專利名稱：拮抗性抗－cd40單克隆抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠結(jié)合CD40細(xì)胞表面抗原，從而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體，和使用該抗體的方法，包括治療C4BP刺激CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而介導(dǎo)的疾病的方法。
背景技術(shù)：
CD40是涉及人神經(jīng)生長因子(NGF)受體、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)受體和Fas的細(xì)胞表面抗原。首先在B淋巴細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)TNF受體家族的這個(gè)成員的表達(dá)，但最近的發(fā)現(xiàn)證明，它在許多細(xì)胞類型上廣泛表達(dá)。在造血系統(tǒng)中，CD40表達(dá)細(xì)胞包括CD34+造血祖細(xì)胞、B細(xì)胞祖細(xì)胞、成熟的B淋巴細(xì)胞(正常和惡性)、漿細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、eisonophil、嗜堿性細(xì)胞和一些T淋巴細(xì)胞。表達(dá)CD40的非造血細(xì)胞包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞。CD40也在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的滑膜、活化血小板、發(fā)炎的血管平滑肌細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞上表達(dá)。它在血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá)水平低，在局部炎癥區(qū)域上調(diào)。因?yàn)槠鋵挿旱谋磉_(dá)模式，CD40可能通過介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞以及其它細(xì)胞類型之間的相互作用在免疫調(diào)節(jié)中起到更為綜合的作用。參見例如，Kooten和Banchereau(1997)Frontiers in Biosciences 21-11。
配體CD40L或CD154與CD40受體結(jié)合介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的活化效果取決于所涉及的細(xì)胞類型。因此，在B細(xì)胞上激活CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能刺激B細(xì)胞增殖和分化、抗體產(chǎn)生、同種型交換和B細(xì)胞記憶產(chǎn)生，而在樹突細(xì)胞和單核細(xì)胞上活化CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致表達(dá)共同刺激分子和分泌炎癥細(xì)胞因子(如IL-8、IL-12和TNF-α)，以有效活化T淋巴細(xì)胞。激動(dòng)性(agonist)抗-CD40單克隆抗體和寡聚可溶性CD40L可刺激CD40信號傳導(dǎo)通路(參見例如，國際公開WO 00/75348和美國專利號6,087,329)。這些信號的總作用是顯著增強(qiáng)T-細(xì)胞初敏作用(priming)，對于表達(dá)CD40的樹突細(xì)胞來說，有助于產(chǎn)生Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答。
補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)在體內(nèi)先天免疫應(yīng)答中起重要作用。參見例如，William Paul(1993)Fundamental Immunology(第3版，Raven Press)，924-929頁。在補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)中，抗原-結(jié)合的IgG啟動(dòng)了一系列水解反應(yīng)，最終產(chǎn)生能夠刺穿細(xì)菌細(xì)胞膜的攻膜復(fù)合物(MAC)。C4是此通路中的重要組分。通常在血清中失活的C4可被抗原-抗體復(fù)合物中存在的C1切割。C1將C4切成C4a和C4b片段。C4a是可溶性小蛋白，用作弱過敏毒素。C4b結(jié)合于細(xì)菌細(xì)胞膜的表面，可獨(dú)立地用作調(diào)理素，或可結(jié)合C3b形成經(jīng)典補(bǔ)體結(jié)合通路的C3轉(zhuǎn)化酶。產(chǎn)生作為靶點(diǎn)的結(jié)合C4b是一個(gè)低效率過程，僅5％-10％的C4b變成底物結(jié)合形式。血清調(diào)控蛋白負(fù)責(zé)清除過量C4b。
C4b結(jié)合蛋白(C4BP)是結(jié)合C4b的血清調(diào)節(jié)蛋白之一。它由肝臟細(xì)胞和活化的單核細(xì)胞合成，它是C4b和C3b的因子I-介導(dǎo)的代謝中的輔因子。參見例如，Dahlback和Hildebrand(1983)Biochem.J.209857；Lappin和Whaley(1990)Biochem.J.271767；Kusada-Funakoshi等(1991)Biochem.Med.Metab.Biol.45350；Blom等(2001)JBiol.Chem.27627136；Blom等(2001)J Immunol.1666764；Blom等(2003)MoI.Immunol.399547。在循環(huán)系統(tǒng)中，C4BP以基于α(70kDa)和β(45kDa)鏈不同組合的三種同種型的形式存在。主要同種型是7個(gè)α亞基和1個(gè)β亞基的八聚體(α7β1)(Pardo-Manuel等(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA874529；Kask等(2002)Biochemistry419348)。據(jù)報(bào)道，C4BP也能夠結(jié)合CD40，體外結(jié)合B細(xì)胞上的CD40可以模擬CD40L結(jié)合的方式活化這些細(xì)胞(Brodeur等(2003)Immunity18837)。而且，此體外活性與C4BP在不競爭性抑制CD40配體結(jié)合的分子區(qū)域中直接結(jié)合CD40蛋白的能力相關(guān)。CD40刺激是自身免疫病的關(guān)鍵介導(dǎo)因素。C4BP可直接誘導(dǎo)CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而幫助導(dǎo)致自身免疫病和炎性疾病的發(fā)生和發(fā)展。C4BP也可附加或協(xié)同地與CD40配體一起起作用，加強(qiáng)CD40刺激并幫助導(dǎo)致疾病的發(fā)生和發(fā)展。因此，C4BP與CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合可將異?；虿涣夹盘栟D(zhuǎn)導(dǎo)至CD40表達(dá)細(xì)胞。
阻斷CD40作用和活化可能抑制抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答?？捎每?CD40拮抗性抗體治療自身免疫病，如系統(tǒng)性狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、炎性腸病和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。也用這種抗體通過抑制自身免疫應(yīng)答來預(yù)防器官和組織移植的排斥，通過去除由CD40提供活化信號的惡性B淋巴細(xì)胞治療淋巴瘤，以及以特定方式將毒素遞送給攜帶CD40的細(xì)胞。兩種類型的抗-CD40拮抗性單克隆抗體可阻斷CD40活化1)阻斷CD40配體介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體，和2)阻斷C4BP介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體。由于C4BP在CD40活化途徑中的推定的作用，需要干擾C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，以便治療與C4BP-CD40結(jié)合作用相關(guān)的疾病。
發(fā)明概述提供了用于抑制通過C4BP與CD40結(jié)合介導(dǎo)的CD40-導(dǎo)向活性的組合物和方法，就是治療通過此C4BP-CD40結(jié)合作用介導(dǎo)的CD40相關(guān)疾病的方法。本發(fā)明組合物包含具有以下特征的抗-CD40抗體，或其抗原結(jié)合片段1)結(jié)合于CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原時(shí)沒有顯著的CD40激動(dòng)劑活性；和2)能夠特異性結(jié)合于細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原，其中此種與CD40抗原的結(jié)合阻斷了這些細(xì)胞中C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制一種或多種CD40-導(dǎo)向的活性。這些抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段對CD40細(xì)胞表面抗原具有強(qiáng)大的單位點(diǎn)結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明抗體與CD40的離解平衡常數(shù)(KD)至少為10-5M，至少3×10-5M，優(yōu)選至少10-6M-10-7M，更優(yōu)選至少10-8M-約10-12M。合適的單克隆抗體含有人恒定區(qū)；它們也優(yōu)選含有完全或部分人源化的構(gòu)架區(qū)；最優(yōu)選完全是人抗體或其抗原結(jié)合片段。組合物也包含產(chǎn)生這些抗體或其抗原結(jié)合片段的雜交瘤細(xì)胞系，以及包含這些抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物。
抑制CD40表達(dá)細(xì)胞的CD40導(dǎo)向活性的方法包括將該細(xì)胞與有效量的本發(fā)明抗CD40抗體，或有效量的它的抗原結(jié)合片段相接觸?？杀灰种频腃D40導(dǎo)向活性包括但不限于細(xì)胞生長和增殖、細(xì)胞分化、抗體產(chǎn)生、細(xì)胞記憶產(chǎn)生、同種型交換、細(xì)胞間粘著、分泌細(xì)胞因子、分泌金屬蛋白酶和表達(dá)細(xì)胞粘著分子?？捎帽景l(fā)明抗CD40抗體治療通過C4BP活化CD40導(dǎo)向活性介導(dǎo)的CD40相關(guān)疾病，包括但不限于癌癥，包括B細(xì)胞相關(guān)性癌癥和實(shí)體瘤，以及具有自身免疫和/或炎性組分的疾病或失調(diào)，包括器官和組織移植排斥。也提供了對CD40具有拮抗劑活性并在CD40表達(dá)細(xì)胞中干擾C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗體的鑒定方法。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及抗CD40抗體和其使用方法。這些抗CD40抗體和其抗原結(jié)合片段能夠特異性結(jié)合細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原，并且在結(jié)合于CD40抗原時(shí)沒有顯著的CD40激動(dòng)劑活性。這些抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合而有效阻斷這些細(xì)胞中C4b結(jié)合蛋白(C4BP)-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?！錍4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)″指當(dāng)C4BP結(jié)合于在細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原時(shí)對CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的刺激?！遄钄唷逯覆糠只蛲耆种仆ǔＴ跊]有拮抗劑如本發(fā)明抗CD40抗體時(shí)由C4BP與細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40上的C4BP結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而產(chǎn)生的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。阻斷此CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)提供了部分抑制(即活性降低)或完全抑制(即阻斷活性)由C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生的一種或多種CD40導(dǎo)向活性的方法。抑制這些CD40導(dǎo)向活性可有益地用于治療CD40相關(guān)疾病，包括但不限于癌癥，如B細(xì)胞相關(guān)性癌癥和實(shí)體瘤，以及具有自身免疫和/或炎性組分的疾病或失調(diào)，包括器官和組織移植排斥，如本文以下所述。
本發(fā)明通篇使用以下術(shù)語，下面進(jìn)一步定義這些術(shù)語。
本文所用″腫瘤″指所有腫瘤細(xì)胞(無論是惡性或良性)生長和增殖，以及所有癌前細(xì)胞、癌前組織、癌細(xì)胞和癌組織。
術(shù)語″癌癥″和″癌″指或描述了一般特征為細(xì)胞生長不受調(diào)節(jié)的哺乳動(dòng)物生理?xiàng)l件。癌癥的例子包括但不限于淋巴瘤和白血病，以及實(shí)體瘤。
″抗體″和″免疫球蛋白″(Ig)是具有相同結(jié)構(gòu)特征的糖蛋白?？贵w具有抗原結(jié)合特異性，免疫球蛋白包括缺少抗原特異性的抗體和其它抗體樣分子。后一種多肽是(例如)淋巴系統(tǒng)以低水平產(chǎn)生和骨髓瘤以高水平產(chǎn)生的多肽。
術(shù)語“抗體”以最廣義用時(shí)包括全裝配的抗體、能結(jié)合抗原的抗體片段(例如，F(xiàn)ab、F(ab′)2、Fv、單鏈抗體、雙體分子)和包含以上物質(zhì)的重組肽。
本文使用的術(shù)語“單克隆抗體”指得自基本上同質(zhì)的抗體群的抗體，即除了可能存在極少量天然發(fā)生的突變以外，構(gòu)成該群的每個(gè)抗體是相同的。
“天然抗體”和“天然免疫球蛋白”通常是由兩條相同的輕鏈(L)和兩條相同的重鏈(H)組成的約150,000道爾頓的異源四聚糖蛋白。每條輕鏈經(jīng)共價(jià)二硫鍵與重鏈相連，而二硫鍵的數(shù)目視不同免疫球蛋白同種型的重鏈而不同。每條重鏈和輕鏈也具有有規(guī)律地隔開的鏈內(nèi)二硫橋。每條重鏈的一端為可變區(qū)(VH)，其后是多個(gè)恒定區(qū)。每條輕鏈的一端為可變區(qū)(VL)，在另一端為恒定區(qū)；輕鏈的恒定區(qū)與重鏈的第一恒定區(qū)配對，輕鏈可變區(qū)與重鏈的可變區(qū)配對。據(jù)信，特定的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈可變區(qū)之間形成相互作用界面。
術(shù)語“可變”表示以下內(nèi)容在抗體之間，可變區(qū)的某些部分在序列上差別很大，這部分是每種特定抗體用于與其特定抗原特異性結(jié)合的部分。然而，可變性不是均勻分布于整個(gè)抗體可變區(qū)中。它集中于位于輕鏈或重鏈可變區(qū)的稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)或超變區(qū)的3個(gè)區(qū)段。可變區(qū)的較保守部分稱為框架(FR)區(qū)。天然輕鏈和重鏈的可變區(qū)包含主要采取β-折疊片層構(gòu)型并由3個(gè)CDR相連的4個(gè)FR區(qū)，CDR形成(有時(shí)形成部分)連接β-折疊片層結(jié)構(gòu)的環(huán)。每條鏈中的CDR通過FR區(qū)緊密相聚，并且與另一條鏈的CDR緊靠在一起形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見，Kabat等，(1991)NIH Publ.No.91-3242，第I卷，647-669頁)。恒定區(qū)不直接參與抗體抗原結(jié)合，但具有各種效應(yīng)器功能，如Fc受體(FcR)結(jié)合、抗體參與抗體依賴性細(xì)胞毒性、啟動(dòng)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性和肥大細(xì)胞脫粒。
術(shù)語“超變區(qū)”指負(fù)責(zé)結(jié)合抗原的抗體氨基酸殘基。超變區(qū)包括“互補(bǔ)決定區(qū)”的氨基酸殘基(即輕鏈可變區(qū)的殘基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等，(1991)《免疫學(xué)感興趣的蛋白質(zhì)的序列》(Sequences of proteins of Immunological Interest)(第5版，Public HealthService，National Institute of Health，Bethesda，MD)和/或“超變環(huán)”的氨基酸殘基(即，輕鏈可變區(qū)的殘基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重鏈可變區(qū)的殘基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Clothia和Lesk，(1987)J. Mol.Biol.196901)?！翱蚣堋被颉癋R”殘基是除超變區(qū)殘基以外的可變區(qū)殘基。
“抗體片段”包括完整抗體的一部分，優(yōu)選完整抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段；雙體分子；線性抗體(Zapata等，(1995)Protein Eng 101057)；單鏈抗體分子和由抗體片段形成的多特異性(multispecific)抗體。木瓜蛋白酶消化抗體產(chǎn)生兩個(gè)稱為“Fab”片段的相同的抗原結(jié)合片段(每種具有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn))與一殘留的“Fc”片段(其名字反映它易于結(jié)晶)。胃蛋白酶處理得到能夠交聯(lián)抗原的具有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab′)2片段。
“Fv”是含有完整的抗原識別和結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段。在雙鏈Fv抗體中，該區(qū)由緊密的非共價(jià)締合的一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。在單鏈Fv抗體中，一條重鏈可變區(qū)和一條輕鏈可變區(qū)經(jīng)可彎曲的肽接頭共價(jià)相連從而使輕鏈和重鏈締合成類似于雙鏈Fv抗體中的“二聚體”結(jié)構(gòu)。每個(gè)可變區(qū)的3個(gè)CDR正是在這種構(gòu)型中相互作用而確定了VH-VL二聚體表面上的抗原結(jié)合位點(diǎn)。6個(gè)CDR共同賦予了該抗體的抗原結(jié)合特異性。然而，即使一個(gè)可變區(qū)(或僅含有3個(gè)抗原特異性CDR的半個(gè)Fv)也能識別并結(jié)合抗原，雖然親和力低于完整的結(jié)合位點(diǎn)。
Fab片段也含有輕鏈恒定區(qū)和重鏈第一恒定區(qū)(CH1)。Fab片段因在重鏈CH1結(jié)構(gòu)域的羧基末端多幾個(gè)殘基(包括抗體絞鏈區(qū)的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸殘基)而不同于Fab’片段。本文稱為Fab′-SH的是其恒定區(qū)半胱氨酸殘基帶有一個(gè)游離巰基的Fab′。F(ab′)2抗體片段最初制備為之間具有絞鏈半胱氨酸的成對Fab′片段?？贵w片段的其它化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)也是已知的。
任何脊椎動(dòng)物種類的抗體(免疫球蛋白)的“輕鏈”可分為兩種類型，這兩種類型根據(jù)它們恒定區(qū)的氨基酸序列稱為kappa(κ)和lambda(λ)。
免疫球蛋白可依它們重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列包括不同類型。人免疫球蛋白主要有5類IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，在人類中，這些類型可進(jìn)一步分成亞類(同種型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。對應(yīng)于不同類免疫球蛋白的重鏈恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域分別稱為α、δ、ε、γ和μ。不同類免疫球蛋白的亞單位結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是熟知的。不同的同種型具有不同的效應(yīng)器功能。例如，人IgG1和IgG3同種型具有依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)活性。
本文所用的“標(biāo)記”指直接或間接與抗體偶聯(lián)而產(chǎn)生“標(biāo)記”抗體的化合物或組合物。標(biāo)記本身可檢測(如放射性同位素標(biāo)記或熒光標(biāo)記)，或者就酶標(biāo)記而言，可催化可檢測的底物化合物或組合物化學(xué)轉(zhuǎn)變?？捎米骺蓹z測標(biāo)記的放射性核素包括例如I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212和Pd-109。標(biāo)記也可以是不可檢測的實(shí)體如毒素。
術(shù)語“拮抗劑”以最廣義使用，包括能部分或完全阻斷、抑制或中和本文公開的靶蛋白分子的生物活性或其轉(zhuǎn)錄或翻譯的任何分子。拮抗性抗體是結(jié)合于細(xì)胞相關(guān)抗原但不給細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的抗體。信號可包括導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)改變的任何生化反應(yīng)，包括誘導(dǎo)增殖和/或存活、誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)其它蛋白的磷酸化、誘導(dǎo)鈣儲(chǔ)存釋放和誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌。
本文所用的“載體”包括當(dāng)其以所用劑量和濃度與細(xì)胞或哺乳動(dòng)物接觸時(shí)沒有毒性的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑。生理上可接受的載體通常是pH緩沖水溶液。生理上可接受的載體的例子包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于約10個(gè)氨基酸殘基)多肽；蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖或其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖醇，例如甘露醇或山梨醇；成鹽反荷離子，例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如吐溫、聚乙二醇(PEG)和普朗尼克?！奥?lián)合”一種或多種其它治療性藥物給藥包括同步(同時(shí))和以任何順序連續(xù)給藥。
本文所用的術(shù)語“宿主細(xì)胞”指以單核實(shí)體培養(yǎng)的微生物或真核細(xì)胞或細(xì)胞系，它們可以是或已用作重組載體或其它轉(zhuǎn)移多核苷酸的受者，并且包括受轉(zhuǎn)染原始細(xì)胞的后代。應(yīng)理解，由于天然的、偶發(fā)的或設(shè)計(jì)的突變，一個(gè)細(xì)胞的后代在形態(tài)或基因組或總DNA互補(bǔ)性上無需和原始的親代完全相同。
“人效應(yīng)細(xì)胞”是表達(dá)一種或多種FcR并行使效應(yīng)器功能的白細(xì)胞。這些細(xì)胞優(yōu)選至少表達(dá)FcγRIII并行使依賴抗體的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒性(ADCC)效應(yīng)器功能。介導(dǎo)ADCC的人白細(xì)胞的例子包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)、天然殺傷(NK)細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞，優(yōu)選PBMC和NK細(xì)胞。具有ADCC活性的抗體通常是IgG1或IgG3同種型。除了分離得到IgG1和IgG3抗體以外，ADCC介導(dǎo)性抗體可通過將非ADCC抗體的可變區(qū)或可變區(qū)片段工程改造為IgG1或IgG3同種型的恒定區(qū)來合成。
術(shù)語“Fc受體”或“FcR”用于描述能結(jié)合抗體Fc區(qū)域的受體。優(yōu)選的FcR是天然序列的人FcR。此外，優(yōu)選的FcR可結(jié)合IgG抗體(γ受體)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者交替剪接形式。FcγRII受體包括具有相似氨基酸序列、主要在于胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域不同的FcγIIA(“活化受體”)和FcγIIB(“抑制性受體”)?；罨荏wFcγRIIA在其胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有免疫受體酪氨酸激活基序(ITAM)。抑制性受體FcγRIIB在其細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域中含有基于免疫受體酪氨酸的抑制基序(ITIM)(參見Daeron(1997)Annu.Rev.Immunol.15203)。FcR綜述見Ravetch和Kinet(1991)Annu.Rev.Immunol.9457；Capel等，(1994)Immunomethods 425和de Haas等，(1995)J.Lab.Clin.Med.126330。本文的術(shù)語“FcR”包括其它FcR，包括將來鑒定到的FcR。該術(shù)語也包括將成熟IgG轉(zhuǎn)移至胎兒的新生受體，F(xiàn)cRn(Guyer等，(1976)J.Immunol.117587和Kim等，(1994)J.Immunol.24249)。
合成人抗體的方法很多。例如，可用Epstein-Barr病毒(EBV)感染使分泌細(xì)胞永生化。然而，EBV-感染的細(xì)胞難于克隆并且通常得到的免疫球蛋白產(chǎn)量較低(James和Bell(1987)J.Immunol.Methods 1005)。最后，可能通過引入轉(zhuǎn)化基因的有限組合來實(shí)現(xiàn)人B細(xì)胞的永生化。近來的發(fā)現(xiàn)增加了這種可能性，此發(fā)現(xiàn)即端粒酶催化性亞基連同SV40大癌蛋白以及H-ras的癌等位基因一起表達(dá)可導(dǎo)致正常人上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的致癌性轉(zhuǎn)變(Hahn等，(1999)Nature 400464)。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(如小鼠)經(jīng)過免疫后，在不產(chǎn)生內(nèi)源性免疫球蛋白的情況下能產(chǎn)生全套人抗體(Jakobovits等，(1993)Nature 362255；Lonberg和Huszar(1995)Int.Rev.Immunol.1365；Fishwild等，(1996)Nat.Biotechnol.14845；Mendez等，(1997)Nat.Genet.15146；Green(1999)J.Immunol.Methods 23111；Tomizuka等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97722-727；綜述見Little等，(2000)Immunol.Today 21364)。例如，已有描述，嵌合型和種系突變小鼠的抗體重鏈連接區(qū)(JH)基因的純合子消除可完全抑制內(nèi)源性抗體的產(chǎn)生(Jakobovits等，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA902551)。將人種系免疫球蛋白基因陣列轉(zhuǎn)移入這種種系突變小鼠導(dǎo)致在抗原刺激后產(chǎn)生人抗體(Jakobovits等，(1993)Nature362255)。Mendez等，(1997)(Nature Genetics15146)，產(chǎn)生用抗原刺激時(shí)產(chǎn)生高親和力完全人抗體的轉(zhuǎn)基因小鼠。這通過將兆堿基的人重鏈和輕鏈基因座通過種系整合入刪除了上述內(nèi)源性JH區(qū)段的小鼠來實(shí)現(xiàn)。這些小鼠(XenoMouseIItechnology(Abgenix；Fremont，California))具有1,020kb的人重鏈基因座和800kb的人κ基因座，其中人重鏈基因座含有約66個(gè)VH基因、完全的DH和JH區(qū)域，以及3個(gè)不同的恒定區(qū)，人κ基因座含有32個(gè)Vκ基因、Jκ片段和Cκ基因。這些小鼠中產(chǎn)生的抗體在各方面，包括基因重排、裝配和所有成分方面極其類似于在人中觀察到的抗體。由于刪除了內(nèi)源性片段從而防止了鼠基因座中的基因重排，這些人抗體壓倒內(nèi)源性抗體而優(yōu)先表達(dá)。這種小鼠可用特別感興趣的抗原免疫。
可篩選這種免疫動(dòng)物血清對感興趣抗原的抗體反應(yīng)性?？蓮牧馨凸?jié)或脾細(xì)胞分離淋巴細(xì)胞，選擇CD138-陰性和CD19-陽性淋巴細(xì)胞來選擇B細(xì)胞。一方面，可將這種B細(xì)胞培養(yǎng)物(BCC)與骨髓瘤細(xì)胞融合以產(chǎn)生上述雜交瘤。
在另一方面，宜進(jìn)一步篩選這種B細(xì)胞培養(yǎng)物對原先(接種)抗原的反應(yīng)性。這種篩選包括用靶/抗原蛋白質(zhì)的ELISA、用能與感興趣抗原結(jié)合的已知抗體進(jìn)行競爭性試驗(yàn)和與瞬時(shí)感染的表達(dá)該靶抗原的CHO或其它細(xì)胞的體外結(jié)合試驗(yàn)。
以下更詳細(xì)地描述本發(fā)明抗CD40抗體和其使用方法。
拮抗性抗CD40抗體本發(fā)明抗CD40抗體和其抗原結(jié)合片段優(yōu)選具有對CD40的拮抗劑活性，因此在本文中稱為″拮抗性″抗CD40抗體。更具體說，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體特異性結(jié)合于CD40表達(dá)細(xì)胞表面上的CD40抗原，這種結(jié)合阻斷了C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。阻斷此信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路導(dǎo)致抑制激動(dòng)劑如C4BP結(jié)合于CD40細(xì)胞表面抗原時(shí)啟動(dòng)的一種或多種CD40導(dǎo)向活性。
“CD40抗原”、“CD40細(xì)胞表面抗原”、“CD40受體”或“CD40”指屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的跨膜糖蛋白(參見，例如美國專利號5,674,492和4,708,871；Stamenkovic等，(1989)EMBO81403；Clark(1990)Tissue Antigens3633；Barclay等，(1997)《白血球抗原手冊》(The Leucocyte Antigen Facts Book)(第二版；AcademicPress，San Diego))。已鑒定到該基因交替剪接轉(zhuǎn)錄變體編碼的人CD40的兩種同種型。第一種同種型(也稱為“長同種型”或“同種型1”)表達(dá)為具有由前19個(gè)殘基代表的信號序列的277個(gè)氨基酸的前體多肽(首次報(bào)道為GenBank登錄號CAA43045，鑒定為同種型1，GenBank登錄號NP_001241，由GenBank登錄號X60592和NM_001250編碼)。第二種同種型(也稱為“短同種型”或“同種型2”)表達(dá)為也具有由前19個(gè)殘基表示的信號序列的203個(gè)氨基酸的前體多肽(GenBank登錄號NP_690593；由GenBank登錄號NM_152854編碼)。人CD40的這兩種同種型的前體多肽的前165個(gè)殘基相同。短同種型的前體多肽由缺少編碼區(qū)段，導(dǎo)致翻譯移碼的轉(zhuǎn)錄物變體編碼；與CD40長同種型所含的C末端(GeneBank登錄號NP_001241和GeneBank登錄號CAA43045的殘基166-277所示的C末端)相比，得到的CD40同種型含有較短且不同的C-末端(GeneBank登錄號NP_690593的殘基166-203)。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“CD40抗原”、“CD40細(xì)胞表面抗原”、“CD40受體”或“CD40”包括CD40的短和長同種型。
如本文別處所述，CD40受體展示在各種類型細(xì)胞的表面?！罢故居诒砻妗焙汀氨磉_(dá)于表面”指CD40抗原的全部或一部分暴露在細(xì)胞的外部。展示的或表達(dá)的CD40抗原可完全或部分糖基化。
″C4b結(jié)合蛋白″或″C4BP″指至少包括一部分α亞基(GenBank登錄號NP_000706，由GenBank登錄號NM_000715編碼；Kask等(2002)Biochemistry 419349)或一部分β亞基(GenBank登錄號NP_000707，由GenBank登錄號NM_000716編碼；Webb等(2003)Eur.J.Biochem.27093)的可溶性肽或其片段。本文所用術(shù)語″C4BP″可包括單獨(dú)的α或β亞基或者包含這些亞基的更大的異聚體，如三個(gè)血清同種型α7β1(血清中主要的同種型)、α7β0和α6β1?！錍D40上的C4BP結(jié)合位點(diǎn)″指任何C4BP亞基的任何部分能結(jié)合的CD40抗原區(qū)域。參見例如，Brodeur等(2003)Immunity18837，全文納入本文作參考。結(jié)合位點(diǎn)可包括CD40上的線性決定簇，或者它可包含不連續(xù)氨基酸形成的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中不連續(xù)氨基酸通過二級或三級構(gòu)象、或其組合來形成C4BP結(jié)合位點(diǎn)。在一些情況下，C4BP結(jié)合位點(diǎn)僅與C4BPα亞基相互作用。
當(dāng)C4BP結(jié)合于CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原時(shí)，它用作CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激動(dòng)劑，因此據(jù)說具有CD40激動(dòng)劑活性。“激動(dòng)劑活性”指該物質(zhì)能發(fā)揮激動(dòng)劑的作用。激動(dòng)劑結(jié)合細(xì)胞上的受體，并引起與該受體的天然配體(如CD40的天然配體CD40L)所引起的類似或相同的反應(yīng)或活性。CD40激動(dòng)劑如C4BP可誘導(dǎo)但不限于在CD40轉(zhuǎn)導(dǎo)信號時(shí)發(fā)生的以下任何或所有活性抗原遞呈細(xì)胞(APC)增殖和/或分化；B細(xì)胞抗體產(chǎn)生；胞間粘著；B細(xì)胞記憶產(chǎn)生；B細(xì)胞同種型轉(zhuǎn)換(尤其是在IL-4存在下IgE同種型轉(zhuǎn)化)；上調(diào)APC中II型MHC、CD54、CD95和CD80/86的細(xì)胞表面表達(dá)；上調(diào)bcl-XL、A20、二酰甘油激酶α、p38和c-myc基因表達(dá)；NFκB的核易位；分泌細(xì)胞因子如IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12和TNFα；分泌金屬蛋白酶如MMP-I/膠原酶和MMP-9/明膠酶B；以及表達(dá)細(xì)胞粘著分子如E-選擇蛋白、VCAM-1和ICAM-1。出于本發(fā)明目的，這些活性稱為“CD40導(dǎo)向活性”，通過C4BP結(jié)合于CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)而誘導(dǎo)這種活性稱為″C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)″。
本發(fā)明抗CD40抗體和其抗原結(jié)合片段對它們與CD40的結(jié)合作用有拮抗劑活性。此拮抗劑活性來源于抗CD40抗體能夠在其結(jié)合于CD40時(shí)阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或通過CD40發(fā)出負(fù)調(diào)節(jié)信號。″拮抗劑活性″指該物質(zhì)能用作拮抗劑。本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體防止或降低由于CD40受體與激動(dòng)性配體(具體是C4BP)結(jié)合而誘導(dǎo)的任何一種或多種CD40導(dǎo)向活性的誘導(dǎo)。本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可將對C4BP與CD40結(jié)合誘導(dǎo)的一種或多種CD40導(dǎo)向活性的誘導(dǎo)降低5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％，優(yōu)選40％、45％、50％、55％、60％，更優(yōu)選70％、80％、85％，最優(yōu)選90％、95％、99％或100％。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知測定抗CD40抗體和C4BP結(jié)合特異性和拮抗劑活性的方法，包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)競爭結(jié)合試驗(yàn)、樹突細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的試驗(yàn)、監(jiān)測B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白的試驗(yàn)、B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Banchereau樣B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、T輔助細(xì)胞產(chǎn)生抗體的試驗(yàn)、共同刺激B細(xì)胞增殖試驗(yàn)和上調(diào)APC活化標(biāo)記的試驗(yàn)。參見例如，這種試驗(yàn)公開于Brodeur等(2003)Immunity 18837，WO 00/75348和美國專利號6,087,329，納入本文作為參考。在一些實(shí)施方式中，結(jié)合展示在人細(xì)胞表面上的CD40阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致抑制這些人細(xì)胞的增殖和分化。因此，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體包括對表達(dá)細(xì)胞表面CD40抗原的人正常細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞具有拮抗劑活性的抗體。
通過阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，例如，競爭性或空間性干擾C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，證明了本發(fā)明抗CD40抗體的拮抗劑活性。“競爭性抑制”指抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與天然可溶性C4BP結(jié)合CD40上相同的C4BP結(jié)合位點(diǎn)或至少其一部分，從而抑制C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合?！翱臻g性抑制”或“空間抑制”指抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合于或至少部分結(jié)合于CD40上的C4BP結(jié)合位點(diǎn)以外，其中該抗體仍能通過空間干擾或破壞CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)或其組合來抑制C4BP或其片段結(jié)合于CD40。在一些實(shí)施方式中，拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與CD40抗原的結(jié)合阻斷了C4BP連接于CD40抗原時(shí)產(chǎn)生的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法確定抗體是否競爭性或空間性干擾了C4BP與CD40的結(jié)合，或阻斷了C4BP結(jié)合于CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)后進(jìn)行的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
當(dāng)本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體結(jié)合CD40表達(dá)細(xì)胞(如人正常和致瘤性B細(xì)胞以及人樹突細(xì)胞)表面上展示的CD40時(shí)，抗體結(jié)合于CD40時(shí)沒有顯著的激動(dòng)劑活性。″顯著的″激動(dòng)劑活性指在CD40表達(dá)細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中所檢測的激動(dòng)劑活性比中性物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％?！帮@著的”激動(dòng)劑活性優(yōu)選在B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)中檢測到的激動(dòng)劑活性比中性物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的高至少2倍或3倍。因此，例如當(dāng)感興趣的B細(xì)胞應(yīng)答是B細(xì)胞增殖時(shí)，“顯著的”激動(dòng)劑活性指誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖水平比中性物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的B細(xì)胞增殖水平大至少2倍或3倍。在一個(gè)實(shí)施方案中，不結(jié)合CD40的非特異性免疫球蛋白，例如IgG1作為陰性對照?！盁o明顯激動(dòng)劑活性”的物質(zhì)顯示激動(dòng)劑活性不高于中性物質(zhì)或陰性對照誘導(dǎo)的激動(dòng)劑活性約25％，優(yōu)選不高約20％、15％、10％、5％、1％、0.5％或甚至不高約0.1％。出于本發(fā)明目的，用B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)測定本發(fā)明抗CD40抗體的激動(dòng)劑活性。本領(lǐng)域熟知這種試驗(yàn)，包括但不限于監(jiān)測B細(xì)胞分泌的免疫球蛋白的試驗(yàn)、B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、Banchereau樣B細(xì)胞增殖試驗(yàn)、共同刺激B細(xì)胞增殖試驗(yàn)。參見例如，這種試驗(yàn)公開于Brodeur等(2003)Immunity 18837，WO 00/75348和美國專利號6,087,329，納入本文作為參考。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，拮抗性抗CD40抗體在一種B細(xì)胞應(yīng)答中沒有顯著的激動(dòng)劑活性。在本發(fā)明的另一實(shí)施方式中，拮抗性抗CD40抗體在一種以上B細(xì)胞應(yīng)答試驗(yàn)(如增殖和分化，或增殖、分化和抗體產(chǎn)生)中沒有顯著的激動(dòng)劑活性。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體是雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的IgG1同種型的完全人抗-CD40單克隆抗體。用來自免疫小鼠，包括用XenoMouse技術(shù)(Abgenix；Fremont，Califomia)獲得的小鼠(參見例如美國專利號6,075,181和PCT國際公開號WO 94/02602)的脾細(xì)胞產(chǎn)生這些細(xì)胞系。將脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞(Sierra BioSource)融合。將得到的雜交瘤亞克隆數(shù)次，建立單克隆細(xì)胞系。類似地，可用帶有人免疫球蛋白基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠或用本領(lǐng)域已知和/或本文所述的其它方法制備本發(fā)明其它抗體。本發(fā)明的人抗-CD40單克隆抗體特異性結(jié)合CD40，例如人CD40，但它們也特異性結(jié)合于含有人抗CD40抗體識別的表位的非人序列。
在其它實(shí)施方式中，可用(例如)美國專利號5,766,886或美國專利號6,180,370所述方法使CD40人源化。此外，可用C4BP篩選人抗體的噬菌體展示文庫，以鑒定具有本文所述結(jié)合特征的抗CD40抗體。
除了拮抗劑活性以外，一些本發(fā)明抗CD40抗體具有另外的作用機(jī)制，例如，具有抗體-依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)的抗體?；蛘?，可在具有ADCC活性的另一種抗體同種型上表達(dá)抗CD40抗體的可變區(qū)。也可能將抗CD40抗體的天然形式、重組形式或抗原結(jié)合片段偶聯(lián)于細(xì)胞毒性毒劑。這種拮抗性抗CD40抗體可用于靶向(例如)表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞，如惡性B細(xì)胞或?qū)嶓w瘤中表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在ELISA-類型的試驗(yàn)中結(jié)合可溶性CD40；在其它實(shí)施方式中，抗體或其抗原結(jié)合片段抑制C4BP與細(xì)胞表面CD40的結(jié)合，從而取代了預(yù)先結(jié)合的C4BP，如流式細(xì)胞術(shù)所測定。用于本發(fā)明方法的合適的拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段對CD40細(xì)胞表面抗原具有強(qiáng)大的單位點(diǎn)結(jié)合親和力。在一些實(shí)施方式中，用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)如BiacoreTM測定，本發(fā)明抗體與CD40的離解平衡常數(shù)(KD)至少為10-5M，至少3×10-5M，優(yōu)選至少10-6M-10-7M，更優(yōu)選至少10-8M-約10-12M。本領(lǐng)域已知Biacore分析，BIAapplicationsHandbook中提供了詳情?？捎肳O 01/27160所述方法調(diào)節(jié)結(jié)合親和力。
產(chǎn)生拮抗性抗CD40抗體本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體包括特異性識別CD40細(xì)胞表面抗原的抗體，包括多克隆抗體、單克隆抗體、單鏈抗體和保留親本抗CD40抗體的抗原結(jié)合功能的它們的片段，如Fab、F(ab′)2、Fv和其它片段。本發(fā)明方法尤其感興趣的是結(jié)合于CD40時(shí)能阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且沒有顯著的激動(dòng)劑活性的抗CD40抗體?？捎帽绢I(lǐng)域已知的抗體生產(chǎn)方法產(chǎn)生這些抗體，包括能阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并且是重組產(chǎn)生的拮抗性抗CD40抗體和其抗原結(jié)合片段。
可用常規(guī)方法制備多克隆血清。通常，首先用含有CD40抗原的溶液免疫合適的動(dòng)物，優(yōu)選小鼠、大鼠、兔或山羊。由于可獲得的血清體積大以及標(biāo)記的抗兔和抗山羊抗體的可用性，兔或山羊優(yōu)選用于制備多克隆血清。
可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，優(yōu)選攜帶人免疫球蛋白基因座的小鼠中制備多克隆血清。在一優(yōu)選的實(shí)施方案中，表達(dá)CD40的SF9細(xì)胞用作免疫原。也可用鹽水，優(yōu)選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外(通常是皮下或肌肉內(nèi))注射該混合物或乳劑來免疫。每次注射50-200μg的劑量一般足夠。通常在2-6周后注射用鹽水配制，優(yōu)選用不完全弗氏佐劑配制的蛋白質(zhì)加強(qiáng)免疫一次或多次?；蛘呖捎帽绢I(lǐng)域已知的方法體外免疫產(chǎn)生抗體，就本發(fā)明目的而言體外與體內(nèi)免疫等效。將免疫動(dòng)物的血液放入玻璃或塑料容器25℃孵育該血液1小時(shí)，然后4℃孵育2-18小時(shí)獲得多克隆抗血清。離心(例如，1,000×g10分鐘)回收血清。每次放血可自家兔獲得約20-50ml血清。
Sf9(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda))細(xì)胞的制備方法見納入本文作為參考的美國專利號6,004,552中所述。簡言之，將編碼人CD40的序列用轉(zhuǎn)移載體重組入桿狀病毒。將質(zhì)粒與野生型桿狀病毒DNA共同轉(zhuǎn)染入Sf9細(xì)胞。鑒定重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞并克隆純化。
優(yōu)選的抗體性質(zhì)上是單克隆抗體。“單克隆抗體”指得自基本上均質(zhì)抗體群的抗體，即除了存在極少量天然發(fā)生的突變以外，組成該群的每個(gè)抗體是相同的。該術(shù)語不受限于抗體的種類或來源。該術(shù)語包括完整的免疫球蛋白及其片段，例如Fab、F(ab′)2、Fv和保留了抗體結(jié)合功能的其它片段。單克隆抗體是高度特異性的，針對一個(gè)的抗原性位點(diǎn)，即在本發(fā)明中為CD40細(xì)胞表面抗原。此外，與通常包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制劑相反，每種單克隆抗體針對抗原上一個(gè)決定簇。修修詞“單克隆的”表示得自基本上均質(zhì)的抗體群的抗體特性，不可理解為需要通過任何具體方法產(chǎn)生該抗體。例如，本發(fā)明所用的單克隆抗體可通過Kohler等，(1975)Nature 256495首次描述的雜交瘤方法或重組DNA方法制備(參見，例如美國專利號4,816,567)?！皢慰寺】贵w”也可用，例如Clackson等，(1991)Nature 352624-628；Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222581-597；和美國專利號5,514,548中所述技術(shù)自噬菌體抗體文庫分離得到。
“表位”指抗原性分子中能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體并結(jié)合該抗體的那一部分。表位可含有線性氨基酸殘基(即，表位內(nèi)的殘基以線性方式一個(gè)接一個(gè)順序排列)，非線性氨基酸殘基(本文稱為“非線性表位”；這些表位非順序排列)或線性與非線性氨基酸殘基。
可使用Kohler等，(1975)Nature 256495-496所述方法或其改進(jìn)形式制備單克隆抗體。通常用含抗原的溶液免疫小鼠?？捎名}水，優(yōu)選用完全弗氏佐劑混合或乳化含有抗原的溶液，經(jīng)胃腸外注射混合物或乳劑來免疫?？捎帽绢I(lǐng)域已知的任何免疫方法來獲得本發(fā)明的單克隆抗體。免疫動(dòng)物后，取出脾臟(任選取出幾個(gè)大的淋巴結(jié))解離成為單個(gè)細(xì)胞。使細(xì)胞混懸液涂布于包被有感興趣抗原的板或孔來篩選脾細(xì)胞。表達(dá)抗原特異性膜結(jié)合免疫球蛋白的B細(xì)胞與板結(jié)合而不被洗掉。然后誘導(dǎo)得到的B細(xì)胞或所有分離的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤，用選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)。接種得到的細(xì)胞系列稀釋液并測定能特異性結(jié)合感興趣抗原的抗體(和不結(jié)合無關(guān)抗原的抗體)的產(chǎn)生。然后將分泌單克隆抗體(mAb)的選出的雜交瘤在體外(例如，在組織培養(yǎng)瓶或中空纖維反應(yīng)器中)或體內(nèi)(作為小鼠的腹水)培養(yǎng)。
當(dāng)用重組DNA方法制備本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體時(shí)(即重組產(chǎn)生的拮抗性抗-CD40抗體)，使用常規(guī)方法(例如，用能特異性結(jié)合編碼鼠抗體重鏈和輕鏈的基因的寡核苷酸探針)不難分離得到并測序編碼單克隆抗體的DNA。本文所述的雜交瘤細(xì)胞是這種DNA的優(yōu)選來源。一旦分離后，可將此DNA置于表達(dá)載體中，然后將載體轉(zhuǎn)染入本身不產(chǎn)生免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，例如大腸桿菌、猿COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞中從而獲得在該重組宿主細(xì)胞中合成的單克隆抗體。在細(xì)菌中重組表達(dá)編碼抗體的DNA的綜述性文章包括Skerra等，(1993)Curr.Opinionin Immunol.5256和Phickthun(1992)Immunol.Revs.130151。
或者，如納入本文作為參考的美國專利號5,545,403；5,545,405和5,998,144中所公開的，可在細(xì)胞系，例如CHO細(xì)胞系中制備抗體。簡言之，用能表達(dá)輕鏈和重鏈的載體分別轉(zhuǎn)染該細(xì)胞系。嵌合性抗體可通過轉(zhuǎn)染不同載體上的兩種蛋白質(zhì)來制備。另一優(yōu)點(diǎn)是該抗體正確糖基化。在另一實(shí)施方案中，可用GS基因表達(dá)系統(tǒng)(LonzaBiologies，Portsmouth，New Hampshire)在CHO細(xì)胞中制備拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，所述表達(dá)系統(tǒng)使用谷氨酰胺合成酶作為標(biāo)記。也參見其內(nèi)容全文納入本文作為參考的美國專利號5,122,464；5,591,639；5,658,759；5,770,359；5,827,739；5,879,936；5,891,693；和5,981,216。
本領(lǐng)域已知CD40的單克隆抗體。參見例如，以下文獻(xiàn)中有關(guān)B-細(xì)胞抗原的章節(jié)，McMichael編，(1987；1989)《白細(xì)胞分型III和IV》(Leukocyte Typing III and IV)(牛津大學(xué)出版社，紐約)；美國專利號5,674,492；5,874,082；5,677,165；6,056,959；國際公開號WO 00/63395、WO 02/28905和WO 02/28904；美國專利申請公開號US2002/0142358 A1和2003/0059427；2003年11月4日、2003年11月26日和2004年4月27日提交的題為″拮抗性抗-CD40單克隆抗體和其使用方法″(AntagonistAnti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods for Their Use)的臨時(shí)申請中公開的拮抗性抗CD40抗體，以及轉(zhuǎn)讓的美國專利申請?zhí)?0/517,337(代理案卷號PP20107.001(035784/258442))、60/525,579(代理案卷號PP20107.002(035784/271525))和60/565,710(代理案卷號PP20107.003(035784/277214))，2004年11月4日提交的題為″拮抗性抗-CD40單克隆抗體和其使用方法″的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916))；Gordon等(1988)J.Immunol.1401425；Valle等(1989)Eur.J.Immunol.191463；Clark等(1986)PNAS834494；Paulie等(1989)J.Immunol.142590；Gordon等(1987)Eur.J.Immunol.171535；Jabara等(1990)J.Exp.Med.1721861；Zhang等(1991)J.Immunol.1461836；Gascan等(1991)J Immunol.1478；Banchereau等(1991)Clin.Immunol.Spectrum38；和Banchereau等(1991)Science25170；將所有上述文獻(xiàn)納入本文作參考。本發(fā)明尤其感興趣的是本文公開的結(jié)合在CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)上或其附近，從而阻斷CD40-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗性抗CD40抗體，其阻斷CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制可能是拮抗性抗CD40抗體能夠競爭性和空間性抑制C4BP與C4BP上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合或者它們能夠通過C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而阻斷CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本文所用″CD40-抗原表位″指除了CD40抗原本身以外，能夠與本發(fā)明抗CD40單克隆抗體發(fā)生免疫反應(yīng)的分子。CD40-抗原表位可包括蛋白、蛋白片段、肽、糖、脂質(zhì)和其它分子，但出于本發(fā)明目的，最常用的是蛋白質(zhì)、短寡肽、寡肽模擬物(即模擬CD40抗原的抗體結(jié)合特性的有機(jī)物)或其組合。合適的寡肽參見PCT申請US91/04282等。
此外，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體包括嵌合抗CD40抗體和人源化抗CD40抗體；本發(fā)明的嵌合抗CD40抗體和人源化抗CD40抗體結(jié)合于CD40上的C4BP結(jié)合位點(diǎn)上或其附近，從而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)?！迩逗稀蹇贵w指最優(yōu)選用重組脫氧核糖核酸技術(shù)獲得并且包含人(包括免疫″相關(guān)性″物種如黑猩猩)和非人組分的抗體。因此，嵌合抗體的恒定區(qū)最優(yōu)選與天然人抗體的恒定區(qū)基本相同；嵌合抗體的可變區(qū)最優(yōu)選獲自非人來源，并具有對CD40細(xì)胞表面抗原的所需抗原特異性。非人來源可以是可用于產(chǎn)生針對人CD40細(xì)胞表面抗原或包含人CD40細(xì)胞表面抗原的物質(zhì)的抗體的任何脊椎動(dòng)物來源。這種非人來源包括但不限于嚙齒類(如兔、大鼠、小鼠等；參見例如，美國專利號4,816,567，納入本文作參考)和非人靈長類(如舊大陸猴(Old World Monkey)、猿等；參見例如，美國專利號5,750,105和5,756,096；納入本文作參考)。利妥昔是具有鼠可變區(qū)和人恒定區(qū)的嵌合抗體的例子。提到嵌合抗CD40抗體時(shí)，本文所用術(shù)語“免疫活性”指結(jié)合CD40、具體是人CD40的嵌合抗體。
“人源化”指含有衍生自非人免疫球蛋白序列的最小序列的抗-CD40抗體形式。就大部分序列而言，人源化抗體指其中受者的超變區(qū)殘基(也稱為互補(bǔ)決定區(qū)或CDR)被非人種類(供體抗體)，例如小鼠、大鼠、家兔或非人靈長類的超變區(qū)殘基取代的，具有所需特異性、親和力或能力的人免疫球蛋白(受者抗體)。短語“互補(bǔ)決定區(qū)”指共同確定了天然免疫球蛋白結(jié)合位點(diǎn)的天然Fv區(qū)域的結(jié)合親和力和特異性的氨基酸序列。參見，例如Chothia等，(1987)J.Mol.Biol.196901-917；Kabat等，(1991)美國健康與人類服務(wù)部(U.S.Dept.of Health and Human Services)，NIH公布號91-3242)。短語“恒定區(qū)”指抗體分子中賦予效應(yīng)器功能的那部分。在以前涉及產(chǎn)生用于治療人疾病的無免疫原性抗體的研究中，小鼠恒定區(qū)被人恒定區(qū)取代。所述人源化抗體的恒定區(qū)衍生自人免疫球蛋白。然而，這些人源化抗體仍能在人中引發(fā)有害且可能危險(xiǎn)的免疫應(yīng)答并且喪失了親和力。用于本發(fā)明方法的人源化抗-CD40抗體具有類似于本文所述CHIR-5.9和CHIR-12.12單克隆抗體所顯示的結(jié)合特性。本發(fā)明的人源化抗CD40抗體也特異性結(jié)合CD40，從而阻斷或抑制C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
人源化基本上可根據(jù)Winter及其同事(Jones等，(1986)Nature 321522-525；Riechmann等，(1988)Nature 332323-327；Verhoeyen等，(1988)Science 2391534-1536)的方法通過用嚙齒類或突變型嚙齒類CDR或CDR序列取代人抗體的相應(yīng)序列來進(jìn)行。也參見納入本文作為參考的美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762和5,859,205。在一些例子中，人免疫球蛋白的一個(gè)或多個(gè)可變區(qū)的框架區(qū)內(nèi)的殘基為對應(yīng)的非人殘基所取代(參見，例如美國專利號5,585,089；5,693,761；5,693,762和6,180,370)。此外，人源化抗體可含有在受者抗體或供體抗體中沒發(fā)現(xiàn)的殘基。制備這些修飾物可進(jìn)一步精制抗體的性能(例如，獲得所需的親和力)?？傮w上，人源化抗體基本上含有所有可變區(qū)、至少一個(gè)，通常兩個(gè)可變區(qū)，其中所有或基本上所有的超變區(qū)是對應(yīng)的非人免疫球蛋白序列，所有或基本上所有的框架區(qū)是對應(yīng)的人免疫球蛋白序列。人源化抗體也任選包含免疫球蛋白恒定區(qū)(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)的至少一部分。更多的細(xì)節(jié)見引作參考的Jones等，(1986)Nature331522-525；Riechmann等，(1988)Nature332323-329；和Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.2593-596。因此，這種“人源化”抗體可包括其中基本上小于完整的人可變區(qū)被非人種類的相應(yīng)序列取代的抗體。實(shí)際上，人源化抗體通常是其中一些CDR殘基和可能的一些框架殘基被嚙齒類抗體中類似位點(diǎn)的殘基取代的人抗體。參見，例如美國專利號5,225,539；5,585,089；5,693,761；5,693,762；5,859,205。也參見美國專利號6,180,370，和國際公布號WO 01/27160，其中公開了人源化抗體和產(chǎn)生對預(yù)定抗原具有改進(jìn)親和力的人源化抗體的技術(shù)。
本發(fā)明抗-CD40抗體也包括非人哺乳動(dòng)物宿主，更具體說是以滅活的內(nèi)源性免疫球蛋白(Ig)基因座為特征的轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生的異種或修飾的抗-CD40抗體。在這種轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中，使得表達(dá)宿主免疫球蛋白輕鏈和重鏈的活性內(nèi)源性基因無功能，并用同類人免疫球蛋白基因座取代。這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物產(chǎn)生基本上無宿主免疫球蛋白輕或重鏈亞基的人抗體。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號5,877,397和5,939,598。因此，這種抗體是完全人抗CD40抗體。
針對CD40的完全人抗體優(yōu)選通過免疫轉(zhuǎn)基因小鼠獲得。這種小鼠可用XenoMouse技術(shù)(Abgenix；Fremont，California)獲得并公開于納入本文作為參考的美國專利號6,075,181；6,091,001和6,114,598中。因此，例如，在一個(gè)實(shí)施方式中，可通過用表達(dá)人CD40的Sf9細(xì)胞免疫具有人IgG1重鏈基因座和人κ輕鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠，產(chǎn)生本文公開的人拮抗性抗CD40抗體。小鼠也可以是其它同種型的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。本發(fā)明的完全人拮抗性抗-CD40抗體的特征也是結(jié)合于CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)上或其附近，從而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體的片段適合用于本發(fā)明方法，只要它們保持相應(yīng)的全長拮抗性抗CD40抗體的所需親和力，并且特征是特性類似于相應(yīng)的全長拮抗性抗CD40抗體。即，該片段將特異性結(jié)合細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原(例如人細(xì)胞表面上的人CD40抗原)，并且在結(jié)合于CD40抗原時(shí)沒有顯著的激動(dòng)劑活性，但具有拮抗劑活性。因此，此片段與CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40結(jié)合能阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制一種或多種CD40導(dǎo)向活性。本文將此片段稱為″抗原結(jié)合″片段，適用于本發(fā)明中的任何方法。
抗體的合適抗原結(jié)合片段包括全長抗體的一部分，通常是其抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片段的例子包括但不限于Fab、F(ab′)2和Fv片段以及單鏈抗體分子?！癋ab”指由輕鏈或重鏈的一部分組成的免疫球蛋白的單價(jià)抗原結(jié)合片段。F(ab′)2指含有兩條輕鏈和兩條重鏈的一部分的免疫球蛋白的二價(jià)抗原結(jié)合片段。“單鏈Fv”或“sFv”抗體片段指含有抗體的VH和VL結(jié)構(gòu)域的片段，其中這些結(jié)構(gòu)域以一條多肽鏈的形式存在。參見，例如納入本文作為參考的美國專利號4,946,778；5,260,203；5,455,030和5,856,456。Fv多肽通常在VH和VL結(jié)構(gòu)域之間還含有一多肽接頭使sFv形成能與抗原結(jié)合所需的結(jié)構(gòu)。sFv的綜述見Pluckthun(1994)《單克隆抗體的藥理學(xué)》(ThePharmacology of Monoclonal Antibodies)，第113卷，Rosenburg和Moore編，(Springer-Verlag，NewYork)，269-315頁。如下文所述，本文公開的拮抗性抗-CD40抗體的抗原結(jié)合片段也可與細(xì)胞毒素偶連以起殺傷靶細(xì)胞(如靶癌細(xì)胞)的作用。
可利用例如McCafferty等，(1990)Nature348552-554(1990)和美國專利號5,5 14,548中描述的技術(shù)從抗體噬菌體文庫分離得到抗體或抗體片段。Clackson等，(1991)Nature352624-628和Marks等，(1991)J.Mol.Bird.222581-597分別描述了利用噬菌體文庫分離得到鼠和人抗體。隨后的出版物描述了通過構(gòu)建非常大的噬菌體文庫方案的鏈改組(Marks等，(1992)Bio/Technology10779-783)以及組合感染和體內(nèi)重組來產(chǎn)生高親和力(nM范圍)人抗體(Waterhouse等，(1993)Nucleic.Acids Res.212265-2266)。因此，這些技術(shù)是分離單克隆抗體的傳統(tǒng)單克隆抗體雜交瘤技術(shù)的可行替代方法。
已開發(fā)了各種技術(shù)來制備抗體片段。這些片段通過使完整抗體蛋白水解消化而獲得(參見，例如Morimoto等，(1992)Journal of Biochemical and Biophysical Methods24107-117(1992)和Brennan等，(1985)Science 22981)。然而，現(xiàn)在這些片段可通過重組宿主細(xì)胞直接制備。例如，可從上述噬菌體文庫分離抗體片段?；蛘?，可從大腸桿菌中直接回收Fab′-SH片段并化學(xué)偶聯(lián)形成F(ab′)2片段(Carter等，(1992)Bio/Technology 10163-167)。根據(jù)另一方法，可從重組宿主細(xì)胞培養(yǎng)物直接分離得到F(ab′)2片段。其它制備抗體片段的技術(shù)是技術(shù)人員熟知的。
本發(fā)明方法所用的拮抗性抗-CD40抗體包括本文上述抗CD40單克隆抗體以及與這些抗體不同但保留了CDR的抗體；具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸添加、刪除或取代的抗體，其中可通過該抗體阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、從而抑制一種或多種CD40-導(dǎo)向活性的能力來測定其拮抗劑活性。本發(fā)明也包括脫免疫的(de-immunized)拮抗性抗-CD40抗體，該抗體可按納入本文作為參考的國際公布號WO 98/52976和WO 0034317所述制備。本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體內(nèi)的殘基以該方式修飾而使得這些抗體對人無免疫原性或免疫原性較低，但卻保留了對人CD40表達(dá)細(xì)胞的拮抗活性，具體是能夠阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、導(dǎo)致抑制了一種或多種CD40-導(dǎo)向活性，所述活性可用本文其它部分所述試驗(yàn)測定。權(quán)利要求的范圍也包括含有本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其片段的融合蛋白，如本領(lǐng)域所知，所述融合蛋白可合成或從相應(yīng)的多核苷酸載體表達(dá)。參考下述抗體偶聯(lián)法來描述這類融合蛋白。
本發(fā)明的抗體可具有用例如納入本文作為參考的專利公布號EP0983303A1、WO 00/34317和WO 98/52976中所述方法產(chǎn)生的序列變異。例如，CDR中的序列顯示可導(dǎo)致抗體與II型MHC結(jié)合并引發(fā)有害的輔助性T細(xì)胞應(yīng)答。保守取代可使得該抗體保留結(jié)合活性而喪失其引發(fā)有害T細(xì)胞應(yīng)答的能力。可用本領(lǐng)域已知，例如本文其它部分所述的方法進(jìn)行任何這種保守或非保守取代，得到的抗體屬于本發(fā)明的范圍。用本文所述方法常規(guī)測試變體抗體的拮抗活性、親和力和特異性。
如果用上述方法或本文未公開的任何其它方法產(chǎn)生的抗體與CD40抗原的結(jié)合阻斷了C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，那么該抗體屬于本發(fā)明范圍。該抗體可通過以下方式阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，所述方式包括但不限于通過空間抑制C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合來防止C4BP結(jié)合，通過競爭CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分來競爭性抑制C4BP結(jié)合，當(dāng)C4BP連接于細(xì)胞表面CD40時(shí)阻斷CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可抑制通過C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而誘導(dǎo)的一種或多種CD40導(dǎo)向活性，包括但不限于本文公開的CD40導(dǎo)向活性，例如，T細(xì)胞刺激的正常人外周血B細(xì)胞分泌免疫球蛋白；Jurkat T細(xì)胞刺激的正常人外周血B細(xì)胞的存活和/或增殖；表達(dá)C4BP的細(xì)胞或可溶性C4BP刺激的正常人外周血B細(xì)胞的存活和/或增殖；可溶性C4BP或固相C4BP刺激的任何細(xì)胞中的″存活″抗凋亡胞內(nèi)信號；與可溶性C4BP或固相C4BP連接后任何細(xì)胞中的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；以及如下所述人惡性B細(xì)胞增殖?？扇绫疚膶?shí)施例所述進(jìn)行測定拮抗性抗CD40抗體抑制這些CD40導(dǎo)向活性的能力的試驗(yàn)。也參見納入本文作為參考的Schultze等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA928200；Denton等(1998)Pediatr.Transplant.26-15；Evans等(2000)J Immunol.164688；Noelle(1998)Agents ActionsSuppl.4917-22；Lederman等(1996)Curr.Opin.Hematol.311；Coligan等，(1991)Current Protocols in Immunology1312；Kwekkeboom等(1993)Immunology79439；和美國專利號5,674,492和5,847,082所述試驗(yàn)。
對特異性結(jié)合于CD40-抗原和以本文所述的方式阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗性抗-CD40抗體進(jìn)行檢測的代表性試驗(yàn)是“競爭性結(jié)合試驗(yàn)”。競爭性結(jié)合試驗(yàn)是通過未知物抑制標(biāo)記的已知配體(如C4BP)和其特異性受體(如CD40)結(jié)合的能力來檢測和定量未知物的血清學(xué)試驗(yàn)。也稱為競爭性抑制試驗(yàn)。在代表性的競爭性結(jié)合試驗(yàn)中，標(biāo)記的CD40多肽被樣品中的候選抗體沉淀，例如與針對本發(fā)明抗體的一種或多種表位而產(chǎn)生的單克隆抗體結(jié)合而沉淀。可通過篩選針對CD40蛋白或含有感興趣CD40蛋白特定表位的蛋白片段而制備的一系列抗體來鑒定能與感興趣表位特異性結(jié)合的抗-CD40抗體。例如，就人CD40而言，感興趣的表位包括含有以下同種型的線性和/或非線性氨基酸殘基的表位人CD40的短同種型(參見GenBank登錄號NP_690593，由GenBank登錄號NM_152854編碼)，或人CD40的長同種型(參見GenBank登錄號CAA43045和NP_001241，由GenBank登錄號X60592和NM_001250編碼)?；蛘?，可用以前鑒定的合適的拮抗性抗-CD40抗體進(jìn)行競爭性結(jié)合試驗(yàn)來選擇與以前鑒定的抗體相當(dāng)?shù)膯慰寺】贵w。
這種免疫試驗(yàn)采用的抗體可以是標(biāo)記的或未標(biāo)記的。未標(biāo)記的抗體可用于凝結(jié)試驗(yàn)或ELISA；采用各種各樣標(biāo)記物的標(biāo)記抗體可用于各種試驗(yàn)。通過使抗體與可檢測物質(zhì)連接有助于檢測抗-CD40抗體與感興趣表位之間形成的抗體-抗原復(fù)合物。合適的檢測方式包括使用例如放射性核素、酶、輔酶、熒光劑、化學(xué)發(fā)光劑、色原、酶底物或輔助因子、酶抑制劑、輔基復(fù)合物、自由基、顆粒、染料等標(biāo)記。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子是魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。這種標(biāo)記的試劑可用于各種熟知的試驗(yàn)，例如放射性免疫試驗(yàn)，酶免疫試驗(yàn)如ELISA、熒光免疫試驗(yàn)等。參見，例如美國專利號3,766,162；3,791,932；3,817,837和4,233,402。
可將任何前述的拮抗性抗-CD40抗體或它們的抗原結(jié)合片段偶聯(lián)然后用于本發(fā)明方法。制備偶聯(lián)抗體的方法是本領(lǐng)域已知的。因此，可用間接標(biāo)記或間接標(biāo)記方法來標(biāo)記抗-CD40抗體?！伴g接標(biāo)記”或“間接標(biāo)記方法”指將螯合劑共價(jià)偶聯(lián)于抗體并且將至少一種放射性核素插入該螯合劑中。例如，參見納入本文作為參考的Srivagtava和Mease，(1991)Nucl.Med.Bio.18589-603中所述的螯合劑和放射性核素。合適的標(biāo)記包括熒光基團(tuán)、生色團(tuán)、放射性原子(特別是32P和125I)、電子密集試劑(electron-dense reagent)、酶和具有特異性結(jié)合伴侶(partner)的配體。一般通過其活性來檢測酶。例如，常通過將3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變?yōu)榭捎梅止夤舛扔?jì)定量的藍(lán)色色素的能力來檢測辣根過氧化物酶?！疤禺愋越Y(jié)合伴侶”指能以高特異性結(jié)合配體分子的蛋白質(zhì)，例如抗原和其特異性單克隆抗體。其它特異性結(jié)合伴侶包括生物素和親和素或鏈霉抗生物素蛋白、IgG和蛋白A、本領(lǐng)域已知的許多受體-配體對。因?yàn)橄嗤臉?biāo)記可以幾種不同模式使用，以上描述應(yīng)該理解為不是要將各種標(biāo)記歸為截然不同的種類。例如，125I可用作放射性標(biāo)記或作為電子密集試劑。辣根過氧化物酶(HRP)可用作酶或單克隆抗體的抗原。此外，可為所需的作用組合各種標(biāo)記。例如，單克隆抗體與親和素在實(shí)施本發(fā)明中也需要標(biāo)記因此，可用生物素標(biāo)記單克隆抗體，然后用標(biāo)記125I的親和素或用標(biāo)記HRP的抗-生物素單克隆抗體檢測其存在。其它預(yù)先(制備)的突變與可能性對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不難理解，應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明范圍內(nèi)的等價(jià)物。
或者，抗-CD40抗體可使用放射性核素與抗體直接共價(jià)相連(一般通過氨基酸殘基)的“直接標(biāo)記”或“直接標(biāo)記方法”標(biāo)記。優(yōu)選的核素見Srivagtava和Mease(1991)，同上。特別優(yōu)選間接標(biāo)記方法。也參見，例如國際公布號WO 00/52031和WO00/52473，其中接頭用于連接放射性標(biāo)記與抗體；抗-CD40抗體的受標(biāo)記形式描述于納入本文作為參考的美國專利號6,015,542。
此外，抗體(或其片段)可與治療性部分，例如細(xì)胞毒素、治療性藥物或放射性金屬離子或放射性同位素偶聯(lián)。細(xì)胞毒素或細(xì)胞毒藥物包括對細(xì)胞有害的任何藥物。例子包括紫杉醇、細(xì)胞松弛素B、短桿菌肽D、溴化乙錠、吐根堿、絲裂霉素、足葉乙苷、鬼臼噻吩甙(tenoposide)、長春新堿、長春堿、秋水仙素、阿霉素、道諾紅菌素、二羥基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放線菌素D、1-脫氫睪酮、糖皮質(zhì)激素、普魯卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛爾和嘌呤霉素及它們的類似物或同系物。治療性藥物包括，但不限于抗代謝物(例如，氨甲喋呤、6-巰基嘌呤、6-硫代鳥嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪(decarbazine))、烷化劑(例如，氮芥、thioepa、瘤可寧、美法侖、卡氮芥(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、環(huán)磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、鏈脲霉素、絲裂霉素C和順二氯二胺鉑(II)(DDP)順鉑)、蒽環(huán)類(例如，道諾紅菌素(曾用名道諾霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放線菌素D(曾用名放線菌素)、博萊霉素、光神霉素和氨茴霉素(AMC))、和抗有絲分裂藥物(例如，長春新堿和長春堿)。放射性同位素包括，但不限于I-131、I-123、I-125、Y-90、Re-188、Re-186、At-211、Cu-67、Bi-212、Bi-213、Pd-109、Tc-99、In-111等。本發(fā)明的偶聯(lián)抗體可用于修飾給定的生物應(yīng)答；此類藥物部分不應(yīng)理解為限制于典型的化學(xué)治療劑。例如，此類藥物部分可以是擁有所需生物活性的蛋白質(zhì)或多肽。這種蛋白質(zhì)可包括，例如毒素，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假單胞菌外毒素或白喉毒素；蛋白質(zhì)，如腫瘤壞死因子、干擾素-α、干擾素-β、神經(jīng)生長因子、血小板衍生生長因子、組織纖溶酶原激活物；或生物應(yīng)答修飾劑，如淋巴因子、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒細(xì)胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生長因子。
將這種治療性部分偶聯(lián)于抗體的技術(shù)是熟知的。參見，例如《單克隆抗體和癌癥治療》(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)中的Arnon等，(1985)，“癌癥治療中用于藥物的免疫靶向的單克隆抗體”(Monoclonal Antibodies for Immunotargetingof Drugs in Cancer Therapy)，Reisfeld等編，(Alan R.Liss，Inc.)，第243-256頁；Hellstrom等，(1987)，《受控藥物遞送》(Controlled Drug Delivery)中的“用于藥物遞送的抗體”(Antidodies for Drug Delivery)，Robinson等編，(第二版；MarcelDekker，Inc.)，第623-653頁；《單克隆抗體’84生物學(xué)和臨床應(yīng)用》(Monoclonal Antibodies′84Biological andClinical Applications)中的Thorpe，(1985)，“癌癥治療中細(xì)胞毒性藥物的抗體載體綜述”(Antibody carriers of Cytoxic Agents in Cancer TherapyA review)，Pinchera等編，(Editrice Kurtis，Milano，Italy，1985)，第475-506頁；《癌癥診斷和治療的單克隆抗體》(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy)中的“在癌癥治療中治療性應(yīng)用放射性標(biāo)記抗體的分析、結(jié)果和前景”(Analysis，Results，and FutureProspective of Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therpy)，Baldwin等編，(Academic Press，New York，1985)，第303-316頁；和Thorpe等，(1982)Immunol.Rev.62119-158。
或者，可將抗體與二抗偶聯(lián)形成如美國專利號4,676,980所述的抗體雜合偶聯(lián)物。此外，可在標(biāo)記和本發(fā)明的抗體之間使用接頭(參見美國專利號4,831,175)?？贵w或其抗原結(jié)合片段可用放射性碘、銦、銥或本領(lǐng)域已知的其它放射性顆粒直接標(biāo)記(美國專利號5,595,721)。治療方案可由同時(shí)或依次給予偶聯(lián)和非偶聯(lián)抗體的組合治療方案構(gòu)成(國際公開號WO 00/52031和WO 00/52473)。
拮抗性抗-CD40抗體的變體拮抗性抗-CD40抗體的合適的生物活性變體可用于本發(fā)明的方法。這種變體保留了親代拮抗性抗-CD40抗體的所需結(jié)合特性。制備抗體變體的方法一般是本領(lǐng)域可用的。
例如，拮抗性抗-CD40抗體的氨基酸序列變體可通過突變克隆的編碼感興趣抗體的DNA序列來制備。誘變與核苷酸序列改變的方法是本領(lǐng)域熟知的。例如，參見納入本文作為參考的Walker和Gaastra編，(1983)，《分子生物學(xué)技術(shù)》(Techniques inMolecular Biology)，(MacMillan Publishing Company，New York)；Kunkel，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82488；Kunkel等，(1987)Methods Enzymol.154367；Sambrook等，(1989)，《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》(Molecular CloningA LaboratoryManual)，(冷泉港，紐約)；美國專利號4,873,192；和本文引用的參考文獻(xiàn)。適當(dāng)?shù)陌被崛〈挥绊懜信d趣多肽的生物活性的指南見納入本文作為參考的Dayhoff等，(1978)《蛋白質(zhì)序列和結(jié)構(gòu)圖》(Atlas of Protezh Sequence and Structure)，(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.)中的模型。優(yōu)選保守取代，例如用具有相似特性的另一氨基酸取代一個(gè)氨基酸。保守取代的例子包括，但不限于GlyAla、ValIleLeu、AspGlu、LysArg、AsnGln和PheTrpTyr。
在構(gòu)建感興趣的拮抗性抗-CD40抗體多肽的變體過程中，進(jìn)行修飾使變體繼續(xù)具有所需活性，即相似的結(jié)合親和力并能特異性地結(jié)合表達(dá)于人細(xì)胞表面的人CD40抗原，從而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并且當(dāng)與人CD40表達(dá)細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合時(shí)無明顯的激動(dòng)活性而顯示拮抗活性。很顯然，編碼這種變體多肽的DNA中的任何突變都必須不能將其序列置于讀碼框外并且優(yōu)選不生成可能產(chǎn)生二級mRNA結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)區(qū)。參見歐洲專利公布號75,444。
此外，可以許多方式使拮抗性抗-CD40抗體的恒定區(qū)突變而改變其效應(yīng)器功能。例如，參見美國專利號6,737,056B1和美國專利申請公布號2004/0132101A1所述的優(yōu)化抗體與Fc受體結(jié)合的Fc突變。
參比的拮抗性抗-CD40抗體的變體的氨基酸序列優(yōu)選與該參比拮抗性抗-CD40抗體分子的氨基酸序列，或與該參比抗體分子的較短部分具有至少70％或75％序列相同性，優(yōu)選至少80％或85％序列相同性，更優(yōu)選至少90％、91％、92％、93％、94％或95％序列相同性。這些分子更優(yōu)選具有至少96％、97％、98％或99％序列相同性。出于本發(fā)明的目的，可使用Smith-Waterman同源性檢索算法以相關(guān)空格(affine gap)檢索確定序列相同性百分比，所用參數(shù)為空格開放罰分12、空格延伸罰分2和BLOSUM矩陣62。Smith-Waterman同源性檢索算法的說明見Smith和Waterman，(1981)，Adv.Appl.Math.2482-489。例如，變體與參比的抗-CD40抗體有少至1-15個(gè)氨基酸殘基、少至1-10個(gè)氨基酸殘基，如6-10，少至5個(gè)、少至4個(gè)、3個(gè)、2個(gè)、甚至1個(gè)氨基酸殘基的不同。
就兩條氨基酸序列的最佳比對而言，與參比氨基酸序列相比，變體氨基酸序列的毗連區(qū)段可具有額外的氨基酸殘基或刪除的氨基酸殘基。用于和參比氨基酸序列比較的毗連區(qū)段包括至少20個(gè)毗連氨基酸殘基，可以是30、40、50或更多個(gè)氨基酸殘基。可對與保守殘基取代或空格相關(guān)的序列相同性進(jìn)行校正(參見Smith-Waterman同源性檢索算法)。
能特異性結(jié)合CD40并保留拮抗活性的抗-CD40抗體(特別是當(dāng)與CD40抗原結(jié)合時(shí))的精確化學(xué)結(jié)構(gòu)，取決于許多因素。由于分子中存在可電離的氨基和羧基，特定的多肽可以酸性鹽或堿性鹽，或以中性鹽形式獲得。在合適的環(huán)境中可保留它們的生物活性的所有這種制劑包括在本文所用的拮抗性抗-CD40抗體的定義中。此外，可通過使用糖組分衍生(糖基化)或通過其它補(bǔ)充分子，例如脂質(zhì)、磷酸、乙?；仍黾釉摱嚯牡囊患壈被嵝蛄小Ｒ部赏ㄟ^和糖偶聯(lián)來增加該多肽的一級氨基酸序列。這種增加的某些方面可通過生產(chǎn)宿主的翻譯后加工系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)；可在體外引入其它這種修飾。在任何情況中，只要抗-CD40抗體的拮抗特性能未遭破壞，這種修飾就包括在本文所用的抗-CD40抗體的定義中。在各種試驗(yàn)中，期望這種修飾可通過提高或降低該抗體的活性來定量或定性地影響其活性。此外，可通過氧化、還原或其它衍生方式來修飾鏈中的各個(gè)氨基酸殘基，可切割該抗體得到保留活性的片段。這種不破壞拮抗活性的改變未將該抗體多肽序列排除在本文所用感興趣的抗-CD40抗體的定義之外。
本領(lǐng)域?yàn)橛嘘P(guān)抗體變體的制備和使用提供了基本指南。在制備抗-CD40抗體變體過程中，本領(lǐng)域的技術(shù)人員易于確定對天然核苷酸或氨基酸序列的哪種修飾將導(dǎo)致適合用作本發(fā)明方法藥物組合物中治療性活性組分的變體。
使用本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體的治療方法由于拮抗性抗CD40抗體提供了阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法，可用它們抑制本文上述一種或多種CD40導(dǎo)向活性。因此，本發(fā)明提供了抑制CD40表達(dá)細(xì)胞中CD40導(dǎo)向活性的方法，該方法包括將該細(xì)胞與本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體相接觸，抗體用量能有效阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如上所述，阻斷此信號通路可能是通過競爭性抑制或空間抑制了C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，或阻斷了通過C4BP與CD40上它的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而進(jìn)行的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，只要抗CD40抗體與CD40的結(jié)合阻斷了C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
本文所述拮抗性抗CD40抗體可用于治療患有C4BP刺激CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的疾病的患者?！錍D40表達(dá)細(xì)胞″指表達(dá)CD40細(xì)胞表面抗原的任何細(xì)胞類型，特別是B細(xì)胞和其它APC，包括樹突細(xì)胞，可以是正?；驉盒訡D40表達(dá)細(xì)胞。本領(lǐng)域已知檢測細(xì)胞中CD40表達(dá)的方法，包括但不限于PCR技術(shù)、免疫組化、流式細(xì)胞術(shù)、Western印跡、ELISA等。
″惡性B細(xì)胞″指任何致瘤性B細(xì)胞，包括但不限于衍生自淋巴瘤(包括低級、中級和高級B細(xì)胞淋巴瘤)的B細(xì)胞、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、愛波斯坦-巴爾病毒(EBV)誘導(dǎo)的淋巴瘤和AIDS相關(guān)性淋巴瘤，以及B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)、骨髓瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)、急性成髓細(xì)胞性白血病等。在其它實(shí)施方式中，CD40表達(dá)細(xì)胞是實(shí)體瘤細(xì)胞?！灞磉_(dá)CD40的實(shí)體瘤細(xì)胞″指實(shí)體瘤的表達(dá)CD40細(xì)胞表面抗原的任何惡變細(xì)胞或惡變前細(xì)胞。出于本發(fā)明目的，表達(dá)CD40抗原的癌細(xì)胞和癌前或惡變前細(xì)胞稱為″表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞″。而且，當(dāng)CD40配體(CD40L)和C4BP通過CD40活化協(xié)同作用時(shí)，可用本發(fā)明抗CD40抗體阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而影響CD40/CD40L作用介導(dǎo)的疾病。
本文將“治療”定義為將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⑥卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)用于或給予患者的分離的組織或細(xì)胞系，所述患者患有疾病，疾病癥狀，或疾病的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響該疾病、疾病的癥狀、或疾病的易感性。“治療”也指將含有拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⒑修卓剐钥?CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物應(yīng)用于或給予患者的分離的組織或細(xì)胞系，所述患者患有疾病，疾病的癥狀，或疾病的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響該疾病、疾病的癥狀、或疾病的易感性。
采用本發(fā)明至少一種拮抗性抗CD40抗體(或其抗原結(jié)合片段)的治療產(chǎn)生對治療人體中C4BP激活CD40表達(dá)細(xì)胞的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)性疾病(本文中稱為CD40相關(guān)性疾病)的有益生理應(yīng)答。這些CD40相關(guān)疾病包括但不限于過度增殖、可導(dǎo)致癌癥的惡變前疾病，癌癥，包括B細(xì)胞相關(guān)性癌癥和包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤，以及自身免疫和/或炎性疾病。因此，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可通過抑制自身免疫應(yīng)答用于治療自身免疫和/或炎性疾病，如系統(tǒng)性狼瘡、牛皮癬、多發(fā)性硬化、炎性腸病(克羅恩氏病)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及器官和組織移植排斥，通過清除CD40提供活化信號的惡性B淋巴細(xì)胞治療淋巴瘤，和以特定方式將毒素遞送給攜帶CD40的細(xì)胞。
因此，例如，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可用于治療異常、不可控B細(xì)胞增殖或累積相關(guān)的非霍奇金淋巴瘤。出于本發(fā)明目的，根據(jù)《工作試劑》(WorkingFormulation)分類表分類這些淋巴瘤，即將B細(xì)胞淋巴瘤分類為低級、中級和高級(參見“非霍奇金淋巴瘤病理學(xué)分類方案”(The non-Hodgkin’s Lymphoma PathologicClassification Project)，(1982)Cancer 492112)。因此，低級B細(xì)胞淋巴瘤包括小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、濾泡性小粘著細(xì)胞淋巴瘤以及濾泡混合性小粘著細(xì)胞和大細(xì)胞淋巴瘤；中級淋巴瘤包括濾泡性大細(xì)胞淋巴瘤、彌散性小粘著性細(xì)胞淋巴瘤、彌散混合性小細(xì)胞和大細(xì)胞淋巴瘤以及彌散性大細(xì)胞淋巴瘤；高級淋巴瘤包括伯基特類型和非伯基特類型的大細(xì)胞免疫母細(xì)胞淋巴瘤、成淋巴細(xì)胞淋巴瘤和小非粘著性細(xì)胞淋巴瘤。
應(yīng)該認(rèn)識到，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可用于治療性治療按修正的歐美淋巴瘤分類(REAL)系統(tǒng)分類的B細(xì)胞淋巴瘤。這種B細(xì)胞淋巴瘤包括但不限于前B細(xì)胞瘤，例如B淋巴細(xì)胞性白血病/淋巴瘤；外周B細(xì)胞瘤，包括慢性B細(xì)胞型淋巴細(xì)胞性白血病/小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞(lymphoplasmacytoid)淋巴瘤/免疫細(xì)胞瘤、外套細(xì)胞淋巴瘤(MCL)、濾泡中心淋巴瘤(濾泡性)(包括彌散性小細(xì)胞、彌散性小和大細(xì)胞，與彌散性大細(xì)胞淋巴瘤)、邊緣層B細(xì)胞淋巴瘤(包括結(jié)節(jié)外、結(jié)節(jié)的和脾臟類型)、毛細(xì)胞性白血病、漿細(xì)胞瘤/骨髓瘤、原發(fā)性縱隔(胸腺)亞型彌散性大細(xì)胞型B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤和伯基特樣高級B細(xì)胞淋巴瘤；急性白血病；急性淋巴細(xì)胞性白血病(ALL)；成髓細(xì)胞白血病；急性髓細(xì)胞性白血??；前髓細(xì)胞性白血?。涣魏思?xì)胞白血?。粏魏思?xì)胞性白血??；紅白血病；髓細(xì)胞性白血病(慢性髓細(xì)胞性白血病)；慢性淋巴細(xì)胞性白血病(CLL)；真紅細(xì)胞增多；多發(fā)性骨髓瘤；特發(fā)性巨球蛋白血癥；重鏈疾?。缓筒豢煞诸惖牡图壔蚋呒塀細(xì)胞淋巴瘤。
本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可用于預(yù)防治療期間產(chǎn)生的其它腫瘤派生物，并可用于治療患有低級B細(xì)胞淋巴瘤的對象，尤其是在標(biāo)準(zhǔn)化療后復(fù)發(fā)的對象。低級B細(xì)胞淋巴瘤比中級和高級B細(xì)胞淋巴瘤進(jìn)展緩慢，其特征是復(fù)發(fā)/緩解過程。因此，用本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體改進(jìn)了這些淋巴瘤的治療，因?yàn)榭山档蛷?fù)發(fā)的次數(shù)和嚴(yán)重性。
包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤包括但不限于卵巢癌、肺癌(如鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌類型的非小細(xì)胞肺癌，以及小細(xì)胞肺癌)、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌(包括例如腎細(xì)胞癌)、膀胱癌(如膀胱癌)、肝癌(包括例如肝細(xì)胞癌)、胃癌、宮頸癌、前列腺癌、鼻咽癌、甲狀腺癌(如甲狀腺乳頭狀癌)和皮膚癌如黑色素瘤、以及肉瘤(包括例如骨肉瘤和尤因肉瘤)。
當(dāng)給予患有包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的癌癥的對象時(shí)，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體和其抗原結(jié)合片段可提供抗腫瘤活性?！蹇鼓[瘤活性″指表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞增殖或積累速率降低，從而使已存在的腫瘤或在治療期間發(fā)生的腫瘤的生長速率降低，和/或破壞已存在的腫瘤細(xì)胞或新形成的腫瘤細(xì)胞，從而在治療期間使腫瘤整體大小減小。
因此，本發(fā)明提供了治療包含CD40表達(dá)細(xì)胞的癌癥如B細(xì)胞淋巴瘤和實(shí)體瘤的方法，其中將治療有效量的本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段給予患有該癌癥的對象。給予這些抗體或其抗原結(jié)合片段能夠促進(jìn)陽性治療反應(yīng)。提到癌癥治療時(shí)，″陽性治療反應(yīng)″指與這些抗體或其片段的抗腫瘤活性相關(guān)的疾病有改進(jìn)，和/或與該疾病相關(guān)的癥狀有改進(jìn)。因此，例如，陽性治療反應(yīng)指以下疾病改進(jìn)的一種或多種(1)腫瘤大小減??；(2)癌(即腫瘤)細(xì)胞數(shù)目減少；(3)腫瘤細(xì)胞死亡增加；(4)抑制了腫瘤細(xì)胞存活；(4)抑制(即減緩到一定程度，優(yōu)選中止)腫瘤生長；(5)抑制(即減緩到一定程度，優(yōu)選中止)癌細(xì)胞浸潤周圍器官；(6)抑制(即減緩到一定程度，優(yōu)選中止)腫瘤轉(zhuǎn)移；(7)預(yù)防其它腫瘤派生物；(8)提高患者生存率；和(9)一定程度上緩解與該癌癥相關(guān)的一種或多種癥狀。還可根據(jù)改善程度進(jìn)一步表征這些治療反應(yīng)。因此，例如，疾病改善的特征可以是完全應(yīng)答。“完全應(yīng)答”指以前異常的放射顯影研究、骨髓和腦脊髓液(CSF)正常化后臨床上無可檢測的疾病。用本發(fā)明的方法治療后這種應(yīng)答必須維持至少一個(gè)月。或者，疾病的改善可歸類為部分應(yīng)答?！安糠謶?yīng)答”指在無新的病損時(shí)，所有可檢測的腫瘤負(fù)荷(即對象中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量)至少降低約50％并至少持續(xù)一個(gè)月。這種應(yīng)答僅適用于可檢測的腫瘤。
可用以下篩選技術(shù)評價(jià)腫瘤應(yīng)答所導(dǎo)致的腫瘤形態(tài)(即，總的腫瘤負(fù)荷、腫瘤體積等)變化例如磁共振成像(MRI)掃描、x-放射顯影成像、計(jì)算機(jī)化斷層顯像(CT)掃描、生物發(fā)光成像，如螢光素酶成像、骨掃描成像和包括抽取骨髓(BMA)的腫瘤活體組織取樣。除了這些陽性治療性應(yīng)答以外，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段治療的對象可經(jīng)歷疾病相關(guān)癥狀改善的有益作用。因此，就B細(xì)胞腫瘤而言，對象可經(jīng)歷所謂的B癥狀，即盜汗、發(fā)熱、體重降低和/或蕁麻疹的減輕。
本文所述拮抗性抗CD40抗體也可用于治療其它CD40相關(guān)疾病，其中阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致抑制一種或多種CD40導(dǎo)向活性，這種抑制導(dǎo)致疾病改善，或至少減輕了所述疾病的一種或多種不良癥狀。因此，當(dāng)C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與不良免疫應(yīng)答或體內(nèi)過程相關(guān)時(shí)，如與自身免疫和/或炎性組分有關(guān)的疾病或失調(diào)相關(guān)時(shí)，可將本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體給予有風(fēng)險(xiǎn)的對象或需要治療一種或多種CD40相關(guān)性疾病的對象，以阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制或預(yù)防與各種CD40相關(guān)性疾病相關(guān)的癥狀。
炎性疾病的特征是炎癥和組織損傷，或其組合?！逖仔约膊　灏▎?dòng)事件或免疫應(yīng)答靶點(diǎn)包括非自身抗原的任何炎性免疫介導(dǎo)過程，所述非自身抗原包括例如同種抗原、異種抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、未知抗原或變應(yīng)原。
而且，出于本發(fā)明目的，術(shù)語″炎性疾病″包括″自身免疫病″。通常理解，本文所用術(shù)語″自身免疫″包括涉及″自身″抗原的炎性免疫介導(dǎo)過程。在自身免疫病中，自身抗原引發(fā)宿主的免疫應(yīng)答。
同時(shí)，本發(fā)明包括治療與組織移植排斥相關(guān)的炎癥?！逡浦才懦狻寤颉逡浦参锱懦狻逯杆拗鲗σ浦参锂a(chǎn)生的任何免疫應(yīng)答，移植物包括但不限于HLA抗原、血型抗原等。
本發(fā)明也可用于治療移植物抗宿主病，如骨髓移植相關(guān)的移植物抗宿主病。在這種移植物抗宿主病中，供體骨髓包括淋巴細(xì)胞和成熟后成為淋巴細(xì)胞的細(xì)胞。供體的淋巴細(xì)胞將受體的抗原識別為非自身物質(zhì)并產(chǎn)生炎性免疫應(yīng)答。因此，本文所用″移植物抗宿主病″或″移植物抗宿主反應(yīng)″指供體淋巴細(xì)胞對宿主抗原起反應(yīng)的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。
因此，可按照本發(fā)明方法用本文所述拮抗性抗CD40抗體和其抗原結(jié)合片段治療自身免疫和/或炎性疾病，包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，盤狀狼瘡，狼瘡性腎炎，結(jié)節(jié)病，炎性關(guān)節(jié)炎，包括少年關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、萊特爾綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎和痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎，器官或組織移植排斥，過急性、急性或慢性排斥和/或移植物抗宿主病，多發(fā)性硬化，高免疫球蛋白E血癥綜合征，結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，炎性腸病，克羅恩氏病，乳糜瀉(麩膠敏感性腸病)，自免疫肝炎，惡性貧血，自身免疫性溶血性貧血，牛皮癬，硬皮病，重癥肌無力，自身免疫性血小板減少性紫癜，自身免疫性甲狀腺炎，格雷夫斯病，橋本甲狀腺炎，免疫復(fù)合物病，慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)，多肌炎和皮肌炎，冷球蛋白血癥，溶栓，心肌病，尋常天皰瘡，肺間質(zhì)纖維化，I型和II型糖尿病，1型、2型、3型和4型遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，過敏或過敏性疾病，對治療性蛋白的不良/無意免疫應(yīng)答(參見例如，美國專利申請?zhí)朥S2002/0119151和Koren等，(2002)Curr.Pharm.Biotechnol.3349-60)，哮喘，丘-施綜合征(過敏性肉芽腫病)，特應(yīng)性皮炎，過敏性和刺激性接觸性皮炎，風(fēng)疹，IgE-介導(dǎo)的過敏，動(dòng)脈粥樣硬化，血管炎，特發(fā)性炎性肌病，溶血性疾病，阿耳茨海默病，慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病等。在一些其它實(shí)施方式中，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可用于治療肺部炎癥，包括但不限于肺移植排斥、哮喘、結(jié)節(jié)病、肺氣腫、囊性纖維化病、特發(fā)性肺纖維化、慢性支氣管炎、過敏性鼻炎和肺部變應(yīng)性病、如過敏性肺炎、嗜酸細(xì)胞性肺炎、由骨髓和/或肺移植或其它原因引起的閉塞性細(xì)支氣管炎、移植性動(dòng)脈粥樣硬化/移植性靜脈硬化，以及由膠原病、血管病和自身免疫病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和紅斑狼瘡引起的肺纖維化。
″抗炎活性″指降低或預(yù)防炎癥。用本文其它地方所述的至少一種抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)行治療提供對治療自身免疫病和/或炎性疾病有益的生理應(yīng)答，該疾病包括表達(dá)CD40抗原的細(xì)胞。應(yīng)認(rèn)識到，本發(fā)明方法可用于預(yù)防細(xì)胞的表型改變?nèi)缭鲋?、活化等?br> 提到自身免疫病和/或炎性疾病時(shí)，″陽性治療應(yīng)答″指與這些抗體或其抗原結(jié)合片段的抗炎活性相關(guān)的疾病改善，和/或與該疾病相關(guān)的癥狀改善。即，可觀察到抗增殖效果、防止CD40表達(dá)細(xì)胞進(jìn)一步增殖、降低炎性反應(yīng)，包括但不限于減少炎性細(xì)胞因子、粘著分子、蛋白酶、免疫球蛋白(在攜帶CD40的細(xì)胞是B細(xì)胞的情況下)和其組合的分泌等，提高抗炎蛋白的產(chǎn)量，減少自身反應(yīng)細(xì)胞的數(shù)量，增加免疫耐受，抑制自身反應(yīng)細(xì)胞存活，和/或減輕刺激CD40表達(dá)細(xì)胞介導(dǎo)的一種或多種癥狀。這種陽性治療反應(yīng)并不限制給藥途徑，可包括給予供體、供體組織(如器官灌注)、宿主、它們的組合等。
對于進(jìn)行自身免疫和/或炎性疾病治療的對象來說，可用以下篩選技術(shù)評價(jià)臨床反應(yīng)，例如磁共振成像(MRI)掃描、x-射線成像、計(jì)算機(jī)化斷層(CT)掃描、流式細(xì)胞術(shù)或熒光激活的細(xì)胞分選(FACS)分析、組織學(xué)、宏觀病理學(xué)和血液化學(xué)，包括但不限于可用ELISA、RIA、色譜等檢測的改變。除了這些陽性治療反應(yīng)以外，用拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段進(jìn)行治療的對象可能獲得該疾病相關(guān)的癥狀改善的有利效果。
“治療有效劑量或量”指給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段后，可導(dǎo)致與治療CD40相關(guān)性疾病患者相關(guān)的陽性治療性反應(yīng)的量。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其片段的治療有效量為約0.003mg/kg-50mg/kg、約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg.lkg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。應(yīng)知道該治療方法可包括一次給予或多次給予治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是將拮抗性抗-CD40抗體用作臨床測試過程的一部分來診斷性監(jiān)測組織中蛋白質(zhì)水平，例如用于檢測給定治療方案的有效性。將該抗體與可檢測的物質(zhì)偶聯(lián)有助于檢測。可檢測物質(zhì)的例子包括各種酶、輔基、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)、生物發(fā)光物質(zhì)和放射性物質(zhì)。合適的酶的例子包括辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰膽堿酯酶；合適的輔基復(fù)合物的例子包括鏈霉抗生物素蛋白/生物素和親和素/生物素；合適的熒光物質(zhì)的例子包括傘形酮、熒光素、異硫氰酸熒光素、羅丹明、二氯三嗪基胺熒光素、丹磺酰氯或藻紅蛋白；發(fā)光物質(zhì)的例子包括魯米諾；生物發(fā)光物質(zhì)的例子包括螢光素酶、螢光素和水母蛋白；合適的放射性物質(zhì)的例子包括125I、131I、35S或3H。
拮抗性抗CD40抗體可與已知的化療藥、細(xì)胞因子和/或其它單克隆抗體，包括具有不同作用方式的其它拮抗性抗CD40抗體聯(lián)用，以治療CD40相關(guān)疾病。例如，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可與細(xì)胞因子如白介素-2聯(lián)用。在另一實(shí)施方式中，本發(fā)明抗CD40抗體可與(例如)其它單克隆抗體，如利妥昔單抗(IDEC-C2B8；利妥昔；E)EC Pharmaceuticals Corp.，San Diego，California)聯(lián)用，以治療B細(xì)胞淋巴瘤。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明抗CD40抗體可與阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抗CD40單克隆抗體聯(lián)用。這種組合可能用于治療自身免疫病和/或炎性疾病，包括但不限于器官和組織移植排斥。當(dāng)對象進(jìn)行組織或器官移植時(shí)，拮抗性抗CD40抗體可與抑制移植的組織/器官排斥的其它治療劑聯(lián)用。這種治療劑包括但不限于皮質(zhì)類固醇、環(huán)孢霉素和硫唑嘌呤。當(dāng)多種治療劑聯(lián)用時(shí)，可依次、以任一順序或同時(shí)(即同時(shí)或在相同時(shí)間框內(nèi))給予這些治療劑。
以此方式、當(dāng)對象正在治療B細(xì)胞相關(guān)性癌癥(包括但不限于本文上述癌癥)時(shí)，本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與至少一種其它癌癥療法聯(lián)合給予，其它癌癥療法包括但不限于外科或手術(shù)方法(如脾切除術(shù)、肝切除術(shù)、淋巴結(jié)切除術(shù)、白細(xì)胞去除術(shù)(leukophoresis)、骨髓移植等)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的聯(lián)用方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細(xì)胞毒和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達(dá)比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱(nelarabine)；其它抗癌癥單克隆抗體療法(例如，阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath)或其它靶向惡性B細(xì)胞上CD52細(xì)胞表面糖蛋白的抗-CD52抗體；利妥昔單抗(利妥昔)、完全人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗(tositumomab)/I-131托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)或任何其它靶向惡性B細(xì)胞上CD20抗原的治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(例如，MT103，雙特異性抗體)；抗-CD22抗體(例如，人源化單克隆抗體埃坡組單抗(epratuzumab))；貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)或其它靶向人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的抗癌抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD22抗原的抗-CD22抗體(例如，單克隆抗體BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬細(xì)胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發(fā)性骨髓瘤中過度表達(dá)的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD23抗原的抗-CD23抗體(例如，IDEC-152)；靶向CD80抗原的抗-CD80抗體(例如，IDEC-114)；靶向惡性B細(xì)胞上的CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達(dá)于惡性B細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細(xì)胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(例如SGN-40；和能阻斷CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40L介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD-40抗體如CHIR-12.12和CHIR-5.9，及其抗原結(jié)合片段，如2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916)，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies andMethods For Their Use))所述)；和靶向表達(dá)于許多實(shí)體腫瘤和造血來源腫瘤上腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)的抗體(例如，激動(dòng)性人單克隆抗體HGS-ETR1)和靶向TRAIL-R2的抗體)；基于小分子的癌癥療法，所述小分子包括但不限于微管和/或托撲異構(gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀(dolastatin)和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL119；和托撲異構(gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達(dá)莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林(midostaurin)((PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(eloxatin)(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細(xì)胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱(clofarabine)、癌細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bc1-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森(oblimersen)和Genasense)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米(bortezomib)))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細(xì)胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(suberanilohydroxamic acid)(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬釓(motexafin gadolinium))；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個(gè)性化的免疫療法或活性獨(dú)特型免疫療法(例如，MyVax個(gè)性化免疫療法，以前命名為GTOP-99)、Promune(CpG7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動(dòng)劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；類固醇療法；或其它癌癥療法；其中其它癌癥療法在拮抗性抗-CD40抗體治療給予之前、期間或之后給予。
當(dāng)對象正在治療包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤(包括但不限于本文上述實(shí)體瘤)時(shí)，本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段可與至少一種其它癌癥治療聯(lián)合給予，其它癌癥治療包括但不限于手術(shù)、放療、化療、細(xì)胞因子治療或考慮用于治療感興趣實(shí)體瘤的其它單克隆抗體，在抗CD40抗體治療之前、期間或之后給予其它癌癥治療。
因此，當(dāng)組合療法包括給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段時(shí)聯(lián)合給予例如化療、放療、其它抗癌抗體療法、基于小分子的癌癥療法或基于疫苗/免疫治療的癌癥療法的另一種治療性藥物時(shí)，本發(fā)明的方法包括用分開的制劑或單獨(dú)的藥物制劑共同給藥，或/和以任一順序連續(xù)給藥。當(dāng)本發(fā)明的方法包括組合治療方案時(shí)，這些治療可同時(shí)進(jìn)行，即拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與其它癌癥療法同時(shí)給予或在相同的時(shí)間框內(nèi)給予(即，同時(shí)進(jìn)行治療，但拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段不與其它療法在正好相同的時(shí)間給予)?；蛘撸景l(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段也可在其它療法之前或之后給予?？梢来芜M(jìn)行不同的癌癥療法而不論受治療的對象是否對第一療程反應(yīng)以降低緩解(remission)或復(fù)發(fā)的可能性。當(dāng)組合療法包括聯(lián)合給予拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段和細(xì)胞毒藥物時(shí)，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段優(yōu)選在給予細(xì)胞毒藥物之前給予。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，對象患有B-細(xì)胞相關(guān)性癌癥，將本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與化療聯(lián)合給予，并且任選與自體骨髓移植聯(lián)合，其中抗體和化療藥物可以依次給予、以任一順序給予或同時(shí)給予(即同時(shí)或在相同時(shí)間框內(nèi))。合適的化療藥物的例子包括，但不限于氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細(xì)胞毒和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達(dá)比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱。在一些實(shí)施方案中，本文所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用化療藥物治療之前給予。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用化療藥物治療之后給予。在還有的其它實(shí)施方案中，化療藥物與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予。
因此，例如，在一些實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱聯(lián)合給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱之前給予。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱治療之后給予。在還有其它的實(shí)施方案中，氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予。
在其它實(shí)施方案中，瘤可寧(一種烷化藥物)與本文所述拮抗性抗-CD40抗體，或其抗原結(jié)合片段聯(lián)合給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予瘤可寧之前給予。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用瘤可寧治療之后給予。在還有其它的實(shí)施方案中，瘤可寧與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予。
在其它的實(shí)施方案中，含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)與本文所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段聯(lián)合給予。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予含有蒽環(huán)類的方案之前給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用含有蒽環(huán)類的方案治療之后給予該患者。在還有其它的實(shí)施方案中，含有蒽環(huán)類的方案與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予該患者。
在其它實(shí)施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與阿來組單抗(alemtuzumab)(Campath；Berlex Laboratories，Richmond，California經(jīng)銷)聯(lián)合給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者。阿來組單抗是靶向表達(dá)于惡性B細(xì)胞上CD52抗原的重組人源化單克隆抗體(Campath-1H)。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予阿來組單抗之前給予。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用阿來組單抗治療之后給予。在還有其它的實(shí)施方案中，阿來組單抗與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予。
在其它實(shí)施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與靶向惡性B細(xì)胞上的CD20抗原的治療性抗-CD20抗體，例如利妥昔單抗(利妥昔)、完全人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar)或替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)(Zevalin)聯(lián)合給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予抗-CD20抗體之前給予患者。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用抗-CD20抗體治療之后給予患者。在還有其它的實(shí)施方案中，抗-CD20抗體與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予患者。
考慮可與本發(fā)明抗CD40抗體聯(lián)用以治療B細(xì)胞相關(guān)性癌癥的單克隆抗體的其它例子包括但不限于阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體，包括例如，完全人單克隆抗體CHIR-12.12和CHIR-5.9，如2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916)，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use))所述。
在其它實(shí)施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與基于小分子的癌癥療法聯(lián)合給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者，所述小分子包括但不限于微管和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如有絲分裂抑制劑多拉斯他汀和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL119；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達(dá)莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林(PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細(xì)胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱、癌細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白Bc1-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense)、蛋白酶體抑制劑(如VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極型細(xì)胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(SAHA)和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬釓)。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予基于小分子的癌癥療法之前給予該患者。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用基于小分子的癌癥療法治療之后給予該患者。在還有其它的實(shí)施方案中，基于小分子的癌癥療法與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予該患者。
在其它的實(shí)施方案中，本文所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與基于疫苗/免疫治療的癌癥療法聯(lián)合給予B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者，所述療法包括但不限于疫苗方法(如Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個(gè)性化的免疫療法或活性獨(dú)特型免疫療法(例如，MyVax個(gè)性化免疫療法，以前命名為GTOP-99)、Promune(CpG7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動(dòng)劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；或類固醇療法。在一個(gè)這種實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在給予基于疫苗/免疫治療的癌癥療法之前給予該患者。在其它實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在用基于疫苗/免疫治療的癌癥療法治療之后給予該患者。在還有其它的實(shí)施方案中，基于疫苗/免疫治療的癌癥療法與拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段同時(shí)給予該患者。
在一個(gè)這種實(shí)施方案中，本文所述的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與IL2聯(lián)合給予。IL2是已知的一種可擴(kuò)增受治療患者的天然殺傷(NK)效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量的藥物，可在給予本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段之前或同時(shí)給予。當(dāng)本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段具有抗體依賴性細(xì)胞-介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)作為另一種作用方式時(shí)，伴隨給予IL-2的NK效應(yīng)器細(xì)胞數(shù)量增加，可導(dǎo)致給予的拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的ADCC活性提高。在其它實(shí)施方式中，IL-21用作免疫治療劑，與本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段聯(lián)合給予時(shí)能刺激NK細(xì)胞活性。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，對象患有包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤，將本文所述抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與化療或細(xì)胞因子治療聯(lián)合給予此對象，其中抗體和化療藥物或細(xì)胞因子可以依次給予、以任一順序給予或同時(shí)給予(即同時(shí)或在相同時(shí)間框內(nèi))。用于包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤患者的合適化療藥的例子包括但不限于可用于(例如)治療結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的CPT-11(伊立替康)；可用于(例如)治療肺癌、乳腺癌和上皮性卵巢癌的吉西他濱；以及適合治療實(shí)體瘤的其它化療藥。感興趣的細(xì)胞因子包括但不限于α干擾素，γ干擾素、白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15和IL-21、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，或這些細(xì)胞因子的生物活性變體。
在本發(fā)明的其它實(shí)施方式中，將本文所述抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與考慮用于治療實(shí)體瘤的其它單克隆抗體聯(lián)合給予包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤患者。因此，例如，當(dāng)治療對象的包含表達(dá)CD40的癌細(xì)胞的乳腺癌時(shí)，治療可包括給予有效量的本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，再聯(lián)合給予有效量的靶向Her2+乳腺癌細(xì)胞上的Her2受體蛋白的賀賽汀(Genentech，Inc.，加利福尼亞州舊金山)。類似地，當(dāng)治療對象的包含表達(dá)CD40的癌細(xì)胞的的結(jié)直腸癌時(shí)，治療可包括給予有效量的本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，聯(lián)合給予有效量的結(jié)合于并抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的人源化單克隆抗體阿瓦斯汀TM(也稱為貝伐單抗；Genentech，Inc.，加利福尼亞州舊金山)，VEGF是在腫瘤新生血管發(fā)生中起重要作用的蛋白質(zhì)?？紤]可與本發(fā)明抗CD40抗體聯(lián)用以治療實(shí)體瘤的單克隆抗體的其它例子包括但不限于靶向表皮生長因子受體的抗-EGFR抗體(例如IMC-C225(ImClone Systems，紐約州紐約)(參見例如，Mendelsohn和Baselga(2000)Oncogene196550-6565和Solbach等(2002)Int.J.Cancer101390-394)；靶向IGF-1受體蛋白的抗IGF-1受體抗體(參見例如，Maloney等(2003)Cancer Res.635073-5083和Hailey等(2002)Mol.Cancer.Ther.11349-1353)；靶向腫瘤相關(guān)抗原MUC1的抗-MUC1抗體；靶向相應(yīng)整聯(lián)蛋白的抗α5β1、抗αvβ5和抗αvβ3，整聯(lián)蛋白能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附以及參與細(xì)胞增殖和存活的信號通路(參見例如，Laidler等(2000)ActaBiochimica Polonica47(4)1159-1170和Cruet-Hennequart等(2003)Oncogene22(11)1688-1702)；靶向此鈣粘著蛋白家族成員的抗-P-鈣粘著蛋白抗體(參見例如，共待審的美國專利申請公開號20030194406)；靶向此內(nèi)皮細(xì)胞-特異性粘著分子的血管新生相關(guān)功能的抗-VE-鈣粘著蛋白抗體(參見例如，Liao等(2002)Cancer Res.622567-2575)；和能阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體，包括例如，完全人單克隆抗體CHIR-12.12和CHIR-5.9，如2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916))，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(AntagonistAnti-CD40 MonoclonalAntibodies and Methods For Their Use))所述。
也考慮將聯(lián)合治療應(yīng)用于包含自身免疫和/或炎性組分的CD40相關(guān)性疾病的患者。以此方式，當(dāng)治療對象的自身免疫和/或炎性疾病，包括但不限于本文所述疾病時(shí)，可將靶向C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與用于自身免疫和炎性疾病的任何已知治療聯(lián)合給予，已知治療包括已知可用于、或已經(jīng)用于或目前用于治療自身免疫和炎性疾病的任何藥劑或藥劑組合。這種治療和治療劑包括但不限于外科或手術(shù)方法(如脾切除術(shù)，淋巴結(jié)切除術(shù)，甲狀腺切除術(shù)，血漿去除術(shù)，白細(xì)胞去除術(shù)，細(xì)胞、組織或器官移植，腸操作，器官灌注等)、放療、諸如類固醇治療和非類固醇治療等治療、激素治療、細(xì)胞因子治療、用皮膚病藥物(例如用于治療皮膚病如過敏、接觸性皮炎和牛皮癬的局部藥劑)治療、免疫抑制療法和其它抗炎性單克隆抗體治療等。以此方式，將本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與至少一種其它治療聯(lián)合給予，其它治療包括但不限于手術(shù)、器官灌注、放療、類固醇治療、非類固醇治療、抗生素治療、抗真菌治療、激素治療、細(xì)胞因子治療、用皮膚病藥物(例如用于治療皮膚病如過敏、接觸性皮炎和牛皮癬的局部藥劑)治療、免疫抑制療法、其它抗炎性單克隆抗體治療、它們的組合等。
當(dāng)本發(fā)明方法包括用于自身免疫病和/或炎性疾病患者的聯(lián)合治療方案時(shí)，這些治療可同時(shí)給予，即拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與其它治療同時(shí)或在相同時(shí)間框內(nèi)給予(即治療同時(shí)進(jìn)行，但抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與其它治療不在正好相同的時(shí)間上給予)?；蛘?，也可在其它治療之前或之后給予本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。可以連續(xù)給予不同治療，而不管接受治療的對象是否對第一療程起反應(yīng)以降低緩解或復(fù)發(fā)的可能。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，本文所述拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與免疫抑制藥物或抗炎藥物聯(lián)合給予，其中抗體和治療劑可以依次給予、以任一順序給予或同時(shí)給予(即同時(shí)或在相同時(shí)間框內(nèi))。可與本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體聯(lián)合給予的合適免疫抑制藥物的例子包括但不限于甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、咪唑立賓、瘤可寧、環(huán)孢霉素如霧化環(huán)孢霉素(參見美國專利申請公開號US20020006901、全文納入本文作參考)、他克莫司(FK506；ProGrafTM)、麥考酚酸嗎乙酯和硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(雷帕霉素)、脫氧精胍菌素、來氟米特和其丙二腈酰胺類似物；以及免疫抑制蛋白，包括例如，抗-CTLA4抗體和Ig融合物、抗-B淋巴細(xì)胞刺激物抗體(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗體和依坦西普(Enbrel)以及抗-T細(xì)胞抗體如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等。合適的抗炎藥的例子包括但不限于皮質(zhì)類固醇，例如氯倍他索、鹵倍他索、氫化可的松、曲安西龍、醋布倍他米松、氟輕松(fluocinole)、醋酸氟輕松、氯潑尼松、氟潑尼龍、甲潑尼龍；非甾類抗炎藥(NSAID)例如柳氮磺吡啶、含有美沙拉嗪(mesalamine)的藥物(稱為5-ASA藥)、塞來考昔、雙氯芬酸、依托度酸、芬洛芬(fenprofen)、氟比洛芬、布洛芬、酮洛芬、meclofamate、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奧沙普秦、吡羅昔康、羅非考昔、水楊酸鹽、舒林酸和托美丁；抗炎抗體如阿達(dá)木單抗(HUMIRA，TNF-α拮抗劑)和英夫利昔單抗(Remicade，TNF-α拮抗劑)等。在其它實(shí)施方式中，將本發(fā)明抗CD40抗體或其合適的抗原結(jié)合片段與靶向CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體聯(lián)合給予接受自身免疫和/或炎性疾病治療的對象，其它拮抗性抗CD40抗體例如，拮抗性抗CD40抗體CHIR-12.12和CHIR-5.9及其抗原結(jié)合片段，如2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916))，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use)所述。
移植排斥和移植物抗宿主病可以是過急性(體液)、急性(T細(xì)胞介導(dǎo))或慢性(未知病因)，或其組合。因此，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可用于一些實(shí)施方式以預(yù)防和/或緩解排斥和與任何組織的過急性、急性和/或慢性移植排斥相關(guān)的癥狀，所述組織包括但不限于肝、腎、胰臟、胰島細(xì)胞、小腸、肺、心臟、角膜、皮膚、血管、骨、異體或自體骨髓等。移植組織可獲自任何供者，并移植入任何受體宿主，因此移植程序可包括將動(dòng)物組織移植到人(如異種移植物)、將組織從一個(gè)人移植到另一個(gè)人(如同種異體移植物)，和/或?qū)⒔M織從人體的一部分抑制到另一部分(如自體移植物)。用本發(fā)明抗體治療也可減少移植后遺癥，如發(fā)熱、食欲缺乏、血液動(dòng)力學(xué)異常、白細(xì)胞減少癥、白細(xì)胞浸潤移植的器官/組織，以及條件性感染。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可單獨(dú)使用或與免疫抑制藥物聯(lián)用，以治療和/或預(yù)防移植排斥，如過急性、急性和/或慢性排斥和/或移植物抗宿主病。因此，在用本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體治療移植排斥的一些實(shí)施方式中，可將這些抗體與合適的免疫抑制藥物聯(lián)用，包括但不限于甲氨蝶呤；環(huán)磷酰胺；咪唑立賓；瘤可寧；環(huán)孢霉素如霧化環(huán)孢霉素(參見美國專利申請公開號US20020006901、以全文納入本文作參考)、他克莫司(FK506；ProGraFTM)、麥考酚酸嗎乙酯和硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(雷帕霉素)、脫氧精胍菌素、來氟米特和其丙二腈酰胺類似物；以及免疫抑制蛋白，包括例如，抗-CTLA抗體和Ig融合物、抗-B淋巴細(xì)胞刺激物抗體(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD80抗體和依坦西普(Enbrel)，以及抗-T細(xì)胞抗體如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等；或靶向CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40L介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體，如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段。
同樣，特別考慮到本發(fā)明組合物和方法可與其它藥物聯(lián)用，以進(jìn)一步改善移植受體如接受肺移植的患者的癥狀和結(jié)果。因此，在一些實(shí)施方式中，單獨(dú)使用本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體，或與胃腸道外或非胃腸道外給予的環(huán)孢霉素(包括例如口服環(huán)孢霉素、可注射環(huán)孢霉素、霧化(如吸入型)環(huán)孢霉素和其組合)聯(lián)用以治療移植排斥(如肺移植受體的過急性、急性和/或慢性排斥或移植物抗宿主病)。在治療的至少一個(gè)組分是霧化環(huán)孢霉素的一些實(shí)施方式中，采用(例如)加壓遞送裝置或噴霧器吸入氣溶膠噴霧形式的環(huán)孢霉素，從而將環(huán)孢霉素遞送到受體的肺部?？梢愿煞坌问交驖裥问浇o予環(huán)孢霉素。
在一些其它實(shí)施方式中，可單獨(dú)使用本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或與免疫抑制藥物聯(lián)用，以治療和/或預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。因此，在用本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的一些實(shí)施方式中，這些抗體可與合適的免疫抑制藥物聯(lián)用，包括但不限于甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、咪唑立賓、瘤可寧、環(huán)孢霉素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、麥考酚酸嗎乙酯和硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(雷帕霉素)、脫氧精胍菌素、來氟米特和其丙二腈酰胺類似物；免疫抑制蛋白，包括例如抗-CTLA抗體和Ig融合物、抗-B淋巴細(xì)胞刺激物抗體(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗體(如利妥昔)；完全人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131、托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(Zevalin)；抗-CD80抗體和依坦西普(ENBREL)，以及抗-T細(xì)胞抗體如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等；或靶向CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40L介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體，如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段。如上所述，可用任何方式評價(jià)治療有效性，包括但不限于如美國風(fēng)濕病學(xué)院標(biāo)準(zhǔn)、歐洲風(fēng)濕病聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)或任何其它標(biāo)準(zhǔn)確定的臨床反應(yīng)所測定的有效性。參見例如，F(xiàn)elson等(1995)ArthritisRheum.38727-35和van Gestel等(1996)Arthritis Rheum.3934-40。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體可單獨(dú)使用或與免疫抑制藥物聯(lián)用，以治療或預(yù)防多發(fā)性硬化。因此，在用本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體治療多發(fā)性硬化的一些實(shí)施方式中，該抗體可與合適的免疫抑制藥物聯(lián)用，包括但不限于甲氨蝶呤、環(huán)磷酰胺、咪唑立賓、瘤可寧、環(huán)孢霉素、他克莫司(FK506；PROGRAFTM)、麥考酚酸嗎乙酯，和硫唑嘌呤(6-巰基嘌呤)、西羅莫司(雷帕霉素)、脫氧精胍菌素、來氟米特和其丙二腈酰胺類似物；免疫抑制蛋白，包括例如抗-CTLA抗體和Ig融合物、抗-B淋巴細(xì)胞刺激物抗體(如LYMPHOSTAT-BTM)和Ig融合物(BLyS-Ig)、抗-CD20抗體(如利妥昔)；完全人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131、托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(Zevalin)；抗-CD80抗體和依坦西普(ENBREL)，以及抗-T細(xì)胞抗體如抗-CD3(OKT3)、抗-CD4等；或靶向CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40L介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體，如CHIR-12.12或CHIR-5.9抗體或其抗原結(jié)合片段。
而且，也可采用兩種或多種治療劑和本文所述拮抗性抗CD40抗體的聯(lián)合療法來治療包含刺激的CD40表達(dá)細(xì)胞的疾病，例如B細(xì)胞相關(guān)性癌癥、實(shí)體瘤以及自身免疫和/或炎性疾病。例子包括但不限于三聯(lián)治療，其中兩種化療藥與本文所述拮抗性抗CD40抗體聯(lián)合給予，或者一種化療藥和另一種抗癌性單克隆抗體(例如阿來組單抗、利妥昔單抗、抗-CD23抗體或另一種拮抗性抗CD40抗體如靶向CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的CHIR-12.12或CHIR-5.9)與本文所述拮抗性抗CD40抗體聯(lián)合給予。這種聯(lián)合的例子包括但不限于氟達(dá)拉濱、環(huán)磷酰胺和本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的聯(lián)合；氟達(dá)拉濱、抗-CD20抗體如利妥昔單抗(利妥昔；IDEC Pharmaceuticals Corp.，加利福尼亞州圣地亞哥)和本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的聯(lián)合；以及氟達(dá)拉濱、靶向CD40L介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的另一種拮抗性抗CD40抗體如CHIR-12.12或CHIR5.9和靶向C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的聯(lián)合。
本文所述拮抗性抗CD40抗體還可用于提供試劑，如可用于(例如)鑒定表達(dá)CD40的細(xì)胞的標(biāo)記抗體。這可能在測定未知樣品的細(xì)胞類型中非常有用?？捎脝慰寺】贵w組鑒定組織的種類和/或器官類型。以相似方式，這些抗CD40抗體可用于篩選組織培養(yǎng)細(xì)胞中的污染(即篩選培養(yǎng)物中是否存在CD40表達(dá)細(xì)胞和非CD40表達(dá)細(xì)胞的混合物)。
藥物制劑和給藥方式本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的給藥濃度可在治療上有效預(yù)防或治療CD40-相關(guān)性疾病，如自身免疫病、超敏、炎癥、產(chǎn)生自身抗體、器官或組織移植排斥、移植物抗宿主病和表達(dá)CD40的癌癥，如B-細(xì)胞淋巴瘤和實(shí)體瘤。為實(shí)現(xiàn)此目的，可用本領(lǐng)域已知的各種可接受的賦形劑配制此抗體。這些抗體一般通過靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射給藥。實(shí)現(xiàn)此種給藥的方法是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的。也可能獲得可局部或口服給藥，或能透過粘膜輸送的組合物。
取決于所施用的抗-CD40抗體，靜脈內(nèi)給藥優(yōu)選通過輸液在約1-10小時(shí)期間進(jìn)行，更優(yōu)選約1-8小時(shí)，甚至更優(yōu)選約2-7小時(shí)、還要優(yōu)選約4-6小時(shí)。該藥物組合物的最初輸液可在約4-6小時(shí)期間進(jìn)行，后續(xù)輸液可較快遞送。后續(xù)輸液可在約1-6小時(shí)期間，例如約1-4小時(shí)、約1-3小時(shí)或約1-2小時(shí)給予。
可將本發(fā)明的藥物組合物配制成與其要采用的給藥途徑相容。可能的給藥途徑的例子包括胃腸外(例如，靜脈內(nèi)(IV)、肌肉內(nèi)(IM)、真皮內(nèi)、皮下(SC)或輸液)、口服和肺部(例如，吸入)、鼻、經(jīng)皮(局部)、經(jīng)粘膜和直腸給藥。用于胃腸外、真皮內(nèi)或皮下應(yīng)用的溶液或混懸液可含有以下組分無菌稀釋劑，例如注射用水、鹽水溶液、不易揮發(fā)的油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗細(xì)菌試劑，例如芐醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如維生素C或亞硫酸氫鈉；螯合劑，例如乙二胺四乙酸；緩沖液，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽和用于調(diào)整張力的試劑，例如氯化鈉和葡萄糖?？捎盟峄驂A，例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH。胃腸外制劑可包裝在玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多劑量小瓶中。
抗-CD40抗體通常用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)以藥學(xué)上可接受的緩沖液提供，例如無菌鹽水、無菌緩沖水、丙二醇、上述物質(zhì)的組合等。納入本文作為參考的《雷明頓藥物科學(xué)》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(第18版；Mack Publishing Company，Eaton，Pennsylvania，1990)描述了制備可胃腸外給予藥物的方法。也參見，例如描述了適用于本發(fā)明方法的穩(wěn)定的抗體藥物制劑的國際公開號WO 98/56418。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員不難確定待給予的至少一種拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的量而無需過多實(shí)驗(yàn)。影響給藥方式和至少一種拮抗性抗-CD40抗體(或其抗原結(jié)合片段)的各自用量的因素包括，但不限于進(jìn)行治療的具體疾病、疾病的嚴(yán)重性、病史、所治療個(gè)體的年齡、身高、體重、重量、健康和身體狀況。類似地，待給予的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的用量取決于給藥方式和對象是接受單劑量還是多劑量的該抗腫瘤藥物。隨著所治療患者體重的增加，一般優(yōu)選較高劑量的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。待給予的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的劑量為約0.003mg/kg-50m/kg、優(yōu)選0.01mg/kg-約40mg/kg。因此，例如劑量可以是0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg或50mg/kg。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法包括給予多劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。該方法可包括給予1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40或更多次治療有效劑量的含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物。多劑量的含抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物的給藥頻率和持續(xù)時(shí)間取決于疾病、疾病階段和進(jìn)行治療的患者的病史。此外，用治療有效量的抗體治療對象包括一次治療，或優(yōu)選可包括一系列治療。在一優(yōu)選的實(shí)施例中，用拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段以約0.1-20mg/kg體重，在約1-10周之間進(jìn)行每周一次的治療，優(yōu)選在約2-8周之間、更優(yōu)選約3-7周之間、甚至更優(yōu)選約4、5或6周。可每年進(jìn)行治療以防復(fù)發(fā)或根據(jù)復(fù)發(fā)的跡象進(jìn)行治療。也要理解用于治療的抗體或其抗原結(jié)合片段的有效劑量在具體治療期間可增加或減少。根據(jù)本文所述診斷試驗(yàn)的結(jié)果決定劑量的變化。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，給藥方案包括在治療期間的第1、7、14和21天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，給藥方案包括在治療期間的每周的第1、2、3、4、5、6和7天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。其它實(shí)施方案包括在治療期間的每周的第1、3、5和7天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的給藥方案；包括在治療期間每周第1和3天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的給藥方案；和在治療期間每周第1天先給予治療有效劑量的至少一種抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的優(yōu)選給藥方案。治療時(shí)期可包括1周、2周、3周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月或1年。治療時(shí)期可連續(xù)或間隔1天、1周、2周、1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月或1年。
在一些實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量是約0.003mg/kg-50mg/kg、約0.01mg/kg-40mg/kg、約0.01mg/kg-30mg/kg、約0.1mg/kg-30mg/kg、約0.5mg/kg-30mg/kg、約1mg/kg-30mg/kg、約3mg/kg-30m/kg、約3mg/kg-25mg/kg、約3mg/kg-20mg/kg、約5mg/kg-15mg/kg或約7mg/kg-12mg/kg。因此，例如，任何一種拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的劑量可以是0.003mg/kg、0.01mg/kg、0.03mg/kg、0.1mg/kg、0.3mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、1.5mg/kg、2mg/kg、2.5mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、7mg/kg、10mg/kg、15 mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、35mg/kg、40mg/kg、45mg/kg、50mg/kg或在約0.003mg/kg-50mg/kg范圍內(nèi)的其它這種劑量。在整個(gè)抗體給藥的每周可給予相同治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。或者，可在治療期間采用不同的治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。
在其它實(shí)施方式中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量可在較低的劑量范圍(即約0.003mg/kg-20mg/kg)內(nèi)，后續(xù)的劑量可在較高的劑量范圍(即約20mg/kg-50mg/kg)內(nèi)。
在其它實(shí)施方案中，本文它處定義的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量可在較高的劑量范圍(即約20mg/kg-50mg/kg)內(nèi)，后續(xù)劑量可在較低的劑量范圍(即約0.003mg/kg-20mg/kg)內(nèi)。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的最初治療有效劑量是約20mg/kg-35mg/kg，包括約20mg/kg、約25mg/kg、約30mg/kg和約35mg/kg，隨后的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量為約5mg/kg-15mg/kg，包括約5mg/kg、8mg/kg、10mg/kg、12mg/kg和約15mg/kg。
在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，拮抗性抗-CD40抗體治療先是給予需要拮抗性抗-CD40抗體治療的對象以“負(fù)荷劑量”的抗體或其抗原結(jié)合片段?！柏?fù)荷劑量”指給予對象的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的初始劑量，其中給予的抗體或其抗原結(jié)合片段的劑量在較高的劑量范圍內(nèi)(即約20mg/kg-50mg/kg)。只要全部的“負(fù)荷劑量”在約24小時(shí)期間給予，該“負(fù)荷劑量”可以一次給藥，例如該抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)靜脈內(nèi)一次輸液；或可以多次給藥，例如該抗體或其抗原結(jié)合片段經(jīng)靜脈內(nèi)多次輸液。給予“負(fù)荷劑量”后，可給予對象一次或多次額外治療有效劑量的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段。隨后可按，例如每周給藥時(shí)間表、或每兩周一次、每三周一次或每四周一次給予治療有效劑量。在這種實(shí)施方案中，后續(xù)的治療有效劑量在較低的劑量范圍內(nèi)(即0.003mg/kg-約20mg/kg)。
或者，在一些實(shí)施方案中，給予“負(fù)荷劑量”后，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段按照“維持時(shí)間表”給予，其中治療有效劑量的抗體或其抗原結(jié)合片段按每月一次、每六周一次、每兩個(gè)月一次、每十周一次、每三個(gè)月一次、每十四周一次、每四個(gè)月一次、每十八周一次、每五個(gè)月一次、每二十二周一次、每六個(gè)月一次、每七個(gè)月一次、每八個(gè)月一次、每九個(gè)月一次、每十個(gè)月一次、每十一個(gè)月一次或每十二個(gè)月一次給藥。在這種實(shí)施方案中，特別是當(dāng)隨后的劑量以更高頻率的間隔給藥，例如每兩個(gè)月一次到每月一次時(shí)，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的治療有效劑量在較低劑量范圍內(nèi)(即0.003mg/kg-約20mg/kg)；或者特別是當(dāng)隨后的劑量以更低頻率的間隔給藥，例如約間隔一個(gè)月到約十二個(gè)月時(shí)，治療有效劑量在較高劑量范圍內(nèi)(即約20mg/kg-50mg/kg)。
用于本發(fā)明方法的本文所述藥物組合物中的拮抗性抗-CD40抗體可以是天然的或通過重組技術(shù)獲得，可以是任何來源的，包括哺乳動(dòng)物來源，例如小鼠、大鼠、家兔、靈長類、豬和人。這種多肽優(yōu)選得自人來源，更優(yōu)選得自雜交瘤細(xì)胞系的重組人蛋白。
本發(fā)明方法所用的藥物組合物包含本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體的生物活性變體。這種變體應(yīng)該保留參比拮抗性抗CD40抗體的生物活性，從而使得當(dāng)將包含變體多肽的藥物組合物給予對象時(shí)具有與包含參比拮抗性抗CD40抗體的藥物組合物相同的治療作用。即，該變體抗-CD40抗體可以類似于參比拮抗性抗CD40抗體觀察到的作用方式作為藥物組合物中的治療活性組分。本領(lǐng)域已建立了可用于確定變體抗-CD40抗體是否保留了所需生物活性從而可用作藥物組合物中的治療活性組分的方法?？刹捎脼闄z測參比拮抗性抗CD40抗體活性而特別設(shè)計(jì)的試驗(yàn)，包括本發(fā)明所述的試驗(yàn)來測定抗體變體的生物活性。
任何含有本文所述結(jié)合特性的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段作為活性組分的藥物組合物可用于本發(fā)明的方法。因此，包含一種或多種本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的液體、凍干或噴霧干燥的組合物可根據(jù)本發(fā)明的方法制備用作隨后給予對象的水性或非水性溶液或混懸液。這些組合物中的每種包含至少一種本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段作為治療或預(yù)防活性組分?！爸委熁蝾A(yù)防活性組分”指特別引入該組合物中的抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段，當(dāng)將該藥物組合物給予對象時(shí)，可產(chǎn)生治療、預(yù)防或診斷對象疾病或病癥的所需治療性或預(yù)防性應(yīng)答。該藥物組合物優(yōu)選包含合適的穩(wěn)定劑、填充劑，或同時(shí)包含二者以最大程度降低制備和儲(chǔ)存期間與蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和生物活性喪失相關(guān)的問題。
可在包含本發(fā)明的拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物組合物中加入一些制劑(formulant)。這些制劑包括，但不限于油、聚合物、維生素、碳水化合物、氨基酸、鹽、緩沖劑、白蛋白、表面活性劑或填充劑。碳水化合物優(yōu)選包括糖或糖醇，例如單糖、二糖或多糖或水溶性葡聚糖。糖或葡聚糖可包括果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麥芽糖、蔗糖、葡聚糖、支鏈淀粉、糊精、α和β環(huán)糊精、可溶性淀粉、羥乙基淀粉和羧甲基纖維素或它們的混合物?！疤谴肌倍x為具有羥基的C4-C8烴，包括半乳糖醇、肌醇、甘露醇、木糖醇、山梨醇、甘油和阿拉伯糖醇。這些糖或糖醇可單獨(dú)或組合使用。糖或糖醇的濃度在1.0％和7％w/v之間，更優(yōu)選在2.0％和6.0％w/v之間。優(yōu)選的氨基酸包括左旋(L)形式的肉毒堿、精氨酸和甜菜堿；然而，也可加入其它氨基酸。優(yōu)選的聚合物包括平均分子量為2,000和3,000之間的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)或平均分子量為3,000和5,000之間的聚乙二醇(PEG)?？杉尤朐撝苿┑谋砻婊钚詣┮姎W洲專利號270,799和268,110。
此外，例如可通過與聚合物共價(jià)偶聯(lián)來化學(xué)修飾抗體以增加它們的循環(huán)半衰期。優(yōu)選的聚合物和連接肽的方法見全文納入本文作為參考的美國專利號4,766,106；4,179,337；4,495,285和4,609,546。優(yōu)選的聚合物是聚氧乙基化多元醇和聚乙二醇(PEG)。PEG在室溫可溶于水并如通式R(O--CH2--CH2)nO--R所示，其中R可以是氫或保護(hù)性基團(tuán)，如烷基或烷醇基團(tuán)。保護(hù)性基團(tuán)優(yōu)選具有1-8個(gè)碳原子，更優(yōu)選是甲基。符號n是優(yōu)選1-1,000之間，更優(yōu)選2-500之間的正整數(shù)。PEG優(yōu)選具有平均分子量1,000-40,000、更優(yōu)選2,000-20,000、最優(yōu)選3,000-12,000。PEG優(yōu)選具有至少一個(gè)羥基、更優(yōu)選是末端羥基。優(yōu)選激活該羥基以和抑制劑上的游離氨基反應(yīng)。然而，應(yīng)理解可改變反應(yīng)基團(tuán)的類型和數(shù)量以獲得共價(jià)偶聯(lián)的PEG/本發(fā)明的抗體。
水溶性聚氧乙基化多元醇也可用于本發(fā)明。它們包括聚氧乙基化山梨醇、聚氧乙基化葡萄糖、聚氧乙基化甘油(POG)。優(yōu)選POG。原因之一是聚氧乙基化甘油的骨架與例如動(dòng)物和人的單、二、甘油三酯中天然存在的骨架相同。因此，該分支在體內(nèi)不會(huì)被視作外來物質(zhì)。POG的優(yōu)選分子量與PEG的相同。POG的結(jié)構(gòu)見Knauf等，(1988)，J.Bio.Chem.26315064-15070，美國專利號4,766,106描述了POG/IL-2偶聯(lián)物，兩篇文獻(xiàn)均全文納入本文作為參考。
另一種增加循環(huán)半衰期的藥物遞送系統(tǒng)是脂質(zhì)體。制備脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的方法見Gabizon等，(1982)，Cancer Research 424734；Cafiso(1981)，Biochem Biophys Acta649129和Szoka(1980)，Ann.Rev.Bioplays.Eng.9467所述。本領(lǐng)域已知的其它藥物遞送系統(tǒng)描述見，例如Poznansky等，(1980)，《藥物遞送系統(tǒng)》(Drug DeliverySystems)，(R.L.Juliano編，Oxford，紐約)，第253頁；Poznansky，(1984)，Pharm Revs36277。
引入藥物組合物中的制劑應(yīng)使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段穩(wěn)定。即，拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段應(yīng)保留其物理和/或化學(xué)穩(wěn)定性并具有所需生物活性，即，一種或多種本文以上定義的拮抗活性，包括但不限于抑制T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞分泌免疫球蛋白；抑制Jurkat T細(xì)胞刺激的正常人外周B細(xì)胞存活和/或增殖；抑制C4BP表達(dá)細(xì)胞或可溶性C4BP刺激的正常人外周B細(xì)胞存活和/或增殖；抑制可溶性C4BP或固相C4BP刺激的任何細(xì)胞中“存活性”抗-凋亡胞內(nèi)信號；抑制結(jié)合可溶性C4BP或固相C4BP后任何細(xì)胞中的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)；和抑制本文它處所述人惡性B細(xì)胞的增殖。
監(jiān)測蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法是本領(lǐng)域熟知的。參見，例如Jones，(1993)Adv.DrugDelivery Rev.1029-90；Lee編，(1991)，《肽和蛋白質(zhì)藥物遞送》(Peptide and ProteinDrug Delivery)，(Marcel Dekker，Inc.，紐約，紐約)。通常在所選擇的溫度下，測定蛋白質(zhì)在一段特定時(shí)期內(nèi)的穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)在室溫(約25℃)儲(chǔ)存至少1個(gè)月、至少3個(gè)月、或至少6個(gè)月，和/或在約2-8℃儲(chǔ)存至少6個(gè)月、至少9個(gè)月、至少12個(gè)月、至少18個(gè)月、至少24個(gè)月時(shí)，穩(wěn)定的抗體藥物制劑將使得拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段穩(wěn)定。
當(dāng)將某種蛋白質(zhì)，例如抗體配制入藥物組合物時(shí)，如果在該藥物組合物中未出現(xiàn)沉淀、凝聚和/或變性的可見跡象(即，變色或澄清度喪失)或可測跡象(例如，采用體積排阻層析(SEC)或紫外光散射法)時(shí)，則可認(rèn)為該蛋白質(zhì)在給定時(shí)間點(diǎn)保留了其物理穩(wěn)定性。就化學(xué)穩(wěn)定性而言，當(dāng)將某種蛋白質(zhì)，例如抗體配制入藥物組合物時(shí)，如果化學(xué)穩(wěn)定性的測定顯示該蛋白質(zhì)(即，抗體)在該藥物組合物中保留了其感興趣的生物活性，則可認(rèn)為該蛋白質(zhì)保留了其化學(xué)穩(wěn)定性。測定化學(xué)穩(wěn)定性變化的方法是本領(lǐng)域熟知的，包括但不限于用例如SDS-PAGE、SEC和/或襯質(zhì)輔助激光解析與電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜檢測因剪切所致蛋白質(zhì)的化學(xué)改變形式的方法；和用例如離子交換色譜檢測與分子荷電改變相關(guān)(例如，與脫氨基相關(guān))的降解的方法。參見例如，以全文納入本文作參考的2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916))，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use)所述的方法。
當(dāng)將拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段配制入藥物組合物時(shí)，如果在給定時(shí)間的所需生物活性處于該藥物組合物制備之時(shí)用所需生物活性的合適試驗(yàn)檢測到的所需生物活性的約30％以內(nèi)，優(yōu)選約20％以內(nèi)，則可認(rèn)為所述拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在該時(shí)間點(diǎn)保留了所需生物活性。檢測拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的所需生物活性的試驗(yàn)可如本文的實(shí)施例所述進(jìn)行。也參見納入本文作為參考的以下文獻(xiàn)所述的試驗(yàn)Schutze等，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci. USA928200-8204；Denton等，(1998)，Pediatr Transplant.26-15；Evans等，(2000)，J.Immunol.164688-697；Noelle，(1998)，Agents Actions Suppl.4917-22；Lederman等，(1996)，Curr Opin.Hematol.377-86；Coligan等，(1991)，Current Protocols in Immunology 1312；Kwekkeboom等，(1993)Immunology79439-444；和美國專利號5,674,492和5,847,082。
當(dāng)將拮抗性抗CD40抗體配制成液體制劑時(shí)，優(yōu)選凍干液態(tài)藥物組合物，以防止降解和保持無菌。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知凍干液體組合物的方法。臨用前，可用可包括其它成分的無菌稀釋劑(如林格氏溶液、蒸餾水或無菌鹽水)重建該組合物。重建后，優(yōu)選用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將該組合物給予對象。
拮抗性抗-CD40抗體在生產(chǎn)藥物中的應(yīng)用本發(fā)明也提供能阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療癌癥患者的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞，其中所述藥物與至少一種其它癌癥療法合作起作用。在一些實(shí)施方式中，該癌癥的特征是致瘤性B細(xì)胞生長。這種癌癥包括，但不限于上文所述的B細(xì)胞相關(guān)癌癥，例如非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、高級B細(xì)胞淋巴瘤、中級B細(xì)胞淋巴瘤、低級B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞白血病、霍奇金病、漿細(xì)胞瘤、濾泡淋巴瘤、濾泡小粘著性淋巴瘤、濾泡大細(xì)胞淋巴瘤、濾泡混合小粘著性淋巴瘤、彌散性小粘著性細(xì)胞淋巴瘤、彌散性小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、前淋巴細(xì)胞性白血病(PLL)、漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞淋巴瘤、邊緣層淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、單核細(xì)胞樣B細(xì)胞性淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛細(xì)胞性白血病、彌散性大細(xì)胞淋巴瘤、縱隔大B細(xì)胞型淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、血管內(nèi)淋巴瘤病、彌散性混合細(xì)胞性淋巴瘤、彌散性大細(xì)胞淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS-相關(guān)淋巴瘤和外套細(xì)胞淋巴瘤。在其它實(shí)施方式中，該癌癥是實(shí)體瘤。包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤的例子包括但不限于卵巢癌、肺癌(如鱗狀細(xì)胞癌、腺癌和大細(xì)胞癌類型的非小細(xì)胞肺癌，以及小細(xì)胞肺癌)、乳腺癌、結(jié)腸癌、腎癌(包括例如腎細(xì)胞癌)、肝癌(包括例如肝細(xì)胞癌)、胃癌、宮頸癌、前列腺癌、鼻咽癌、甲狀腺癌(如甲狀腺乳頭狀癌)和皮膚癌如黑色素瘤、以及肉瘤(包括例如骨肉瘤和尤因肉瘤)。
提到需要治療癌癥的患者時(shí)，“合作”指含有拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物在用至少一種其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。用于B細(xì)胞相關(guān)性癌癥患者的其它癌癥療法的例子如本文上述的包括但不限于手術(shù)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱、瘤可寧、長春新堿、噴司他丁、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環(huán)磷酰胺、阿霉素、潑尼松和它們的組合，例如含有蒽環(huán)類的方案，如CAP(環(huán)磷酰胺、阿霉素加潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、潑尼松加阿霉素)、VAD(長春新堿、阿霉素加地塞米松)、MP(美法侖加潑尼松)，和用于化療的其它細(xì)胞毒性和/或治療性藥物，如米托蒽醌、道諾紅菌素、依達(dá)比星、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱；其它抗癌癥單克隆抗體療法(如阿來組單抗(Campath)或靶向惡性B細(xì)胞上CD52細(xì)胞表面糖蛋白的其它抗-CD52抗體；利妥昔單抗(利妥昔)、完全人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗(Zevalin)或靶向惡性B細(xì)胞上CD20抗原的任何其它治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(如雙特異性抗體MT103)；抗-CD22抗體(如人源化單克隆抗體埃坡組單抗(epratuzumab))；貝伐單抗(bevacizumab)(阿瓦斯汀)或其它靶向人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的抗癌抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD22抗原的抗-CD22抗體(例如，單克隆抗體BL-22，αCD22毒素)；靶向巨噬細(xì)胞集落刺激因子的α-M-CSF抗體；靶向多發(fā)性骨髓瘤中過度表達(dá)的核因子-κB(RANK)及其配體(RANKL)的受體激活劑的抗體；靶向惡性B細(xì)胞上CD23抗原的抗-CD23抗體(例如，IDEC-152)；靶向惡性B細(xì)胞上CD38抗原的抗-CD38抗體；靶向表達(dá)于惡性B細(xì)胞上主要組織相容性復(fù)合體II類受體的抗體(抗-MHC抗體)；其它靶向惡性B細(xì)胞上CD40抗原的抗-CD40抗體(如SGN-40；和阻斷CD40表達(dá)細(xì)胞上CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗-CD40抗體如CHIR-12.12和CHIR-5.9，及其抗原結(jié)合片段，如2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916)，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use))所述；和靶向表達(dá)于許多實(shí)體腫瘤和造血來源的腫瘤上腫瘤壞死因子相關(guān)促凋亡配體受體1(TRAIL-R1)的抗體(例如，激動(dòng)性人單克隆抗體HGS-ETR1))；基于小分子的癌癥療法，所述小分子包括但不限于微管和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如，有絲分裂抑制劑多拉斯他汀和其類似物；微管蛋白結(jié)合藥物T900607；XL119；和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)、SDX-105(鹽酸苯達(dá)莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素(epothilone)類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑，例如米哚妥林((PKC-412、CGP41251、N-苯甲酰基十字孢堿)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomide(沙立度胺)、沙立度胺的免疫調(diào)節(jié)衍生物(例如，revlimid(曾用名revimid))、AffinitakTM(蛋白質(zhì)激酶C-α的反義抑制劑)、SDX-101(誘導(dǎo)惡性淋巴細(xì)胞凋亡的R-依托度酸)、第二代嘌呤核苷類似物，如氯法拉濱、癌細(xì)胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)Bc1-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense)、蛋白酶體抑制劑(例如，VelcadeTM(硼替佐米))、小分子激酶抑制劑(例如，CHIR-258)、小分子VEGF抑制劑(例如，ZD-6474)、熱激蛋白(HSP)90的小分子抑制劑(例如，17-AAG)、組蛋白脫乙酰酶的小分子抑制劑(例如，雜交/極性細(xì)胞分化HPC)藥物，如N-辛二酰苯異羥肟酸(SAHA)、和FR-901228)和凋亡藥物，如Trisenox(三氧化砷)和Xcytrin(莫特沙芬釓)；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于疫苗方法(如Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個(gè)性化的免疫療法或活性獨(dú)特型免疫療法(例如，MyVax個(gè)性化免疫療法，以前命名為GTOP-99)、Promune(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動(dòng)劑)、干擾素-α療法、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法；類固醇療法；或其它癌癥療法；其中用其它癌癥療法治療可在用上述包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療對象之前、期間或之后給予。
用于包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤的癌癥患者的其它癌癥治療的例子包括但不限于手術(shù)；放療；化療，其中合適的化療藥包括但不限于氟達(dá)拉濱或磷酸氟達(dá)拉濱、瘤可寧、長春新堿、戊糖苷、2-氯脫氧腺苷(cladribine)、環(huán)磷酰胺、多柔比星、氯潑尼松和其組合，例如含有蒽環(huán)類的方案如CAP(環(huán)磷酰胺、多柔比星加氯潑尼松)、CHOP(環(huán)磷酰胺、長春新堿、氯潑尼松加多柔比星)、VAD(長春新堿、多柔比星加地塞米松)、MP(美法侖家氯潑尼松)，以及用于化療的其它細(xì)胞毒劑和/或治療劑，如米托蒽醌、道諾霉素、黃膽素、天冬酰胺酶和抗代謝物，包括但不限于阿糖胞苷、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、達(dá)卡巴嗪、6-硫鳥嘌呤、6-巰基嘌呤和奈拉濱；細(xì)胞因子療法，包括但不限于α-干擾素治療，γ-干擾素治療，采用白介素-2(IL-2)、IL-12、IL-15和IL-21的治療，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)，或這些細(xì)胞因子的生物活性變體；或考慮用于治療感興趣實(shí)體瘤的其它單克隆抗體，如靶向Her2+乳腺癌細(xì)胞上的Her2受體蛋白的賀賽汀(Genentech，Inc.，加利福尼亞州舊金山)；結(jié)合于并抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的能夠用于治療結(jié)腸癌的人源化單克隆抗體阿瓦斯汀TM(也稱為貝伐單抗；Genentech，Inc.，加利福尼亞州舊金山)；靶向表皮生長因子受體的抗EGFR抗體(如IMC-C225(ImClone Systems，紐約州紐約)；靶向IGF-1受體蛋白的抗IGF-1受體抗體；靶向腫瘤相關(guān)抗原MUC1的抗MUC1抗體；靶向相應(yīng)整聯(lián)蛋白的抗α5β1、抗αvβ5和抗αvβ3，整聯(lián)蛋白能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附以及參與細(xì)胞增殖和存活的信號通路；靶向此鈣粘著蛋白家族成員的抗-P-鈣粘著蛋白抗體(參見例如，共待審的美國專利申請公開號20030194406)；靶向此內(nèi)皮細(xì)胞-特異性粘著分子的血管新生相關(guān)功能的抗-VE-鈣粘著蛋白抗體；和能阻斷表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞上CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體如CHIR-12.12和CHIR-5.9及其抗原結(jié)合片段，如2004年11月4日提交的國際專利申請?zhí)朠CT/US2004/037152(代理案卷號PP20107.004(035784/282916))，題目也是“拮抗性抗CD40單克隆抗體和其使用方法”(Antagonist Anti-CD40 Monoclonal Antibodies and Methods For Their Use)所述；當(dāng)采用其它癌癥治療時(shí)，在使用包含拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療患者之前、期間或之后進(jìn)行治療，如上所述。
因此，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細(xì)胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與至少一種其它癌癥療法合作起作用，其它癌癥療法選自化療、抗癌抗體治療、基于小分子的癌癥治療和基于疫苗/免疫治療的癌癥治療，其中，所述藥物在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。
因此，例如，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細(xì)胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與化療合作起作用，化療藥選自環(huán)磷酰胺、多柔比星、長春新堿、氯潑尼松和其組合，如CHOP。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細(xì)胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與至少一種其它抗癌抗體合作起作用，其它抗癌抗體選自阿來組單抗(Campath)或靶向惡性B細(xì)胞上CD52細(xì)胞表面糖蛋白的其它抗-CD52抗體；利妥昔單抗(利妥昔)、完全人抗體HuMax-CD20、R-1594、IMMU-106、TRU-015、AME-133、托西莫單抗/I-131托西莫單抗(Bexxar)、替伊莫單抗tiuxetan(Zevalin)或靶向惡性B細(xì)胞上CD20抗原的任何其它治療性抗-CD20抗體；抗-CD19抗體(如雙特異性抗體MT103)；抗-CD22抗體(如人源化單克隆抗體埃坡組單抗(epratuzumab))；貝伐單抗(阿瓦斯汀)或靶向人血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子的其它抗癌抗體；完全人單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9或阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體；以及它們的任何組合；其中，所述藥物在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細(xì)胞淋巴瘤(如非霍奇金淋巴瘤)的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與至少一種基于小分子的其它癌癥治療合作起作用，基于小分子的其它癌癥治療選自微管和/或拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑(例如有絲分裂抑制劑多拉斯他汀和其類似物；微管結(jié)合劑T900607；XL119和拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑氨基喜樹堿)，SDX-105(鹽酸苯達(dá)莫司汀)、ixabepilone(埃坡霉素類似物，也稱為BMS-247550)、蛋白激酶C抑制劑如米哚妥林(PKC-412、CGP41251、N-苯甲?；宙邏A)、pixantrone、奧沙利鉑(一種抗腫瘤藥物)、硝酸鎵(硝酸鎵)、Thalomid(沙立度胺)、凋亡劑如Xcytrin(莫特沙芬釓)、癌細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白Bc1-2的抑制劑(例如，反義藥物奧利默森和Genasense)、奈拉濱及其任何組合；其中，所述藥物在用其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細(xì)胞性淋巴瘤，例如非霍奇金淋巴瘤的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與用至少一種選自以下的基于疫苗/免疫治療的癌癥療法的治療合作起作用疫苗方法(例如，Id-KLH、oncophage、vitalethine)、個(gè)性化的免疫療法或活性獨(dú)特型免疫療法(例如，MyVax個(gè)性化免疫療法，以前命名為GTOP-99)、Promune(CpG 7909，一種toll-樣受體9(TLR9)的合成激動(dòng)劑)、白介素-2(IL-2)療法、IL-12療法、IL-15療法和IL-21療法，和它們的任何組合；所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。
在一些實(shí)施方式中，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的B細(xì)胞相關(guān)白血病，例如急性B細(xì)胞型淋巴細(xì)胞性白血病(B-ALL)的藥物中的應(yīng)用，所述藥物與至少一種選自化療和抗代謝物療法的其它癌癥療法的治療合作起作用，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。這種實(shí)施方案的例子包括，但不限于包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物與選自以下的化療藥物或抗代謝物的治療合作起作用環(huán)磷酰胺、阿霉素、長春新堿、潑尼松、阿糖胞苷、米托蒽醌、依達(dá)比星、天冬酰胺酶、氨甲喋呤、6-硫代鳥嘌呤、6-巰基嘌呤，和它們的組合；所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用，或者在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法治療對象之前、期間或之后使用。在一個(gè)這樣的實(shí)施方案中，所述藥物與阿糖胞苷加道諾紅菌素、阿糖胞苷加米托蒽醌和/或阿糖胞苷加依達(dá)比星的治療合作起作用；所述藥物在其它癌癥療法治療B-ALL對象之前、期間或之后使用，或者，在多重組合療法中，所述藥物在其它癌癥療法之前、期間或之后使用。
在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療實(shí)體瘤患者的藥物中的應(yīng)用，所述實(shí)體瘤包含表達(dá)CD40抗原的腫瘤細(xì)胞，其中所述藥物與化療合作起作用，化療藥選自可用于(例如)治療結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌的CPT-11(伊立替康)；可用于(例如)治療肺癌、乳腺癌和上皮性卵巢癌的吉西他濱；以及適合用于治療實(shí)體瘤的其它化療藥；在用包含拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療患者之前、期間或之后用其它癌癥療法治療，如上所述。
在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療實(shí)體瘤患者的藥物中的應(yīng)用，所述實(shí)體瘤包含表達(dá)CD40抗原的腫瘤細(xì)胞，其中所述藥物與至少一種其它抗癌抗體的治療合作起作用，所述其它抗癌抗體選自靶向Her2+乳腺癌細(xì)胞上的Her2受體蛋白的賀賽汀(Genentech，Inc.，加利福尼亞州舊金山)；結(jié)合于并抑制血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的能夠用于治療結(jié)腸癌的人源化單克隆抗體阿瓦斯汀TM(也稱為貝伐單抗；Genentech，Inc.，加利福尼亞州舊金山)；靶向表皮生長因子受體的抗EGFR抗體(如IMC-C225(LnClone Systems，紐約州紐約)；靶向IGF-1受體蛋白的抗IGF-1受體抗體；靶向腫瘤相關(guān)抗原MUC1的抗MUC1抗體；靶向相應(yīng)整聯(lián)蛋白的抗α5β1、抗αvβ5和抗αvβ3，整聯(lián)蛋白能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附以及參與細(xì)胞增殖和存活的信號通路；靶向此鈣粘著蛋白家族成員的抗-P-鈣粘著蛋白抗體(參見例如，待批美國專利申請公開號20030194406)；靶向此內(nèi)皮細(xì)胞-特異性粘著分子的血管新生相關(guān)功能的抗-VE-鈣粘著蛋白抗體；和完全人單克隆抗體CHIR-12.12或CHIR-5.9，或能阻斷CD40L-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的其它拮抗性抗CD40抗體；在用包含拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療患者之前、期間或之后用其它癌癥療法治療，如上所述。
本發(fā)明也提供本發(fā)明拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的癌癥的藥物中的應(yīng)用，所述癌癥包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞，如特征為致瘤性B細(xì)胞增殖的癌癥，包括本文上述的B細(xì)胞相關(guān)癌癥或?qū)嶓w瘤，所述藥物可用于已預(yù)先采用至少一種其它癌癥療法治療過的對象?！邦A(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前，對象已接受一種或多種其它癌癥療法(即，已用至少一種其它癌癥療法治療過)?！邦A(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療開始前的以下時(shí)間內(nèi)曾采用至少一種其它癌癥療法治療過的對象2年、18個(gè)月、1年、6個(gè)月、2個(gè)月、6周、1個(gè)月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。對象無需對先前一種或多種癌癥療法產(chǎn)生反應(yīng)。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物的對象可以對先前癌癥療法或一種或多種先前癌癥療法(當(dāng)預(yù)先治療由多種療法組成時(shí))的預(yù)先治療已產(chǎn)生反應(yīng)或未產(chǎn)生反應(yīng)。對象在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前可接受的其它癌癥療法的例子包括，但不限于手術(shù)；放療；化療，任選與自體骨髓移植組合，其中合適的化療藥物包括，但不限于上文所列的藥物；其它抗癌癥單克隆抗體療法，包括但不限于上文所列的抗癌癥抗體；基于小分子的癌癥療法，包括但不限于上文所列的小分子；基于疫苗/免疫治療的癌癥療法，包括但不限于上文所列的；類固醇療法；其它癌癥療法；或它們的任何組合。
本文將合作使用本文所述的藥物與一種或多種其它癌癥療法的“治療”定義為將所述藥物或其它癌癥療法應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⑺鏊幬锘蚱渌┌Y療法應(yīng)用于或給予患者的分離的組織或細(xì)胞系，所述患者患有包含表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞的癌癥，如特征為致瘤性B細(xì)胞增殖的癌癥或?qū)嶓w瘤，具有這種癌癥相關(guān)的癥狀，或患這種癌癥的易感性，給藥的目的是為治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響癌癥、癌癥相關(guān)癥狀、或發(fā)生癌癥的易感性。
本發(fā)明也提供了阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的自身免疫病和/或炎性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與至少一種其它治療合作起作用。提到需要治療自身免疫病和/或炎性疾病的患者時(shí)，“合作”指在用至少一種其它療法治療之前、期間或之后使用所述藥物。用于自身免疫病和/或炎性疾病的其它療法的例子包括但不限于上述療法，即外科或手術(shù)方法(如脾切除術(shù)，淋巴結(jié)切除術(shù)，甲狀腺切除術(shù)，血漿去除術(shù)，白細(xì)胞去除術(shù)，細(xì)胞、組織或器官移植，器官灌注，腸操作等)、放療、諸如類固醇治療和非類固醇治療等治療、激素治療、細(xì)胞因子治療、用皮膚病藥物(例如用于治療皮膚病如過敏、接觸性皮炎和牛皮癬的局部藥劑)治療、免疫抑制療法和其它抗炎性單克隆抗體治療等，其中在用包含拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療患者之前、期間或之后用其它療法治療，如上所述。在一個(gè)這種實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的自身免疫病和/或炎性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物與至少一種其它治療合作起作用，如上所述。
在一些實(shí)施方式中，包含本發(fā)明拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物與兩種其它治療合作起作用。當(dāng)包含拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物與兩種其它治療合作起作用時(shí)，可在用這兩種治療之一或二者治療患者之前、期間或之后使用所述藥物。
本發(fā)明也提供了阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗性抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段在生產(chǎn)治療對象的自身免疫病和/或炎性疾病的藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物用于用至少一種其它療法預(yù)先治療過的對象?！邦A(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”指在接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物之前，已用一種或多種其它療法治療對象。“預(yù)先治療過”或“預(yù)先治療”包括在用包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物治療開始前的以下時(shí)間內(nèi)曾采用其它療法治療過的對象2年、18個(gè)月、1年、6個(gè)月、2個(gè)月、6周、1個(gè)月、4周、3周、2周、1周、6天、5天、4天、3天、2天或甚至1天。對象無需對先前療法的預(yù)治療產(chǎn)生反應(yīng)。因此，接受包含拮抗性抗-CD40抗體或其抗原結(jié)合片段的藥物的對象可以對先前療法的預(yù)治療或一種或多種先前療法(當(dāng)預(yù)先治療由多種療法組成時(shí))的預(yù)治療產(chǎn)生反應(yīng)或不產(chǎn)生反應(yīng)。
本文將合作使用本文所述的藥物與一種或多種用于自身免疫病和/或炎性疾病的其它療法的“治療”定義為將所述藥物或其它癌癥療法應(yīng)用于或給予患者，或?qū)⑺鏊幬锘蚱渌┌Y療法應(yīng)用于或給予來自患者的分離的組織或細(xì)胞系，所述患者患有自身免疫病和/或炎性疾病、與自身免疫病和/或炎性疾病相關(guān)的癥狀或發(fā)生自身免疫病和/或炎性疾病的易感性，目的是治愈、治療、緩解、減輕、改變、補(bǔ)救、改善、提高或影響自身免疫病和/或炎性疾病、自身免疫病和/或炎性疾病的相關(guān)癥狀或發(fā)生自身免疫病和/或炎性疾病的易感性。
提供以下實(shí)施例是為了說明，而非限制。
實(shí)驗(yàn)以下方案可用于下述實(shí)施例。
用于定量免疫球蛋白的ELISA試驗(yàn)用ELISA估計(jì)人IgM和IgG的濃度。用0.05M碳酸鹽緩沖液(pH9.6)配制的2μg/ml山羊抗-人IgG Mab(The Jackson Laboratory，Bar Harbor，Maine)或2μg/ml山羊抗-人IgM mAb4102(Bio Source International，California)包被96-孔ELISA板，4℃孵育16小時(shí)。用PBS-0.05％吐溫-20(PBS-吐溫)洗滌板三次并用BSA飽和1小時(shí)。洗滌兩次后，將板與測試樣品的不同稀釋液一起于37℃孵育2小時(shí)。洗滌三次后，與1μg/ml過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗-人IgG mAb或山羊抗-人IgM mAb37℃孵育2小時(shí)檢測結(jié)合的Ig。洗滌板四次，加入鄰-苯二胺作為底物顯示結(jié)合的過氧化物酶活性。使用人IgG或IgM標(biāo)準(zhǔn)品(Caltaq，Burlingame，Califomia)建立每個(gè)試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
分離人外周血的外周血單核細(xì)胞(PBMC)在3只50ml的聚苯乙烯試管中各加入20ml Ficoll-Paque溶液(內(nèi)毒素低；Pharmacia)，30分鐘后加入血液。使Ficoll-Paque溶液加溫至室溫。制備3L1∶10稀釋的漂白液(bleach)，用于洗滌接觸血液的所有試管和移液管。血液以1.5ml血/1mlFicoll-Paque疊加在Ficoll-Paque溶液上部不再攪動(dòng)Ficoll層。關(guān)閉離心機(jī)上的制動(dòng)，在室溫下1700rpm離心試管30分鐘。盡可能多地吸取上層(血漿)，使真空度盡可能低以避免取出溶液的第二層。用無菌巴斯德移液管收集含有B和T淋巴細(xì)胞的第二層，并置于兩個(gè)50ml聚苯乙烯試管中。收集液以3倍體積的無添加物的冷RPMI稀釋，1000RPM離心試管10分鐘。吸棄培養(yǎng)液，將兩個(gè)50ml試管的細(xì)胞重懸于總體積10ml的冷RPMI(有添加物)中并轉(zhuǎn)移至15ml試管。用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)細(xì)胞，然后1000RPM離心10分鐘。除去培養(yǎng)液，細(xì)胞重懸于4ml RPMI中。該組分含有PBMC。
從PBMC中分離B細(xì)胞將100μl Dyna珠(抗-CD19)置于5-ml塑料試管中。向珠中加入3ml無菌PBS、混合、置于磁力支架上，然后靜置2分鐘。用巴斯德移液管吸棄溶液。加入3ml無菌PBS、混合、置于磁力支架上，然后靜置2分鐘。用無菌PBS再重復(fù)該過程一次，共洗滌三次。將PMBC加入珠中，攪拌下在40℃孵育30分鐘。含有PBMC和珠的試管置于磁力支架上2分鐘，然后將溶液移至磁力支架上的新的5ml試管內(nèi)。2分鐘后，將溶液移至新的15ml試管。再重復(fù)該步驟4次，將前4次的溶液收集在15ml試管中，然后1000RPM離心5分鐘。該步驟產(chǎn)生了T細(xì)胞分離的沉淀。
加入100μl RPMI(有添加物)以收集珠，將溶液移入0.7ml試管內(nèi)。在室溫向懸液中加入10ul Dynal Detacha珠，旋狀45分鐘。將懸液移入新的5ml試管中并加入3ml RPMI(有添加物)。試管置于磁力支架上2分鐘。將溶液移入支架上的新的5ml試管中，2分鐘，然后移入15ml試管中。再重復(fù)前一步驟3次，溶液收集于15ml試管中。1000RPM離心15ml試管10分鐘，細(xì)胞重懸于10ml RPMI中。再重復(fù)洗滌步驟兩次，共洗滌3次。在最后離心之前計(jì)數(shù)細(xì)胞。該步驟完成了B細(xì)胞的純化。細(xì)胞保存于90％FCS和10％DMSO中并于-80℃冷凍。
流式細(xì)胞術(shù)試驗(yàn)將Ramos細(xì)胞(106個(gè)細(xì)胞/樣品)于4℃用100μl一抗(以PBS-BSA配制為10μg/ml)孵育20分鐘。用PBS-BSA或HBSS-BSA洗滌3次后，細(xì)胞在4℃用100μl FITC-標(biāo)記的山羊抗-(人IgG)抗體(Caltaq)的F(ab′)2片段孵育20分鐘。用PBS-BSA洗滌3次和用PBS洗滌1次后，細(xì)胞重懸于0.5-ml PBS中。用FACSCAN V (BectonDickinson，San Jose，California)進(jìn)行分析。
產(chǎn)生雜交瘤克隆如先前de Boer等，(1988)J.Immunol.Meth.113143所述，采用50％聚乙二醇將取自免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0或P3×63Ag8.653鼠雜交瘤細(xì)胞以10∶1的比例融合。將融合的細(xì)胞重懸于補(bǔ)加了次黃嘌呤(0.1mM)、氨基喋呤(0.01mM)、胸苷(0.016mM)和0.5ng/ml hIL-6(Genzyme，Cambridge，Massachusetts)的完全I(xiàn)MDM培養(yǎng)基中。然后將融合的細(xì)胞分置于96-孔組織培養(yǎng)板的各孔之間，使平均每孔含有1個(gè)生長的雜交瘤。
10-14天后，篩選雜交瘤細(xì)胞群上清液中產(chǎn)生的特異性抗體。為篩選雜交瘤克隆產(chǎn)生的特異性抗體，合并每孔的上清液并先用ELISA檢測抗-CD40活性特異性。然后將陽性(雜交瘤細(xì)胞)用于以上FACS試驗(yàn)所述EBV-轉(zhuǎn)化B細(xì)胞的熒光細(xì)胞染色。通過在含有0.5ng/ml hIL-6的IMDM/FBS中有限稀釋克隆陽性雜交瘤細(xì)胞兩次。
實(shí)施例1產(chǎn)生抗CD40抗體利用攜帶人IgG1或IgG2重鏈基因座和人κ鏈基因座的轉(zhuǎn)基因小鼠(Abgenixγ-1XenoMouse)產(chǎn)生抗CD40抗體。表達(dá)CD40胞外結(jié)構(gòu)域的SF9昆蟲細(xì)胞用作免疫原。融合小鼠脾(細(xì)胞)與小鼠骨髓瘤SP2/0細(xì)胞，以產(chǎn)生能在ELISA中識別重組CD40的抗體。平均約10％Abgenix XenoMouse產(chǎn)生的雜交瘤可能含有小鼠λ輕鏈，而非人κ鏈。選出含有小鼠λ輕鏈的抗體。選出也能結(jié)合細(xì)胞表面CD40的抗體亞組，進(jìn)行進(jìn)一步分析。在結(jié)合和功能試驗(yàn)中進(jìn)一步鑒定用一系列亞克隆方法選出的穩(wěn)定雜交瘤。進(jìn)一步鑒定出，來自其它雜交瘤的克隆具有拮抗活性。根據(jù)它們的相對拮抗能力和抑制C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)從而影響CD40導(dǎo)向活性的能力，選擇雜交瘤克隆進(jìn)行進(jìn)一步評價(jià)。
實(shí)施例2所選擇雜交瘤的結(jié)合特性通過胺偶聯(lián)將蛋白A固定在CM5生物傳感器芯片上。以10μl/分鐘的流速，用1.5分鐘使1.5μg/ml抗CD40單克隆抗體捕獲到修飾的生物傳感器表面上。不同濃度的重組可溶性CD40-his流過生物傳感器表面。用0.01M HEPES pH7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性劑P20(HBS-EP)稀釋抗體和抗原。用Biaevaluation軟件以1∶1交互作用模型/全局?jǐn)M合測定動(dòng)力學(xué)常數(shù)和親和力常數(shù)。
實(shí)施例3拮抗性抗CD40抗體對CD40/C4BP體外相互作用的影響在一些情況下，候選抗體將防止C4BP結(jié)合于細(xì)胞表面CD40并取代預(yù)先結(jié)合的C4BP。測試候選抗體是否能夠防止C4BP結(jié)合于淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos)表面上的CD40。如流式細(xì)胞術(shù)所測定，合適的拮抗性抗CD40抗體與這些細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合防止后續(xù)的PE-C4BP、FITC-C4BP、生物素-C4BP或Alexfluor-C4BP結(jié)合。在第二組試驗(yàn)中，測試候選抗體是否能夠取代預(yù)先結(jié)合于細(xì)胞表面CD40的C4BP。
實(shí)施例4拮抗正常人對象的淋巴細(xì)胞的CD40導(dǎo)向增殖的抗體C4BP對CD40的作用能刺激CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，該信號通路能誘導(dǎo)正常人B細(xì)胞增殖。預(yù)計(jì)阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的拮抗性抗CD40抗體能抑制此增殖。
測定候選抗體是否能夠抑制C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和后續(xù)正常人對象的PBMC的增殖?？扇苄訡4BPα鏈亞基和C4BPα7β1異聚體用作激動(dòng)劑。通過摻入氚標(biāo)記的-胸苷來測定PBMC增殖。用多個(gè)供者的PBMC(n＞1)進(jìn)行該試驗(yàn)，以保證觀察到的抑制不是單個(gè)供者的細(xì)胞的特別現(xiàn)象。這些試驗(yàn)中采用多種抗體濃度(0.01μg/ml-100μg/ml)。通常，感興趣抗體將干擾C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制CD40導(dǎo)向的增殖，大部分情況下抗體濃度為0.1μg/ml。
除了B細(xì)胞以外，人PBMC也含有可介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)的天然殺傷細(xì)胞。為了闡明抗體介導(dǎo)的增殖抑制的機(jī)制，用從人PBMC純化的B細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。如果抗體可抑制C4BP與CD40結(jié)合誘導(dǎo)的純化B細(xì)胞的CD40導(dǎo)向增殖，那么在這些試驗(yàn)中是候選抗體的拮抗劑活性而非ADCC機(jī)制引起了增殖抑制。
實(shí)施例5拮抗性抗體不誘導(dǎo)正常人對象B細(xì)胞的強(qiáng)烈增殖C4BP能誘導(dǎo)正常B細(xì)胞增殖。激動(dòng)性抗CD40抗體的結(jié)合可為正常和惡性B細(xì)胞的增殖提供相似的刺激信號。具有強(qiáng)烈B細(xì)胞刺激活性的抗體不是治療性治療B細(xì)胞淋巴瘤和自身免疫病的合適候選物。測定能阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的候選抗體是否能夠誘導(dǎo)正常志愿供者的B細(xì)胞增殖。用不同濃度的候選抗體(0.001-100μg/ml)培養(yǎng)由正常供者PBMC純化的B細(xì)胞，共計(jì)4天。通過摻入氚標(biāo)記的胸苷測定B細(xì)胞增殖。當(dāng)可溶性C4BP誘導(dǎo)B細(xì)胞強(qiáng)烈增殖時(shí)，適合用于本發(fā)明方法的候選抗體僅誘導(dǎo)正常B細(xì)胞輕微增殖。
除了B細(xì)胞以外，人PBMC包含攜帶IgG1分子的Fc受體(FcR)的細(xì)胞類型，其可使結(jié)合于B細(xì)胞上CD40的抗CD40抗體交聯(lián)。此交聯(lián)可能增強(qiáng)抗CD40抗體的刺激活性。為證實(shí)在交聯(lián)細(xì)胞存在下候選抗體沒有B細(xì)胞刺激活性，用含有B細(xì)胞和FcR+細(xì)胞的總PBMC進(jìn)行增殖實(shí)驗(yàn)。通常，即使在攜帶FcR的細(xì)胞的存在下，相對于對照人IgG1誘導(dǎo)的背景增殖，這些候選抗體也不刺激B細(xì)胞增殖。通過測定由于對培養(yǎng)孔的塑料表面上固定的候選抗CD40抗體起反應(yīng)而發(fā)生的PBMC增殖，進(jìn)一步證實(shí)候選mAb沒有刺激活性?？傊?，這些數(shù)據(jù)證明，候選抗CD40抗體沒有強(qiáng)烈的B細(xì)胞刺激特性。
實(shí)施例6候選抗體能夠通過ADCC殺傷攜帶CD40的靶細(xì)胞在一些情況下，候選抗體可通過ADCC機(jī)制殺傷攜帶CD40的靶細(xì)胞(淋巴瘤細(xì)胞系和/或?qū)嶓w瘤細(xì)胞系)。預(yù)計(jì)IgG1同種型抗體能夠通過ADCC機(jī)制誘導(dǎo)殺傷靶細(xì)胞。測定了候選抗CD40抗體是否能夠在體外試驗(yàn)中殺傷癌細(xì)胞系。將兩種人淋巴瘤細(xì)胞系(Ramos和Daudi)、一種人結(jié)腸癌細(xì)胞系(HCT116)和七種其它癌細(xì)胞系(包括卵巢癌細(xì)胞系SKOV3和HEY、皮膚鱗癌細(xì)胞系A(chǔ)431、乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB231和MDA-MB435以及肺癌細(xì)胞系NCI-H460和SK-MES-I選作這些試驗(yàn)的靶細(xì)胞。將正常志愿供者的PBMC或富集的NK細(xì)胞用作這些試驗(yàn)中的效應(yīng)器細(xì)胞。
實(shí)施例7候選抗體不刺激來自NHL患者淋巴結(jié)的癌細(xì)胞增殖CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)能誘導(dǎo)來自NHL患者的淋巴瘤細(xì)胞存活和增殖。因此，C4BP可能在NHL中起作用。一些抗CD40抗體(激動(dòng)劑)的結(jié)合可為患者癌細(xì)胞增殖提供相似的刺激信號。如上所述，具有強(qiáng)烈B細(xì)胞刺激活性的抗體不是治療性治療B細(xì)胞淋巴瘤的合適候選物。測定候選抗體是否能夠誘導(dǎo)患者的NHL細(xì)胞增殖。用不同濃度的候選抗體(0.01-300μg/ml)培養(yǎng)分離自淋巴結(jié)(LN)活檢物的細(xì)胞，共計(jì)3天。通過摻入氚標(biāo)記的胸苷測定細(xì)胞增殖。通常，候選mAb在任何受試濃度下都不應(yīng)誘導(dǎo)癌細(xì)胞增殖。即使存在外源性加入的B細(xì)胞生長因子IL-4，候選抗體也不應(yīng)誘導(dǎo)NHL細(xì)胞增殖。這些結(jié)果表明，候選抗體是否是非激動(dòng)性抗CD40抗體和不刺激患者NHL細(xì)胞的體外增殖。
實(shí)施例8候選抗體可阻斷C4BP-誘導(dǎo)的非霍奇金淋巴瘤患者的癌細(xì)胞增殖C4BP對CD40的作用可誘導(dǎo)NHL患者的癌細(xì)胞增殖。預(yù)計(jì)候選拮抗性抗CD40抗體能抑制此增殖。測定不同濃度(0.01μg/ml-100μg/ml)的候選抗CD40抗體是否能夠抑制C4BP與這些細(xì)胞上的CD40抗原結(jié)合而誘導(dǎo)的CD40導(dǎo)向的NHL細(xì)胞增殖。在IL-4存在下與C4BP一起懸浮培養(yǎng)患者的NHL細(xì)胞。通過摻入3H-胸苷測定NHL細(xì)胞增殖。與對照相比，感興趣的候選抗體以劑量依賴方式抑制NHL細(xì)胞增殖，抑制效果隨拮抗性抗CD40抗體濃度增加而提高。
實(shí)施例9與C4BP表達(dá)細(xì)胞一起培養(yǎng)時(shí)，候選抗體對活NHL細(xì)胞數(shù)量的影響C4BP與CD40結(jié)合是刺激CD40表達(dá)細(xì)胞的一種可選方法。CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)對B細(xì)胞存活很重要。該組實(shí)驗(yàn)評價(jià)了在C4BP存在下，第7、10和14天候選抗CD40抗體對NHL細(xì)胞數(shù)量的影響。在IL-4存在下與C4BP一起懸浮培養(yǎng)患者的NHL細(xì)胞。在第0天和第7天加入濃度為10μg/ml的對照人IgG和候選抗體。在特定天計(jì)數(shù)各條件下的活細(xì)胞。對照組(IgG)的細(xì)胞數(shù)量通常隨時(shí)間而增加。通常，與對照組相比細(xì)胞數(shù)量減少發(fā)生在拮抗性抗體存在時(shí)。
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中獲益進(jìn)而想出這些發(fā)明的許多改進(jìn)形式和其它實(shí)施方案。因此，應(yīng)該理解本發(fā)明不受限于所公開的具體實(shí)施方案，這些改進(jìn)形式和其它實(shí)施方案均包括在附加權(quán)利要求的范圍和本文所公開實(shí)施方案的內(nèi)容中。雖然本文使用了特定的術(shù)語，但它們僅是一般性和描述性地使用并非出于限制的目的。
說明書中述及的所有出版物和專利申請表明本發(fā)明所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的水平。如同每篇單獨(dú)的出版物或?qū)＠暾執(zhí)囟ㄇ要?dú)立地用作參考一樣，所有出版物和專利申請納入本文作為參考。
權(quán)利要求
1.一種抗體或其抗原結(jié)合片段，其能夠特異性結(jié)合于細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原，所述抗體或其抗原結(jié)合片段沒有顯著的CD40激動(dòng)劑活性，其中所述抗體與所述CD40抗原結(jié)合阻斷了C4b結(jié)合蛋白(C4BP)介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
2.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體是單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，所述單克隆抗體是完全人抗-CD40單克隆抗體。
4.如權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，所述單克隆抗體是人源化抗-CD40單克隆抗體。
5.如權(quán)利要求2所述的抗體，其特征在于，所述單克隆抗體是有免疫活性的嵌合抗-CD40單克隆抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體與所述CD40抗原的結(jié)合親和力(KD)至少約為10-6M-10-12M。
7.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述其抗原結(jié)合片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
8.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體與CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分結(jié)合的親和力高于C4BP。
9.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與所述CD40抗原結(jié)合通過空間抑制所述C4BP與所述CD40抗原結(jié)合而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
10.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過競爭所述CD40抗原上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分而競爭性抑制C4BP與所述CD40抗原結(jié)合。
11.如權(quán)利要求1所述的抗體，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與所述CD40抗原結(jié)合阻斷了所述C4BP連接于所述CD40抗原時(shí)產(chǎn)生的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
12.如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段是重組產(chǎn)生的。
13.一種雜交瘤細(xì)胞系，其能夠產(chǎn)生權(quán)利要求2所述的單克隆抗體。
14.一種拮抗性抗CD40抗體，其能夠結(jié)合于CD40上C4b結(jié)合蛋白(C4BP)結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分。
15.如權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體是完全人抗體。
16.如權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體沒有顯著的CD40激動(dòng)劑活性。
17.如權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與所述CD40抗原結(jié)合通過空間抑制所述C4BP與所述CD40抗原結(jié)合而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
18.如權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段通過競爭所述CD40抗原上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分而競爭性抑制C4BP與所述CD40抗原結(jié)合。
19.如權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與所述CD40抗原結(jié)合阻斷了所述C4BP連接于所述CD40抗原時(shí)產(chǎn)生的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
20.如權(quán)利要求14所述的抗體，其特征在于，所述抗體與CD40上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分結(jié)合的親和力高于C4BP。
21.一種抑制CD40表達(dá)細(xì)胞的CD40導(dǎo)向活性的方法，其中C4b結(jié)合蛋白(C4BP)與所述細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原結(jié)合介導(dǎo)了所述CD40導(dǎo)向活性，所述方法包括將所述細(xì)胞與有效量的能夠特異性結(jié)合于所述CD40抗原的抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段相接觸，所述抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段沒有顯著的CD40激動(dòng)劑活性，其中所述抗體與所述CD40表達(dá)細(xì)胞上的所述CD40抗原結(jié)合阻斷了C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制所述CD40導(dǎo)向活性。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述CD40導(dǎo)向活性選自細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、抗體產(chǎn)生、細(xì)胞記憶產(chǎn)生、同種型交換、胞間粘著、分泌細(xì)胞因子、分泌金屬蛋白酶和表達(dá)細(xì)胞粘著分子。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述CD40表達(dá)細(xì)胞是正常的B細(xì)胞，受抑制的所述CD40導(dǎo)向活性選自細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和抗體產(chǎn)生。
24.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，所述CD40表達(dá)細(xì)胞是惡性B細(xì)胞或?qū)嶓w瘤中表達(dá)CD40的腫瘤細(xì)胞，受抑制的所述CD40導(dǎo)向活性是細(xì)胞增殖。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與所述CD40抗原結(jié)合通過空間抑制所述C4BP與所述CD40抗原結(jié)合而阻斷C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段通過競爭所述CD40抗原上C4BP結(jié)合位點(diǎn)的至少一部分而競爭性抑制C4BP與所述CD40抗原結(jié)合。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段與所述CD40抗原結(jié)合阻斷了所述C4BP連接于所述CD40抗原時(shí)產(chǎn)生的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
28.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體是單克隆抗體。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體是完全人抗-CD40單克隆抗體。
30.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體是人源化抗-CD40單克隆抗體。
31.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，所述單克隆抗體是有免疫活性的嵌合抗-CD40單克隆抗體。
32.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗CD40抗體與所述CD40抗原的結(jié)合親和力(KD)至少約為10-6M-10-12M。
33.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述抗原結(jié)合片段選自Fab片段、F(ab′)2片段、Fv片段和單鏈Fv片段。
34.一種治療需要治療的對象的CD40相關(guān)性疾病的方法，所述方法包括給予所述對象治療有效量的權(quán)利要求1-12和14-20中任一項(xiàng)所述的抗體或其抗原結(jié)合片段。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述CD40相關(guān)性疾病是癌癥。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌癥是B細(xì)胞相關(guān)性癌癥，選自非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細(xì)胞性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、B細(xì)胞淋巴瘤、高級B細(xì)胞淋巴瘤、中級B細(xì)胞淋巴瘤、低級B細(xì)胞淋巴瘤、B細(xì)胞急性成淋巴細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞白血病、霍奇金病、漿細(xì)胞瘤、濾泡淋巴瘤、濾泡小粘著性淋巴瘤、濾泡大細(xì)胞淋巴瘤、濾泡混合小粘著性淋巴瘤、彌散性小粘著性細(xì)胞淋巴瘤、彌散性小淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、前淋巴細(xì)胞性白血病、漿細(xì)胞樣淋巴細(xì)胞淋巴瘤、邊緣層淋巴瘤、粘膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、單核細(xì)胞樣B細(xì)胞性淋巴瘤、脾淋巴瘤、毛細(xì)胞性白血病、彌散性大細(xì)胞淋巴瘤、縱隔大B細(xì)胞型淋巴瘤、淋巴瘤樣肉芽腫、血管內(nèi)淋巴瘤病、彌散性混合細(xì)胞性淋巴瘤、彌散性大細(xì)胞淋巴瘤、免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、AIDS-相關(guān)淋巴瘤和外套細(xì)胞淋巴瘤。
37.如權(quán)利要求35所述的方法，其特征在于，所述癌癥是包含表達(dá)CD40抗原的腫瘤細(xì)胞的實(shí)體瘤。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其特征在于，所述實(shí)體瘤選自肺癌、乳腺癌、卵巢癌、皮膚癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、腎細(xì)胞癌、鼻咽癌、鱗狀細(xì)胞癌、甲狀腺乳頭狀癌、宮頸癌和肉瘤。
39.如權(quán)利要求36-38中任一項(xiàng)所述的方法，還包括給予所述對象考慮用于治療所述癌癥的至少一種其它癌癥療法，其中所述至少一種其它癌癥療法選自手術(shù)、放療、化療、其它抗癌單克隆抗體療法、基于小分子的癌癥療法、基于疫苗的癌癥療法、基于免疫治療的癌癥療法和類固醇療法。
40.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述CD40相關(guān)性疾病是炎性疾病或自身免疫病。
41.如權(quán)利要求40所述的方法，其特征在于，所述炎性疾病或自身免疫病選自系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、盤狀狼瘡、狼瘡性腎炎、結(jié)節(jié)病、少年關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、萊特爾綜合征、強(qiáng)直性脊柱炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、器官或組織移植排斥、移植物抗宿主病、多發(fā)性硬化、高免疫球蛋白E血癥綜合征、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、炎性腸病、克羅恩氏病、乳糜瀉(麩膠敏感性腸病)、自免疫肝炎、惡性貧血、自身免疫性溶血性貧血、牛皮癬、硬皮病、重癥肌無力、自身免疫性血小板減少性紫癜、自身免疫性甲狀腺炎、格雷夫斯病、橋本甲狀腺炎、免疫復(fù)合物病、慢性疲勞免疫功能障礙綜合征(CFIDS)、多肌炎和皮肌炎、冷球蛋白血癥、溶栓、心肌病、尋常天皰瘡、肺間質(zhì)纖維化、結(jié)節(jié)病、I型和II型糖尿病、1型、2型、3型和4型遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、過敏或過敏性疾病、哮喘、丘-施綜合征(過敏性肉芽腫病)、特應(yīng)性皮炎、過敏性和刺激性接觸性皮炎、風(fēng)疹、IgE-介導(dǎo)的過敏、動(dòng)脈粥樣硬化、血管炎、特發(fā)性炎性肌病、溶血性疾病、阿耳茨海默病和慢性炎性脫髓鞘多神經(jīng)病。
42.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述器官或組織移植選自心臟、肺、腎、胰、皮膚和骨髓。
43.如權(quán)利要求41所述的方法，其特征在于，所述治療還包括給予所述對象至少一種其它治療，選自手術(shù)、器官灌注、放療、類固醇治療、非類固醇治療、抗生素治療、抗真菌治療、激素治療、細(xì)胞因子治療、用皮膚病藥物治療、免疫抑制療法和其它抗炎單克隆抗體治療。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述CD40相關(guān)性疾病是器官或組織移植排斥，也給予所述對象免疫抑制劑，所述免疫抑制劑選自環(huán)孢霉素、FK506、雷帕霉素、皮質(zhì)類固醇、CTLA4-Ig和抗B淋巴細(xì)胞刺激物抗體。
45.一種鑒定抑制C4BP與CD40抗原結(jié)合的抗體的方法，所述方法包括進(jìn)行C4BP和結(jié)合CD40的抗體之間的競爭性結(jié)合試驗(yàn)。
46.一種人單克隆抗體，其能夠特異性結(jié)合于人CD40表達(dá)細(xì)胞表面上表達(dá)的人CD40抗原，所述單克隆抗體沒有顯著的激動(dòng)劑活性，其中所述抗體與所述CD40抗原結(jié)合阻斷了所述細(xì)胞中C4BP-介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
全文摘要
本發(fā)明提供了抑制通過C4BP與CD40結(jié)合介導(dǎo)的CD40導(dǎo)向活性的組合物和方法。本發(fā)明組合物包括具有以下特征的抗CD40抗體或其抗原結(jié)合片段1)結(jié)合于CD40抗原時(shí)沒有顯著的CD40激動(dòng)劑活性；和2)能夠特異性結(jié)合于細(xì)胞表面上表達(dá)的CD40抗原，其中此種與CD40抗原的結(jié)合阻斷了C4BP－介導(dǎo)的CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而抑制一種或多種CD40導(dǎo)向活性。這些拮抗性抗CD40抗體可有效用于治療C4BP刺激CD40信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的CD40相關(guān)疾病，包括癌癥如B細(xì)胞相關(guān)性癌癥和實(shí)體瘤，以及含有自身免疫和/或炎性組分的疾病或失調(diào)，包括器官和組織移植排斥。
文檔編號A61K39/395GK101014386SQ200580020729
公開日2007年8月8日 申請日期2005年4月27日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月27日
發(fā)明者M·盧克曼 申請人:諾華疫苗和診斷公司