窗口中具有兩個位點(diǎn)的子代植株進(jìn)一步與在限定的基因組窗口內(nèi)包含第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或第二目的基因組座位并且缺少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位的第三轉(zhuǎn)基因植株雜交。然后選擇具有在基因組窗口內(nèi)的不同基因組插入位點(diǎn)整合的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第一目的基因組座位和第二目的基因組座位的子代。這類方法可用于產(chǎn)生包含復(fù)合性狀基因座的轉(zhuǎn)基因植物，該復(fù)合性狀基因座具有在基因組窗口內(nèi)的不同位點(diǎn)整合的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位。以這種方式，可產(chǎn)生多個復(fù)合性狀基因座。[0103]在一個非限制性的實(shí)施例中，在植物基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法包括提供第一植株，該第一植株在長度為約l〇cM的基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)并且不包含第一目的基因組區(qū)。該基因組窗口可具有任何所需長度，如本文別的地方所述的。該方法涉及將該第一植株與在相同基因組窗口內(nèi)的不同基因組插入位點(diǎn)包含第一目的基因組座位并且不包含該第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第二植株進(jìn)行育種，并且選擇包含該第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和該目的基因組座位的子代。在另一個實(shí)施例中，該方法還涉及提供在基因組窗口內(nèi)具有第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植株，所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)，其中該第一植株不包含目的基因組座位。將該第一植株與第二植株進(jìn)行育種，其中該第二植株在基因組窗口內(nèi)包含目的基因組座位并且不包含該第一和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，并且選擇包含該第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、該第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和該目的基因組座位的子代植物，所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位全部在基因組窗口具有不同的基因組插入位點(diǎn)。該子代植物的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位可以約10-0.1%、約10-0.5%、約10-1%、約10-5%、約9-0.1%、約9-0.5%、約9-1%、約9-5%、約8-0.1%、約8-0.5%、約8-1%、約8-4%、約7-0.1%、約7-0.5%、約7-1%、約7-4%、約6-0.1%、約6-0.5%、約6-1%、約6-3%、約5-0.1%、約5-0.5%、約5-1%、約4-0.1%、約4-0.5%、約4-1%、約3-0.1%、約3-0.5%、約3-1%、約2-0.1%、約2-0.5%、約1-0.1%或約1-0.5%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0104]以該方式，已經(jīng)認(rèn)識到可使本文提供的植物雜交以產(chǎn)生包含本文所述的各種基因組窗口、轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位和/或目的多核苷酸的任何組合的復(fù)合性狀基因座。[0105]B.奪審復(fù)合件狀某閔座[0106]前面的部分描述了通過將靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位添加至基因組窗口從而制備復(fù)合性狀基因座來產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的各種方法。已經(jīng)認(rèn)識到還可通過移除或育種除去某些轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位來變更復(fù)合性狀基因座。對本文提供的復(fù)合性狀基因座進(jìn)行設(shè)計，使得各轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)并且可獨(dú)立地分開。這種設(shè)計使得性狀能在育種中添加進(jìn)基因組窗口中并且還使得性狀能在育種中從基因組窗口移除。[0107]可采用上面描述的將性狀組合進(jìn)基因組窗口中的育種方法來通過育種移除性狀而從基因組窗口移除性狀。[0108]通過育種移除來變更復(fù)合性狀基因座的方法包括提供包含待移除的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位的第一植株，并使該第一植株與在基因組窗口中不具有該特定轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位的第二植株雜交。然后就選擇缺少該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位的所得的子代。例如，可使包含各在基因組窗口內(nèi)具有不同的基因組插入位點(diǎn)的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的第一植株與第二植株雜交。選擇其中該基因組窗口不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位中的任一者或任兩者的子代植物。以該方式，可從該復(fù)合性狀基因座移除至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個靶位點(diǎn)和/或目的基因組座位。[0109]在該方法的一個實(shí)施例中，第一植株在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位。第一植株的基因組窗口長約10cM，并且第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位的每一者具有不同的基因組插入位點(diǎn)并且以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。該方法還包括將第一植株與第二植株育種并選擇其中子代的基因組窗口不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位中的任一者或任二者的子代。在另一個實(shí)施例中，所述第一植株的基因組窗口長約5cM，并且該第一植株的第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。在又一實(shí)施例中，第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率與第一植株的第一目的基因組座位獨(dú)立地分開。[0110]C.奪審轉(zhuǎn)某閔靶位點(diǎn)的方法[0111]本文提供的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含至少一個重組位點(diǎn)，如本文別的地方描述的，其可用于將一種或多種目的多核苷酸直接插入進(jìn)靶位點(diǎn)中。因而，可通過位點(diǎn)特異性整合方法操縱包含多個靶位點(diǎn)的復(fù)合性狀基因座。這類方法在W099/25821中詳細(xì)描述，將該專利以引用的方式并入本文。該方法使得能通過采用位點(diǎn)特異性重組在建立的復(fù)合性狀基因座的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)內(nèi)移除、添加和/或替代多種目的多核苷酸?；蛘撸稍趯⒅参镉糜谟N方法來產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座之前變更該植物中的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0112]可通過任何本領(lǐng)域已知的轉(zhuǎn)化方法將轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)引入進(jìn)植物基因組中。例如，將轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)作為多核苷酸構(gòu)建體提供并引入進(jìn)植物或植物細(xì)胞中。然后，可采用位點(diǎn)特異性整合來將轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)插入進(jìn)植物的基因組中。參見例如美國專利No.6,187,994、No.6,262,341、No.6,330,545和No.6,331，661以及編號為2011-0047655的美國專利公開，將這些專利和專利公開以引用的方式全文并入本文。一旦產(chǎn)生，可將包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的這種植株用于上面論述的育種方法中以及用于多種操縱靶位點(diǎn)內(nèi)的序列的方法中。這類方法采用位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的各種成分，如本文別的地方詳細(xì)描述的。[0113]該方法還包括向包含整合的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物細(xì)胞中引入轉(zhuǎn)移盒。該轉(zhuǎn)移盒包含用于將目的多核苷酸摻入進(jìn)植物基因組內(nèi)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)中的各種成分。如本文所定義的，"轉(zhuǎn)移盒"包含至少第一重組位點(diǎn)、目的多核苷酸和第二重組位點(diǎn)，其中所述第一和第二重組位點(diǎn)是相異的并且對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)中的重組位點(diǎn)。在一些實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移盒的第一和第二重組位點(diǎn)是相異的并且彼此具有降低的相容性并且對應(yīng)于轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)中的重組位點(diǎn)。已經(jīng)認(rèn)識到可將重組位點(diǎn)的任何組合用于轉(zhuǎn)移盒中以提供目的多核苷酸。[0114]在一個實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移盒包含第一重組位點(diǎn)、第一目的多核苷酸和第二重組位點(diǎn)。在這類方法中，轉(zhuǎn)移盒的所述第一和第二重組位點(diǎn)是可分別與轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一和第二重組位點(diǎn)會發(fā)生重組（即相同的或?qū)?yīng)的）。[0115]在一特定的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移盒還包含至少一個與驅(qū)動在植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動子有效連接的編碼區(qū)。如本文別的地方論述的，提供了在轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和轉(zhuǎn)移盒的重組位點(diǎn)處識別并實(shí)現(xiàn)重組的重組酶。重組酶可通過本領(lǐng)域已知的任何手段提供并且在本文別的地方有詳細(xì)描述。在一特定的實(shí)施例中，轉(zhuǎn)移盒的編碼區(qū)編碼重組酶，該重組酶有利于轉(zhuǎn)移盒和轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一和第二重組位點(diǎn)之間的重組。[0116]另外，提供了選擇至少一個在轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)處具有轉(zhuǎn)移盒整合的植物細(xì)胞的方法。選擇在轉(zhuǎn)基因祀位點(diǎn)處具有整合的植物細(xì)胞，例如選擇表達(dá)選擇標(biāo)記的細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域已知的并且在本文別的地方有描述。[0117]照此，可變更復(fù)合性狀基因座內(nèi)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以包含各種目的多核苷酸。因而，本文提供的方法具有通過育種方法和通過位點(diǎn)特異性整合方法兩者來變更復(fù)合性狀基因座的有益效果。通過這類方法，可將任何目的多核苷酸從植物中的復(fù)合性狀基因座中移除和/或引入其中。[0118]IV.引入方法[0119]本文提供的方法包括向植物細(xì)胞、植物或種子中引入各種多核苷酸構(gòu)建體或多肽，包括但不限于本文提供的各種轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位、轉(zhuǎn)基因、包含第一和第二相異重組位點(diǎn)或彼此具有降低的相容性的第一和第二相異重組位點(diǎn)的靶位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶、轉(zhuǎn)移盒、目的多核苷酸或其任何活性變體或片段。[0120]所謂"引入"意指將序列（多肽或多核苷酸）以使得該序列能夠到達(dá)植物細(xì)胞的內(nèi)部的方式呈送給植物。本文提供的方法不取決于將序列引入進(jìn)植物中的具體方法，只要多核苷酸或多肽進(jìn)入植物的至少一個細(xì)胞的內(nèi)部即可。將序列引入進(jìn)植物中的方法是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化方法、瞬時轉(zhuǎn)化方法、病毒介導(dǎo)的方法和有性育種。因而，在將多核苷酸構(gòu)建體插入進(jìn)細(xì)胞中的語境中的"引入"意指"轉(zhuǎn)染"或"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)導(dǎo)"并且包括指代多核苷酸構(gòu)建體摻入進(jìn)植物細(xì)胞中，其中該多核苷酸構(gòu)建體可摻入進(jìn)細(xì)胞的基因組中。[0121]在一些實(shí)施例中，本方法和組合物中采用的植物細(xì)胞、植物和種子具有穩(wěn)定摻入進(jìn)其基因組中的DNA構(gòu)建體。所謂"穩(wěn)定摻入"或"穩(wěn)定引入"意指多核苷酸引入進(jìn)植物中使得該核苷酸序列整合進(jìn)植物的基因組中并且能夠被其子代所遺傳。可將任何規(guī)程用于該DNA構(gòu)建體或本文采用的各種組分的穩(wěn)定摻入。[0122]轉(zhuǎn)化規(guī)程以及將多肽或多核苷酸序列引入進(jìn)植物中的規(guī)程，可根據(jù)要進(jìn)行轉(zhuǎn)化的植物或植物細(xì)胞的類型（即單子葉植物或雙子葉植物）而異。將多肽和多核苷酸引入進(jìn)植物細(xì)胞中的合適方法包括顯微注射（Crossway等人（1986)Biotechniques(《生物技術(shù)》）4:320-334)、電穿孔（Riggs等人（1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國國家科學(xué)院院刊》）83:5602-5606)、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化（美國專利No.5,563,055和美國專利此.5,981，840)、直接基因轉(zhuǎn)移（?&821?)￥81^等人（1984"1^01(《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》）3:2717-2722)和彈道粒子加速（參見例如美國專利No.4,945,050、美國專利No.5,879,918、美國專利No.5,886,244和5,932,782;Tomes等人（1995)，載于：PlantCell，Tissue，andOrganCulture:FundamentalMethods(《植物細(xì)胞、組織和器官培養(yǎng)：基礎(chǔ)方法》），Gamborg和Phillips編輯（柏林斯普林格出版社）；McCabe等人(1988)Biotechnology(《生物技術(shù)》）6:923-926);以及Lecl轉(zhuǎn)化（W000/28058)。還可參見Weissinger等人（l988)Ann.Rev.Genet.(《遺傳學(xué)年評》）22:42l_477;Sanford等人（1987)ParticulateScienceandTechnology(《粒子科學(xué)和技術(shù)》）5:27-37(洋蔥）；Christou等人（1988)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）87:671-674(大豆）；McCabe等人（1988)Bio/Technology(《生物/技術(shù)》）6:923-926(大豆）；Finer和McMullen(1991)InVitroCellDev.Biol.(《體外細(xì)胞發(fā)育生物學(xué)》）27P:175-182(大豆）；Singh等人(1998)，Theor.Appl.Genet.(《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》)96:319-324(大豆）；Datta等人（1990)Biotechnology(《生物技術(shù)》)8:736-740(水稻）；Klein等人（1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》)85:4305-4309(玉蜀黍）；Klein等人（1988)Biotechnology(《生物技術(shù)》）6:559-563(玉蜀黍）；美國專利No.5,240,855、Νο·5,322,783和No.5,324,646;Klein等人（1988)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）91:440-444(玉蜀黍）；Fromm等人(1990)Biotechnology(《生物技術(shù)》）8:833-839(玉蜀黍）；Hooykaas_VanSlogteren等人(1984)恥加^(《自然》）（倫敦）311:763-764;美國專利吣.5,736,369(谷類）出7七61^6『等人（1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）84:5345-5349(百合科）；DeWet等人（1985),TheExperimentalManipulationofOvuleTissues(《胚珠組織的實(shí)驗(yàn)操作》），Chapman等人編輯，紐約朗文出版社（Longman,NewYork),第197-209頁(花粉）；Ka印pier等人（1990)PlantCellR印orts(《植物細(xì)胞報道》）9:415-418以及Kaeppler等人（1992)Theor.Appl.Genet.(《理論與應(yīng)用遺傳學(xué)》）84:560-566(晶須介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化）；D'Halluin等人（1992)PlantCell(《植物細(xì)胞》）4:1495-1505(電穿孔）；Li等人（1993)PlantCellR印orts(《植物細(xì)胞報道》）12:250-255以及Christou和Ford(1995)AnnalsofBotany(《植物學(xué)年鑒》）75:407-413(水稻）；0sjoda等人（1996)NatureBiotechnology(《自然生物技術(shù)》）14:745-750(經(jīng)由根癌土壤桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)轉(zhuǎn)化玉蜀黍）；將所有這些文獻(xiàn)和專利以引用方式并入本文。[0123]在其他實(shí)施例中，可以通過使植物與病毒或病毒核酸接觸將任何本文所采用的多核苷酸引入植物中。一般地講，這類方法涉及將所需的多核苷酸摻入在病毒DNA或RNA分子內(nèi)。已經(jīng)認(rèn)識到，本文所提供的方法或組合物中采用的序列可最初作為病毒多聚蛋白的一部分來合成，其以后可通過體內(nèi)或體外蛋白水解加工而產(chǎn)生所需的重組蛋白質(zhì)。此外，已經(jīng)認(rèn)識到，本文所采用的啟動子還涵蓋用于通過病毒RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的啟動子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于將多核苷酸引入植物中并表達(dá)其中所編碼的蛋白質(zhì)的方法是本領(lǐng)域已知的。參見（例如）美國專利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、Νο·5,316,931以及Porta等人（1996)MolecularBiotechnology(《分子生物技術(shù)》）5:209-221;將這些專利和文獻(xiàn)以引用方式并入本文。[0124]"瞬時轉(zhuǎn)化"意指將多核苷酸引入宿主（即植物）中并進(jìn)行暫時表達(dá)。這類瞬時轉(zhuǎn)化方法包括但不限于直接將任何組分（即靶位點(diǎn)、目的基因組座位、重組位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶、目的多核苷酸或其活性變體和片段）引入植物中或者將轉(zhuǎn)錄物引入植物中。這類方法包括例如顯微注射或粒子轟擊。參見例如Crossway等人（1986)MolGen.Genet.(《分子遺傳學(xué)和基因組學(xué)》）202:179-185;Nomura等人（1986)PlantSci.(《植物科學(xué)》）44:53_58;H印ler等人（l994)Proc.Natl.Acad.Sci.(《美國科學(xué)院院刊》)91:2176_218〇以及Hush等人（1994)TheJournalofCellScience(《細(xì)胞科學(xué)雜志》）107:775-784,將以上所有文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。或者，可使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)將多核苷酸瞬時轉(zhuǎn)化進(jìn)植物中。這類技術(shù)包括病毒載體系統(tǒng)以及將多核苷酸以避免該DNA隨后釋放的方式進(jìn)行沉淀。因此，可能從粒子結(jié)合的DNA發(fā)生轉(zhuǎn)錄，但將它釋放出來以整合進(jìn)基因組中的頻率大大降低。此類方法包括使用聚乙基亞胺（PEI;Sigma#P3143)包被的粒子。[0125]已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞可以根據(jù)常規(guī)方式培育成植株。參見例如McCormick等人（1986)PlantCellR印orts(《植物細(xì)胞報道》）5:81-84。然后可使這些植物生長，用相同的轉(zhuǎn)化植株或不同的植株進(jìn)行授粉，所得的子代具有所鑒定的所需表型特征的組成型表達(dá)?？梢耘嘤齼纱蚋啻源_保所需表型特性的表達(dá)得到穩(wěn)定保持和遺傳，然后收獲種子以確保已經(jīng)實(shí)現(xiàn)所需表型特征的表達(dá)。這樣，提供了所述DNA構(gòu)建體穩(wěn)定摻入進(jìn)其基因組中的轉(zhuǎn)化種子（也稱為"轉(zhuǎn)基因種子"）。[0126]V.多核苷酸[0127]本文提供包含復(fù)合性狀基因座的各種組分或用于變更本文提供的復(fù)合性狀基因座的各種組分（即各種轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、目的基因組座位、轉(zhuǎn)基因、重組位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶、轉(zhuǎn)移盒、目的多核苷酸或其任何活性變體或片段）的多核苷酸。[0128]術(shù)語"多核苷酸"、"多核苷酸序列"、"核酸序列"和"核酸片段"在本文可互換使用。這些術(shù)語涵蓋核苷酸序列等。多核苷酸可以為RNA或DNA的聚合物，其為單鏈或雙鏈的，并且任選含有合成的、非天然的或變更的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的多核苷酸可以由一段或多段cDNA、基因組DNA、合成DNA或其混合物構(gòu)成。術(shù)語"多核苷酸"的使用并不旨在將本發(fā)明局限于包含DNA的多核苷酸。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會認(rèn)識到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脫氧核糖核苷酸的組合。這種脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的類似物。本文所提供的多核苷酸還涵蓋所有形式的序列，包括但不限于單鏈形式、雙鏈形式、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、莖-環(huán)結(jié)構(gòu)等。[0129]本文所提供的組合物可包含分離的或?qū)嵸|(zhì)上純化的多核苷酸。"分離的"或"純化的"多核苷酸實(shí)質(zhì)上或基本上不含通常在該多核苷酸的天然環(huán)境中存在的、與該多核苷酸相伴隨或相互作用的成分。因此，分離的或純化的多核苷酸，當(dāng)通過重組技術(shù)生產(chǎn)時實(shí)質(zhì)上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基，或者當(dāng)通過化學(xué)法合成時實(shí)質(zhì)上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)品。最佳的是，"分離的"多核苷酸不含在衍生該多核苷酸的生物體的基因組DNA中天然位于該多核苷酸的旁側(cè)的序列（即位于該多核苷酸的5'和3'端的序列）（最佳的是蛋白質(zhì)編碼序列）。例如，在多個實(shí)施例中，分離的多核苷酸可含有小于約5kb、4kb、3kb、2kb、lkb、0.5kb或0.lkb的在衍生該多核苷酸的細(xì)胞的基因組DNA中天然位于該多核苷酸的旁側(cè)的核苷酸序列。[0130]還提供的是包含各種靶位點(diǎn)、轉(zhuǎn)基因、目的基因組座位、轉(zhuǎn)移盒、重組位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶、目的多核苷酸或任何其活性變體或片段的重組多核苷酸。術(shù)語"重組多核苷酸"和"重組DNA構(gòu)建體"在本文可互換使用。重組構(gòu)建體包含核酸序列（如自然界中不在一起的調(diào)控序列和編碼序列）的人工或異源組合。例如，轉(zhuǎn)移盒可包含限制位點(diǎn)和異源目的多核苷酸。在其他實(shí)施例中，重組構(gòu)建體可包含源自不同來源的調(diào)控序列和編碼序列，或者源自相同來源、但是以不同于自然界中存在的方式排列的調(diào)控序列和編碼序列。此類構(gòu)建體可單獨(dú)使用或可與載體結(jié)合使用。如果使用載體，則載體的選擇取決于本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的將用于轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞的方法。例如，可使用質(zhì)粒載體。技術(shù)人員充分認(rèn)識到為了成功轉(zhuǎn)化、選擇和繁殖包含任何本文所提供的分離的核酸片段的宿主細(xì)胞而必須存在于載體上的遺傳元件。技術(shù)人員還將認(rèn)識到，不同的獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件將導(dǎo)致不同的表達(dá)水平和表達(dá)模式（Jones等人EMBOJ.(《歐洲分子生物學(xué)學(xué)會雜志》)4:2411-2418(1985);DeAlmeida等人Mol.Gen.Genetics(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》）218:78-86(1989))，因而必須對多個事件進(jìn)行篩選以獲得顯示所需表達(dá)水平和表達(dá)模式的細(xì)胞系。此類篩選可以通過對DNA的DNA印跡分析、對mRNA表達(dá)的RNA印跡分析、對蛋白表達(dá)的免疫印跡分析、或表型分析等等來實(shí)現(xiàn)。[0131]在具體的實(shí)施例中，可在表達(dá)盒中提供一種或多種本文所述的多核苷酸供在目的植物或其他生物體或細(xì)胞中表達(dá)。該表達(dá)盒可包括與本文所提供的多核苷酸有效連接的5'和3'調(diào)控序列。"有效連接"旨在意指兩個或更多個元件之間的功能性連接。例如，目的多核苷酸與調(diào)控序列（即啟動子）之間的有效連接是可使該目的多核苷酸得以表達(dá)的功能連接。有效連接的元件可以是連續(xù)的或非連續(xù)的。當(dāng)用來指兩個蛋白質(zhì)編碼區(qū)域的連接時，所謂有效連接意指所述編碼區(qū)域處于相同的閱讀框中。表達(dá)盒可另外含有至少一個待共轉(zhuǎn)化進(jìn)該生物體中的額外基因?；蛘?，可在多個表達(dá)盒上提供額外的基因。這種表達(dá)盒設(shè)有多個限制位點(diǎn)和/或重組位點(diǎn)，以使重組多核苷酸的插入處于調(diào)控區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)之下。表達(dá)盒可另外含有選擇標(biāo)記基因。[0132]表達(dá)盒可在5'-3'轉(zhuǎn)錄方向上包括在植物中起作用的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始區(qū)（即啟動子）、本文提供的重組多核苷酸以及轉(zhuǎn)錄和翻譯終止區(qū)（即終止區(qū)）。調(diào)控區(qū)（即啟動子、轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)和翻譯終止區(qū)）和/或本文提供的多核苷酸對宿主細(xì)胞而言或彼此之間而言可以是天然的/同功的。或者，調(diào)控區(qū)和/或本文提供的多核苷酸對宿主細(xì)胞而言或彼此之間而言可以是異源的。如本文所用，指涉序列的"異源"為起源于外來物種的序列，或者，如果起源于相同物種的話，則是通過蓄意人為干預(yù)對其天然形式在組成和/或基因座方面進(jìn)行實(shí)質(zhì)性修飾的序列。例如，有效連接至異源多核苷酸的啟動子來自與衍生這種多核苷酸的物種不同的物種，或者如果來自于相同/相似的物種，則一者或者兩者由它們的原始形式和/或基因座經(jīng)實(shí)質(zhì)修飾而來，或者該啟動子不是該有效連接的多核苷酸的天然啟動子。或者，調(diào)控區(qū)和/或本文提供的重組多核苷酸可以是完全合成的。[0133]終止區(qū)可以對于轉(zhuǎn)錄起始區(qū)而言是天然的，可以對于有效連接的重組多核苷酸而言是天然的，可以對于植物宿主而言是天然的，或者可以衍自對于該啟動子、該重組多核苷酸、該植物宿主或它們的任何組合而言別的來源（即外來的或異源的）。便利的終止區(qū)可獲自根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒，如章魚堿合酶和胭脂堿合酶終止區(qū)。另參見Guerineau等人（1991)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》）262:141-144;Proudfoot(1991)Cell(《細(xì)胞》)64:671-674;Sanfacon等人（1991)GenesDev.(《基因和發(fā)育》）5:141-149;Mogen等人（1990)PlantCell(《植物細(xì)胞》）2:1261-1272;Munroe等人（1990)Gene(《基因》）91:151-158;Ballas等人（1989)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》）17:7891-7903;以及Joshi等人（1987)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》）15:9627-9639。[0134]在制備表達(dá)盒時，可對多個DNA片段進(jìn)行操縱，以提供處于正確取向的DNA序列。為此目的，可應(yīng)用銜接子或接頭將DNA片段連接在一起，或者可涉及其他的操縱以提供便利的限制位點(diǎn)、去除多余的DNA、去除限制位點(diǎn)等。出于這個目的，可涉及到體外誘變、引物修復(fù)、限制酶切、退火、再置換（如轉(zhuǎn)換和顛換）。[0135]可將多個啟動子用于本文提供的表達(dá)盒中。啟動子可基于所需的結(jié)果來選擇。已經(jīng)認(rèn)識到，可通過在表達(dá)盒中使用不同啟動子來調(diào)節(jié)目的多核苷酸表達(dá)的時序、位置和/或水平而增強(qiáng)不同的應(yīng)用。如果需要，這種表達(dá)構(gòu)建體還可含有啟動子調(diào)控區(qū)（如，賦予誘導(dǎo)型表達(dá)或組成型表達(dá)，由環(huán)境或發(fā)育調(diào)節(jié)的表達(dá)，或細(xì)胞或組織特異性/選擇性表達(dá)的啟動子調(diào)控區(qū)）、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、RNA加工信號、轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)和/或多腺苷酸化信號。[0136]在一些實(shí)施例中，本文所提供的表達(dá)盒可以與用于在植物中表達(dá)的組成型啟動子、組織偏好型啟動子或其他啟動子組合。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)、源自根癌農(nóng)桿菌T-DNA的Γ-或2'-啟動子、泛素1啟動子、Smas啟動子、肉桂醇脫氫酶啟動子（美國專利No.5,683,439)、Nos啟動子、pEmu啟動子、rubisco啟動子、GRP1-8啟動子和源自技術(shù)人員已知的各種植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)。如果低水平表達(dá)是所需的，則可使用弱啟動子。弱組成型啟動子包括例如Rsyn7啟動子的核心啟動子（W099/43838和美國專利No.6,072,050)、核心35SCaMV啟動子等。其他組成型啟動子包括例如美國專利No.5,608,149、No.5,608,144、No.5,604,121、No.5,569,597、No.5,466,785、No.5,399,680、No.5,268,463和No.5,608,142。還可參見美國專利No.6,177,611，將其以引用方式并入本文。[0137]誘導(dǎo)型啟動子的例子為Adhl啟動子（其可由低氧或冷應(yīng)激誘導(dǎo)）、Hsp70啟動子(其可由熱應(yīng)激誘導(dǎo)）、PPDK啟動子和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶啟動子（兩者均可由光誘導(dǎo)）。還可使用的是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，如受安全劑（safener)誘導(dǎo)的In2-2啟動子（美國專利No.5,364,780)、受雌激素誘導(dǎo)的ERE啟動子、以及受植物生長素誘導(dǎo)的、絨氈層特異性的但在愈傷組織中也有活性的Axigl啟動子（PCTUS01/22169)。[0138]在發(fā)育控制下的啟動子的例子包括優(yōu)先在某些組織（如葉、根、果實(shí)、種子或花）中起始轉(zhuǎn)錄的啟動子。示例性啟動子是花藥特異性啟動子5126(美國專利No.5,689,049和No.5,689,051)。種子偏好的啟動子的例子包括但不限于27kDY玉米醇溶蛋白基因啟動子和蠟質(zhì)基因啟動子，Boronat，A.等人（1986)PlantSci.(《植物科學(xué)》）47:95-102;Reina，Μ·等人Nucl.AcidsRes.(《核酸研究》）18(21):6426;以及Kloesgen，R.B.等人（1986)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》）203:237-244。在胚、果皮和胚乳中表達(dá)的啟動子在美國專利No.6,225,529和PCT公布W000/12733中有公開。將這些專利各自的公開內(nèi)容全文以引用方式并入本文中。[0139]可將化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子用于通過施加外源化學(xué)調(diào)節(jié)劑來調(diào)控基因在植物中的表達(dá)。取決于目標(biāo)，啟動子可以是化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)可誘導(dǎo)基因表達(dá)，或者是化學(xué)抑制型啟動子，其中施用化學(xué)物質(zhì)可抑制基因表達(dá)?；瘜W(xué)誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域已知的，包括但不限于玉蜀黍In2-2啟動子（其通過苯磺酰胺除草劑安全劑激活）、玉蜀黍GST啟動子（其通過用作出土前（pre-emergent)除草劑的疏水性親電化合物激活）和煙草PR-la啟動子（其通過水楊酸激活）。其他值得關(guān)注的化學(xué)調(diào)節(jié)啟動子包括類固醇響應(yīng)型啟動子（參見例如，糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)型啟動子，載于：Schena等人（1991)Proc·Nat；LAcad·Sci·USA(《美國科學(xué)院院刊》)88:10421-10425;以及McNellis等人（1998)PlantJ.(《植物雜志》）14(2):247-257)和四環(huán)素誘導(dǎo)型和四環(huán)素阻遏型啟動子（參見例如，Gatz等人（1991)Mol.Gen.Genet.(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》）227:229-237;以及美國專利No.5,814,618和No.5,789,156)，將這些專利和文獻(xiàn)以引用方式并入本文。[0140]可利用組織偏好的啟動子來靶向目的多核苷酸在特定植物組織內(nèi)的增強(qiáng)表達(dá)。組織偏好的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人（1997)PlantJ.(《植物雜志》）12(2):255_265;Kawamata等人（I"7)PlantCellPhysiol.(《植物細(xì)胞生理學(xué)》）38(7):792-803;Hansen等人（1997)Mol.GenGenet.(《分子遺傳學(xué)與普通遺傳學(xué)》）254(3):337-343;Russell等人（1997)TransgenicRes.(《轉(zhuǎn)基因研究》）6(2):157-168;Rinehart等人（1996)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）112(3):1331-1341;VanCamp等人（1996)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）112(2):525-535;Canevascini等人(1996)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）112(2):513-524;Yamamoto等人（1994)PlantCellPhysiol.(《植物細(xì)胞生理學(xué)》）35(5):773-778;Lam(l994)ResultsProbl.CellDiffer.(《細(xì)胞分化的結(jié)果與問題》）20:181-196;01'〇2(：〇等人（1993)?1&拉厘〇181〇1.(《植物分子生物學(xué)》）23(6):1129-1138;Matsuoka等人（1993)ProcNatl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）90(20):9586-9590;以及Guevara-Garcia等人（1993)PlantJ.(《植物雜志》）4(3):495-505。如有必要，可對這種啟動子進(jìn)行修飾以用于弱表達(dá)。[0141]葉偏好的啟動子是本領(lǐng)域已知的。參見例如Yamamoto等人（1997)PlantJ.(《植物雜志》）12(2):255-265;Kwon等人（1994)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）105:357-67;Yamamoto等人（1994)PlantCellPhysiol.(《植物細(xì)胞生理學(xué)》）35(5):773-778;Gotor等人（l"3)PlantJ.(《植物雜志》）3:5〇9_18;0rozco等人（l"3)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）23(6):1129-1138;以及Matsuoka等人（1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）90(20):9586-9590。此外，還可使用cab和rubisco的啟動子。參見例如Simpson等人（1958)ΕΜΒ0J(《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》）4:2723-2729以及Timko等人(1988)Nature(《自然》）318:57-58。[0142]根偏好的啟動子是已知的，可選自許多可從文獻(xiàn)得到的啟動子，或者從多種相容物種從頭分離。參見例如Hire等人（1992)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）20(2):207-218(大豆根特異性的谷氨酰胺合成酶基因）；Keller和Baumgartner(1991)PlantCell(《植物細(xì)胞》)3(10):1051-1061(法國菜豆的GRP1.8基因中的根特異性控制元件）；Sanger等人（1990)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）14(3):433-443(根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的甘露氨酸合酶（MAS)基因的根特異性啟動子）；以及Miao等人（1991)PlantCell(《植物細(xì)胞》)3(1):11-22(編碼細(xì)胞溶膠谷氨酰胺合成酶（GS)的全長cDNA克隆，其在大豆的根和根瘤中表達(dá)）。另參見Bogusz等人（1990)，PlantCell(《植物細(xì)胞》），2(7):633-641,其中描述了從來自固氮非豆科植物榆科山黃麻（Parasponiaandersonii)和相關(guān)的非固氮非豆科植物雞屎藤山麻黃（Trematomentosa)的血紅蛋白基因分離的兩個根特異性啟動子。將這些基因的啟動子連接至β-葡糖醛酸酶報告基因并引入非豆科植物煙草（Nicotianatabacum)和豆科植物百脈根（Lotuscorniculatus)二者中，在這兩種情況中根特異性啟動子活性得以保持。Leach和Aoyagi(1991)描述了他們對毛根土壤桿菌（Agrobacteriumrhizogenes)的高度表達(dá)的roIC和roID根誘導(dǎo)基因的分析(參見PlantScience(《植物科學(xué)》）（Limerick)79(l):69-76)。他們得出結(jié)論認(rèn)為，增強(qiáng)子和組織偏好的DNA決定子在那些啟動子中是分離的。Teeri等人（1989)使用與lacZ的基因融合表明，編碼章魚氨酸合酶的土壤桿菌T-DNA基因在根尖的表皮中特別活躍，且TR2'基因在完整植物中是根特異性的并且通過葉組織中的創(chuàng)傷刺激，這是與殺昆蟲或殺幼蟲基因一起使用的特別理想的特性組合（參見ΕΜΒ0J.(《歐洲分子生物學(xué)組織雜志》）8(2):343-350)。與nptll(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II)融合的TR1'基因顯示了相似的特性。另外的根優(yōu)選的啟動子包括WENOD-GRP3基因啟動子（Kuster等人（1995)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）29(4):759-772);和roIB啟動子（Capana等人（1994)PlantMol.Biol.(《植物分子生物學(xué)》）25(4):681-691。還可參見美國專利No.5,837,876、No.5,750,386、No.5,633,363、Νο·5,459,252、Νο·5,401，836、Νο·5,110,732和No.5,023,179。菜豆蛋白基因（Murai等人（1983)Science(《科學(xué)》）23:476-482以及Sengopta-Gopalen等人（1988)PNAS(《美國國家科學(xué)院院刊》）82:3320-3324)。[0143]含有本文提供的多核苷酸的表達(dá)盒還可包含選擇標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇。選擇標(biāo)記基因被利用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織的選擇。選標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性的基因，如編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II(ΝΕ0)和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（HPT)的那些基因，以及賦予對除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物為例如草銨膦、溴苯腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D)和磺脲。另外的選擇標(biāo)記包括表型標(biāo)記如β-半乳糖苷酶和熒光蛋白如綠色熒光蛋白（GFP)(Su等人（2004)Biotechnol.Bioeng.(《生物技術(shù)和生物工程》）85:610-9以及Fetter等人（2004)PlantCell(《植物細(xì)胞》）16:215-28)、青色熒光蛋白（CYP)(Bolte等人（2004)J.CellScience(《細(xì)胞科學(xué)雜志》）117:943-54以及Kato等人（2002)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）129:913-42)以及黃色熒光蛋白（來自Evrogen的PhiYFP.TM.;參見Bolte等人（2004)J.CellScience(《細(xì)胞科學(xué)雜志》）117:943-54)。對于另外的選擇標(biāo)記，通常參見Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.(《生物技術(shù)新見》）3:506-511;Christopherson等人（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）89:6314-6318;Yao等人（1992)Cell(《細(xì)胞》）71:63-72;Reznikoff(1992)Mol·Microbiol.(《分子微生物學(xué)》)6:2419-2422;Barkley等人（1980)，載于：TheOperon(《操縱子》），第177-220頁；Hu等人（1987)Cell(《細(xì)胞》）48:555-566;Brown等人（1987)Cell(《細(xì)胞》）49:603-612;Figge等人（1988)Cell(《細(xì)胞》）52:713-722;Deuschle等人(l989)Proc.Natl.Acad.Aci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）86:5400_5404;Fuerst等人（I989)Proc.Nail.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）86:2549-2553;Deuschle等人（1"0)Science(《科學(xué)》）248:480-483;Gossen，（1993)，海德爾堡大學(xué)博士論文；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）90:1917-1921;Labow等人（1990)Mol.Cell.Biol.(《分子細(xì)胞生物學(xué)》）10:3343-3356;Zambretti等人（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）89:3952-3956;Baim等人（1"1)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）88:5072-5076;Wyborski等人（1991)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》）19:4647-4653;Hillenand_Wissman(1989)TopicsMol.Struc.Biol.(《分子結(jié)構(gòu)生物學(xué)主題》）10:143-162;Degenkolb等人（1991)Antimicrob.AgentsChemother.(《抗微生物劑化學(xué)療法》）35:1591-1595;Kleinschnidt等人（1988)Biochemistry(《生物化學(xué)》)27:1094-1104;Bonin，（1993)，海德爾堡大學(xué)博士論文；Gossen等人（1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）89:5547-5551;01iva等人（1992)Antimicrob.AgentsChemother.(《抗微生物劑化學(xué)療法》）36:913-919;Hlavka等人（1985)HandbookofExperimentalPharmacology(《實(shí)驗(yàn)藥理學(xué)手冊》），第78卷（柏林斯普林格出版社(Springer_Verlag，Berlin));Gill等人（1988)Nature(《自然》）334:721_724。將這些公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。上面關(guān)于選擇標(biāo)記基因的名單并不意指是限制性的?？蓪⑷魏芜x擇標(biāo)記基因用于本文給出的組合物中。[0144]如果合適，可為了增加在轉(zhuǎn)化植物中的表達(dá)對所述方法和組合物中采用的序列(即目的多核苷酸、重組酶等）進(jìn)行優(yōu)化。也就是說，可使用植物偏好的密碼子來合成基因以改善表達(dá)。有關(guān)宿主偏好的密碼子用法的論述，參見例如Campbell和Gowri(1990)PlantPhysiol.(《植物生理學(xué)》）92本領(lǐng)域可獲得用于合成植物偏好的基因的方法。參見例如，美國專利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray等人（1989)NucleicAcidsRes.(《核酸研究》）17:477-498,將所述專利和文獻(xiàn)以引用方式并入本文。[0145]VI.何含轉(zhuǎn)某閔靶位點(diǎn)的f庫和制各方法[0146]本文提供產(chǎn)生包含本文所述的各種轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)中的任一者的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫的方法。該方法包括將包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的重組構(gòu)建體引入植物、種子或植物細(xì)胞的群體中。所謂"群體"意指一群或一批植物、種子或植物細(xì)胞。該群體可包含2個或更多個（即5、10、100、300、500、700、900、1100、1300、1500、1700、1900、2100、2300、2500、2900、3100、3300、3500、3700、3900、4000、4096、104、105、106個或更多個）植物、種子或植物細(xì)胞。如本文所用，"文庫"是包含穩(wěn)定摻入進(jìn)其基因組中的至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物、種子或植物細(xì)胞的群體。[0147]為了產(chǎn)生植物文庫，將包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的重組構(gòu)建體引入進(jìn)植物細(xì)胞的群體中?？赏ㄟ^任何本領(lǐng)域已知的的手段引入重組構(gòu)建體。該方法包括鑒別具有該重組構(gòu)建體的植物或植物細(xì)胞并表征該重組構(gòu)建體的基因組插入位點(diǎn)。有多種方法可供鑒別至少一個在其基因組中包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物細(xì)胞并表征基因組插入位點(diǎn)。這類方法包括但不限于根據(jù)選擇標(biāo)記進(jìn)行的選擇、PCR方法、測序方法、核酸酶消化、DNA印跡以及它們的任何組合。參見例如美國專利申請12/147,834,將該專利申請全文以引用的方式并入本文。[0148]重組構(gòu)建體可在植物基因組中的任何位置整合。在一個實(shí)施例中，集成植物、種子或植物細(xì)胞的文庫使得該文庫的每個成員包含具有不同基因組插入位點(diǎn)的靶位點(diǎn)，并且當(dāng)組合進(jìn)單個植物基因組中時，可彼此獨(dú)立地分開。在這些情形中，轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的整合位點(diǎn)在植物基因組中彼此相距約0.l、〇.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10cM或更遠(yuǎn)?；蛘撸D(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的整合位點(diǎn)在植物基因組中彼此相距約l-10cM、約2-10cM、約2-5cM、約3-10cM、約3-6cM、約4-10cM、約4-7cM、約5-10cM、約5-8cM、約6-10cM、約6-9cM、約7-10cM、約8-10cM、約9-10cM、約0·5-1%、約0·5-5%、約0·5-10%、約0·1-lcM、約0·l-2cM、約0·l-3cM、約0·l-4cM、約0·l-5cM、約0·l-6cM、約0·l-7cM、約0·l-8cM、約0·l-9cM或約0·l-10cM。[0149]在一些實(shí)施例中，植物、種子或植物細(xì)胞的文庫包含這樣的群體，其中所述群體的成員在確定的基因組窗口內(nèi)以約10cM至約lcM的間隔具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。所謂"間隔"意指存在著以距離另一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)確定的距離定位的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。例如，在10cM基因組窗口內(nèi)以lcM間隔定位的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)意指在該基因組窗口內(nèi)每lcM距離有一個靶位點(diǎn)，使得該基因組窗口為靶位點(diǎn)所飽和。所謂"飽和"意指該文庫包含這樣的成員的群體，所述成員在整個基因組窗口上以約10cM間隔至約0.lcM間隔、約10cM間隔至約0.5cM間隔、約5cM間隔至約0.lcM間隔、約4cM間隔至約0.lcM間隔、約3cM間隔至約0.lcM間隔、或約2cM間隔至約0.lcM間隔具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0150]在一些實(shí)施例中，植物、種子或植物細(xì)胞的文庫包含這樣的群體，其中所述群體的成員在確定的基因組窗口內(nèi)以約lOcM至約lcM間隔具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。所述確定的基因組窗口可具有任何長度，包括長度為約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000cM或最多至整個基因組?；蚪M窗口可為約l-5cM、約Ι-lOcM、約10-30cM、約30-60cM、約60-100cM、約100-500cM、約500-1000cM、約1000-2500cM、約2500-5000cM或最多至基因組的整個長度。在基因組窗口是整個基因組的情形中，植物、種子或植物細(xì)胞文庫以每個確定的間隔包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，使得整個基因組為轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)所飽和。[0151]本文還包涵鑒別在給定的基因組窗口內(nèi)具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物或植物細(xì)胞的方法?？蓮脑撐膸爝x擇植物、種子或植物細(xì)胞的亞群，使得文庫每個成員內(nèi)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)并且在存在于相同基因組中時以約10%至約〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0152]在另一個實(shí)施例中，該文庫包含植物、種子或植物細(xì)胞的群體，其中文庫每個成員中轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的基因組插入位點(diǎn)在存在于相同基因組中時彼此獨(dú)立地分開，并且該群體的成員在基因組窗口內(nèi)以10cM的間隔至約lcM的間隔定位。[0153]這些文庫可用于通過使該文庫內(nèi)的植物雜交或使該文庫內(nèi)的植物與來自包含不同轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的文庫的植物雜交來在任何給定基因組窗口中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座。以該方式，可將多個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)在給定基因組窗口內(nèi)合并進(jìn)單個植物基因組中。[0154]VII.片段、奪體和序列比較[0155]本文還提供了各種重組位點(diǎn)、位點(diǎn)特異性重組酶和目的多核苷酸的活性變體或片段。本文別的地方描述了這些成分每一者的生物活性。[0156]所謂"片段"，意指多核苷酸的一部分或由其編碼的氨基酸序列從而由其編碼的蛋白質(zhì)的一部分。多核苷酸的片段可編碼保留天然蛋白質(zhì)的生物活性的蛋白質(zhì)片段（即重組酶的片段可實(shí)現(xiàn)重組事件）。如本文所用，"天然"多核苷酸或多肽分別包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。因而，多核苷酸的片段可在至少約20個核苷酸、約50個核苷酸、約100個核苷酸以及最多至全長多核苷酸的范圍內(nèi)。本方法或組合物中所采用的編碼蛋白質(zhì)的生物活性部分的多核苷酸片段將編碼至少15、25、30、50、100、150、200或250個連續(xù)的氨基酸，或最多至全長蛋白質(zhì)中存在的總氨基酸數(shù)目。或者，可用作雜交探針的多核苷酸片段通常不編碼保留生物活性的片段蛋白質(zhì)。因此，核苷酸序列的片段可在至少約10、20、30、40、50、60、70、80個核苷酸或最多至全長序列的范圍內(nèi)。[0157]"變體"序列具有高度的序列相似性。對于多核苷酸，保守變體包括由于遺傳密碼的簡并性而編碼天然多肽之一的氨基酸序列的那些序列。諸如這些變體之類的變體可用眾所周知的分子生物學(xué)技術(shù)，例如用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)技術(shù)和雜交技術(shù)來鑒別。變體多核苷酸也包括以合成法衍生的核苷酸序列，如那些例如通過使用定點(diǎn)誘變產(chǎn)生但仍編碼蛋白質(zhì)的核苷酸序列。通常，通過已知的序列比對程序和參數(shù)測定，特定多核苷酸的變體將與該特定多核苷酸具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。[0158]特定多核苷酸（即參比核苷酸序列）的變體還可通過比較變體多核苷酸所編碼的多肽與該參比多核苷酸所編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)來進(jìn)行評價。因而，例如，編碼與重組酶具有給定的序列同一性百分?jǐn)?shù)的多肽的分離的多核苷酸是本領(lǐng)域已知的。任何兩條多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)可用所述的序列比對程序和參數(shù)來計算。若任何給定的多核苷酸對是通過比較它們編碼的兩條多肽所具有的序列同一性百分?jǐn)?shù)進(jìn)行評價，則該兩條編碼的多肽之間的序列同一性百分?jǐn)?shù)為至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一I"生。[0159]所謂"變體"蛋白質(zhì)意指通過如下手段而衍生自天然蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)：在天然蛋白質(zhì)的N末端和/或C末端缺失（所謂的截短）或添加一個或多個氨基酸；在天然蛋白質(zhì)中的一個或者多個位點(diǎn)缺失或添加一個或多個氨基酸；或在天然蛋白質(zhì)中的一個或多個位點(diǎn)置換一個或多個氨基酸。變體蛋白質(zhì)是有生物活性的，即它們繼續(xù)具有天然蛋白質(zhì)的所需生物活性。這類變體可例如由遺傳多態(tài)性或由人類操縱而得到。通過已知的序列比對程序和參數(shù)測定，天然蛋白質(zhì)的生物活性變體將與該天然蛋白質(zhì)的氨基酸序列具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列同一性。蛋白質(zhì)的生物活性變體可與該蛋白質(zhì)相差少至1-15個氨基酸殘基、少至1-10個如6-10個、少至5個、少至4個、3個、2個或甚至1個氨基酸殘基。[0160]以下術(shù)語用于描述兩條或更多條多肽或多核苷酸之間的序列關(guān)系：如本文所用，"參比序列"是用作序列比較的基礎(chǔ)的確定的序列。參比序列可以是指定序列的一部分或全部。序列關(guān)系可使用計算機(jī)執(zhí)行的算法分析和描述。兩條或更多條多核苷酸或者兩條或更多條多肽之間的序列關(guān)系可通過這樣來測定：產(chǎn)生所述序列的最佳比對，并對該比對中的匹配和空位進(jìn)行打分，這可得到序列同一性百分?jǐn)?shù)和序列相似性百分比。多核苷酸關(guān)系還可根據(jù)每一者所編碼的多肽的比較來描述。用于序列比較和分析的許多程序和算法是本領(lǐng)域所熟知的。[0161]除非另有規(guī)定，否則本文提供的序列同一性/相似性值是指使用GAP版本10(GCG，Accelrys公司，加利福尼亞州圣地亞哥市（SanDiego,CA))采用以下參數(shù)獲得的值：對于核苷酸序列的同一性百分?jǐn)?shù)和相似性百分?jǐn)?shù)，使用空位產(chǎn)生罰分權(quán)重（gapcreationpenaltyweight)50和空位長度延伸罰分權(quán)重（gaplengthextensionpenaltyweight)3以及nwsgapdna.cmp打分矩陣；對于氨基酸序列的同一'丨生百分?jǐn)?shù)和相似性百分?jǐn)?shù)，使用空位產(chǎn)生罰分權(quán)重8和空位長度延伸罰分權(quán)重2以及BL0SUM62打分矩陣（Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.SciUSA(《美國科學(xué)院院刊》）89:10915);以及它們的任何等同程序。所謂"等同程序"意指任何這樣的序列比較程序，其對于任何兩條所考慮的序列，相比于GAP版本10所產(chǎn)生的對應(yīng)的比對，能產(chǎn)生出具有相同的核苷酸或氨基酸殘基匹配和相同的序列同一性百分?jǐn)?shù)的比對。[0162]GAP使用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.(《分子生物學(xué)雜志》）48:443-453的算法來尋找兩個完整序列的比對，該比對使匹配數(shù)最大而使空位數(shù)最小。GAP考慮所有可能的比對和空位位置，并產(chǎn)生具有最大數(shù)目的匹配堿基和最少的空位的比對。它使得可以提供以匹配堿基數(shù)為單位的空位產(chǎn)生罰分和空位延伸罰分。GAP對于其插入的每個空位，必須利用匹配的空位產(chǎn)生罰分?jǐn)?shù)。如果選擇大于零的空位延伸罰分，GAP對于每個插入的空位必須另外利用空位長度乘以空位延伸罰分。[0163]GAP給出該家族中的具有最佳比對的一個成員?？赡艽嬖谶@個家族的許多成員，但其他成員沒有更好的品質(zhì)。GAP顯示用于比對的四個優(yōu)值因素：品質(zhì)、比率、同一性和相似性。品質(zhì)是為了將序列進(jìn)行比對而最大化的指標(biāo)（metric)。比率是品質(zhì)除以較短區(qū)段中的堿基數(shù)。同一性百分?jǐn)?shù)是實(shí)際匹配的符號的百分?jǐn)?shù)。相似性百分?jǐn)?shù)是相似的符號的百分?jǐn)?shù)。將對應(yīng)于空位的符號忽略。當(dāng)一對符號的評分矩陣值大于或等于〇.50(相似性閾值）時，評定為相似性。[0164]如本文所用，"序列同一性"或"同一性"在兩條多核苷酸或多肽序列的語境中是指當(dāng)進(jìn)行比對以獲得最大對應(yīng)時兩條序列中相同的殘基。差別在于保守置換的序列（特別是多肽）被稱為具有"序列相似性"或"相似性"。作出這個調(diào)整的手段是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。通常，這涉及將保守置換評定為部分錯配而不是完全錯配，從而增加序列同一性百分?jǐn)?shù)。因而，例如，如果相同的氨基酸給予1分，非保守置換給予0分，則保守置換給予0至1之間的分?jǐn)?shù)。保守性置換的打分使用所選擇的打分矩陣（對于GAP默認(rèn)BL0SUM62)來計算。[0165]蛋白質(zhì)可以各種方式進(jìn)行變更，包括氨基酸置換、缺失、截短和插入。這類操縱的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，重組酶蛋白的氨基酸序列變體可通過DNA中的突變來制備。誘變以及核苷酸序列變更的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。參見例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）82:488-492;Kunkel等人（1987)MethodsinEnzymol.(《酶學(xué)方法》）154:367-382;美國專利No.4,873,192;Walker和Gaastra編輯(1983)TechniquesinMolecularBiology(《分子生物學(xué)技術(shù)》）（紐約麥克米倫出版公司（MacMillanPublishingCompany,NewYork))以及其中所引用的參考文獻(xiàn)。有關(guān)不影響目的蛋白質(zhì)的生物活性的適當(dāng)氨基酸置換的指導(dǎo)，可見于Dayhoff等人（1978)AtlasofProteinSequenceandStructure(《蛋白序列和結(jié)構(gòu)圖表集》）（華盛頓特區(qū)國家生物醫(yī)學(xué)研究基金會（Natl.Biomed.Res.Found.，Washington,D.C.))的模型，將該文獻(xiàn)以引用方式并入本文。保守置換，如將一個氨基酸用另一具有相似性質(zhì)的氨基酸進(jìn)行交換，可以是優(yōu)選的。[0166]變體多核苷酸和蛋白質(zhì)還涵蓋衍生自誘變和重組程序（如DNA改組）的序列和蛋白質(zhì)。使用這樣一種程序，可操縱一條或多條不同的編碼序列以產(chǎn)生具有所需特性的新蛋白質(zhì)。這樣，從包含具有實(shí)質(zhì)的序列同一性且可體外或體內(nèi)同源重組的序列區(qū)的相關(guān)多核苷酸的群體產(chǎn)生了重組多核苷酸的文庫。這種DNA改組的策略是本領(lǐng)域已知的。參見例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA(《美國科學(xué)院院刊》）91:10747-10751;Stemmer(1994)Nature(《自然》）370:389-391;Crameri等人（1997)NatBiotech.(《自然生物技術(shù)》）15:436-438;Moore等人（1997)(《分子生物學(xué)雜志》)272:336-347;Zhang等人(1997)Proc.Natl.AcacLSci.USA(《美國科學(xué)院院刊》)94:4504-4509;Crameri等人（1998)Nature(《自然》）391:288-291;以及美國專利No.5,605,793和No.5,837,458。[0167]本文所公開的方法和組合物的非限制性例子如下：[0168]1.一種在其基因組中具有包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的基因組窗口的植物或種子，其中所述基因組窗口長約10cM;[0169]其中所述目的基因組座位、所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)；以及[0170]其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0171]2.實(shí)施例1的植物或種子，其中所述基因組窗口長約5cM;[0172]其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以[0173]約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0174]3.實(shí)施例1或2的植物或種子，其中（a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率獨(dú)立地與所述目的基因組座位分離；或者，（b)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0175]4.實(shí)施例1、2或3的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，其中[0176](i)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異；或者（ii)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；[0177]并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第三重組位點(diǎn)和[0178]第四重組位點(diǎn)，其中（i)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異；[0179]或者（ii)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低。[0180]5.實(shí)施例1-4中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約5cM以內(nèi)。[0181]6.實(shí)施例1-4中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約2cM以內(nèi)。[0182]7.實(shí)施例1-4中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約0.5cM以內(nèi)。[0183]8.實(shí)施例1-7中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述基因組窗口還包含具有第五重組位點(diǎn)和第六重組位點(diǎn)的第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中（i)所述第五和所述第六重組位點(diǎn)彼此相異；或者（ii)所述第五和所述第六重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；[0184]并且所述第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有與所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位不同的基因組插入位點(diǎn)。[0185]9.實(shí)施例8的植物或種子，其中所述第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約5cM以內(nèi)。[0186]10.實(shí)施例1-9中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述目的基因組座位賦予包含雄性不育、位點(diǎn)特異性重組、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物、除草劑耐受性、昆蟲抗性或病害抗性的性狀。[0187]11.實(shí)施例1-10中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述目的基因組座位包含轉(zhuǎn)基因。[0188]12.實(shí)施例1-10中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述目的基因組座位包含天然性狀。[0189]13.實(shí)施例1-12中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含至少一種目的多核苷酸。[0190]14.實(shí)施例1-12中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含至少第二目的多核苷酸。[0191]15.實(shí)施例4的植物或種子，其中所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含與所述第一轉(zhuǎn)基因革巴位點(diǎn)相同的相異重組位點(diǎn)。[0192]16.實(shí)施例4的植物或種子，其中所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含與所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)不同的相異重組位點(diǎn)。[0193]17.實(shí)施例4的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述相異重組位點(diǎn)包含L0X位點(diǎn)、突變型L0X位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。[0194]18.實(shí)施例17的植物或種子，其中所述第一和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。[0195]19.實(shí)施例17或18的植物或種子，其中所述突變型FRT位點(diǎn)包含F(xiàn)RT5位點(diǎn)、FRT6位點(diǎn)、FRT7位點(diǎn)、FRT12位點(diǎn)或FRT87位點(diǎn)。[0196]20.實(shí)施例15的植物或種子，其中所述第一和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)。[0197]21.實(shí)施例1-20中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述植物或種子是單子葉植物。[0198]22.實(shí)施例21的植物或種子，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱或黑麥。[0199]23.實(shí)施例1-20中任一項(xiàng)的植物或種子，其中所述植物或種子是雙子葉植物。[0200]24.實(shí)施例23的植物或種子，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓苔、向日葵、棉花或苜蓿。[0201]25.-種產(chǎn)生第二植物的方法，所述方法包括對第一植物或其部分應(yīng)用植物育種技術(shù)，其中所述第一植物是實(shí)施例1-24中任一項(xiàng)的植物，并且其中應(yīng)用所述技術(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生所述第二植物。[0202]26.實(shí)施例25的方法，其中當(dāng)與所述第一植物比較時，所述第二植物在所述基因組窗口內(nèi)包含至少一個另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或至少一個另外的目的基因組座位；其中所述另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述另外的目的基因組座位各自相對于彼此以及相對于所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。[0203]27.實(shí)施例26的方法，其中所述至少一個另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸。[0204]28.實(shí)施例25的方法，其中當(dāng)與所述第一植物比較時，所述第二植物在所述基因組窗口內(nèi)包含少至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或少至少一個目的基因組座位。[0205]29.-種在植物基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括[0206](a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，并且其中所述基因組窗口長約10cM且所述第一植物不包含第一目的基因組座位；(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位并且所述第二植物不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，（c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。[0207]30.-種在植物基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括[0208](a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，其中所述基因組窗口長約10cM，并且其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)，其中所述第一植物不包含第一目的基因組座位；[0209](b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位，其中所述第二植物在所述基因組窗口中不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，[0210](c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；[0211]以及，[0212]其中所述子代植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0213]31.實(shí)施例30的方法，其中所述基因組窗口長約5cM，并且其中所述子代植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約5%至0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0214]32.實(shí)施例30或31的方法，其中（a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)與所述第一目的基因組座位以約5%至約0.1%的比率獨(dú)立地分開；或者，（b)所述子代植物的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0215]33.實(shí)施例30-32中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法還包括（a)將所述子代植物與包含第二目的基因組座位的第三植物進(jìn)行育種，其中所述第三植物在所述基因組窗口中包含所述第二目的基因組座位，其中所述第三植物在所述基因組窗口中不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位；以及（b)從步驟（a)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位和所述第二目的基因組座位的第二子代植物；并且[0216]其中在所述第二子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位和所述第二目的基因組座位各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，[0217]其中所述第二子代植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位或所述第二目的基因組座位各以約10%至約〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0218]34.根據(jù)實(shí)施例30-33中任一項(xiàng)的方法，其中[0219](a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，其中⑴所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；或者(ii)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；并且，[0220](b)所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)，其中（i)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸；或者[0221](ii)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸。[0222]35.實(shí)施例30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在5cM以內(nèi)。[0223]36.實(shí)施例30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在2cM以內(nèi)。[0224]37.實(shí)施例30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的基因組位置彼此相距在〇.5cM以內(nèi)。[0225]38.實(shí)施例30-31中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一目的基因組座位賦予包含雄性不育、位點(diǎn)特異性重組、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物、除草劑耐受性、昆蟲抗性或病害抗性的性狀。[0226]39.實(shí)施例29-38中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一目的基因組座位包含天然性狀、目的轉(zhuǎn)基因或另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0227]40.實(shí)施例34的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含相同的相異重組位點(diǎn)。[0228]41.實(shí)施例34的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含不同的相異重組位點(diǎn)。[0229]42.實(shí)施例34、40或41的方法，其中所述相異重組位點(diǎn)包含L0X位點(diǎn)、突變型L0X位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。[0230]43.實(shí)施例34、40或41的方法，其中所述相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。[0231]44.實(shí)施例42或43的方法，其中所述突變型FRT位點(diǎn)包含F(xiàn)RT5位點(diǎn)、FRT6位點(diǎn)、FRT7位點(diǎn)、FRT12位點(diǎn)或FRT87位點(diǎn)。[0232]45.實(shí)施例34的方法，其中所述第一和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含F(xiàn)RT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)。[0233]46.-種變更植物基因組中的復(fù)合性狀基因座的方法，包括[0234](a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位的第一植物，其中所述基因組窗口長約10cM，并且其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)；[0235]其中所述第一植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位各以約10%至約〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開；[0236](b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種；[0237](c)從步驟（b)選擇子代植物，其中所述子代植物的所述基因組窗口不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位中的任一者或任兩者。[0238]47.實(shí)施例46的方法，其中所述基因組窗口長約5cM并且其中所述第一植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位各以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開；[0239]48.實(shí)施例46或47的方法，其中（a)所述第一植物的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開；或者，（b)所述第一植物的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)與所述第一目的基因組座位以約5%至約0.1%的比率獨(dú)立地分開。[0240]49.實(shí)施例46、47或48的方法，其中[0241](a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，其中⑴所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；或者(ii)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；并且，[0242](b)所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)，其中（i)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸；或者[0243](ii)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸。[0244]51.實(shí)施例46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在2cM以內(nèi)。[0245]52.實(shí)施例46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的基因組位置彼此相距在〇.5cM以內(nèi)。[0246]53.實(shí)施例46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述目的基因組座位賦予包含雄性不育、位點(diǎn)特異性重組、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物、除草劑耐受性、昆蟲抗性或病害抗性的性狀。[0247]54.實(shí)施例46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一目的基因組座位包含天然性狀、目的轉(zhuǎn)基因或另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0248]55.實(shí)施例25-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是單子葉植物。[0249]56.實(shí)施例55的方法，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱或黑麥。[0250]57.實(shí)施例25-54中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物是雙子葉植物。[0251]58.實(shí)施例57的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓苔、向日葵、棉花或苜蓿。[0252]59.-種產(chǎn)生植物、種子或植物細(xì)胞的文庫的方法，其中所述文庫中的所述植物、所述種子或所述植物細(xì)胞各包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，所述方法包括：(a)向植物細(xì)胞的群體中引入包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的重組構(gòu)建體；(b)鑒別具有所述重組構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物；(c)表征所述重組構(gòu)建體在步驟（b)的所述植物細(xì)胞或植物內(nèi)的基因組插入位點(diǎn)；以及，(d)集成所述植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述文庫的每個成員包含具有不同基因組插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，并且當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)組合進(jìn)單個植物基因組中時，所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)彼此獨(dú)立地分開。[0253]60.實(shí)施例59的方法，其中步驟（d)的所述植物、種子或植物細(xì)胞的文庫包含植物、種子或植物細(xì)胞的群體，其中所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約10cM至約lcM的間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0254]61.實(shí)施例62的方法，其中所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約2cM間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0255]62.實(shí)施例60或61的方法，其中所述基因組窗口是整個基因組。[0256]63.-種鑒別在基因組窗口中具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物或植物細(xì)胞的方法，包括(a)提供植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述文庫中的所述植物、所述種子或所述植物細(xì)胞各包含不同基因組插入位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中所述文庫的每個成員中的所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述基因組插入位點(diǎn)當(dāng)存在于相同基因組中時彼此獨(dú)立地分開；以及（b)鑒別所述文庫中的植物、種子或植物細(xì)胞的亞群，其中所述亞群的每個成員中的所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述基因組插入位點(diǎn)當(dāng)存在于相同基因組中時以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0257]64.-種包含植物、種子或植物細(xì)胞的群體的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，所述植物、種子或植物細(xì)胞具有穩(wěn)定摻入進(jìn)其基因組中的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中所述文庫的每個成員中的所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的基因組插入位點(diǎn)當(dāng)存在于相同基因組中時彼此獨(dú)立地分開，并且所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約10cM間隔至約lcM間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0258]65.實(shí)施例64的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述基因組窗口包含完整的基因組。[0259]66.實(shí)施例64的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述基因組窗口長約10cM。[0260]67.實(shí)施例64、65或66的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約2cM的間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。[0261]68.-種在其基因組中具有包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的基因組窗口的植物或種子，其中所述基因組窗口：(a)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166,所述第二標(biāo)記包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169;或者[0262](b)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)或UMC2313,所述第二標(biāo)記包含CD0545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E;[0263]其中所述目的基因組座位、所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，[0264]其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0265]69.-種子代植物，所述子代植物從實(shí)施例68的植物獲得。[0266]70.實(shí)施例68的植物，所述植物還包含至少一種變更的靶序列，其中所述至少一種變更的靶序列起源于被雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑識別和切割的對應(yīng)靶序列，并且其中所述至少一種變更的靶序列位于所述基因組窗口中。[0267]71.-種在植物基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括[0268](a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因組座位，并且其中所述基因組窗口：（i)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166,所述第二標(biāo)記包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169;或者（ii)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)或UMC2313,所述第二標(biāo)記包含CD0545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E;[0269](b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位并且所述第二植物不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，(c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。[0270]72.-種在其基因組中具有包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的基因組窗口的植物或種子，其中所述基因組窗口：旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462,并且所述第二標(biāo)記包含SATT481、SATT156或SCT_010;[0271]其中所述目的基因組座位、所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至約〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。[0272]73.-種子代植物，所述子代植物從實(shí)施例72的植物獲得。[0273]74.實(shí)施例72的植物，所述植物還包含至少一種變更的靶序列，其中所述至少一種變更的靶序列起源于被雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑識別和切割的對應(yīng)靶序列，并且其中所述至少一種變更的靶序列位于所述基因組窗口中。[0274]75.-種在植物的基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括[0275](a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因組座位，并且其中所述基因組窗口：旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462,并且所述第二標(biāo)記包含SATT481、SATT156或SCT_010;(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位并且所述第二植物不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，（c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。[0276]以下實(shí)例以說明性方式而不是以限制性方式提供。[0277]SS.[0278]實(shí)例1[0279]何含用于位點(diǎn)特異件整合（ssi)的轉(zhuǎn)某閔靶位點(diǎn)的玉米f庫的產(chǎn)牛[0280]如下所述針對玉米開發(fā)了一種產(chǎn)生一大批轉(zhuǎn)基因植物或者包含用于位點(diǎn)特異性重組（SSI)的多個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（TTS)中的任一者的植物、種子或植物細(xì)胞的"文庫"的方法。[0281]SSI平臺II載體的開發(fā)[0282]使用Komari等人，1996中描述的原始共整合土壤桿菌雙元系統(tǒng)的衍生構(gòu)建體開發(fā)了用于玉米的土壤桿菌轉(zhuǎn)化的載體。這些載體攜帶必要的分子元件以使得能基于來自酵母的FLP/FRT系統(tǒng)進(jìn)行位點(diǎn)特異性整合（SSI)。將具有FRT位點(diǎn)以利于重組酶介導(dǎo)的盒交換（EecombinaseMediated￡assetteExchange，RMCE)(Seibler和Bode，I"7)的土壤桿菌構(gòu)建體命名為SSI平臺II載體。除了FRT位點(diǎn)，SSI平臺II載體的中間體包括多克隆位點(diǎn)或用于Gateway?克隆的Invitrogen?Gateway?目的位點(diǎn)以有效地引入供轉(zhuǎn)化的性狀基因（圖2)。SSI平臺II載體的另一特征是包括處于引入性狀基因的區(qū)域的旁側(cè)的loxP位點(diǎn)以允許在需要時利用cre/lox切除來移除性狀基因。包括在SSI平臺II載體中的元件允許在轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（TTS)將新的基因或多個基因添加至現(xiàn)有的基因，包括例如采用FRT1和FRT87。如果將cre/lox切除與新基因的SSI引入聯(lián)合使用，則可在轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)處對現(xiàn)有基因進(jìn)行有效置換。SSI平臺II載體可用于在轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)上設(shè)置值以及為修飾被認(rèn)為具有高價值的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的基因內(nèi)容提供的靈活性。[0283]SSI平臺II載體的一個通用特征是設(shè)置FRT位點(diǎn)，F(xiàn)RT位點(diǎn)建立了基因俘獲構(gòu)造（gene-trappingconfiguration)。FRT1位點(diǎn)設(shè)置在啟動子（例如玉蜀黍泛素啟動子UBIZMPR0,如圖2中所示）與玉蜀黍密碼子優(yōu)化的草胺膦乙酰轉(zhuǎn)移酶的編碼區(qū)（Μ0-ΡΑΤ，PHP35557,圖2A)或磷酸甘露糖異構(gòu)酶（PMI，PHP44290,圖2B)選擇標(biāo)記基因之間。FRT87位點(diǎn)設(shè)置在SSI平臺II載體的SSI區(qū)中的最后的選擇標(biāo)記基因的終止子序列（例如PINII終止子（PINIITERM)或鈣花葉病毒35S終止子（CAMV35STERM)，如圖2A中所示）的下游（3')。一些載體包含第二選擇標(biāo)記，如FRT1與FRT87之間的Μ0-ΡΑΤ，其由水稻（Oryzasativa)肌動蛋白啟動子（OS-ACTINPRO,圖2B)驅(qū)動。在引入未包括在靶位點(diǎn)中并且以與針對SSI平臺II載體所述相同的方式含有處于編碼序列上游的FRT1位點(diǎn)的具有無啟動子選擇標(biāo)記基因的DNA序列后，重組插入恢復(fù)。該無啟動子標(biāo)記構(gòu)建體（稱為SSI供體構(gòu)建體）通過基因槍方法引入進(jìn)具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的細(xì)胞中。在成功RMCE后，初始的靶位點(diǎn)標(biāo)記（M〇-PAT、PMI)不再表達(dá)，并且新引入的來自供體構(gòu)建體的標(biāo)記因?yàn)樵贔RT1處的重組和在基因俘獲物上游捕獲啟動子而得以表達(dá)（參見美國專利No.7,102,055)。選擇標(biāo)記和可視標(biāo)記二者均可用于該俘獲物中以指示成功的位點(diǎn)特異性整合。[0284]在選擇標(biāo)記基因或處于左T-DNA邊界（LB)區(qū)的基因周圍包括FRT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)的構(gòu)建體中間體在圖2中示出。為了簡潔起見僅示出了該構(gòu)建體的T-DNA區(qū)。PHP35557是pSBll樣載體（Komari等人，1996)的衍生物，其中在形成最終的共整合構(gòu)建體之前添加性狀基因。PHP44290是pSBl樣中間體與pSBll樣中間體（Komari等人，1996)之間的共整合產(chǎn)物，并且Invitrogen?Gateway?目的位點(diǎn)被用于供經(jīng)由Gateway?克隆進(jìn)行基因引入的位點(diǎn)中（圖2)。一種SSI平臺II載體（PHP44556)的例子在圖3中示出。產(chǎn)生了大量的相關(guān)構(gòu)建體，所述構(gòu)建體不同之處在于基因數(shù)目、基因活性、基因序列、啟動子、轉(zhuǎn)錄終止元件、基因相對于彼此的取向以及基因在loxP位點(diǎn)之間的位置。將每個新的構(gòu)建體用于制備多株玉米轉(zhuǎn)化株（η=20至100)，每株轉(zhuǎn)化株具有獨(dú)特的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。基于SSI平臺II的該轉(zhuǎn)化工作的結(jié)果是玉米中的大量的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其攜帶元件以有利于位點(diǎn)特異性整合和/或性狀基因切除并因而具有供基因添加或基因置換的能力。[0285]玉米SSIf庫的開發(fā)[0286]轉(zhuǎn)基因植物的第一群體使用玉蜀黍近交系（MaizeInbredlinel，Mil)生成并且涉及構(gòu)建自SSI平臺II的16種構(gòu)建體。這些構(gòu)建體全部在T-DNA區(qū)中與圖2中所示的兩個構(gòu)建體中的一個或另一個相同，不同的是loxP位點(diǎn)之間的基因中的計劃變異。[0287]通過如（Djukanovic等人，2006)中所述的改良的土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化程序，用這些構(gòu)建體轉(zhuǎn)化玉米未成熟胚。從經(jīng)滅菌的籽粒切取8到10天的胚并置于液體培養(yǎng)基（4.0g/IN6基礎(chǔ)鹽（SigmaC-1416)、1.Oml/1Eriksson維生素混合物（SigmaE-1511)、1.Omg/1鹽酸硫胺素、1.511^/12,40、0.69(^/11^-脯氨酸、68.58/1鹿糖、368/1葡萄糖，口!15.2)中。在收集胚后，將培養(yǎng)基替換為lml的土壤桿菌懸浮液，該懸浮液的濃度為在550nm光學(xué)密度為0.175-0.45。在室溫下溫育五分鐘后，將胚懸浮液傾倒于裝有4.Og/1N6基礎(chǔ)鹽（SigmaC_1416)、l.Oml/1Eriksson維生素混合物（SigmaE_1511)、LOmg/1鹽酸硫胺素、1.5mg/12,4D、0.690g/lL-脯氨酸、30.Og/1鹿糖、0·85mg/l硝酸銀、0·InM乙酰丁香酮、3.Og/1Gelrite,pH5.8的板上。將胚于暗處21°C下溫育3-5天，然后在新的板上于暗處28°C下溫育3-7天，該新板裝有4.Og/1N6基礎(chǔ)鹽（SigmaC_1416)、l.Oml/1Eriksson維生素混合物(SigmaE-1511)、LOmg/1鹽酸硫胺素、1.5mg/12,4D、0.690g/lL-脯氨酸、30.Og/1鹿糖、0·5g/lMES、0.85mg/l硝酸銀、100mg/l羧芐青霉素、9.Og/1瓊脂，ρΗ5·8。然后將胚轉(zhuǎn)移至新的板上3-4周，該新板裝有4.Og/1Ν6基礎(chǔ)鹽（SigmaC_1416)、l.Oml/1Eriksson維生素混合物（SigmaE-1511)、LOmg/1鹽酸硫胺素、1.5mg/12,4D、0.690g/lL-脯氨酸、30.Og/1蔗糖、0·5g/lMES、0.85mg/l硝酸銀、1.5mg/l雙丙氨磷、100mg/l羧芐青霉素、6.Og/1瓊脂，pH5.8。在第一選擇培養(yǎng)基上3-4周后，將胚在4.Og/1N6基礎(chǔ)鹽（SigmaC-1416)、1.0ml/1Eriksson維生素混合物（SigmaE-1511)、LOmg/1鹽酸硫胺素、1.5mg/12,4D、0.690g/11^-脯氨酸、30.(^/1鹿糖、0.5區(qū)/110^、0.8511^/1硝酸銀、311^/1雙丙氨磷（用于1]1〇?八丁選擇）、100mg/l羧芐青霉素、6.0g/l瓊脂，pH5.8上每2-4周進(jìn)行分培直至鑒定到轉(zhuǎn)基因事件。通過將小的組織部分轉(zhuǎn)移至成熟培養(yǎng)基上來誘導(dǎo)再生，該培養(yǎng)基含有4.3g/lMS鹽(GibcollllT7:紐約格蘭德島（GrandIsland，NY)，Gibco公司）、5·0ml/lMS維生素母液、100mg/l肌醇、0·1μΜΑΒΑ、0·5mg/l玉米素、lmg/1ΙΑΑ、60·0g/l鹿糖、3.0mg/l雙丙氨磷、100mg/l羧芐青霉素、6.0g/l瓊脂，pH5.6)。將板于暗處28°C下溫育二周。將體細(xì)胞胚轉(zhuǎn)移至含有4.3g/lMS鹽（Gibcollll7:紐約格蘭德島Gibco公司）、5.0ml/lMS維生素母液、l〇〇mg/L肌醇、40.Og/Ι蔗糖、3.0mg/l雙丙氨磷、6.Og/Ι瓊脂，ρΗ5·6的培養(yǎng)基上，并在人造光下于28°C溫育。一周后，將小植株移進(jìn)裝有相同培養(yǎng)基的玻璃管中并培養(yǎng)直至對它們進(jìn)行采樣和/或?qū)⑺鼈円圃灾镣寥?。[0288]在使用玉蜀黍近交系1和相對有限數(shù)目的具有可用的旁側(cè)序列數(shù)據(jù)的插入物進(jìn)行探索性工作后，選擇另一種玉蜀黍近交系（玉蜀黍近交系1MI2)來繼續(xù)和擴(kuò)展該工作。因?yàn)橄噍^于玉蜀黍近交系1有優(yōu)越的遺傳學(xué)特性以及相當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化效率的組合而選取MI2。大量的具有旁側(cè)序列數(shù)據(jù)的玉蜀黍近交系2轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的集合是主要的目標(biāo)。用于開發(fā)該新轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)集合的構(gòu)建體和分子方法類似于MI1，但是轉(zhuǎn)化方法有變動，尤其是在組織培養(yǎng)基的配方方面。用于MI2的組織培養(yǎng)方法可見于Cho,M-J等人，2011(US20110165561)，更多細(xì)節(jié)見于Wu，X.E.等人（US20100192253)。類似的方法用于這兩種玉蜀黍近交系以回收轉(zhuǎn)基因植物至溫室、采樣和下游處理。[0289]針對T-DNA拷貝數(shù)以及針對轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)基因組旁側(cè)序列對轉(zhuǎn)基因植株（靶株系）進(jìn)行分析。將實(shí)時定量PCR(qPCR)用于評估T-DNA的拷貝數(shù)。高品質(zhì)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)定義為以單拷貝存在于轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以及不包括超出T-DNA左邊界或右邊界（RB、LB)的來自土壤桿菌載體的額外序列的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。針對每個構(gòu)建體的T-DNA邊界內(nèi)的每個基因開發(fā)了一種特異性、獨(dú)立的qPCR測定法。此外，將多個qPCR測定法用于檢測土壤桿菌構(gòu)建體在T-DNA邊界之外的獨(dú)特序列（通常稱為載體骨架序列）。如果根據(jù)qPCR分析T-DNA內(nèi)的所有基因被評定為單拷貝并且未檢測到載體骨架序列，則該轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)被描述為單拷貝轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)（單拷貝插入）。將具有單拷貝轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的那些轉(zhuǎn)基因植物繼續(xù)在溫室里培養(yǎng)并用于進(jìn)一步分析。來自玉米SSI文庫的每個獨(dú)立的單拷貝轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)視為獨(dú)特的實(shí)體和用于位點(diǎn)特異性整合的潛在候選物。[0290]將含有單拷貝T-DNA插入的轉(zhuǎn)基因植物作為第一或第二代轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行采樣供旁側(cè)序列分析以便開始對轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的進(jìn)一步表征。從每株植物取多份葉樣品并匯集以供DNA提取。通過使用OmegaBioteckE-Z96植物DNA試劑盒按照制造商的推薦提取DNA。通過反向PCR(IPCR)或連接介導(dǎo)的巢式PCR(LMnPCR)(圖4)進(jìn)行旁側(cè)序列分析，然后對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。對于這兩種方法二者，設(shè)計位點(diǎn)特異性引物來擴(kuò)增正好T-DNARB和LB內(nèi)偵彳。如果使用IPCR，則用4-8種不同的在接近外側(cè)引物結(jié)合位點(diǎn)的T-DNA序列中切割一次的限制酶消化基因組DNA樣品。所述酶可在處于轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)之外但鄰近轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的基因組序列中的未知位點(diǎn)以及基因組中的許多其他位點(diǎn)切割一次。然后將在每個末端具有類似限制性切割的DNA片段置于連接反應(yīng)中以獲得自身連接而生成由T-DNA的一部分和一段基因組DNA組成的小DNA環(huán)。用在該小環(huán)的T-DNA序列的每個末端處設(shè)計的向外引物進(jìn)行巢式PCR。PCR可擴(kuò)增含有T-DNA的末端和轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的鄰接基因組序列（旁側(cè)序列）的產(chǎn)物。將小體積的PCR產(chǎn)物用ExoSAP處理以清除剩余的引物和dNTP，然后使用桑格法對凈化的擴(kuò)增子進(jìn)行測序。如果使用LMnPCR方法，則將基因組DNA機(jī)械剪切成較小的片段并使用具有3'至5'外切核酸酶活性的Klenow片段將片段的末端轉(zhuǎn)化為平末端。接著將片段通過在3'末端添加dA尾來進(jìn)行加工以防止平末端片段連接，并提供互補(bǔ)的懸突端供銜接子連接至片段。如果使用桑格法對擴(kuò)增子進(jìn)行測序，則將銜接子連接至片段上并用銜接子特異性引物和針對T-DNA邊界序列設(shè)計的引物進(jìn)行巢式PCR。如果使用Solexa法對擴(kuò)增子進(jìn)行測序，則將索引銜接子（indexedadapter)連接至DNA片段的末端供混合擴(kuò)增子測序（pooledampliconsequencing)并使用DNA特異性芯片在2100Bioanalyzer上運(yùn)行以檢驗(yàn)產(chǎn)物的大小和濃度。通過僅使用其中在各個單獨(dú)的堿基判定（basecall)中置信度高的最佳質(zhì)量的讀出結(jié)果，將來自Solexa的序列結(jié)果進(jìn)行去卷積、比較和評價。將完成的序列數(shù)據(jù)用于針對整個玉蜀黍基因組序列進(jìn)行BLAST分析。該方法預(yù)測了轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)位于10個玉米染色體中哪個染色體上以及來自染色體的該區(qū)域的相關(guān)數(shù)據(jù)，如轉(zhuǎn)基因靶序列供SSI的遺傳位置和該位置處的標(biāo)記。并不是全部樣品都能夠以該方式解析，但在第一輪分析后根據(jù)來自T-DNA邊界中的至少一者的序列數(shù)據(jù)，全部樣品的大約70%能夠被分配到給特定的染色體（表1A和1B)。通過詳細(xì)的BLAST分析，一部分轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)被預(yù)測為間斷內(nèi)源基因。間斷內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)被視為不期望的并棄去。將來自包含其余的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的事件的種子作為種子保持于可在需要時容易存取的集合中。給予該集合的初期名稱為"插入位點(diǎn)文庫"，其是指相對大量的經(jīng)表征的樣品、涵蓋全部10個玉蜀黍染色體的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)分布以及允許我們按需通達(dá)玉蜀黍基因組中的特定位點(diǎn)的后續(xù)的種子集合。[0291]表1A:玉蜀黍沂奪系1的樣品數(shù)目和旁側(cè)序列結(jié)果[0292]【權(quán)利要求】1.一種在其基因組中具有包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的基因組窗口的植物或種子，其中所述基因組窗口長約10cM;其中所述目的基因組座位、所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物或種子，其中所述基因組窗口長約5cM;其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的植物或種子，其中(a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)與所述目的基因組座位以約5%至約0.1%的比率獨(dú)立地分開；或者(b)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，其中(i)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異?；蛘?ii)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)，其中(i)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異；或者(ii)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約5cM以內(nèi)。6.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約2cM以內(nèi)。7.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約〇.5cM以內(nèi)。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述基因組窗口還包含具有第五重組位點(diǎn)和第六重組位點(diǎn)的第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中(i)所述第五和所述第六重組位點(diǎn)彼此相異。或者(ii)所述第五和所述第六重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；并且所述第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有與所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位不同的基因組插入位點(diǎn)。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的植物或種子，其中所述第三轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)距所述目的基因組座位在約5cM以內(nèi)。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述目的基因組座位賦予包含雄性不育、位點(diǎn)特異性重組、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物、除草劑耐受性、昆蟲抗性或病害抗性的性狀。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述目的基因組座位包含轉(zhuǎn)基因。12.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述目的基因組座位包含天然性狀。13.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含至少一種目的多核苷酸。14.根據(jù)權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含至少第二目的多核苷酸。15.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物或種子，其中所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含與所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)相同的相異重組位點(diǎn)。16.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物或種子，其中所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含與所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)不同的相異重組位點(diǎn)。17.根據(jù)權(quán)利要求4所述的植物或種子，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述相異重組位點(diǎn)包含LOX位點(diǎn)、突變型LOX位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的植物或種子，其中所述第一和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。19.根據(jù)權(quán)利要求17或18所述的植物或種子，其中所述突變型FRT位點(diǎn)包含F(xiàn)RT5位點(diǎn)、FRT6位點(diǎn)、FRT7位點(diǎn)、FRT12位點(diǎn)或FRT87位點(diǎn)。20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的植物或種子，其中所述第一和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)。21.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述植物或種子是單子葉植物。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的植物或種子，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱或黑麥。23.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的植物或種子，其中所述植物或種子是雙子葉植物。24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的植物或種子，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓苔、向日葵、棉花或苜蓿。25.-種產(chǎn)生第二植物的方法，所述方法包括對第一植物或其部分應(yīng)用植物育種技術(shù)，其中所述第一植物是根據(jù)權(quán)利要求1-24中任一項(xiàng)所述的植物，并且其中應(yīng)用所述技術(shù)導(dǎo)致產(chǎn)生所述第二植物。26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中當(dāng)與所述第一植物比較時，所述第二植物在所述基因組窗口內(nèi)包含至少一個另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或至少一個另外的目的基因組座位；其中所述另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述另外的目的基因組座位各自相對于彼此以及相對于所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述至少一個另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸。28.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中當(dāng)與所述第一植物比較時，所述第二植物在所述基因組窗口內(nèi)包含少至少一個轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或少至少一個目的基因組座位。29.-種在植物的基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括(a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，并且其中所述基因組窗口長約10cM且所述第一植物不包含第一目的基因組座位；(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位并且所述第二植物不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，(c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。30.-種在植物的基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括(a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，其中所述基因組窗口長約10cM，并且其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)具有不同的基因組插入位點(diǎn)，其中所述第一植物不包含第一目的基因組座位；(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位，其中所述第二植物在所述基因組窗口中不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，(c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，其中所述子代植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法，其中所述基因組窗口長約5cM，并且其中所述子代植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約5%至0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。32.根據(jù)權(quán)利要求30或31所述的方法，其中(a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)與所述第一目的基因組座位以約5%至約0.1%的比率獨(dú)立地分開；或者，(b)所述子代植物的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。33.根據(jù)權(quán)利要求30-32中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法還包括(a)將所述子代植物與包含第二目的基因組座位的第三植物進(jìn)行育種，其中所述第三植物在所述基因組窗口中包含所述第二目的基因組座位，其中所述第三植物在所述基因組窗口中不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位；以及，(b)從步驟（a)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位和所述第二目的基因組座位的第二子代植物；其中在所述第二子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位和所述第二目的基因組座位各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，其中所述第二子代植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位或所述第二目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。34.根據(jù)權(quán)利要求30-33中任一項(xiàng)所述的方法，其中(a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，其中(i)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；或者(ii)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；并且(b)所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)，其中(i)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸；或者(ii)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸。35.根據(jù)權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在5cM以內(nèi)。36.根據(jù)權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在2cM以內(nèi)。37.根據(jù)權(quán)利要求30-34中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的基因組位置彼此相距在0.5cM以內(nèi)。38.根據(jù)權(quán)利要求30-31中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一目的基因組座位賦予包含雄性不育、位點(diǎn)特異性重組、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物、除草劑耐受性、昆蟲抗性或病害抗性的性狀。39.根據(jù)權(quán)利要求29-38中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一目的基因組座位包含天然性狀、目的轉(zhuǎn)基因或另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含相同的相異重組位點(diǎn)。41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含不同的相異重組位點(diǎn)。42.根據(jù)權(quán)利要求34、40或41所述的方法，其中所述相異重組位點(diǎn)包含LOX位點(diǎn)、突變型LOX位點(diǎn)、FRT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。43.根據(jù)權(quán)利要求34、40或41所述的方法，其中所述相異重組位點(diǎn)包含F(xiàn)RT位點(diǎn)或突變型FRT位點(diǎn)。44.根據(jù)權(quán)利要求42或43所述的方法，其中所述突變型FRT位點(diǎn)包含F(xiàn)RT5位點(diǎn)、FRT6位點(diǎn)、FRT7位點(diǎn)、FRT12位點(diǎn)或FRT87位點(diǎn)。45.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述第一和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含F(xiàn)RT1位點(diǎn)和FRT87位點(diǎn)。46.-種變更植物的基因組中的復(fù)合性狀基因座的方法，包括(a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和第一目的基因組座位的第一植物，其中所述基因組窗口長約10cM，并且其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)；其中所述第一植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開；(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種；以及，(c)從步驟（b)選擇子代植物，其中所述子代植物的所述基因組窗口不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位中的任一者或任兩者。47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述基因組窗口長約5cM，并且其中所述第一植物中的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第一目的基因組座位各以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。48.根據(jù)權(quán)利要求46或47所述的方法，其中(a)所述第一植物的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)以約5%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開；或者，(b)所述第一植物的所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)或所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)與所述第一目的基因組座位以約5%至約0.1%的比率獨(dú)立地分開。49.根據(jù)權(quán)利要求46、47或48所述的方法，其中(a)所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第一重組位點(diǎn)和第二重組位點(diǎn)，其中(i)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；或者(ii)所述第一和所述第二重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低，并且所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含目的多核苷酸；并且，(b)所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)包含第三重組位點(diǎn)和第四重組位點(diǎn)，其中(i)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸；或者(ii)所述第三和所述第四重組位點(diǎn)彼此相異且相容性降低；并且所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)還包含第二目的多核苷酸。50.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在5cM以內(nèi)。51.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位的基因組位置彼此相距在2cM以內(nèi)。52.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的基因組位置彼此相距在0.5cM以內(nèi)。53.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述目的基因組座位賦予包含雄性不育、位點(diǎn)特異性重組、非生物脅迫耐受性、變更的磷、變更的抗氧化劑、變更的脂肪酸、變更的必需氨基酸、變更的碳水化合物、除草劑耐受性、昆蟲抗性或病害抗性的性狀。54.根據(jù)權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述第一目的基因組座位包含天然性狀、目的轉(zhuǎn)基因或另外的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。55.根據(jù)權(quán)利要求25-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物是單子葉植物。56.根據(jù)權(quán)利要求55所述的方法，其中所述單子葉植物是玉蜀黍、小麥、水稻、大麥、高粱或黑麥。57.根據(jù)權(quán)利要求25-54中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物是雙子葉植物。58.根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述雙子葉植物是大豆、蕓苔、向日葵、棉花或苜蓿。59.-種產(chǎn)生植物、種子或植物細(xì)胞的文庫的方法，其中所述文庫中的所述植物、所述種子或所述植物細(xì)胞各包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，所述方法包括：(a)向植物細(xì)胞的群體中引入包含轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的重組構(gòu)建體；(b)鑒別具有所述重組構(gòu)建體的植物細(xì)胞或植物；(c)表征所述重組構(gòu)建體在步驟（b)的所述植物細(xì)胞或植物內(nèi)的基因組插入位點(diǎn)；以及，(d)集成所述植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述文庫的每個成員包含具有不同基因組插入位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，并且當(dāng)所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)組合進(jìn)單個植物基因組中時，所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)彼此獨(dú)立地分開。60.根據(jù)權(quán)利要求59所述的方法，其中步驟（d)的所述植物、種子或植物細(xì)胞的文庫包含植物、種子或植物細(xì)胞的群體，其中所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約10cM的間隔至約lcM的間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。61.根據(jù)權(quán)利要求62所述的方法，其中所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約2cM的間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。62.根據(jù)權(quán)利要求60或61所述的方法，其中所述基因組窗口是整個基因組。63.-種鑒別在基因組窗口中具有轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的植物或植物細(xì)胞的方法，包括(a)提供植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述文庫中的所述植物、所述種子或所述植物細(xì)胞各包含不同基因組插入位點(diǎn)中的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中所述文庫的每個成員中的所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述基因組插入位點(diǎn)當(dāng)存在于相同基因組中時彼此獨(dú)立地分開；以及，(b)鑒別所述文庫中的植物、種子或植物細(xì)胞的亞群，其中所述亞群的每個成員中的所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的所述基因組插入位點(diǎn)當(dāng)存在于相同基因組中時可以約10%至約〇.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。64.-種包含植物、種子或植物細(xì)胞的群體的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，所述植物、種子或植物細(xì)胞具有穩(wěn)定摻入進(jìn)其基因組中的轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)，其中所述文庫的每個成員中的所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的基因組插入位點(diǎn)當(dāng)存在于相同基因組中時彼此獨(dú)立地分開，并且所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約10cM的間隔至約lcM的間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。65.根據(jù)權(quán)利要求64所述的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述基因組窗口包含完整的基因組。66.根據(jù)權(quán)利要求64所述的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述基因組窗口長約10cM。67.根據(jù)權(quán)利要求64、65或66所述的植物、種子或植物細(xì)胞的文庫，其中所述群體的成員在基因組窗口內(nèi)以約2cM的間隔具有所述轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)。68.-種在其基因組中具有包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的基因組窗口的植物或種子，其中所述基因組窗口：(a)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166,所述第二標(biāo)記包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169;或者，(b)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)或UMC2313,所述第二標(biāo)記包含CD0545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E;其中所述目的基因組座位、所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。69.-種子代植物，所述子代植物從根據(jù)權(quán)利要求68所述的植物獲得。70.根據(jù)權(quán)利要求68所述的植物，所述植物還包含至少一種變更的靶序列，其中所述至少一種變更的靶序列起源于被雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑識別和切割的對應(yīng)靶序列，并且其中所述至少一種變更的靶序列位于所述基因組窗口中。71.-種在植物基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括(a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因組座位，并且其中所述基因組窗口：(i)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1160、UMC2224、NPI579B、PMCB1、IDP3917、GPM199C、IDP1425、MMP68、UMC2225、STD2C(DBA)、TIDP3300、CSU1171、SUT1或UMC1166,所述第二標(biāo)記包含AY107207、UMC1568、IDP3783、BNLG1429、IDP209、LTK1或IDP7169;或者(ii)旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含UMC1625、UMC2196、UMC2312、BNLG1867、PZA03047、UMC1229、UCK1、RZ390D(CYB5)、MMP20、MMP10、MMP160、PHP20528、UMC2314、UAZ232B(SCI)和UMC2313,所述第二標(biāo)記包含CD0545、PHP20854、UMC1133、UFG69、MMP76、Y1、BNLG1422、MMP108B、MMP4、UMC1006或RZ444E;(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位并且所述第二植物不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，(c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。72.-種在其基因組中具有包含至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和目的基因組座位的基因組窗口的植物或種子，其中所述基因組窗口：旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462,并且所述第二標(biāo)記包含SATT481、SATT156或SCT_010;其中所述目的基因組座位、所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)各具有不同的基因組插入位點(diǎn)；并且，其中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)、所述第二轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位各以約10%至約0.1%的比率彼此獨(dú)立地分開。73.-種子代植物，所述子代植物從根據(jù)權(quán)利要求72所述的植物獲得。74.根據(jù)權(quán)利要求72所述的植物，所述植物還包含至少一種變更的靶序列，其中所述至少一種變更的靶序列起源于被雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑識別和切割的對應(yīng)靶序列，并且其中所述至少一種變更的靶序列位于所述基因組窗口中。75.-種在植物基因組中產(chǎn)生復(fù)合性狀基因座的方法，包括(a)提供在基因組窗口內(nèi)具有至少第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)的第一植物，其中所述第一植物不包含第一目的基因組座位，并且其中所述基因組窗口：旁側(cè)為至少第一標(biāo)記和至少第二標(biāo)記，所述第一標(biāo)記包含SATT613、SATT284、S60414-TB或SATT462,并且所述第二標(biāo)記包含SATT481、SATT156或SCT_010;(b)將所述第一植物與第二植物進(jìn)行育種，其中所述第二植物在所述基因組窗口中包含所述第一目的基因組座位并且所述第二植物不包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)；以及，(c)從步驟（b)選擇包含所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述目的基因組座位的子代植物；其中在所述子代植物中所述第一轉(zhuǎn)基因靶位點(diǎn)和所述第一目的基因組座位具有不同的基因組插入位點(diǎn)。【文檔編號】C12N15/82GK104245939SQ201380007014【公開日】2014年12月24日申請日期:2013年1月24日優(yōu)先權(quán)日:2012年1月27日【發(fā)明者】C.法爾科S.,拉斯納M.,李Z.,J.塞隆奇C.申請人:先鋒國際良種公司,納幕爾杜邦公司