專利名稱：無限增殖化細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞無限增殖化領(lǐng)域以及細(xì)胞作為病毒繁殖和重組蛋白質(zhì)表達(dá)的儲(chǔ)存庫的用途。具體地講，本發(fā)明涉及誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下的蛋白質(zhì)p53生產(chǎn)無限增殖化細(xì)胞的用途。
背景技術(shù)：
用于生產(chǎn)鳥類和動(dòng)物疫苗的許多鳥類病毒在胚胎化的雞卵或原代雞成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中進(jìn)行繁殖。使用這些雞的底物生產(chǎn)的動(dòng)物疫苗的實(shí)例包括用于狗的Canine Distemper，用于火雞的Marek’s病疫苗，呼腸孤病毒，禽痘病毒(Fowl Pox)以及用于家禽的感染性Bursal病疫苗。原代細(xì)胞培養(yǎng)物可以是各種各樣的且存在著受內(nèi)源性病毒、支原體及類似物的污染的危險(xiǎn)。從中獲取原代細(xì)胞培養(yǎng)物的動(dòng)物組織的來源常常是有限的并由于需要保持動(dòng)物原種處于無病原狀態(tài)而價(jià)格昂貴。
需要開發(fā)一種可再現(xiàn)的方法，以產(chǎn)生適用于動(dòng)物疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)的無病毒的無限增殖化鳥類細(xì)胞底物。充分地研究了特征的無限增殖化(即，傳代)細(xì)胞系的可用性具有限制或減少對(duì)原代動(dòng)物組織培養(yǎng)物的依賴性的益處，而原代動(dòng)物組織培養(yǎng)物從質(zhì)量觀點(diǎn)出發(fā)是不易控制的。在疫苗工業(yè)中，有關(guān)產(chǎn)品安全性，一致性和效價(jià)方面的規(guī)章的要求正促使公司尋求細(xì)胞系作為現(xiàn)行實(shí)踐中使用卵為基礎(chǔ)和原代細(xì)胞疫苗之底物的最佳替代物。疫苗生產(chǎn)公司必須先規(guī)定用于病毒生產(chǎn)的一致的細(xì)胞系以滿足容許所述公司傳播其疫苗的規(guī)章要求。在美國和國外，人和動(dòng)物疫苗產(chǎn)品的生產(chǎn)廠家均必須證明其疫苗底物是無污染的。用于產(chǎn)生從原代組織獲得的傳代動(dòng)物細(xì)胞系的可再現(xiàn)方法的出現(xiàn)將使生物制品生產(chǎn)廠家更好地控制生產(chǎn)過程并提高產(chǎn)品的安全性和一致性，同時(shí)最終降低成本。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的方法和通過將金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的編碼p53的核酸導(dǎo)入所述細(xì)胞并通過篩選有無限增殖化特征的細(xì)胞而產(chǎn)生的細(xì)胞。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，公開一種轉(zhuǎn)化原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞的方法，其步驟包括在一個(gè)能指導(dǎo)p53表達(dá)的基因載體中定位編碼金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53之核酸；將所述基因載體引入原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞；和篩選群體倍增時(shí)間為每天約0.6到1.5倍的細(xì)胞灶，其中所述細(xì)胞呈反轉(zhuǎn)錄酶陰性并是非致瘤性的。在一個(gè)實(shí)施方案中，原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是源于鳥類的，而另一實(shí)施方案中所述原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是源于人類的。在本發(fā)明中使用的原代細(xì)胞可源于多種組織，而在優(yōu)選實(shí)施方案中所述細(xì)胞從皮膚組織，胸肌組織和/或心肌組織獲得。
在本發(fā)明的另一方面，公開了細(xì)胞。這些細(xì)胞是含有在金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下能表達(dá)p53之基因載體的無限增殖化成纖維細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞是源于鳥類的。
本發(fā)明還涉及繁殖病毒的方法，包括步驟用一種無限增殖化細(xì)胞培養(yǎng)物的至少一個(gè)細(xì)胞接觸至少一種感染性病毒顆粒，其中所述培養(yǎng)物的細(xì)胞含能在金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下指導(dǎo)p53表達(dá)的基因載體；和收集由所述細(xì)胞產(chǎn)生的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是呼腸孤病毒，在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是HVT，而在第三個(gè)實(shí)施方案中，所述病毒是禽痘病毒。
在本發(fā)明的另一方面，公開了繁殖病毒的方法，包括步驟用原代細(xì)胞接觸至少一種感染性病毒顆粒；在細(xì)胞培養(yǎng)中，將原代細(xì)胞和含有處于金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)p53的基因載體的無限增殖化細(xì)胞一起培養(yǎng)；以及從細(xì)胞培養(yǎng)物中收集病毒。
本發(fā)明還涉及含金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53并含能在細(xì)胞中指導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)的至少一種載體的無限增殖化，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì)，而在另一實(shí)施方案中，所述載體編碼一種病毒的至少一部分。還有一種實(shí)施方案中，所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中使用的載體pJFNⅡ的示意圖。
圖2是本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中使用的載體pJFNⅡcMTD的示意圖。
發(fā)明詳述目前需要一種可重復(fù)地?zé)o限增殖化原代細(xì)胞和產(chǎn)生傳代細(xì)胞系的方法。產(chǎn)生支持病毒復(fù)制的充分研究了特征的細(xì)胞系的技術(shù)開發(fā)將使公司省去重復(fù)生產(chǎn)原代細(xì)胞的時(shí)間并避免了與污染和兩批卵之間存在的不一致性有關(guān)的問題。針對(duì)病毒繁殖所限定的無限增殖化細(xì)胞系降低了與終產(chǎn)品的質(zhì)量控制測(cè)試相關(guān)的成本。
本發(fā)明公開了使用誘導(dǎo)型金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的重組p53對(duì)原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞，具體地講是鳥類和人類細(xì)胞的無限增殖化。所述細(xì)胞用于培養(yǎng)病毒原種，用于表達(dá)病毒蛋白質(zhì)和作為包裝細(xì)胞系產(chǎn)生重組病毒。
原代細(xì)胞培養(yǎng)物最常獲得自從完整組織中新分離的細(xì)胞。這些細(xì)胞常常是無病毒材料的良好來源并且非常適合作為病毒復(fù)制的宿主細(xì)胞。原代細(xì)胞在病毒復(fù)制時(shí)不總是有效的，而且原代動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)中呈現(xiàn)有限的壽命，最終會(huì)衰老。衰老時(shí)，細(xì)胞停止分裂并在一定時(shí)間內(nèi)死亡。培養(yǎng)中細(xì)胞的分裂能力取決于幾個(gè)參數(shù)，包括細(xì)胞來源的品種和組織處于培養(yǎng)中的時(shí)間。經(jīng)歷衰老的細(xì)胞不能長(zhǎng)期在培養(yǎng)中維持，因而是病毒原種繁殖的非再生性宿主。原代細(xì)胞在達(dá)到衰老前一般經(jīng)過23-26代。本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選在約第2代到第4代間用p53轉(zhuǎn)染。
如本發(fā)明通篇所使用的無限增殖化細(xì)胞是指能在培養(yǎng)中生長(zhǎng)超過25代的細(xì)胞。無限增殖化細(xì)胞不同于轉(zhuǎn)化細(xì)胞，因?yàn)?，與轉(zhuǎn)化細(xì)胞不同，無限增殖化細(xì)胞呈現(xiàn)出密度依賴型的生長(zhǎng)制約并保持一種正常的形態(tài)。與無限增殖化細(xì)胞相反，轉(zhuǎn)化細(xì)胞能在軟瓊脂中生長(zhǎng)并在注射給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物時(shí)常能形成腫瘤。
通過將誘導(dǎo)型金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53引入優(yōu)選的原代細(xì)胞使本發(fā)明的細(xì)胞無限增殖化。一部分由于p53基因中的突變以某種方式導(dǎo)致所有的人類癌癥上升50％的事實(shí)，因此細(xì)胞核癌基因p53是研究的最充分的腫瘤抑制基因之一(Levine等，自然351:453-456,1991)。p53是一種細(xì)胞的磷蛋白并常在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中呈現(xiàn)上升的水平(De Leo,A.B.等，Pro.Natl.Acad.Sci 76:2420-2424,1979)。野生型p53似乎在生長(zhǎng)抑制方式中起作用(Michalovity等，細(xì)胞62:671-680,1990)并且p53使細(xì)胞停留在細(xì)胞周期的對(duì)DNA損傷反應(yīng)的關(guān)卡(Kastan等，癌癥研究51:6304-6311,1991)。該關(guān)卡功能通過p53的積累和隨后的GADD45(一種重要的剪接修復(fù)蛋白質(zhì))，WAF1(p21)，和MDM2(其與p53形成一種穩(wěn)定的復(fù)合物)基因的誘導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)。(Kastan，等，細(xì)胞71:587-597,1992)。這個(gè)理論得到了對(duì)p53中的突變能導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖化的觀察的支持。
數(shù)篇報(bào)道通過一種普遍存在的細(xì)胞周期蛋白激酶抑制因子(即，Cipl,E1-Deiry等，細(xì)胞75:817-825,1993由Harper等在細(xì)胞75:805-816,1993報(bào)道的WAF1)將野生型p53分子與細(xì)胞分裂的抑制作用聯(lián)系起來。實(shí)驗(yàn)顯示p53蛋白質(zhì)刺激產(chǎn)生另一種蛋白質(zhì)p21，它在正常細(xì)胞中與一種四元復(fù)合物有關(guān)，其中包括細(xì)胞周期蛋白依賴型激酶，細(xì)胞周期蛋白，增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)和p21。在轉(zhuǎn)化細(xì)胞中，p53功能的喪失似乎是由于突變導(dǎo)致p21和來自多蛋白復(fù)合物的PCNA丟失的原因，從而導(dǎo)致沒有控制的生長(zhǎng)。
當(dāng)將p53中的突變與細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)聯(lián)系起來時(shí)，存在其他的理論，這些理論推斷了p53調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的其他途徑。(Milner，等CellBiol.Int.Rep.4:663-667,1980,Milner等112:785-788,1981,Mercer等Proc.Natl Acad.Sci.79:6309-6312,1982和Mercer等分子細(xì)胞生物學(xué)4:276-281,1984)。例如，p53基因中的突變可能與使細(xì)胞不能修復(fù)細(xì)胞周期臨界點(diǎn)時(shí)由于生理和物理因素，如緊張，老化，離子輻射或接觸致癌物而發(fā)生的損傷有關(guān)。
本領(lǐng)域人員已知p53用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。有一些非突變的大鼠p53能無限增殖化嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞的證據(jù)。Jenkins等證明了只有在使用來自致癌病毒、如勞氏肉瘤病毒(RSV)和猴病毒40(SV40)的組成型啟動(dòng)子時(shí)，大鼠軟骨細(xì)胞才無限增殖化(Jenkins等自然317:816-818,1985)。Eliyahu等(自然312:646-649,1984)和Parada等(自然312:649-651,1984)也能無限增殖化大鼠細(xì)胞，但他們的數(shù)據(jù)與Jenkins等相矛盾并且證明了在單獨(dú)轉(zhuǎn)染p53基因時(shí)，p53構(gòu)建體不能無限增殖化細(xì)胞，但用癌基因ras共轉(zhuǎn)染所述細(xì)胞時(shí)p53構(gòu)建體產(chǎn)生轉(zhuǎn)化灶。當(dāng)這些細(xì)胞具有轉(zhuǎn)化細(xì)胞的特征時(shí)，所述細(xì)胞在轉(zhuǎn)化后相對(duì)短的時(shí)間內(nèi)經(jīng)過衰老并停止增殖。
與Jenkins,Eliyahu，和Parada(上述全部)不同，Rovinski和Benchimol(癌基因2:445-452,1988)用在其內(nèi)源啟動(dòng)子控制下的大鼠p53證明了大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的無限增殖化。Rovinski公布的結(jié)果可通過其他研究得到解釋，這些研究表明人們知道大鼠細(xì)胞易于進(jìn)行無限增殖化和轉(zhuǎn)化。所述細(xì)胞被認(rèn)為是以某種方式引發(fā)的以至它們對(duì)無限增殖化和轉(zhuǎn)化刺激特別敏感。研究已經(jīng)重復(fù)地證實(shí)了嚙齒類成纖維細(xì)胞以高頻率自發(fā)地進(jìn)行無限增殖化(Ponten,.J.Virol.Monogr.8:1,1971；Ponten J.,Biochim,Biophys.Acta 458:397,1976；Todaro和Green細(xì)胞生物學(xué)雜志17:299-313,1963；Meek等，Exp.Cell Res.107:277-284,1977和Curatolo，等In Vitro 20:597-601,1984)。的確，Rovinski和Bechimol(上述446頁)注意到他們的大鼠胚胎成纖維細(xì)胞對(duì)照物是單獨(dú)用一種表達(dá)標(biāo)記轉(zhuǎn)染的并具有約10％的自發(fā)的無限增殖化頻率。相反，《科學(xué)》中的一篇綜述和其他研究表明不存在來自正常供體的人或雞成纖細(xì)胞自發(fā)地?zé)o限增殖化的報(bào)道(Smith等科學(xué)273:63-67,1996,Hayflick,Exp.Cell Res.37:614-636,1965和Smith等，癌癥研究進(jìn)展54:63-77,1990)。況且，大鼠細(xì)胞攜帶各種各樣的內(nèi)源性病毒，特別是使其與商業(yè)疫苗生產(chǎn)不適應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄病毒。
從各種哺乳動(dòng)物已經(jīng)分離出大量的p53基因。例如雞p53的序列(SEQ ID NO:1)可從GenBank的登記號(hào)X13057獲得和從Soussi等的文獻(xiàn)中得到(核酸研究16(23):11383,1988)。正常人p53的序列可從GenBank的登記號(hào)W88747和HSP53G獲得并且通過華盛頓大學(xué)藥學(xué)院公眾可得到該克隆。人p53基因還以GenBank的登記號(hào)M22881-M22884,M22887-M22888 M22894-M33898作為外顯子1-11被提供，并由Buchman等發(fā)表(基因70(2):245-252,1988)。馬的p53可從GenBank的登記號(hào)U37120獲得，而非洲綠猴的p53從GenBank的登記號(hào)X16384獲得。羅猴p53可從GenBank的登記號(hào)L20442獲得，家牛p53從X81704(還參見Dequiedt F等，DNA序列5(4):261-64,1995)，而貓p53從GenBank的登記號(hào)D26608(Okuda M.等Int.J.Cancer 58(4):602-7,1994)獲得。其他序列以及參考使用這些序列的出版物可從如GenBank及類似的許多基因數(shù)據(jù)庫中獲得。熟悉本領(lǐng)域的人將能容易地找到所述文獻(xiàn)或基因數(shù)據(jù)庫以獲得本領(lǐng)域熟知的p53基因序列。
金屬硫蛋白啟動(dòng)子具有多個(gè)金屬結(jié)合區(qū)，并且由金屬硫蛋白啟動(dòng)子調(diào)節(jié)的基因表達(dá)可由Cd++,Cu++和Zn++誘導(dǎo)。該啟動(dòng)子含多個(gè)金屬調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子的多元潛在的結(jié)合位點(diǎn)，包括SPI和MLTF。在啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)的金屬效應(yīng)元件和該啟動(dòng)子中其他識(shí)別區(qū)域由Mueller等(基因與開發(fā)4:412-426,1988)和Lee等(自然325:368-372,1987)進(jìn)行了詳細(xì)的討論。
與編碼p53的基因類似，有許多本領(lǐng)域已知的來自各個(gè)物種的金屬硫蛋白基因。例如雞的金屬硫蛋白啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:2)可從Fernando等的文獻(xiàn)中得到(基因8:177-183,1989)。根據(jù)公開的所述金屬硫蛋白啟動(dòng)子的特征(上述Mueller等和上述Lee等)從本領(lǐng)域可以得到的許多公布的金屬硫蛋白基因序列的所述金屬硫蛋白基因序列中可鑒別所述啟動(dòng)子區(qū)。人金屬硫蛋白啟動(dòng)子基因的序列可從GenBankW68639,X65607,V00594獲得(還參見Stennard等Biochim.Biophys.Acta1218(3):357-365,1994；Richards等，細(xì)胞37(1):263-272,1984和Karin等，核酸研究10(10):3165-3173,1982)。綿羊的金屬硫蛋白啟動(dòng)子可從GenBank的登記號(hào)X04626獲得(參見Peterson等，歐洲生物化學(xué)雜志，160(3):579-585,1986)。其他序列以及參考使用所述序列的出版物可從如GenBank,GenEMBL，和類似的許多基因數(shù)據(jù)庫中獲得。熟悉本領(lǐng)域的人將能容易地找到所述文獻(xiàn)或基因數(shù)據(jù)庫以得到本領(lǐng)域熟知的有關(guān)金屬硫蛋白啟動(dòng)子的基因序列。
通過將編碼p53的核酸引入細(xì)胞使本發(fā)明的細(xì)胞無限增殖化，其中編碼p53的核酸處于金屬硫蛋白啟動(dòng)子的控制下，即把該金屬硫蛋白啟動(dòng)子可操作地連接到編碼p53的核酸上。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53由一表達(dá)載體被引入所述細(xì)胞中。有各種市售表達(dá)載體可用，且熟悉本領(lǐng)域的人將易于認(rèn)識(shí)到許多種載體可用于在非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)p53。表達(dá)載體還可包括各種其他特征，這些特征促進(jìn)了載體在原核細(xì)胞中的復(fù)制，選擇載體，整合其他基因序列或通過添加其他調(diào)節(jié)序列來促進(jìn)基因的表達(dá)。這些特征的實(shí)例包括，但不限于細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的內(nèi)含物，賦予抗生素抗性的基因，其他選擇性標(biāo)記，其中包括但不限于β半乳糖苷酶，熒光素酶，或類似物，增強(qiáng)子序列，多克隆位點(diǎn)等。
實(shí)施例1詳細(xì)描述了金屬硫蛋白啟動(dòng)子和p53基因的鑒別以及將所述啟動(dòng)子與p53插入到表達(dá)載體中。金屬硫蛋白啟動(dòng)子與p53基因優(yōu)選來自同一物種。把金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53構(gòu)建體引入細(xì)胞。所述細(xì)胞優(yōu)選原代細(xì)胞，并且如本公開文本中所使用的，原代細(xì)胞優(yōu)選已培養(yǎng)1-10代和/或不超過2個(gè)月的細(xì)胞。
原代細(xì)胞一般其特征為在培養(yǎng)中有有限生長(zhǎng)能力的細(xì)胞。原代細(xì)胞是從完整組織分離并置于培養(yǎng)中的那些細(xì)胞。所述細(xì)胞可從哺乳動(dòng)物的各個(gè)品種的許多組織獲得。人的活檢組織，來自狗、馬、豬、雞、牛的組織樣品，胚胎組織等可被絞碎，用胰蛋白酶消化并分離為懸浮液中的單細(xì)胞或作為單層培養(yǎng)物或小的(但完整的)組織樣品用于轉(zhuǎn)染。分離的適合于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞包括成纖維細(xì)胞，肌細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞。熟悉本領(lǐng)域的人將認(rèn)識(shí)到有許多熟知的從各種組織樣品中得到和分離各種細(xì)胞的方法，并認(rèn)識(shí)到可以不經(jīng)過過多的試驗(yàn)來實(shí)施這些方法。實(shí)施例2公開了用于從雞胚組織分離細(xì)胞的方法，也包括從皮膚，心肌和胸肌分離細(xì)胞的方法。
在本領(lǐng)域中已知有許多方法用于將能指導(dǎo)核酸序列表達(dá)的載體引入細(xì)胞或?qū)⒑怂崞我爰?xì)胞。這些方法包括，但不限于，磷酸鈣沉淀法，電穿孔法，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染技術(shù)，多胺轉(zhuǎn)染技術(shù)和病毒顆粒轉(zhuǎn)染技術(shù)。實(shí)施例3提供使用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺將本發(fā)明的p53/金屬硫蛋白核酸片段引入真核細(xì)胞的方法。有各種市售試劑盒可用，它們使用各種方法使核酸片段結(jié)合到真核細(xì)胞中。因此，引入金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的編碼p53的核酸之方法不應(yīng)有損于本發(fā)明的范圍。
轉(zhuǎn)染后，在選擇性生長(zhǎng)壓力下培養(yǎng)和擴(kuò)展本發(fā)明之細(xì)胞，若有必要，鑒定含轉(zhuǎn)染的核酸片段的克隆。用必需使用的陽離子處理細(xì)胞以促進(jìn)金屬硫蛋白啟動(dòng)子表達(dá)。實(shí)施例3使用硫酸鋅以誘導(dǎo)金屬硫蛋白啟動(dòng)子。挑選細(xì)胞灶并使其在培養(yǎng)中生長(zhǎng)。術(shù)語“細(xì)胞灶”指有不同于周圍細(xì)胞的特征的細(xì)胞群。在本發(fā)明中，被金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的編碼p53的核酸片段無限增殖化的細(xì)胞比其周圍沒有無限增殖化的細(xì)胞生長(zhǎng)的更快。無限增殖化的細(xì)胞生長(zhǎng)的更快并在原代培養(yǎng)物的單層上形成集落。使用克隆環(huán)可分離所述集落并使其在培養(yǎng)中擴(kuò)展。
當(dāng)將含p53/金屬硫蛋白的構(gòu)建體引入所述細(xì)胞后約經(jīng)25代組織培養(yǎng)時(shí)，和當(dāng)所述細(xì)胞以每天至少約0.6倍進(jìn)行群體倍增并優(yōu)選以每天約0.6到1.5倍進(jìn)行群體倍增時(shí)，則認(rèn)為所述細(xì)胞被無限增殖化。所述細(xì)胞維持一種正常的形態(tài)并呈現(xiàn)密度依賴型和/或接觸抑制型生長(zhǎng)。通過本發(fā)明方法分析了來自雞胚三種組織的細(xì)胞的無限增殖化能力。從如實(shí)施例5中提供的心肌細(xì)胞，胸肌細(xì)胞和皮膚細(xì)胞鑒定出許多克隆。
應(yīng)該檢測(cè)本發(fā)明的無限增殖化細(xì)胞的病毒污染物以及其他組織培養(yǎng)污染物，如低水平的細(xì)菌污染物，支原體及類似物。可檢測(cè)所述細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，禽流感病毒(A型)，禽呼腸孤病毒，禽腺病毒(Ⅰ-Ⅲ類群)，禽腦脊髓炎病毒，禽痘病毒，新城疫病毒，副粘病毒(2型)，以及支原體，沙門氏菌和其他污染物(如在9C.F.R.§113及其細(xì)目所列污染物)的證據(jù)。
用聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)所述細(xì)胞的大范圍的病毒污染物以鑒定污染的核酸片段。有各種針對(duì)各種各樣病毒的市售可得的檢測(cè)試劑盒，可用于測(cè)定是否本發(fā)明細(xì)胞含污染病毒。同樣，有檢測(cè)病毒抗原的市售檢測(cè)，其中抗原來自各種不同的病毒。這些檢測(cè)包括ELISA測(cè)定，免疫熒光測(cè)定等。所有這些測(cè)定是眾所周知的并涉及常規(guī)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。實(shí)施例4提供一種測(cè)定本發(fā)明細(xì)胞是否呈逆轉(zhuǎn)錄酶陰性的方法。在含金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53之無限增殖化細(xì)胞中逆轉(zhuǎn)錄酶活性的證據(jù)是逆轉(zhuǎn)錄病毒污染的證據(jù)。
還檢測(cè)所述細(xì)胞的致瘤的潛力。本發(fā)明細(xì)胞優(yōu)選是不致瘤的。測(cè)定細(xì)胞群是否是致瘤的測(cè)試在本領(lǐng)域中是已知的。實(shí)施例6提供評(píng)定本發(fā)明的無限增殖化細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)的方法，而實(shí)施例7提供將本發(fā)明細(xì)胞引入對(duì)本發(fā)明細(xì)胞來說是優(yōu)選品種之動(dòng)物的方法，以測(cè)定是否本發(fā)明細(xì)胞能誘導(dǎo)受體動(dòng)物中的腫瘤。為測(cè)試含編碼金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53之核酸的人類細(xì)胞的致瘤潛力，可測(cè)試所述細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)和測(cè)試所述細(xì)胞在裸鼠中或鼠或其他有重建的人免疫系統(tǒng)之實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中的生長(zhǎng)。
在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述細(xì)胞可用于繁殖病毒。如實(shí)施例8中所證明的，本發(fā)明細(xì)胞支持呼腸孤病毒感染，火雞皰疹病毒(HVT)和馬立克氏病病毒。從雞組織得到的本發(fā)明細(xì)胞還可用做感染性Bursal病病毒，感染性支氣管炎病毒，新城疫病毒，感染性喉頭氣管炎病毒，包括Ⅲ型腺病毒在內(nèi)的各種腺病毒，Circodnavirideae，雞HSV，禽痘病毒及其他病毒的宿主。許多人和動(dòng)物病毒在含胚卵中生長(zhǎng)，其中包括，但不限于，狂犬病病毒，犬細(xì)球病毒，貓白血球泛減癥病毒，嵌杯樣病毒，肝炎病毒，流感病毒，水痘帶狀皰疹病毒以及其他病毒的宿主。還可檢測(cè)這些病毒在本發(fā)明無限增殖化細(xì)胞中的生長(zhǎng)能力。
為生產(chǎn)病毒原種，可將所述本發(fā)明細(xì)胞接種到組織培養(yǎng)燒瓶，滾瓶，旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或中空纖維反應(yīng)器中。為滾瓶中病毒的繁殖，按約2-5×104細(xì)胞/平方厘米表面積接種所述細(xì)胞。啟動(dòng)病毒原種生長(zhǎng)的感染復(fù)數(shù)(感染性病毒顆粒與細(xì)胞的比例)將根據(jù)毒株而有所不同。熟悉病毒學(xué)領(lǐng)域以及熟悉具體病毒生長(zhǎng)和病毒株的人無須過多實(shí)驗(yàn)即能通過標(biāo)準(zhǔn)地控制感染復(fù)數(shù)，溫度，培養(yǎng)基的變化等使病毒原種產(chǎn)率最大化。
感染后收獲病毒以取得感染病毒原種的方法還隨病毒株而不同。被膜病毒比無被膜病毒更慢地釋放到培養(yǎng)基中。病毒原種可僅從所述培養(yǎng)基獲得或從用條件培養(yǎng)基匯集的細(xì)胞裂解物獲得。對(duì)裂解病毒來說(在病毒釋放期間它們足以裂解一個(gè)細(xì)胞)，在輕微的離心步驟以除去細(xì)胞碎片后收獲所述條件培養(yǎng)基(例如含病毒的余下的培養(yǎng)基)就足夠了。而且，收獲并保存來自大范圍病毒株之病毒的方法是本領(lǐng)域所熟知的。
本領(lǐng)域眾所周知的還有從細(xì)胞培養(yǎng)物中定量病毒生長(zhǎng)的各種方法。例如，對(duì)皰疹病毒科的成員以及對(duì)在細(xì)胞單層表面上產(chǎn)生細(xì)胞病理學(xué)上的細(xì)胞灶的各種病毒的病毒原種滴度通過噬菌斑測(cè)定(如噬菌斑形成單位/毫升培養(yǎng)液或如噬菌斑形成單位/疫苗接種物的病毒定量的劑量)或以組織培養(yǎng)感染劑量-50(TCID50)而容易地被定量。通過TCID50更好地定量了快速裂解病毒，其中TCID50為在一定時(shí)間內(nèi)，能感染50％的所述培養(yǎng)物的病毒原種的劑量或稀釋度。培養(yǎng)和定量病毒的方法在本領(lǐng)域中是眾所周知的，而指導(dǎo)病毒定量方法的資料來源在Fields等(eds.)基礎(chǔ)病毒學(xué)1991,Raven出版社，紐約或在Mandell等(eds.)傳染病的原理與實(shí)踐，1985,John Wiley & Sons，紐約中可找到。
本發(fā)明的細(xì)胞也可以用來生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)，包括病毒蛋白質(zhì)及類似物。將編碼重組蛋白質(zhì)的核酸插入到能指導(dǎo)蛋白質(zhì)在真核細(xì)胞(如本發(fā)明的無限增殖化細(xì)胞)中表達(dá)的調(diào)節(jié)元件控制下的核酸載體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的。表達(dá)載體是能指導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)的可復(fù)制的核酸片段。通過雜志出版物和供應(yīng)商，許多表達(dá)載體，包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本領(lǐng)域中是可用的。可復(fù)制表達(dá)載體成分一般包括，但不限于下述一種或多種成分復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記基因，增強(qiáng)子元件，啟動(dòng)子元件，任選的信號(hào)序列和轉(zhuǎn)錄終止序列。所述選擇或標(biāo)記基因編碼起識(shí)別被轉(zhuǎn)化或被轉(zhuǎn)染細(xì)胞群作用的蛋白質(zhì)。典型的選擇基因編碼提供對(duì)抗生素或其他毒素的抗性，補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)缺陷型或提供復(fù)合培養(yǎng)基所沒有的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)成分的蛋白質(zhì)。
把含編碼重組蛋白質(zhì)的核酸之表達(dá)載體轉(zhuǎn)染到所述細(xì)胞中并用來指導(dǎo)在本發(fā)明無限增殖化細(xì)胞中重組蛋白質(zhì)的表達(dá)。所述載體優(yōu)選可編碼任何能在雞胚成纖維細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白質(zhì)，其中包括但不限于病毒蛋白質(zhì)，包括逆轉(zhuǎn)錄酶和/或病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)。在細(xì)胞中產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的載體的實(shí)例包括產(chǎn)生腫瘤抑制蛋白或病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)[如Givol等癌基因11(12):2609-2618,1995,Givol等細(xì)胞生長(zhǎng)與分化5(4):419-429,1994,Akiyama等病毒學(xué)203(2):211-220,1994和Boyer，等癌基因20:457-66,1993公開的那些病毒結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)]的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
本發(fā)明的細(xì)胞可用做表達(dá)重組病毒(包括但不限于重組逆轉(zhuǎn)錄病毒)的培養(yǎng)基。本發(fā)明的細(xì)胞可用做對(duì)基因治療等有用的遺傳工程病毒的包裝細(xì)胞系。使用具體的細(xì)胞系作為包裝細(xì)胞系所涉及的構(gòu)建體和方法是本領(lǐng)域所熟知的。例如Boerkoel等(病毒學(xué)195(2):669-79,1993)公開了用原代雞胚成纖維細(xì)胞為包裝細(xì)胞系包裝病毒的方法。那些同樣的方法可用于在本發(fā)明的無限增殖化細(xì)胞中包裝病毒。
由于大多數(shù)鳥類細(xì)胞系和全部轉(zhuǎn)化的鳥類細(xì)胞以及幾乎所有的嚙齒類轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或者含病毒污染物(如內(nèi)源性病毒)或者產(chǎn)生病毒蛋白質(zhì)，它們不適合于生產(chǎn)人或動(dòng)物疫苗。所述細(xì)胞不能用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)，因?yàn)樗鰞?nèi)源性污染物會(huì)污染純化的重組蛋白質(zhì)制劑。作為優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明的細(xì)胞提供對(duì)這些問題的適當(dāng)?shù)奶娲桨浮?br> 本發(fā)明的細(xì)胞還可用做支持來自其他細(xì)胞的病毒生長(zhǎng)的底物。這些其他細(xì)胞包括原代細(xì)胞或在其他細(xì)胞存在或細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(如膠原，層連粘蛋白等)存在時(shí)的培養(yǎng)中顯示出生長(zhǎng)有所改進(jìn)或壽命延長(zhǎng)的培養(yǎng)細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，將細(xì)胞與病毒混合，然后與本發(fā)明細(xì)胞混合，優(yōu)選的比例是細(xì)胞與本發(fā)明細(xì)胞之比約為1∶5個(gè)細(xì)胞到約1∶20個(gè)細(xì)胞之間，并更優(yōu)選約1∶10的比例(1個(gè)細(xì)胞比大約10個(gè)本發(fā)明的細(xì)胞)。然后把混合的細(xì)胞置于培養(yǎng)中。在第二個(gè)實(shí)施方案中，把所述細(xì)胞與病毒混合并置于已經(jīng)附著在組織培養(yǎng)表面上的本發(fā)明無限增殖化細(xì)胞的表面上。本發(fā)明的細(xì)胞起到其他細(xì)胞的支持物的作用并且(無意限制本發(fā)明范圍)本發(fā)明細(xì)胞可提供生長(zhǎng)因子等以及細(xì)胞外基質(zhì)成分等以便在其他細(xì)胞產(chǎn)生病毒時(shí)支持這些其他細(xì)胞。實(shí)施例9提供使用本發(fā)明細(xì)胞作為細(xì)胞底物的一個(gè)實(shí)例。
本文引用的全部參考文獻(xiàn)專誠插入本公開文件、僅供參考。本發(fā)明的具體實(shí)施方案將進(jìn)行詳細(xì)討論，并且在本發(fā)明范圍內(nèi)已經(jīng)提到了可能的變動(dòng)。有各種可為熟悉本領(lǐng)域的人所用的替代的技術(shù)和方法，這些技術(shù)和方法同樣能使專業(yè)人員成功地實(shí)現(xiàn)預(yù)計(jì)的發(fā)明。
實(shí)施例1例舉性p53表達(dá)載體的制備通過用pBluescriptSK載體(Stratagene,LaJolla,CA)起始來構(gòu)建質(zhì)粒pJFNⅡ(5436bp)。用PvuⅡ除去多克隆位點(diǎn)和lacZ基因。用牛小腸堿性磷酸酶處理2513bp的載體片段。然后用EDTA處理所述片段，在65℃培養(yǎng)并用苯酚/氯仿，繼之以乙醇沉淀提取。用BamH1和NdeⅠ消化質(zhì)粒pRSVneo(Gorman,C.，等科學(xué)221:551-553,1983)。用DNA聚合酶的Klenow片段(Stratagene,LaJolla,CA)處理所述片段并用2513bp載體片段與平頭末端連接。在分離該克隆后，用EcoRⅠ消化所述載體，用Klenow片段處理并重新連接。所述消化從啟動(dòng)子區(qū)除去EcoRⅠ位點(diǎn)。該質(zhì)粒被命名為pJFNⅡ(參見圖1)。
在載體中距離編碼新霉素抗性基因所使用的SV40聚腺苷酸化信號(hào)下游約1000bp的位點(diǎn)上用BamHⅠ切開pJFNⅡ。用PCR獲得雞金屬硫蛋白啟動(dòng)子。下述引物用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)以獲得所述金屬硫蛋白啟動(dòng)子左引物5’CGAAGATCTCTCAGCACGGCCCCACGCT3’(SEQ ID NO:3)右引物5’CGAAGATCTTTATTCTCGAGATATCGAATTCTCGGGTGGGCTCGTAGCAGT3’(SEQ ID NO:4)在這些實(shí)驗(yàn)中，PCR反應(yīng)的模板是質(zhì)粒pCBcMTlacZ。質(zhì)粒pCBcMtlacZ中的雞金屬硫蛋白誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Fernando和Andres，基因81:177-183,1989)從Dr.Ann Gibbins(Guelph大學(xué)，Guelf，安大略，加拿大)處獲得。熟悉本領(lǐng)域的人將認(rèn)識(shí)到所述啟動(dòng)子還可從基因表達(dá)文庫鑒定以得到其他物種(包括雞)的啟動(dòng)子。所述引物從IDT(Coralville,LA)購得。左和右引物均被設(shè)計(jì)為包括BglⅡ位點(diǎn)。用這些引物擴(kuò)增產(chǎn)生了與SEQ ID NO:2相應(yīng)的核酸片段內(nèi)所含的金屬硫蛋白啟動(dòng)子。
優(yōu)選的雞金屬硫蛋白啟動(dòng)子序列(SEQ ID NO:2)是CTCTCAGCACGG CCCCACGCTG TGCGCACCGC CTCGCAGCGCGGCCCGGGGG GGTGGCGGGG GTGGGAGCAG CAGTGGCGCAATGACCCCTC CGGGTCACAT TCCCGCAACC GAGCGCAGAGTGCGTGGCCG GGAAATTCCC CCCCCCCAAT TCGCCTTTCGGCAGCCAAAG CGGGAGGGGG GGAGTGAGGA GGGTCAGGCACGTTGGGGTC CGTGCCGTGT TCTGGCAAAG TGTCGTGTTTGGGGGGGGGG GGGAGCAAGG AAGGGAGGCG AGGGGTGAGGACACAAAGCA AAAGCGCCCT AAATCTGTTG GCACACATGGCCATCCCACA GCTGTATCCC CCTGCTTTGG GGGAACCCCAACACCAGGGC TGGCCCCGCG GTGAGGCTCC CCCCAGGCAGGGGGCACGGC CGTGACCCCG CTGAGCACGG CACGGCGCTGCCCCGCCCCG CTGAGCACGG CACGGCACGG CACGGCACGGCCCCCCGAGC ACGGCTCAGC ACGGCACGGC GCTCAGCACGGCACGGATCG GCACCGCCCC GCCGTGCGCT GCGCGCAGCACCACCCCGGC CCTATAAATA CAGGGCGGGC AGCGGGACTCGGGACTGCTA CGAGCCCACC CGAG3′該啟動(dòng)子含三個(gè)主要的金屬調(diào)節(jié)元件，GC-盒功能區(qū)和TATA盒。所述金屬調(diào)節(jié)元件結(jié)合金屬并誘導(dǎo)位于下游的雞金屬硫蛋白基因。用BamHⅠ將從左和右引物插入BglⅠ末端的擴(kuò)增的金屬硫蛋白片段連接到pJFNⅡ。選擇從所述連接鑒定的載體克隆提供的新霉素抗性的能力。所述克隆被命名為pJFNⅡcMTD并且約為6088bp。該載體包括多克隆位點(diǎn)，其中包括EcoRⅠ,EcoRⅤ和XhoⅠ。所述右引物內(nèi)的聚腺苷酸化信號(hào)使缺乏此信號(hào)的DNA序列有效地表達(dá)。
把如來自T.Soussi的EcoRⅠ插入片段所提供的雞p53cDNA(SEQ IDNO:1)(GenBank的登記號(hào)#X13057)插入到pJFNⅡcMTD的多克隆位點(diǎn)中的EcoRⅠ內(nèi)切酶限制位點(diǎn)。該cDNA序列(Soussi等，核酸研究16:11383,1988)含64bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)，一個(gè)編碼367個(gè)氨基酸的p53分子的1101bp的開放閱讀框，一個(gè)390的3’UTR和一個(gè)小的poly-A尾。雞p53與人的同源片段有約47％的同源性。得到含EcoRⅠ粘性末端的1555bp的雞p53cDNA，并用EcoRⅠ消化cMT(金屬硫蛋白)/SK+構(gòu)建體。把所述雞p53cDNA插入片段連接到EcoRⅠ位點(diǎn)。鑒定出含以正向(有義)取向的所述p53插入片段的克隆。把所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)染進(jìn)入感受態(tài)大腸桿菌XL-1 Blue細(xì)胞(Stratagene公司)并在添加氨芐青霉素的LB肉湯中培養(yǎng)過夜。通過Sambrook等的大型(maxi)質(zhì)粒制備方法分離質(zhì)粒(分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，第2版，冷泉港，紐約，1989)。轉(zhuǎn)染前通過氯化銫離心兩次純化質(zhì)粒DNA。
實(shí)施例2從完整組織分離原代細(xì)胞胚胎SPAFAS系雞胚(HyVac,Abel,IA)是這些實(shí)驗(yàn)的原代細(xì)胞來源。所述卵和生這些卵的雞由供應(yīng)商證明對(duì)禽流感病毒(A型)，禽呼腸孤病毒，禽腺病毒(Ⅰ-Ⅲ種)，禽腦脊髓炎病毒，禽痘病毒，新城疫病毒，副粘病毒(2型)，支原體，沙門氏菌及其他已知感染禽畜的感染介質(zhì)皆為陰性。受精卵在無菌隔離的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)并對(duì)10天齡和19天齡的胚胎處理加工以建立原代培養(yǎng)物。
用三個(gè)10天齡SPAFAS胚胎從心臟，肝臟，皮膚和肌肉(胸和大腿)獲得細(xì)胞。19天齡胚胎也用于建立原代皮膚培養(yǎng)物。用胰蛋白酶/EDTA溶液解離胚胎組織并鋪在含10％胎牛血清(Gibco)，含1％抗生素/抗真菌劑(Gibco)和2mML-谷氨酰胺(Gibco)的DMEM培養(yǎng)基上(Gibco)。把解離的細(xì)胞懸液收集在一個(gè)含10％毫升胎牛血清的50毫升離心管中以使所述胰蛋白酶失活并在700xg下離心10分鐘。
把所述細(xì)胞重新懸浮在富含36微克/毫升胰島素(Sigma)，1.6微克/毫升運(yùn)鐵蛋白(Sigma,St.Louis,MO),2mML-谷氨酰胺，10％胎牛血清，1％抗生素/抗真菌劑溶液的10毫升Dulbecco’s改良的Eagles’s培養(yǎng)基中并按約1×106細(xì)胞/平皿將細(xì)胞用吸管轉(zhuǎn)移到4-5只100平方毫米的培養(yǎng)皿中并在40.5℃下，在5％二氧化碳，95％空氣中培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后，更換所述培養(yǎng)基。
使培養(yǎng)物生長(zhǎng)到鋪滿平皿(5天)并用胰蛋白酶/EDTA溶液(0.05％胰蛋白酶和0.02％乙二胺四乙酸(EDTA)溶于PBS中)從所述平板移出培養(yǎng)物并重鋪平皿以得到第二代。在液氮中冷凍細(xì)胞原種。
實(shí)施例3把p53/金屬硫蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞來自ELL-0 19天齡的胚胎的原代雞皮細(xì)胞在第一代到第二代之間被轉(zhuǎn)化。將所述細(xì)胞以在100平方毫米平皿中5×105細(xì)胞密度鋪在高濃度葡萄糖DMEM上，所述培養(yǎng)基加有10％合格的胎牛血清并富含1.6微克/毫升運(yùn)鐵蛋白(Sigma,St.Louis,MO)，36微克/毫升胰島素(Sigma)和抗生素。培養(yǎng)細(xì)胞過夜以穩(wěn)定所述培養(yǎng)物并于次日早晨再添加9毫升培養(yǎng)基并采用包裝說明(PanVera公司，麥迪遜，WI)用脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺TransitⅡ轉(zhuǎn)染。每次轉(zhuǎn)染使用10微克純化的p53構(gòu)建體。轉(zhuǎn)染細(xì)胞5小時(shí)并用600微克/毫升的選擇性抗生素G418(Sigma,St.Louis,MO)更換所述培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)化細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中傳代直到形成細(xì)胞灶(通常4-10天)并對(duì)所得細(xì)胞灶進(jìn)行克隆選擇和繁殖。
培養(yǎng)細(xì)胞2-3代以產(chǎn)生G418(600微克/毫升)抗性細(xì)胞的細(xì)胞灶(約103-104)。在開始時(shí)當(dāng)需要時(shí)以5×105細(xì)胞/100平方毫米平皿分裝細(xì)胞以避免鋪制密度對(duì)p53表達(dá)效果的影響。未轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞用對(duì)照質(zhì)粒假轉(zhuǎn)染。所述對(duì)照細(xì)胞衰老并在到達(dá)12代時(shí)死亡。細(xì)胞在50mM硫酸鋅選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周直到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞開始增殖。幾只對(duì)照培養(yǎng)平皿沒有供給硫酸鋅(不存在金屬硫蛋白啟動(dòng)子的誘導(dǎo))。再次添加的兩周后(后-轉(zhuǎn)染4周)開始出現(xiàn)比周圍看上去較老的細(xì)胞生長(zhǎng)更快的表型特異的細(xì)胞灶。在進(jìn)一步再次添加后，所述被轉(zhuǎn)化的皮膚細(xì)胞的細(xì)胞灶之一表現(xiàn)為快速增長(zhǎng)的細(xì)胞。用克隆環(huán)從培養(yǎng)平板移出約5×104細(xì)胞/細(xì)胞灶。把這些細(xì)胞轉(zhuǎn)移到一個(gè)六孔板。把在鋅存在下生長(zhǎng)的幾乎鋪滿細(xì)胞的兩只培養(yǎng)皿以2×105細(xì)胞/皿分裝成六只培養(yǎng)皿，所術(shù)培養(yǎng)皿外加50μM的鋅。在鋅的存在下以1×105細(xì)胞/平方厘米每3-4天增殖所述皮膚細(xì)胞直到17代。在約20-22代時(shí)，群體倍增出現(xiàn)下降，并在以后回升到群體倍增數(shù)每天約為0.7到約1.0倍。還從分離自10天齡雞胎的轉(zhuǎn)染的皮膚細(xì)胞得到細(xì)胞灶。由于文獻(xiàn)中眾所周知p53為一種致瘤抑制基因并為一種生長(zhǎng)調(diào)節(jié)基因，因此所述實(shí)驗(yàn)結(jié)果是出乎意料的。用含反義p53基因片段的相同的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染皮膚細(xì)胞的完全相同的培養(yǎng)物。用這種構(gòu)建體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不能進(jìn)行無限增殖化。
對(duì)原代心肌和胸肌細(xì)胞而言，將所述冷凍的培養(yǎng)物解凍并傳代。在第2代用有義p53構(gòu)建體與多胺化合物，脂質(zhì)轉(zhuǎn)染胺TransitⅡ(PanVera公司，麥迪遜，WI)一起轉(zhuǎn)染每種類型的細(xì)胞之8×106細(xì)胞(鋪滿40-70％)。維持未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陽性生長(zhǎng)的對(duì)照和作為陰性細(xì)胞死亡的對(duì)照(額外添加G418的培養(yǎng)物)。為進(jìn)行轉(zhuǎn)染，滴加2-12微升/微克DNA到100微升無血清培養(yǎng)基(RPMI 1640,LifeTechnologies)。輕輕混合該混合物并在室溫下培養(yǎng)5分鐘。在廠商提供的TransitⅡ試劑中稀釋1-3微克DNA并培養(yǎng)6小時(shí)。洗細(xì)胞并再次添加培養(yǎng)基。在24小時(shí)恢復(fù)期后，將心和胸細(xì)胞分裝到4只培養(yǎng)皿中，每只有3×105細(xì)胞并置于G418選擇和鋅誘導(dǎo)下。鑒定所述實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)中的細(xì)胞灶。從加50μM鋅的對(duì)照培養(yǎng)皿中沒有得到細(xì)胞灶。
實(shí)施例4檢測(cè)含p53-構(gòu)建體之細(xì)胞的病毒污染物檢測(cè)所述細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄酶活性。從快速增長(zhǎng)的培養(yǎng)物中分離1×106細(xì)胞于4毫升培養(yǎng)基中。取所述培養(yǎng)基在-80℃下通過數(shù)次凍融以裂解細(xì)胞。將含裂解細(xì)胞的培養(yǎng)基被鋪蓋到10％甘油梯度培養(yǎng)基上。用SW40離心機(jī)(Beckman Instruments,Pal Alto,CA)將所述梯度培養(yǎng)基在40,000rpm下旋轉(zhuǎn)60分鐘。若有的話，形成病毒顆粒的小片。棄去培養(yǎng)基并將小片重懸浮在20微升Nonidet P-40(Sigma化學(xué)公司，St.Louis,MO)中。
將一只微量離心管在41℃加熱。取5微升樣品加入到45微升含45mMTris,pH7.8,2mM2-β巰基乙醇，2mM乙酸錳，0.1％Triton X-100,10μM dATP,dCTP,dGTP各一份(Boehringer Mannheim Biochemical,Indianapolis,IN),2.4微克poly A(Sigma),60ng引物dT12-19(Pharmacia),0.4微居/反應(yīng)的3H胸苷三磷酸(15,000到28,000cpm/pmole活性，Amersham)的逆轉(zhuǎn)錄酶混合液中。
所述反應(yīng)液在41℃溫育1小時(shí)。陰性對(duì)照使用5微升雙蒸水和45微升混合液。在所述測(cè)定中包括兩個(gè)已知的陽性對(duì)照。通過加入1毫升10％三氯醋酸(TCA,Columbus化學(xué)工業(yè)公司，Columbus,WI)終止所述測(cè)定。通過Whatman GF/C玻璃0.45微米預(yù)過濾器過濾混合物。用5％TCA洗數(shù)次。將濾出物轉(zhuǎn)移到含5毫升閃爍計(jì)數(shù)液的閃爍管中。用050到600窗口設(shè)置在Beckman儀器閃爍計(jì)數(shù)器上對(duì)樣品記數(shù)。數(shù)量超過所述混合液本底(陰性對(duì)照)三倍的被認(rèn)為是陽性的。
與本發(fā)明中使用的其他細(xì)胞一樣，所述原代細(xì)胞檢測(cè)為陰性。逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定的進(jìn)一步資料參見(Crittenden等，病毒學(xué)，57:128-138,1974)。
實(shí)施例5無限增殖化細(xì)胞的鑒定將含p53/金屬硫蛋白的構(gòu)建體引入細(xì)胞后，當(dāng)所述細(xì)胞在組織培養(yǎng)中經(jīng)過約25代以上并且每天以群體倍增約0.6到約1.5倍進(jìn)行倍增時(shí)即可以稱為無限增殖的。將這個(gè)速率與群體倍增速率約為0.1到約0.2群體倍增/天的晚期未處理的(即，未接受p53/金屬硫蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建體的細(xì)胞)對(duì)照比較。接受p53/金屬硫蛋白啟動(dòng)子的皮膚細(xì)胞目前處于將所述基因構(gòu)建體引入所述細(xì)胞之后的第70代。在所述轉(zhuǎn)染方法中，鑒定出20個(gè)以上的無限增殖化克隆。所述細(xì)胞形態(tài)上是正常的并且是接觸抑制型的。胸肌細(xì)胞目前在52代，并且形態(tài)是正常的，表現(xiàn)為接觸抑制的生長(zhǎng)并且目前群體倍增速率約為0.72。選出13個(gè)克隆用于分析。心細(xì)胞目前是在20代，形態(tài)正常，是接觸抑制的，并且平均群體倍增速率是0.6。數(shù)個(gè)克隆的群體倍增速率在約0.8和1.1之間。選出10個(gè)以上的克隆供進(jìn)一步研究。
實(shí)施例6進(jìn)行軟瓊脂菌落形成測(cè)定以評(píng)估細(xì)胞的致瘤潛力為測(cè)試致瘤潛力，檢測(cè)p53/金屬硫蛋白啟動(dòng)子轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在軟瓊脂中的生長(zhǎng)。通過在21.6毫升富含的McCoy’s 5A培養(yǎng)基[BRL/Gibco,120毫升胎牛血清(加熱滅活，5毫升丙酮酸鈉(2.2％儲(chǔ)液)，1毫升L-絲氨酸(21毫克/毫升儲(chǔ)液)，5毫升L-谷氨酰胺(200mM儲(chǔ)液)，12.5毫升Hepes(1M儲(chǔ)液)]中混合12毫升2％瓊脂溶液(已進(jìn)行高壓滅菌并冷卻到56℃),5.9毫升天冬酰胺(44毫克/毫升過濾的無菌儲(chǔ)液)制備軟瓊脂基質(zhì)。將7毫升溫暖的培養(yǎng)基/瓊脂倒在100平方毫米的組織培養(yǎng)皿上并使其于室溫下在組織培養(yǎng)櫥中固化1小時(shí)。
通過胰蛋白酶消化從生長(zhǎng)活躍的(約有40到70％鋪滿)培養(yǎng)物中移出細(xì)胞以便在新鮮的含10％胎牛血清(有L-谷氨酰胺和抗生素-抗真菌劑)的DMEM培養(yǎng)基中得到單細(xì)胞懸液。加入大約1×106細(xì)胞到含10％胎牛血清，0.75毫升1％瓊脂，和50微升2β-巰基乙醇的4.2毫升DMEM培養(yǎng)基中。需要小心以確保在加入所述細(xì)胞前溫暖的培養(yǎng)基/瓊脂在42℃下。很快地，把5毫升上述細(xì)胞懸液鋪在所述瓊脂平板上。
細(xì)胞在37℃下，在5％二氧化碳和95％空氣培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)并觀察35天。用3對(duì)-硝基苯基-5-苯基四唑亞氯酸鹽(INT染料)對(duì)雙份平板染色并在第0,5,10,15,20,30，和35天檢測(cè)菌落的形成和生長(zhǎng)。所有大于60微米的染色的菌落被認(rèn)為是陽性的。
全部細(xì)胞檢測(cè)為陰性。有關(guān)軟瓊脂測(cè)定的進(jìn)一步資料可以從Hamburger等(臨床生物學(xué)研究進(jìn)展48:pps43,135,179,1980)獲得。
實(shí)施例7無限增殖化細(xì)胞的致瘤性在明尼蘇達(dá)大學(xué)的動(dòng)物利用協(xié)議中(協(xié)議第950300-1號(hào)，1995年3月到1996年12月)所概括的準(zhǔn)則下，將細(xì)胞注射給實(shí)驗(yàn)動(dòng)物以測(cè)定所述細(xì)胞是否是致瘤的。為測(cè)試雞金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的雞p53的致瘤潛力，將所述無限增殖化細(xì)胞給雞注射。
從細(xì)胞培養(yǎng)板移出生長(zhǎng)活躍的細(xì)胞并注射給6只SPAFAS品系的成年雞。把皮下注射4×106細(xì)胞置于所述雞翅的網(wǎng)狀組織(web)。在3.5個(gè)月內(nèi)每周檢測(cè)所述注射部位。對(duì)迄今所生產(chǎn)的任意的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(皮膚，心和肌肉)而言，在所述注射部位沒有觀察到腫瘤并且全部動(dòng)物保持健康。
實(shí)施例8p53/金屬硫蛋白細(xì)胞系中的病毒繁殖檢測(cè)上述細(xì)胞支持病毒生產(chǎn)的能力。用滴度為8.2TCID50/毫升的呼腸孤病毒的WSS-Reo1733株感染含所述p53/金屬硫蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建體的2.5×108細(xì)胞。以感染復(fù)數(shù)為0.005,0.001或0.0005感染性病毒顆粒/細(xì)胞的量感染細(xì)胞。在滾瓶中培養(yǎng)被感染的細(xì)胞并在感染后48,64和72小時(shí)檢測(cè)，并確定生產(chǎn)性病毒的增殖。
另外在滾瓶中以2.0×104細(xì)胞/平方厘米接種細(xì)胞。在一個(gè)滾動(dòng)架裝置上所述滾瓶以0.4到0.5 RPM在37℃下培養(yǎng)8天。用火雞的皰疹病毒(HVT病毒，毒株R2/23)感染細(xì)胞。當(dāng)所述滾瓶中約有1.33×107細(xì)胞時(shí)，以0.001的感染復(fù)數(shù)感染細(xì)胞。在約90到約96小時(shí)，當(dāng)約有40％所述單層細(xì)胞有與感染相關(guān)的細(xì)胞病理癥狀時(shí)收獲細(xì)胞。在有10％Hyclone的γ輻射的FBS,2.5g/L TPB,2mM L-谷氨酰胺，100U/毫升青霉素，0.10毫克/毫升鏈霉素，0.25微克/毫升兩性霉素B，1.6毫克/升胰島素和1.6毫克/升運(yùn)鐵蛋白的DMEM中培養(yǎng)和維持細(xì)胞。初步研究證明所述細(xì)胞產(chǎn)生約1.4×104pfu/ml。
細(xì)胞還能支持Marek’s病病毒的復(fù)制。
實(shí)施例9使用受感染的皮膚細(xì)胞作為細(xì)胞底物本發(fā)明的細(xì)胞可用做支持原代細(xì)胞中病毒復(fù)制的底物。在這些實(shí)驗(yàn)中，將p53無限增殖化的皮膚細(xì)胞與原代細(xì)胞混合。在一項(xiàng)研究中，所述原代細(xì)胞被感染并與無限增殖化細(xì)胞混合和置于培養(yǎng)中，而在另一項(xiàng)研究中，原代細(xì)胞被感染并置于所述無限增殖化細(xì)胞上，其中所述無限增殖化細(xì)胞已經(jīng)在所述組織培養(yǎng)瓶中被排成一層菌苔。在一個(gè)實(shí)施例中，所述病毒是Egg Drop Syndrome病毒，而原代細(xì)胞為原代雞胚肝細(xì)胞。在第二個(gè)實(shí)施例中，所述原代細(xì)胞是內(nèi)皮細(xì)胞，優(yōu)選腎內(nèi)皮細(xì)胞，而所述病毒是感染性支氣管炎病毒。優(yōu)選原代細(xì)胞與無限增殖化細(xì)胞的比例是約1∶5到約1∶20，并更優(yōu)選約為1∶10。來自生長(zhǎng)在所述混合細(xì)胞群中的原代細(xì)胞的病毒效價(jià)高于來自單獨(dú)在培養(yǎng)中的原代細(xì)胞的病毒效價(jià)。所述無限增殖化細(xì)胞使所述原代細(xì)胞可以用于商業(yè)條件下的病毒繁殖。
當(dāng)已詳細(xì)地描述本發(fā)明的具體實(shí)施方案時(shí)，熟悉本領(lǐng)域的人員將明白這些實(shí)施方案是舉例，而不是限制，而本發(fā)明的真正范圍是下列權(quán)利要求中所限定的。
權(quán)利要求
1．轉(zhuǎn)化原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞的一種方法，包括步驟在一種能指導(dǎo)p53表達(dá)的基因載體中定位編碼p53的核酸于金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下；將所述基因載體引入原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞；和篩選群體倍增時(shí)間為每天約0.6到約1.5群體倍增的細(xì)胞灶，其中所述細(xì)胞是逆轉(zhuǎn)錄酶陰性并且是非致瘤的。
2．權(quán)利要求1的方法，其中所述原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是禽源的。
3．權(quán)利要求1的方法，其中所述原代非嚙齒類動(dòng)物細(xì)胞是人源的。
4．權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是皮細(xì)胞。
5．權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是胸肌細(xì)胞。
6．權(quán)利要求1的方法，其中所述細(xì)胞是心肌細(xì)胞。
7．含能指導(dǎo)處于金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53表達(dá)之基因載體的無限增殖化細(xì)胞。
8．權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞。
9．權(quán)利要求7的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是禽源的。
10．一種繁殖病毒的方法，包括步驟將至少一種感染性病毒顆粒與一種無限增殖化細(xì)胞培養(yǎng)的至少一個(gè)細(xì)胞接觸，其中所述細(xì)胞培養(yǎng)的細(xì)胞含處于金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)p53的基因載體；并且通過所述細(xì)胞收集所產(chǎn)生的病毒。
11．權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒是呼腸孤病毒。
12．權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒是HVT。
13．權(quán)利要求10的方法，其中所述病毒是禽痘病毒。
14．一種繁殖病毒的方法，包括步驟至少一種感染性病毒顆粒與原代細(xì)胞接觸；在細(xì)胞培養(yǎng)中，將原代細(xì)胞和含在金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下表達(dá)p53之基因載體的無限增殖化細(xì)胞一起生長(zhǎng)；并且從所述細(xì)胞收集所產(chǎn)生的病毒。
15．含所述金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下p53和含能在所述細(xì)胞中指導(dǎo)重組蛋白質(zhì)表達(dá)的至少一種載體的無限增殖化，非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
16．權(quán)利要求15的細(xì)胞，其表達(dá)重組蛋白質(zhì)。
17．權(quán)利要求16的細(xì)胞，其中所述載體編碼至少重組病毒的一部分。
18．權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。
全文摘要
本發(fā)明涉及將金屬硫蛋白啟動(dòng)子控制下的p53引入原代細(xì)胞以生成無限增殖細(xì)胞系。所述細(xì)胞可用做病毒繁殖的底物，用做生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)、生產(chǎn)重組病毒的無污染物來源，和用做支持原代細(xì)胞并在病毒繁殖期間提高病毒產(chǎn)率的細(xì)胞底物。
文檔編號(hào)C12N7/00GK1228122SQ97197323
公開日1999年9月8日 申請(qǐng)日期1997年8月13日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月13日
發(fā)明者D·N·福斯特, J·A·法里斯, L·K·福斯特 申請(qǐng)人:明尼蘇達(dá)大學(xué)評(píng)議會(huì)