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非酒精性脂肪性肝炎的治療方法

文檔序號:1109311閱讀:295來源:國知局
專利名稱:非酒精性脂肪性肝炎的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于治療非酒精性脂肪性肝炎的蛋白和核酸治療學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)為非酒精性脂肪肝疾病(NAFL)范圍內(nèi)的一部分,指在肝臟中與過量攝入酒精引起的組織學(xué)變化相似的組織學(xué)變化進(jìn)展。但是,NASH出現(xiàn)在并不酗酒的患者中。NASH的特征在于指示肝臟細(xì)胞受到損害的血清轉(zhuǎn)氨酶升高。該病的特征是大脂滴(即將肝細(xì)胞核擠至細(xì)胞一側(cè)的胞質(zhì)內(nèi)空泡)、炎癥以及偶發(fā)的可能發(fā)展成為肝硬化的纖維化。越來越多的證據(jù)表明NASH是代謝性胰島素抵抗綜合征(metabolic insulin resistance syndrome)的組成部分。該綜合征為一系列的病癥,包括肥胖癥、血脂異常、動(dòng)脈硬化以及糖尿病(diabetes mellitis),它們的共有特征在于具有胰島素抵抗(de Sligte et al(2004)Eur J Int Med 1510)。
盡管已嘗試使用多種藥物改善NASH,預(yù)防進(jìn)一步的惡化,但是對這種潛在的嚴(yán)重疾病還沒有公認(rèn)的治療方法。一種經(jīng)過測試對NASH有效的藥物是羅格列酮(Muurling et al(2003)Metabolism521078)。體重的降低也可能改善NASH。但是,盡管有這些手段的介入,但是在相當(dāng)數(shù)量的患者中,NASH還是會發(fā)展成為肝硬化,并且最終可能需要進(jìn)行肝移植,此后該病還可能復(fù)發(fā)。
考慮到在美國和歐洲人群中肥胖癥和糖尿病越來越多的趨勢,迫切需要新的NASH的治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種治療受試者中非酒精性脂肪性肝炎的方法。該方法包括將有效量的脂蛋白脂酶(LPL)治療劑給予受試者。本文所使用的LPL治療劑指具有LPL活性的蛋白(EC3.1.1.34),或指編碼該蛋白的核酸。
LPL治療劑的蛋白形式在一個(gè)實(shí)施方案中,LPL治療劑是具有SEQ ID No.1所示氨基酸序列的LPL蛋白,在本文中被稱為LPL S447X蛋白或肽。一般而言,這些LPL S447X蛋白比已知的野生型LPL短,后者具有448個(gè)氨基酸(參見例如Wion et al Science(1987) 2351638或WO 01/00220)。它們可包括如下化合物例如肽片段、經(jīng)修飾的肽片段、類似物或?qū)⒁吧蚅PL羧基端的第447~448個(gè)氨基酸截短的LPL的可藥用的鹽。這些化合物在本文中都被稱為LPL S447X肽。LPL S447X肽可包括野生型成熟LPL序列第1到446個(gè)氨基酸的同系物,包括來源于除人(homo sapiens)外的物種的同系物(可能有獸醫(yī)學(xué)用途)在內(nèi)。LPLS447X肽可包括野生型LPL的衍生物或其天然存在的同工型或其遺傳變體。LPL S447X蛋白的衍生物和變體的用途也包括在本發(fā)明中。
S447X蛋白的衍生物具體而言,衍生物包括具有LPL活性的蛋白,該蛋白具有與LPLS447X蛋白相同的氨基酸序列,但是其中某些N-或O-糖基化位點(diǎn)已被修飾或去除。衍生物還包括C端羥甲基化衍生物、O修飾衍生物(如C端羥甲基二芐醚)和包括被取代的酰胺在內(nèi)N端修飾衍生物如烷基酰胺和酰肼。
在本發(fā)明的LPL治療劑中,肽結(jié)構(gòu)可直接或間接偶聯(lián)到修飾基團(tuán)上。術(shù)語“修飾基團(tuán)”旨在包括直接連接肽結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)(如通過共價(jià)偶聯(lián)),以及間接連接肽結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)(如通過穩(wěn)定的非共價(jià)連接或通過共價(jià)偶聯(lián)到其它氨基酸殘基或其模擬物(mimetics)、類似物或衍生物,它們可位于MCP-3核心肽結(jié)構(gòu)的側(cè)翼)。例如,修飾基團(tuán)可偶聯(lián)到LPL治療劑結(jié)構(gòu)的氨基端或羧基端,或偶聯(lián)到位于核心結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的肽區(qū)或擬肽區(qū)(peptidomimetic region)?;蛘撸揎椈鶊F(tuán)可偶聯(lián)到LPL治療劑氨基酸殘基的側(cè)鏈,或偶聯(lián)到位于核心結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的肽區(qū)或擬肽區(qū)(如通過賴氨酰殘基的ε氨基基團(tuán),通過天冬氨酸殘基或谷氨酸殘基的羧基,通過酪胺酰殘基、絲氨酸殘基或蘇氨酸殘基的羥基,或通過氨基酸側(cè)鏈上其它合適的反應(yīng)基團(tuán))。修飾基團(tuán)共價(jià)偶聯(lián)到肽結(jié)構(gòu)上可通過本領(lǐng)域所熟知的連接化學(xué)結(jié)構(gòu)的手段和方法進(jìn)行連接,這些化學(xué)結(jié)構(gòu)包括例如酰胺、烷基氨基、氨基甲酸酯或脲鍵(urea bond)。
在某些實(shí)施方案中,修飾基團(tuán)可包括環(huán)狀基團(tuán)、雜環(huán)基團(tuán)或多環(huán)基團(tuán)。本文所使用的術(shù)語“環(huán)狀基團(tuán)”包括具有3到10、4到8或5到7個(gè)碳原子的環(huán)狀飽和或不飽和(即芳香族)基團(tuán)。示例性環(huán)狀基團(tuán)包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和環(huán)辛基。環(huán)狀基團(tuán)可在一個(gè)或多個(gè)環(huán)上位置(ring Position)被取代,也可不被取代。環(huán)狀基團(tuán)可被如下物質(zhì)取代,例如鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳基、雜環(huán)、羥基、氨基、硝基、硫氫基、胺、亞胺、酰胺、膦酸酯、膦、羰基、羧基、硅烷基、醚、硫醚、磺?;⒒撬狨?、硒醚、酮、醛、酯、-CF3、-CN。
術(shù)語“雜環(huán)基團(tuán)”包括具有3到10、4到8或5到7個(gè)碳原子的環(huán)狀飽和、不飽和以及芳香族基團(tuán),其中環(huán)結(jié)構(gòu)包括約一個(gè)或多個(gè)雜原子。雜環(huán)基團(tuán)包括吡咯烷、氧雜環(huán)戊烷(oxolane)、四氫噻吩(thiolane)、咪唑、噁唑、哌啶、哌嗪、嗎啉。雜環(huán)的環(huán)可在一個(gè)或多個(gè)位置由如下取代基取代,例如鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、芳基、其它雜環(huán)、羥基、氨基、硝基、硫氫基、胺、亞胺、酰胺、膦酸酯、膦、羰基、羧基、硅烷基、醚、硫醚、磺酰、硒醚、酮、醛、酯、-CF3、-CN。雜環(huán)也可橋接或融合到下述其它環(huán)狀基團(tuán)。
本文所使用的術(shù)語“多環(huán)基團(tuán)”旨在表示兩個(gè)或多個(gè)飽和、不飽和或芳香族環(huán)狀環(huán),其中兩個(gè)相鄰環(huán)共用兩個(gè)或多個(gè)碳,因此這些環(huán)為“稠環(huán)”。通過非相鄰原子連接的環(huán)稱為“橋”環(huán)。多環(huán)基團(tuán)的每一個(gè)環(huán)可被如前所述的取代基取代,例如鹵素、烷基、環(huán)烷基、鏈烯基、炔基、羥基、氨基、硝基、硫氫基、胺、亞胺、酰胺、膦酸酯、膦、羰基、羧基、硅烷基、醚、硫醚、磺酰、硒醚、酮、醛、酯、-CF3或-CN。
術(shù)語“烷基”指飽和脂肪族基團(tuán),包括直鏈烷基、支鏈烷基、環(huán)烷(脂環(huán))基、烷基取代的環(huán)烷基以及環(huán)烷基取代的烷基。在某些實(shí)施方案中,直鏈或支鏈烷基其主鏈具有20個(gè)或更少的碳原子(直鏈為C1-C20,支鏈為C3-C20),或10個(gè)或更少的碳原子。在某些實(shí)施方案中,環(huán)烷基在其環(huán)結(jié)構(gòu)可有4-10個(gè)碳原子,如5、6或7個(gè)碳的環(huán)。若沒有對碳的數(shù)目進(jìn)行專門定義,那么本文所指“低級烷基”為上文所述主鏈結(jié)構(gòu)具有一個(gè)到十個(gè)碳原子的烷基。同樣,“低級鏈烯基”和“低級炔基”具有十個(gè)或更少碳原子的鏈長。
說明書和權(quán)利要求書中所使用的術(shù)語“烷基”(或“低級烷基”)旨在包括“未取代烷基”和“取代烷基”,后者指用取代基取代了烴主鏈上的一個(gè)或多個(gè)碳上的氫的烷基組分。該取代基可包括例如鹵素、羥基、羰基(如羧基、酮(包括烷基羰基和芳基羰基)和酯(包括烷氧羰基和芳氧羰基))、硫代羰基、酰氧基、烷氧基、磷?;?、膦酸酯、次膦酸酯、氨基、酰基氨基(acylamino)、酰氨基(amido)、脒、亞胺基、氰基、硝基、疊氮基、巰基、烷基硫代基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、亞磺酰氨基、雜環(huán)基、芳烷基或芳香族或雜芳族組分。恰當(dāng)時(shí),烴鏈上的取代組分其本身也可以是被取代的形式。例如,取代烷基上的取代基可包括取代和未取代形式的氨基、疊氮基、亞胺基、酰氨基、磷?;?包括膦酸酯和次膦酸酯)、磺?;?包括硫酸酯、磺胺、氨磺酰基和磺酸酯)和硅烷基,以及醚、烷基硫代基、羰基(包括酮、醛、羧酸酯和酯)、-CF3、-CN等。示例性取代烷基在下文有述。環(huán)烷基還可被烷基、鏈烯基、烷氧基、烷基硫代基、氨基烷基、羰基取代的烷基、-CF3、-CN等取代。
術(shù)語“鏈烯基”和“炔基”指在長度和可能的取代上與上述烷基相似的不飽和脂肪基團(tuán),但是它們分別含有至少一個(gè)雙鍵或三鍵。
本文所使用的術(shù)語“芳烷基”指被至少一個(gè)芳基所取代的烷基或鏈烯基。示例性芳烷基包括芐基(即苯甲基)2-萘基、2-(2-吡啶基)丙基、5-二苯并環(huán)庚基等。
本文所使用的術(shù)語“烷基羰基”指-C(O)-烷基。類似地,術(shù)語“芳基羰基”指-C(O)-芳基。本文所使用的術(shù)語“烷氧羰基”指基團(tuán)-C(O)-O-烷基,術(shù)語“芳氧羰基”指-C(O)-O-芳基。術(shù)語“酰氧基”指-O-C(O)-R7,其中R7為烷基、鏈烯基、炔基、芳基、芳烷基或雜環(huán)基。
本文所使用的術(shù)語“氨基”指-N(Rα)(Rβ),其中每個(gè)Rα和Rβ分別為氫、烷基、鏈烯基、炔基、芳烷基、芳基,或者其中Rα和Rβ和它們所連接的氮原子一起形成具有4-8個(gè)原子的環(huán)。因此,本文所使用的術(shù)語“氨基”包括未取代的、單取代的(如單烷基氨基或單芳基氨基)和雙取代的(如二烷基氨基或烷基芳基氨基)氨基基團(tuán)。術(shù)語“酰氨基(amido)”指-C(O)-N(R8)(R9),其中R8和R9為上文所述。術(shù)語“?;坊?acylamino)”指-N(R’8)C(O)-R7,其中R7為上文所述,R’8為烷基。
本文所使用的術(shù)語“硝基”意為-NO2,術(shù)語“鹵素”指-F、-Cl、-Br或-I,術(shù)語“硫氫基(sulfhydryl)”意為-SH,術(shù)語“羥基”意為-OH。
本文所使用的“芳基”包括環(huán)中含有零到四個(gè)雜原子的5個(gè)、6個(gè)和7個(gè)原子的芳香族基團(tuán),如苯基、吡咯基、呋喃基、苯硫基、咪唑基、噁唑、噻唑基、三唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、噠嗪基和嘧啶基等。那些在環(huán)結(jié)構(gòu)上具有雜原子的芳基基團(tuán)也可被稱為“芳基雜環(huán)”或“雜芳族化合物”??稍谝粋€(gè)或多個(gè)環(huán)上位置用上文所述的取代基取代芳環(huán),所述取代基例如鹵素、疊氮化合物、烷基、芳烷基、鏈烯基、炔基、環(huán)烷基、羥基、氨基、硝基、硫氫基(sulfhydryl)、亞氨基、酰氨基、膦酸酯、次膦酸酯、羰基、羧基、硅烷基、醚、烷基硫代基(alkylthio)、磺?;喕酋0被?、酮、醛、酯、雜環(huán)基、芳香族或雜芳族組分、-CF3、-CN等。芳基也可為多環(huán)基團(tuán)的一部分。例如,芳基基團(tuán)包括稠環(huán)芳香族組分,如萘基、蒽基(anthracenyl)、喹啉基、吲哚基等。
修飾基團(tuán)可包括含有生物素基結(jié)構(gòu)的基團(tuán)、含有熒光素的基團(tuán)、二乙烯三胺五乙?;鶊F(tuán)、(-)-薄荷氧基乙酰(menthoxyacetyl)基團(tuán)、N-乙酰神經(jīng)氨酸基(N-acetylneuraminyl)基團(tuán)、膽酰(cholyl)結(jié)構(gòu)或亞胺生物素基(iminobiotinyl)基團(tuán)??刹捎帽绢I(lǐng)域已知的方法(例如參見Wess,G.et al.(1993)Tetrahedron Letters,34817-822在羧基端用膽?;鶊F(tuán)修飾LPL治療劑。膽酰衍生物和類似物也可用作修飾基團(tuán),如Aic(3-(O-氨乙基-異)-膽?;?,它具有可用于進(jìn)一步修飾LPL治療劑的游離氨基基團(tuán)。修飾基團(tuán)可為“生物素基結(jié)構(gòu)”,包括生物素基基團(tuán)及其類似物和衍生物(如2-亞胺生物素基基團(tuán))。在另一個(gè)實(shí)施方案中,修飾基團(tuán)可包括“含有熒光素的基團(tuán)”,例如由LPL治療肽和5-(和6-)羧基熒光素、琥珀酰亞胺基酯(succinimidyl ester)或熒光素異硫氰酸酯反應(yīng)得到的基團(tuán)。在其它各種不同的實(shí)施方案中,修飾基團(tuán)可包括N-乙酰神經(jīng)氨酸基基團(tuán)、反式-4-可他寧羧基(cotinineca rboxyl)基團(tuán)、2-亞胺-1-咪唑啉乙?;?S)-(-)-吲哚-2-羧基基團(tuán)、(-)-薄荷氧基乙酰基團(tuán)、2-降冰片烷乙?;鶊F(tuán)、γ-氧代-5-二氫苊丁酰基、(-)-2-氧代-噻唑烷羧基基團(tuán)、四氫-3-呋喃基、2-亞胺生物素基團(tuán)、二乙烯三胺五乙?;鶊F(tuán)、4-嗎啉羰基基團(tuán)、2-噻吩乙?;鶊F(tuán)或2-噻吩磺?;鶊F(tuán)。
LPL S447X蛋白的變體變體LPL多肽包括具有與LPL S447X蛋白基本相似的序列,如與SEQ ID No.1的相應(yīng)部分具有90%、95%或99%同一性的序列,相應(yīng)部分可為任何長度(如10、20、30、40、50或更多氨基酸)的任何連續(xù)序列。該蛋白的LPL活性或其它類LPL性質(zhì)一般與LPL S447X蛋白的相同或較之更強(qiáng)。在某些實(shí)施方案中,化學(xué)性質(zhì)相似的氨基酸可用來置換LPL S447X蛋白序列的氨基酸(以提供保守氨基酸置換)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中,應(yīng)該回避降低LPL活性的氨基酸置換,其中有多于50個(gè)置換已被公開,如用Ser殘基置換第291位的Asn(Asn291Ser)、用Asn置換第9位的Asp(Asp9Asn)、用Glu置換第188位的Gly(Gly188Glu,參見Monsalve et al.,J.Clin.Invest.1990,86(3)728-734)或Asp250Asn(Ma et al.,Genomios.1992,13649-653)。
LPL治療劑的核酸形式在另一實(shí)施方案中,LPL治療劑是編碼野生型LPL蛋白或編碼LPL S447X蛋白的核酸。在另一實(shí)施方案中,核酸可包括DNA編碼序列,該序列編碼與SEQ ID NO.2(編碼成熟野生型LPL肽的一段核苷酸序列)的第256到1599個(gè)核苷酸具有至少90%的序列同一性的RNA。
又或者,LPL治療劑可包括含DNA編碼序列的核酸,該DNA編碼序列在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID NO.2的第256到1599個(gè)核苷酸雜交。
序列同一性若在將兩個(gè)核酸或蛋白序列進(jìn)行最佳比對時(shí),它們至少具有約70%的序列同一性,那么認(rèn)為它們基本相同。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中,序列同一性可為例如至少75%、至少90%或至少95%。就同一性比較而言,可使用各種算法對序列進(jìn)行最佳比對,這些算法例如局部同源性算法(Smith and Waterman,1981,Adv.Appl.Math 2482)、同源性比對算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Bio.48443)、相似性搜尋方法(Pearson and Lipman,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444)以及由計(jì)算機(jī)完成的這些算法(如Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics ComputerGroup,Madison,WI,U.S.A)。序列比對也可使用在Altschul et.Al.,1990,J.Mol.Biol.215403-10中所描述的BLAST算法進(jìn)行(使用公開的默認(rèn)設(shè)置)。進(jìn)行BLAST分析的軟件可通過美國國家生物技術(shù)信息中心(通過互聯(lián)網(wǎng)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)獲得。BLAST算法包括首先要識別高得分序列對(high scoring sequence pair,HSP),這通過識別待查詢序列中長度為W的短字段實(shí)現(xiàn),該字段與數(shù)據(jù)庫序列中相同長度的字段比對時(shí),匹配或滿足某些正值的閾值得分T。T指相鄰字段得分閾值。最初的相鄰字段命中結(jié)果作為啟動(dòng)檢索的種子,以查找更長的HSP。字段命中結(jié)果沿每個(gè)序列的兩個(gè)方向延伸,使累積比對得分盡量增加。出現(xiàn)以下參數(shù)即停止字段命中結(jié)果沿兩個(gè)方向的延伸累積比對得分從其所獲得的最大值減少了X量;由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)分殘基比對的累積而使累積比對得分為零或小于零;或到達(dá)了任一序列的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了比對的敏感度和速度。就將兩條鏈進(jìn)行比較的核酸而言,BLAST程序使用如下默認(rèn)值字段長度(W)為11,BLOSUM62得分矩陣(見Henikoff and Henikoff,1992,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 8910915-10919)比對值(B)為50,期望值(E)為10(在其它實(shí)施方案中,它可改為1或0.1或0.01或0.001或0.0001,盡管遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于0.1的E值可能不會識別功能相似的序列,但是它可用于檢驗(yàn)顯著性較低的命中結(jié)果,對于較短的相似區(qū)域,E值介于0.1和10之間),M=5,N=4。就蛋白比較而言,BLASTP可使用如下默認(rèn)值G=11(空位開放值);E=1(空位擴(kuò)展值)、E=10(預(yù)期值,在此設(shè)置下,具有與確定比對得分S相等或比它更高得分的10個(gè)命中結(jié)果預(yù)期會隨機(jī)出現(xiàn)在與被檢索數(shù)據(jù)庫大小相同的數(shù)據(jù)庫中;可提高或降低E值以改變檢索的嚴(yán)格程度);并且W=3(字段大小,就BLASTN而言,默認(rèn)值為11,其它blast程序?yàn)?)。
BLOSUM矩陣賦值給比對的每個(gè)位置以概率得分,該得分以相關(guān)蛋白中共有區(qū)塊中已知出現(xiàn)的置換的頻率為基礎(chǔ)。BLOSUM62(空位存在值=11,每個(gè)殘基的空位值=1;λ比率=0.85)置換矩陣使用BLAST2.0中的默認(rèn)值。其它各種矩陣可用作BLOSUM62的替換方案,包括PAM30(9,1,0.87);PAM70(10,1,0.87)BLOSUM80(10,1,0.87);BLOSUM62(11,1,0.82)和BLOSUM45(14,2,0.87)。采用BLAST算法的兩個(gè)序列之間的統(tǒng)計(jì)學(xué)相似性的一個(gè)量度為最小和概率(smallest sum probability,P(N)),它提供了兩個(gè)核苷酸或氨基酸序列之間匹配隨機(jī)出現(xiàn)的概率的指標(biāo)。在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中,若在待測序列的比較中最小和概率小于約1,優(yōu)選小于約0.1,更優(yōu)選小于約0.01,最優(yōu)選小于約0.001,那么核苷酸或氨基酸序列被認(rèn)為基本相同。
修飾本領(lǐng)域已熟知可對多肽的結(jié)構(gòu)進(jìn)行一些修飾和改變,同時(shí)基本不改變該肽的生物學(xué)功能,以獲得在生物學(xué)上等價(jià)的多肽。在本發(fā)明的一方面中,LPL治療劑可包括通過保守氨基酸置換得到的肽,該肽與野生型LPL序列的某一部分不相同。本文所使用的術(shù)語“保守氨基酸置換”指在肽的指定位置用一種氨基酸置換另一種氨基酸,進(jìn)行該置換并不引起功能的喪失。在進(jìn)行此類改變時(shí),以例如側(cè)鏈取代基的大小、電荷情況、疏水性和親水性等的相對相似性為基礎(chǔ),進(jìn)行相似氨基酸殘基的置換,并且可通過常規(guī)測試方法分析這類置換對肽的功能的影響。
在一些實(shí)施方案中,當(dāng)氨基酸殘基被另一具有相似親水值(如在±2.0內(nèi))的氨基酸所置換時(shí),可進(jìn)行保守氨基酸置換,此時(shí)氨基酸殘基被指定為如下親水值(具體參見美國專利No.4,554,101,通過援引納入本文)Arg(+3.0)、Lys(+3.0)、Asp(+3.0)、Glu(+3.0)、Ser(+0.3)、Asn(+0.2)、Gln(+0.2)、Gly(0)、Pro(-0.5)、Thr(-0.4)、Ala(-0.5)、His(-0.5)、Cys(-1.0)、Met(-1.3)、Val(-1.5)、Leu(-1.8)、Ile(-1.8)、Tyr(-2.3)、Phe(-2.5)和Trp(-3.4)。
在其它實(shí)施方案中,當(dāng)氨基酸殘基被另一具有相似親水指數(shù)(如在±2.0內(nèi))的氨基酸所置換時(shí),可進(jìn)行保守氨基酸置換。在這些實(shí)施方案中,每一種氨基酸殘基可基于其疏水性和電荷特征被指定一個(gè)親水指數(shù),具體如下Ile(+4.5)、Val(+4.2)、Leu(+3.8)、Phe(+2.8)、Cys(+2.5)、Met(+1.9)、Ala(+1.8)、Gly(-0.4)、Thr(-0.7)、Ser(-0.8)、Trp(-0.9)、Tyr(-1.3)、Pro(-1.6)、His(-3.2)、Glu(-3.5)、Gln(-3.5)、Asp(-3.5)、Asn(-3.5)、Lys(-3.9)和Arg(-4.5)。
在其它實(shí)施方案中,當(dāng)氨基酸殘基被同類的另一種氨基酸所置換時(shí),可進(jìn)行保守氨基酸置換,此時(shí)氨基酸被分為非極性、酸性、堿性和中性,具體如下非極性Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Trp、Pro、Met;酸性Asp、Glu;堿性Lys、Arg、His;中性Gly、Ser、Thr、Cys、Asn、Gln、Tyr。
基因治療在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中,LPL治療劑以基因治療載體形式給予受試者。載體可由不同類型的病毒制備,包括腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、皰疹病毒(HSV)、慢病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中,使用了選自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7和AAV8的AAV血清型。
選擇最恰當(dāng)?shù)牟《净虿《緛喰驮诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員技術(shù)能力之內(nèi)。就某一種類型的組織而言,一些亞型比其它亞型更合適。例如,LPL的肌肉特異過表達(dá)可優(yōu)先由腺伴隨病毒(AVV)介導(dǎo)的肌細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)所誘導(dǎo)。肌肉對AAV介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)積極響應(yīng),并且可使用不同的血清型(AAV1、AAV6、AAV7、AAV8)。對肌肉的轉(zhuǎn)導(dǎo)可通過在多個(gè)位點(diǎn)肌內(nèi)注射AAV-LPL完成。保持局部病毒劑量較低的多個(gè)位點(diǎn)有助于防止LPL誘導(dǎo)的肌病或載體誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。這是使用血清型1長期轉(zhuǎn)導(dǎo)肌肉的有效方法,然而也可以采用使用其它血清型的靜脈內(nèi)給藥(AAV6,AAV8)。
基因治療的常規(guī)方法為本領(lǐng)域所熟知。參見例如Anderson等人的美國專利No.5,399,346(通過引用納入本文)。遞送遺傳物質(zhì)的生物相容膠囊在Baetge等人的PCT公布WO 95/05452中有述。將基因轉(zhuǎn)移入造血細(xì)胞的方法前人已有報(bào)道(參見Clapp,D.W.,et al.,Blood 781132-1139(1991);Anderson,Science 288627-9(2000);和Cavazzana-Calvo et al.,Science 288669-72(2000),通過援引將這些文獻(xiàn)納入本文)。
有效量在本發(fā)明的治療方法中,通過給予受試者有效量的LPL治療劑治療非酒精性脂肪性肝炎。本文所使用的非酒精性脂肪性肝炎指并不酗酒的患者肝臟中與過量攝入酒精引起的組織學(xué)變化相似的組織學(xué)變化進(jìn)展。
LPL治療劑一般包含在藥用組合物中,任選地可與藥用載體、稀釋劑和/或佐劑聯(lián)合。該組合物包括有效量(足以提供所需治療或預(yù)防效果)的LPL治療劑和可藥用的載體或賦形劑。“有效量”包括治療有效量或預(yù)防有效量。
“治療有效量”指在劑量上和所需時(shí)間內(nèi)有效獲得所需治療結(jié)果的量,該治療結(jié)果例如脂質(zhì)代謝中的參數(shù)的改變,如LPL活性的提高、HDL膽固醇的提高或三酰甘油水平的降低。LPL治療劑的治療有效量可根據(jù)下述因素有所變化如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個(gè)體體重以及LPL治療劑在個(gè)體中誘導(dǎo)所需反應(yīng)的能力??烧{(diào)節(jié)劑量服用方法以提供最佳治療反應(yīng)。治療有效量通常也指LPL治療劑的治療有益效果超過其任何毒副效果。
“預(yù)防有效量”指在劑量上和所需時(shí)間內(nèi)有效獲得所需預(yù)防結(jié)果的量,該預(yù)防結(jié)果為例如預(yù)防或抑制包括LPL反應(yīng)性病癥在內(nèi)的各種病癥,如冠心病、心血管疾病、冠狀動(dòng)脈疾病、高三酰甘油和/或低HDL??稍谑茉囌甙l(fā)病前或發(fā)病早期使用預(yù)防劑量,并且在某些情況下預(yù)防有效量可多于或少于治療有效量。
在具體的實(shí)施方案中,LPL治療劑的治療或預(yù)防有效量的范圍可為0.01 nM-0.1M、0.1 nM-0.1M、0.1 nM-0.05M、0.05 nM-15μM或0.01nM-10μM。應(yīng)該注意的是劑量值隨著有待緩解病癥的嚴(yán)重程度有所變化。對任何具體受試者而言,可根據(jù)個(gè)體需要以及給予或監(jiān)督給予組合物的人的專業(yè)判斷,隨時(shí)間變化對具體劑量服用方法進(jìn)行調(diào)整。本文所闡述的劑量范圍僅僅為示例性的,并不限制醫(yī)師可選擇的劑量范圍。
就基因治療載體而言,待給予劑量很大程度上依賴于被治療的受試者的病癥和個(gè)頭,以及治療制劑、治療頻率和給藥途徑。連續(xù)治療的服用方法,包括劑量、制劑和頻率,可由初始反應(yīng)和臨床判斷進(jìn)行指導(dǎo)。盡管在特定給藥方法中需要其它腸胃外途徑如吸入氣霧制劑,但是注射到組織的細(xì)胞間隙的腸胃外途徑為優(yōu)選的。在某些方案中,水性載體形式的含有基因和基因遞送系統(tǒng)的制劑以恰當(dāng)?shù)牧孔⑸淙虢M織中。組織靶標(biāo)可為特定的,例如肌肉或肝臟組織,或?yàn)閹追N組織的組合如肌肉和肝臟組織的組合。示例性組織靶標(biāo)可包括肝臟、骨骼肌、心肌、脂肪沉積(adipose deposit)、腎臟、肺、血管內(nèi)皮、上皮細(xì)胞和/或造血細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中,采用肌內(nèi)注射,小動(dòng)物(小鼠)的有效劑量范圍介于1×1012和1×1013基因拷貝(gc)/kg之間,較大動(dòng)物(貓)以及可能的受試人,該范圍介于1×1011和1×1012gc/kg之間。小鼠中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的水平通過肝素后(post-heparin)血漿中的LPL進(jìn)行測量,該水平高達(dá)300ng/ml(通過使用從DaiNippon商購的ELISA進(jìn)行測量),并且在單次給藥后該表達(dá)長期持續(xù)(>1年)。
本發(fā)明的組合物中的活性化合物的量可根據(jù)下述因素有所改變?nèi)缂膊顟B(tài)、年齡、性別和個(gè)體體重。可調(diào)節(jié)劑量服用方法以提供最佳治療反應(yīng)。例如,可給予單劑快速濃注、一段時(shí)間內(nèi)給予幾次分份劑量或者根據(jù)治療病癥的迫切程度按比例減少或增加劑量。優(yōu)選將腸胃外給予的組合物制備成易于給藥和劑量均勻的劑量單位形式。本文所使用的“劑量單位形式”指適于以單位劑量形式用于待治療受試者的物理上獨(dú)立的單位,每個(gè)單位含有計(jì)算好的與所需藥物載體聯(lián)合可產(chǎn)生所需治療效果的預(yù)定量活性化合物。對本發(fā)明劑量單位形式的技術(shù)指標(biāo)可由活性化合物的特有特征和所需獲得的具體治療效果、以及配制該治療個(gè)體病癥的活性化合物的領(lǐng)域所固有的局限性所確定。
本文所使用的“可藥用載體”或“賦形劑”包括生理相容的任何和全部溶劑、分散介質(zhì)、包被劑、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等張劑和延長吸收劑(absorption delaying agent)等。在一個(gè)實(shí)施方案中,載體適于腸胃外給藥,包括靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥或肌肉給藥?;蛘撸d體可適用于舌下給藥或口服給藥??伤幱幂d體包括無菌水溶液或分散劑和可即行制備無菌注射用溶液或分散劑的無菌粉劑。這類介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)的用途為本領(lǐng)域所熟知。除了與活性化合物不相容的任何常規(guī)介質(zhì)或藥劑以外,它們在本發(fā)明的藥物組合物中的用途本申請均已考慮。
附加的活性化合物也可被引入本發(fā)明的藥物組合物中。對共同給予其它治療劑的指導(dǎo)可見于例如加拿大藥師聯(lián)合會的加拿大藥典(Compendium of Pharmaceutical and Specialties,CPS)。
藥物組合物通常在制備和儲存條件下是無菌和穩(wěn)定的。藥物組合物可制備成適于容納較高藥物濃度的溶液、微乳劑、脂質(zhì)體或其它有序結(jié)構(gòu)形式。載體可為含有下述物質(zhì)的溶劑或分散介質(zhì)例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇和液態(tài)聚乙二醇等),及其合適的混合物??赏ㄟ^下述方法維持恰當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性例如通過使用諸如磷脂酰膽堿的包被劑、就分散劑而言可通過維持所需粒徑、以及通過使用表面活性劑。在很多情況下,優(yōu)選組合物中含有等張劑,如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇或氯化鈉。注射用組合物的延長吸收可通過在組合物中加入延長吸收的藥劑如單硬脂酸鹽和明膠而得以實(shí)現(xiàn)。LPL治療劑可以時(shí)間釋放制劑或控釋制劑(time or controlled releasedformulation)形式給藥,例如以含有緩釋聚合物或可防止化合物快速釋放的其它載體的組合物形式給藥,包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)。例如可使用可生物降解的、生物相容的聚合物,如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚羥乙酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚羥乙酸共聚物(PLG)。制備這些制劑的很多方法是已獲專利的或本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的。


圖1本發(fā)明的LPL治療劑的一個(gè)實(shí)施方案的蛋白序列,即S447X蛋白。
圖2 LPL mRNA序列。第256到1599個(gè)核苷酸編碼成熟的野生型LPL肽。
實(shí)施例實(shí)施例1 LPL基因治療引起三酰甘油重新分布本實(shí)施例研究了在雄性APOE3-Leiden轉(zhuǎn)基因小鼠中以LPLS447X為轉(zhuǎn)基因的AAV1對飲食誘導(dǎo)的高血脂癥的影響?;诖四康?,我們將1×1013gc’s/kg AAV1-LPL S447X注入6只小鼠,將PBS注入另6只小鼠(肌內(nèi),四個(gè)位點(diǎn))。一周之后小鼠開始Western型飲食。開始該飲食后28周處死小鼠。
結(jié)果表明接受LPL基因治療的小鼠在注射后25周肝素后LPL濃度逐漸升高,最高達(dá)300 ng/ml,但是總的肝素后脂酶活性并沒有顯著改變。另外,未檢測到禁食4小時(shí)后對血漿TG、HDL-c和TC的影響。盡管LPL基因治療對循環(huán)脂蛋白濃度沒有影響,但是它還是被證明是有效的,因?yàn)殪o脈內(nèi)快速濃注給予脂肪乳劑后,被處理小鼠表現(xiàn)出較快的TG和FFA清除率(p<0.05)。其它顯著結(jié)果包括與對照組相比,AAV1-LPL S447X處理動(dòng)物的體重增加顯著降低(p<0.05),該效果并非由腹部脂肪質(zhì)量的差異所引起。與對照相比,AAV1-S447X處理小鼠的肌肉組織勻漿表現(xiàn)出三酰甘油含量顯著提高(p<0.05),而肝臟組織勻漿表現(xiàn)出三酰甘油含量顯著降低(p<0.05)。
本實(shí)施例表明人LPL在小鼠骨骼肌中的表達(dá)對空腹血脂沒有影響,但是引起三酰甘油的重新分布以及體重增加的降低。
表1注射AAV1-LPLS447X后肝素后血漿中的人LPL濃度

表2注射脂肪乳劑后三酰甘油峰值(值的百分比)的脂肪耐量試驗(yàn)

表3注射脂肪乳劑后游離脂肪酸峰值(值的百分比)的脂肪耐量試驗(yàn)

序列表<110>阿姆斯特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)院和阿姆斯特丹分子治療股份有限公司<120>非酒精性脂肪性肝炎的治療方法<130>P215797<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>446<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Ala Asp Gln Arg Arg Asp Phe Ile Asp Ile Glu Ser Lys Phe Ala Leu1 5 10 15Arg Thr Pro Glu Asp Thr Ala Glu Asp Thr Cys His Leu Ile Pro Gly20 25 30Val Ala Glu Ser Val Ala Thr Cys His Phe Asn His Ser Ser Lys Thr35 40 45Phe Met Val Ile His Gly Trp Thr Val Thr Gly Met Tyr Glu Ser Trp50 55 60Val Pro Lys Leu Val Ala Ala Leu Tyr Lys Arg Glu Pro Asp Ser Asn65 70 75 80Val Ile Val Val Asp Trp Leu Ser Arg Ala Gln Glu His Tyr Pro Val85 90 95Ser Ala Gly Tyr Thr Lys Leu Val Gly Gln Asp Val Ala Arg Phe Ile100 105 110
Asn Trp Met Glu Glu Glu Phe Asn Tyr Pro Leu Asp Asn Val His Leu115 120 125Leu Gly Tyr Ser Leu Gly Ala His Ala Ala Gly Ile Ala Gly Ser Leu130 135 140Thr Asn Lys Lys Val Asn Arg Ile Thr Gly Leu Asp Pro Ala Gly Pro145 150 155 160Asn Phe Glu Tyr Ala Glu Ala Pro Ser Arg Leu Ser Pro Asp Asp Ala165 170 175Asp Phe Val Asp Val Leu His Thr Phe Thr Arg Gly Ser Pro Gly Arg180 185 190Ser Ile Gly Ile Gln Lys Pro Val Gly His Val Asp Ile Tyr Pro Asn195 200 205Gly Gly Thr Phe Gln Pro Gly Cys Asn Ile Gly Glu Ala Ile Arg Val210 215 220Ile Ala Glu Arg Gly Leu Gly Asp Val Asp Gln Leu Val Lys Cys Ser225 230 235 240His Glu Arg Ser Ile His Leu Phe Ile Asp Ser Leu Leu Asn Glu Glu245 250 255Asn Pro Ser Lys Ala Tyr Arg Cys Ser Ser Lys Glu Ala Phe Glu Lys260 265 270Gly Leu Cys Leu Ser Cys Arg Lys Asn Arg Cys Asn Asn Leu Gly Tyr275 280 285
Glu Ile Asn Lys Val Arg Ala Lys Arg Ser Ser Lys Met Tyr Leu Lys290 295 300Thr Arg Ser Gln Met Pro Tyr Lys Val Phe His Tyr Gln Val Lys Ile305 310 315 320His Phe Ser Gly Thr Glu Ser Glu Thr His Thr Asn Gln Ala Phe Glu325 330 335Ile Ser Leu Tyr Gly Thr Val Ala Glu Ser GLu Asn Ile Pro Phe Thr340 345 350Leu Pro Glu Val Ser Thr Asn Lys Thr Tyr Ser Phe Leu Ile Tyr Thr355 360 365Glu Val Asp Ile Gly Glu Leu Leu Met Leu Lys Leu Lys Trp Lys Ser370 375 380Asp Ser Tyr Phe Ser Trp Ser Asp Trp Trp Ser Ser Pro Gly Phe Ala385 390 395 400Ile Gln Lys Ile Arg Val Lys Ala Gly Glu Thr Gln Lys Lys Val Ile405 410 415Phe Cys Ser Arg Glu Lys Val Ser His Leu Gln Lys Gly Lys Ala Pro420 425 430Ala Val Phe Val Lys Cys His Asp Lys Ser Leu Asn Lys Lys435 440 445<210>2<211>3549
<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>2cccctcttcc tcctcctcaa gggaaagctg cccacttcta gctgccctgc catccccttt60aaagggcgac ttgctcagcg ccaaaccgcg gctccagccc tctccagcct ccggctcagc120cggctcatca gtcggtccgc gccttgcagc tcctccagag ggacgcgccc cgagatggag180agcaaagccc tgctcgtgct gactctggcc gtgtggctcc agagtctgac cgcctcccgc240ggaggggtgg ccgccgccga ccaaagaaga gattttatcg acatcgaaag taaatttgcc300ctaaggaccc ctgaagacac agctgaggac acttgccacc tcattcccgg agtagcagag360tccgtggcta cctgtcattt caatcacagc agcaaaacct tcatggtgat ccatggctgg420acggtaacag gaatgtatga gagttgggtg ccaaaacttg tggccgccct gtacaagaga480gaaccagact ccaatgtcat tgtggtggac tggctgtcac gggctcagga gcattaccca540gtgtccgcgg gctacaccaa actggtggga caggatgtgg cccggtttat caactggatg600gaggaggagt ttaactaccc tctggacaat gtccatctct tgggatacag ccttggagcc660catgctgctg gcattgcagg aagtctgacc aataagaaag tcaacagaat tactggcctc720gatccagctg gacctaactt tgagtatgca gaagccccga gtcgtctttc tcctgatgat780gcagattttg tagacgtctt acacacattc accagagggt cccctggtcg aagcattgga840atccagaaac cagttgggca tgttgacatt tacccgaatg gaggtacttt tcagccagga900tgtaacattg gagaagctat ccgcgtgatt gcagagagag gacttggaga tgtggaccag960ctagtgaagt gctcccacga gcgctccatt catctcttca tcgactctct gttgaatgaa1020gaaaatccaa gtaaggccta caggtgcagt tccaaggaag cctttgagaa agggctctgc1080ttgagttgta gaaagaaccg ctgcaacaat ctgggctatg agatcaataa agtcagagcc1140aaaagaagca gcaaaatgta cctgaagact cgttctcaga tgccctacaa agtcttccat1200
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權(quán)利要求
1.LPL治療劑用于制備治療受試者的非酒精性脂肪性肝炎的藥劑的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的用途,其中所述LPL治療劑為選自下列的一員a)S447X蛋白,該S447X蛋白具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列,或其衍生物;b)LPL蛋白,所述LPL蛋白具有含有最佳比對時(shí)與SEQ ID No.1有至少90%序列同一性的連續(xù)區(qū)段的氨基酸序列,它的LPL活性與a)中的蛋白相同或比它更大,或其衍生物;或者c)編碼a)或b)的核酸或其衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途,其中所述LPL治療劑含有含DNA編碼序列的核酸,該DNA編碼序列編碼與SEQ ID No.2的第256到1599個(gè)核苷酸有至少90%序列同一性的RNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的用途,其中所述LPL治療劑為含有DNA編碼序列的核酸,該DNA編碼序列在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID No.2的第256到1599個(gè)核苷酸雜交。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2的用途,其中所述LPL治療劑為LPL S447X蛋白,該LPL S447X蛋白具有與SEQ ID No.1有至少95%序列同一性的連續(xù)區(qū)段。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的用途,其中所述LPL治療劑以基因治療載體形式給予受試者。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的用途,其中所述基因治療載體包括病毒載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的用途,其中所述病毒載體包括腺伴隨病毒(AAV)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8的用途,其中所述受試者為人。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9的用途,其中所述LPL治療劑為腸胃外給藥。
11.一種治療受試者的非酒精性脂肪性肝炎的方法,包括給予受試者有效量的LPL治療劑。
12.權(quán)利要求11的方法,其中所述LPL治療劑為選自下列的一員a)S447X蛋白,該S447X蛋白具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列,或其衍生物;b)LPL蛋白,所述LPL蛋白具有含有最佳比對時(shí)與SEQ ID No.1有至少90%序列同一性的連續(xù)區(qū)段的氨基酸序列,它的LPL活性與a)中的蛋白相同或比它更大,或其衍生物;或者c)編碼a)或b)的核酸或其衍生物。
13.權(quán)利要求11的方法,其中所述LPL治療劑含有含DNA編碼序列的LPL核酸,該DNA編碼序列編碼與SEQ ID No.2的第256到1599個(gè)核苷酸有至少90%序列同一性的RNA。
14.權(quán)利要求11的方法,其中所述LPL治療劑為含有DNA編碼序列的核酸,該DNA編碼序列在嚴(yán)格條件下可與SEQ ID No.2的第256到1599個(gè)核苷酸雜交。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過給予受試者有效量的脂蛋白脂酶(LPL)治療劑治療受試者非酒精性脂肪性肝炎(NASH)的方法。該LPL治療劑優(yōu)選為S447X蛋白或其衍生物或變體,或編碼該蛋白的核酸。LPL治療劑可以基因治療載體方式使用。
文檔編號A61K48/00GK1972709SQ200580020633
公開日2007年5月30日 申請日期2005年6月20日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月21日
發(fā)明者S·J·H·范德弗特 申請人:阿姆斯特丹大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 阿姆斯特丹分子治療股份有限公司
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