專利名稱：：與α4β7整合蛋白相作用的人化免疫球蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
整合蛋白受體對于調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞循環(huán)和向炎癥部位富集十分重要[Carlos,T.M.andHarlan,J.M.,Blood,84:2068-2101(1994)]。人類α4β7整合蛋白有多個配體，其中一個是表達(dá)腸系膜淋巴節(jié)和派伊爾氏淋巴集結(jié)與高級內(nèi)皮小靜脈的黏膜血管地址素MAdCAM-1[Berlin,C.,etal.,Cell74:185-195(1993)；Erle,D.J.,etal.,J.Immunol.153:517-528(1994)])[Streeter,P.R.,etal.,Nature331:41-46(1988)]。因而，α4β7整合蛋白作為一種受體，調(diào)控淋巴細(xì)胞遷向腸黏膜淋巴樣組織[Schweighoffer,T.,etal.,J.Immunol.151:717-729(1993)]。另外，α4β7整合蛋白還同纖連蛋白和血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)相互作用。腸炎癥疾病(IBD)，諸如潰瘍性結(jié)腸炎和階段性回腸炎(Crohn’s病)，都是涉及胃腸道炎癥的消耗性和進(jìn)行性疾病，僅在美國就有大約200萬患者，癥狀包括腹痛、痙攣、腹瀉和直腸出血。對IBD的治療包括消炎藥物(如皮質(zhì)類固醇和磺胺沙利比林)，免疫抑制藥物(如6-巰基嘌呤、環(huán)孢霉素和硝基咪唑硫嘌呤)以及外科手術(shù)(如結(jié)腸切除術(shù))。參見Podolsky,NewEngl.J.Med.,325:928-937(1991)andPodolsky,NewEngl.J.Med.,325:1008-1016(1991)?？谷甩?β7整合蛋白抗體，例如鼠單克隆抗體(mAbAct-1)，干擾α4β7整合蛋白結(jié)合到黏膜地址素細(xì)胞黏附分子-1(MAdCAM-1)的過程，后者出現(xiàn)在黏膜淋巴結(jié)的高級內(nèi)皮小靜脈。Act-1最早由Lazarovits,A.I.,etal.,J.Immunol.133:1857-1862(1984)，從被人破傷風(fēng)毒特異性T淋巴細(xì)胞免疫的老鼠分離出來，并被報道為是一種鼠IgGl/κ型抗體。最近的研究[Schweighoffer,T.,etal.,J.Immunol.151:717-729(1993)]顯示，該抗體能夠與特異性表達(dá)α4β7整合蛋白的人記憶CD4+T淋巴細(xì)胞的亞單位相結(jié)合。然而，利用鼠抗體來治療人類疾病存在嚴(yán)重的問題，它們對于人體來講具有高度的免疫原性，能迅速誘發(fā)人體抗鼠抗體的免疫應(yīng)答(HAMA).削弱其治療效果，也不能連續(xù)給藥。HAMA反應(yīng)能快速清除鼠抗體，大大限制其療效。因此，需要有改進(jìn)的方法來治療腸炎癥疾病。本發(fā)明的概述本發(fā)明涉及具有α4β7整合蛋白特異結(jié)合屬性的人化免疫球蛋白，該蛋白包括非人源抗原結(jié)合區(qū)(如嚙齒類)和至少一部分人源免疫球蛋白(如人類框架區(qū)、人類λ型恒定區(qū))。在一個實施方案中，這里所描述的人化免疫球蛋白將和鼠Act-1或LDP-02(見實施例4)競爭結(jié)合α4β7整合蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，人化免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)最好來源于Act-1單克隆抗體[如LDP-02，其是包含輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的一種免疫球蛋白，分別見圖11(SEQIDNO:19)和圖12(SEQIDNO:21)]。例如，人化免疫球蛋白可以包括含非人源互補決定簇(CDR)的抗原結(jié)合區(qū)和從人源框架區(qū)(FR)衍生的框架區(qū)。一方面，這個有α4β7結(jié)合特性的人化免疫球蛋白包括輕鏈和重鏈，輕鏈包括從結(jié)合α4β7的非人源抗體衍生的CDR，和從人源輕鏈衍生的FR(例如，GM607’CL)，重鏈包括從結(jié)合α4β7的非人源抗體衍生的重鏈和從人源重鏈衍生的FR(如21/28’CL)。另一方面，輕鏈含有三個來自于Act-1抗體輕鏈的CDR，重鏈則含有三個來自于Act-1抗體重鏈的CDR。本發(fā)明也涉及人化免疫球蛋白的輕鏈(如Act-1抗體輕鏈的CDR1、CDR2、CDR3和人類輕鏈的FR)和人化免疫球蛋白的重鏈(如Act-1抗體重鏈的CDR1、CDR2、CDR3和人類重鏈的FR)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本文所描述的人化重鏈和輕鏈[例如，含有如圖7所示輕鏈的可變區(qū)(SEQIDNO:12)的人化輕鏈，含有如圖9所示重鏈的可變區(qū)(SEQIDNO:15)的人化重鏈，含有如圖12所示輕鏈的可變區(qū)(SEQIDNO:21)的人化輕鏈，含有如圖11所示重鏈的可變區(qū)(SEQIDNO:19)的人化重鏈]。本發(fā)明也包括那些含有一個或多個人化輕鏈和/或重鏈的人化免疫球蛋白。本發(fā)明不僅涉及分離到的編碼人化免疫球蛋白輕鏈(SEQIDNO:20)的核酸或編碼重鏈(SEQIDNO:18)的核酸，而且還涉及分離到的編碼人化免疫球蛋白(如單一鏈抗體)的核酸。例如，本發(fā)明提供了編碼人化免疫球蛋白輕或重鏈的融合基因，這些鏈又由第一核酸序列和第二核酸序列組成，第一序列編碼鼠源Act-1單克隆抗體的抗原結(jié)合區(qū)，第二序列至少編碼人源免疫球蛋白恒定區(qū)的一部分。本發(fā)明還涉及編碼有α4β7結(jié)合特異性的人化免疫球蛋白或者它的一條鏈的核酸構(gòu)建物。例如，本發(fā)明提供了含融合基因的表達(dá)載體，該融合基因編碼人化免疫球蛋白輕鏈，包括對從與α4β7整合蛋白有結(jié)合特異性的非人源抗體的輕鏈衍生的CDR進(jìn)行編碼的核苷酸序列和衍生自人源輕鏈的框架區(qū)。這類構(gòu)建物的另一個實例是這樣的表達(dá)載體，其包括編碼人化免疫球蛋白重鏈的融合基因，該融合基因包括對從與對α4β7整合蛋白有結(jié)合特異性的非人源抗體重鏈衍生的CDR進(jìn)行編碼的核苷酸序列，以及從人源重鏈衍生的框架區(qū)。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明核酸序列的宿主細(xì)胞，其包括一個或一個以上的含有本發(fā)明核酸的構(gòu)建物。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種包含有編碼人化免疫球蛋白輕鏈的第一重組核酸和編碼人化免疫球蛋白重鏈的第二重組核酸的宿主細(xì)胞，所述的第一核酸包括編碼鼠源Act-1抗體輕鏈CDR和人源輕鏈框架區(qū)的核苷酸序列，所述的第二核酸包括編碼鼠源Act-1抗體重鏈CDR和人源重鏈框架區(qū)的核苷酸序列。本發(fā)明也提供了一種制備人化免疫球蛋白的方法，該方法包括在適于表達(dá)人化免疫球蛋白的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，使人化免疫球蛋白鏈得到表達(dá)，使人源免疫球蛋白被產(chǎn)生。該方法還可以包括人化免疫球蛋白的分離步驟。本發(fā)明的人化免疫球蛋白的免疫原性比它們對應(yīng)的鼠源或其他非人源對應(yīng)體的要小得多。因此，本文中所描述的人源免疫球蛋白能夠用來治療人體疾病，例如，用來控制淋巴細(xì)胞返回到黏膜淋巴樣組織，從而減輕消化道的炎癥反應(yīng)。本發(fā)明還涉及本發(fā)明的人化免疫球蛋白在診斷或治療(包括預(yù)防)中的應(yīng)用。在一個實施方案中，本發(fā)明將人化免疫球蛋白用于組織淋巴細(xì)胞滲透性疾病的治療，例如，治療炎癥疾病，包括胃腸道淋巴細(xì)胞滲透性疾病(包括消化道內(nèi)皮)，其他的黏膜組織，或表達(dá)MAdCAM-1分子的組織。在特別優(yōu)選的實施方案中，這種人化免疫球蛋白還可以用于治療腸炎(IBD)，例如潰瘍性結(jié)腸炎和Crohn’s病。另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人化免疫球蛋白在制造可治療組織淋巴細(xì)胞濾過性疾病的藥物中的應(yīng)用，例如，治療炎癥疾病，包括胃腸道淋巴細(xì)胞滲透性疾病，其他的黏膜組織，或者表達(dá)MAdCAM-1分子的組織。在特別優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的人化免疫球蛋白在制造用于治療腸炎(IBD)，例如潰瘍性結(jié)腸炎或Crohn’s病等藥物中的應(yīng)用。附圖簡要說明圖1說明了一致的DNA序列(SEQIDNO:1)及其編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:2)，包括由多個獨立的鼠重鏈可變區(qū)克隆確定的可變區(qū)。圖2說明了核酸序列(SEQIDNO:3)及其編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:4)，包括由獨立的鼠重鏈可變區(qū)克隆H2B#34所確定的可變區(qū)中的一部分。圖3說明了核酸序列(SEQIDNO:5)及其編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:6)，包括由多個獨立的鼠輕鏈可變區(qū)克隆確定的可變區(qū)。標(biāo)出了為了克隆化而引入KasⅠ位點的兩突變位點。圖4A是一個熒光圖，說明鼠Act-1mAb和鼠同型不相關(guān)對照抗體(MOPC21；IgG1,Kappa)對表達(dá)α4β7的HuT78細(xì)胞的染色能力。圖4B是一個熒光圖，說明三種物質(zhì)對表達(dá)α4β7的HuT78細(xì)胞的染色能力，(ⅰ)嵌和的Act-1抗體，(ⅱ)人同型不相關(guān)對照抗體(IgG1,Kappa),(ⅲ)COS-7細(xì)胞上清液。圖5排列比較了鼠Act-1輕鏈可變區(qū)(“Act-1,vl”)(SEQIDNO:7)和人GM607’CL輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:8)的氨基酸序列。豎線表示相同的氨基酸，相似的氨基酸則根據(jù)相似程度分別用4或2點來表示，框起來并標(biāo)記上的是CDR，每個殘基按序列編號。圖6排列比較了鼠Act-1重鏈可變區(qū)(“Act-1,vh”)(SEQIDNO:9)和人21/28’CL重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:10)的氨基酸序列。豎線表示相同的氨基酸，相似的氨基酸則根據(jù)相似程度分別用4或2點來表示，框起來并標(biāo)記上的是CDR，每個殘基按序列編號。圖7說明了鼠Act-1輕鏈上緊連于信號肽的可變區(qū)的核酸序列(SEQIDNO:11)及其編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:12)。圖8說明了成熟的人GM607′CL抗體Kappa輕鏈可變區(qū)的核酸序列(SEQIDNO:13)及其編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:8)。圖9說明了鼠Act-1抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列及氨基酸序列。該序列連接于可編碼鼠Act-1重鏈信號肽的核酸序列，形成一混合序列(SEQIDNO:14和15)。(擴增重鏈的引物來源于退化序列，信號肽的氨基酸序列來源于引物，下游序列和別的信號肽序列。這里所示的信號肽可能與Act-1雜合體的不相同)。圖10說明了人21/28′CL抗體重鏈可變區(qū)的核酸序列及氨基酸序列。該序列連接于編碼人HG3′CL抗體VH信號肽的核酸序列。[Rechavi,G.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA80:855-859(1983)]，從而形成一混合序列(SEQIDNOS:16和17)。圖11說明了帶有重鏈信號肽的人化Act-1抗體(LDP-02)重鏈一部分的核酸序列[(SEQIDNO:18)和氨基酸序列(SEQIDNO:19)]。圖12說明了帶有輕鏈的信號肽的人化Act-1抗體(LDP-02)輕鏈一部分的核酸序列[(SEQIDNO:20)和氨基酸序列(SEQIDNO:21)]。圖13說明了分別被標(biāo)識為L1-L6(SEQIDNOS:22-27)和H1-H10(SEQIDNOS:28-37)的兩組具有重疊且互補的寡聚核苷酸序列。前者編碼人化Act-1免疫球蛋白(LDP-02)的輕鏈，后者編碼人化Act-1免疫球蛋白的重鏈。圖14是一個熒光圖，說明用構(gòu)建的鼠-人Act-1免疫球蛋白，人化Act-1免疫球蛋白或一不相關(guān)的人同型對照抗體(IgG1,Kappa)，對HuT-78細(xì)胞的染色效果。圖15說明了用流式細(xì)胞光度計對HuT-78細(xì)胞進(jìn)行的滴定生物素化鼠Act-1和人化Act-1(LDP-02/3A9/L0T#1，實施例4)的結(jié)果。圖16是個圖表，說明與對照的鼠IgG1或人IgG1相比，鼠Act-1或人化Act-1免疫球蛋白(LDP-02/3A9/L0T#1，實施例4)對生物素化鼠Act-1結(jié)合的競爭性抑制。圖17是個圖表，說明分別在5種分子存在下，人周邊周血單核細(xì)胞在溶胞中同位素51Cr檢測的結(jié)果，(a)CAMPATH-1H,(b)CAMPATH-1G,(c)人IgG1,(d)LDP-02/3A9/Lot#1(實施例4)或(e)LDP-01(人化抗CD18,Fc突變)；分別于5種濃度50,25,5,2.5，和0.5μg/ml。圖18A-18B是圖表，說明鼠Act-1(圖18A)，鼠IgG1(圖18A)，LDP-02/3A9/Lot#1(圖18B)或人IgG1(圖18B)對α4β7攜帶細(xì)胞(RPMI8866)與構(gòu)建的人MAdCAM-1-Ig(免疫粘附)的吸附過程的抑制作用。圖19比較了4種方法對HuT-78細(xì)胞的染色效果，(a)LDP-02(Fc突變)，(b)在輕鏈(MV4)有單突變，在重鏈有雙突變(R38K,A40R)的LDP-02(Fc突變)的衍生體，(c)不相關(guān)的人同型對照抗體(IgG1,kappa)。本發(fā)明的詳細(xì)敘述本發(fā)明涉及了對α4β7整合蛋白有結(jié)合特性的人化免疫球蛋白，它包括非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分人源免疫球蛋白。優(yōu)選地，人化免疫球蛋白對α4β7整合蛋白的親合度至少要有107M-1，以108M-1為較好，以109M-2為更好。在一個實施方案中，人化免疫球蛋白包含有結(jié)合α4β7整合蛋白的非人源抗原結(jié)合區(qū)和人源恒定區(qū)。在另一個實施方案中，與α4β7整合蛋白結(jié)合的人化免疫球蛋白，包含非人源互補決定區(qū)和一個人源可變框架區(qū)，還可以有或沒有人源恒定區(qū)。例如，這種人化免疫球蛋白可以包括重鏈和輕鏈，其中的輕鏈包括從結(jié)合α4β7整合蛋白的非人源抗體衍生的互補決定區(qū)和人源輕鏈衍生的框架區(qū)，重鏈包括結(jié)合α4β7整合蛋白的非人源抗體衍生的互補決定區(qū)和人源重鏈衍生的框架區(qū)。本發(fā)明也涉及了人化免疫球蛋白的輕鏈和人化免疫球蛋白的重鏈。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含有非人源輕鏈CDR(一個或多個CDR)和人輕鏈框架區(qū)的人化輕鏈。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及包含有非人源重鏈CDR(一個或多個CDR)和人重鏈框架區(qū)的人化免疫球蛋白重鏈。CDR可來自于非人免疫球蛋白。天然的免疫球蛋白都有一相同的核心結(jié)構(gòu)，里面由兩條相同的輕鏈(約24KD)和兩條相同的重鏈(約55或70KD)形成一個四聚體。每條鏈的N端被認(rèn)定為可變區(qū)(V)，并能夠同各條鏈其他部分更加保守的恒定區(qū)(C)相區(qū)別。輕鏈可變區(qū)C端部分稱為J區(qū)，此外，重鏈可變區(qū)內(nèi)，除J區(qū)，還有一D區(qū)。免疫球蛋白中絕大部分氨基酸序列變化限于V區(qū)的三個位點，稱為高度可變區(qū)和互補決定區(qū)(CDR)，該區(qū)直接涉及與抗原的結(jié)合。從N端數(shù)，分別被標(biāo)記為CDR1、CDR2、CDR3，CDR由更保守的框架區(qū)維持位置。從N端數(shù)，框架區(qū)分別被標(biāo)記為FR1、FR2、FR3和FR4。這些CDR和FR區(qū)的位置及其編號，最早由Kabateta1定義。[Kabat,E.A.etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)；又見表3和4]。人免疫球蛋白能被劃分為幾個類和幾個亞類，根據(jù)重鏈的類型，分別為IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。它們各自的重鏈分別為γ、μ、α、δ、或ε型。亞類包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2，各自的重鏈分別為γ1、γ2、γ3、γ4、α1和α2型。某一類或某一亞類人免疫球蛋白分子可能含有一個κ或者λ輕鏈。參見，CellularandMolecularImmunology,Wonsiewicz.M.J.,Ed.,Chapter45,pp.41-50,W.B.SaundersCo,Philadelphia,PA(1991)；Nisonoff,A.,IntroductiontoMelocularImmunology,2ndEd.,Chapter4,pp.45-65,SinauerAssociates,Inc.,Sunderland,MA(1984)。這里用的術(shù)語“免疫球蛋白”包括完整的抗體和其有生物活性的片段。這種生物活性片段至少保留有相對應(yīng)完整長度抗體所具有的一種抗原結(jié)合功能(如對Act-1抗體α4β7的特異性)，最好保留有抑制α4β7與一個或多個它的配體(如MAdCAM-1，纖連蛋白)相互作用的能力。在特別優(yōu)選的實施方案中，生物活性片段能夠抑制α4β7結(jié)合到黏膜地址素(MAdCAM-1)上面?？梢允褂玫纳锘钚钥贵w片段的例子包括能結(jié)合α4β7的片段，例如，單一鏈抗體，F(xiàn)v、Fab、Fab’和F(ab’)2片段。這些片段能通過酶切或者重組技術(shù)來獲得，例如，用木瓜蛋白酶切和胃蛋白酶切分別可制備Fab和F(ab’)2片段?？贵w也能以多種截斷形式被制備，即使用將一個或多個終止子導(dǎo)入到天然停止位置的上游的抗體基因。例如，編碼F(ab’)2片段重鏈的嵌合基因，能被設(shè)計成包含編碼CH1域和重鏈鉸鏈區(qū)的DNA序列。術(shù)語“人化免疫球蛋白”是指一種免疫球蛋白，包括不同來源的免疫球蛋白的局部，其中至少有一部分來源于人。例如，人化免疫球蛋白可以包括有必需特異性的非人源免疫球蛋白部分，如老鼠，以及人源免疫球蛋白序列(如嵌合的免疫球蛋白)，運用傳統(tǒng)技術(shù)(如合成)連接而成，或者運用遺傳工程技術(shù)，將其作為一連續(xù)相鄰的多肽來制備(如對編碼嵌合抗體的DNA進(jìn)行表達(dá)來產(chǎn)生出連續(xù)的多肽鏈)。本發(fā)明的人化免疫球蛋白的另一個實例是，包括一個或多個免疫球蛋白鏈，該免疫球蛋白鏈包括從非人源抗體衍生的CDR和由人源輕/重鏈衍生的框架區(qū)(例如，有或沒有框架改變的CDR移植抗體)。人化免疫球蛋白這個術(shù)語也包括嵌合的或者CDR移植的單鏈抗體。參見，Cabillyetal.，美國專利號4,816,567；Cabillyetal.，歐洲專利號0,125,023B1；Bossetal.，美國專利號4,816,397；Bossetal.，歐洲專利號0,120,694B1；Neuberger,M.S.etal.,WO86/01533；Neuberger,M.S.etal.，歐洲專利號0,194,276B1；Winter，美國專利號5,225,539；Winter，歐洲專利號0,239,400B1；Padlan,E.A.etal.，歐洲專利申請0,519,596A1。又參見Ladneretal.，美國專利號4,946,778；Huston，美國專利號5,476,786；及Bird,R.E.etal.,Science,242:423-426(1988)等，關(guān)于單鏈抗體的描述。人化免疫球蛋白(非人部分)的抗原結(jié)合區(qū)，可以來自于具有與α4β7整合蛋白特性結(jié)合的非人源免疫球蛋白(稱作為供體免疫球蛋白)。例如，合適的抗原結(jié)合區(qū)可以來源于鼠Act-1單克隆抗體[Lazarovits,A.I.etal.,J.Immunol.,133(4):1857-1862(1984))；參見實施例1-3]。其他來源包括非人源特異結(jié)合α4β7整合蛋白的抗體，例如嚙齒類(小鼠、鼠)、兔、豬、山羊或非人靈長目(猴子)。其它的多克隆、單克隆抗體也能制備，例如，和Act-1抗體結(jié)合到同樣或相似的抗原決定部位的抗體。[e.g.Kohleretal.,Nature,256:495-497(1975)；Harlowetal.,1988,Antibodies:ALaboratoryManual,(ColdSpringHarbor,NY)；andCurrentProtocolsinMolecularBiology,Vol.2(Supplement27,Summer’94),Ausubeletal.,Eds.(JohnWiley&amp;Sons:NewYork,NY),Chapter11(1991)]。哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、兔、羊)對一個恰當(dāng)?shù)拿庖咴墚a(chǎn)生抗體。例如，α4β7攜帶細(xì)胞，含有α4β7的膜片段，α4β7免疫原片段，一個β7肽段共價連接上一個合適的載體，都是所述的恰當(dāng)?shù)拿庖咴慕邮苓^免疫的動物的淋巴結(jié)或脾臟都能分離到抗體生成細(xì)胞(例如淋巴細(xì)胞)。將這些細(xì)胞與某種合適的永生細(xì)胞(如骨髓瘤細(xì)胞株)進(jìn)行細(xì)胞融合，形成雜合子。用選擇性的培養(yǎng)技術(shù)能將融合細(xì)胞分離出來，用適當(dāng)?shù)臋z測(如ELISA)能挑選出產(chǎn)生所需特異性抗體的細(xì)胞。具有與α4β7特異性結(jié)合的非人源免疫球蛋白也能從抗體文庫中獲得(例如，具有非人源Fab分子的噬菌體文庫)。在一個實施方案中，人化免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)包括非人源CDR。在這個實施方案里，與α4β7特異性結(jié)合的人化免疫球蛋白至少帶有一個非人源CDR。例如，這些CDR能來源于非人源免疫球蛋白輕鏈和重鏈的可變區(qū)，這樣，人化免疫球蛋白實質(zhì)上就包括一個或多個非人源免疫球蛋白的重鏈CDR1、CDR2和/或CDR3和/或輕鏈CDR1、CDR2和/或CDR3。所生成的人化免疫球蛋白因而具有與α4β7結(jié)合的特異性。特定鏈上全部三個CDR最好和對應(yīng)的供體鏈的CDR實質(zhì)相同，而且，每條輕鏈和重鏈各自的CDR都能與對應(yīng)的供體鏈的實質(zhì)相同則會更好。人化免疫球蛋白的部分或人源免疫球蛋白鏈，可來自于任何合適的人的免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈。例如，人恒定區(qū)或其片段可以來自于人類抗體的κ或λ型輕鏈，和/或γ(如γ1、γ2、γ3、γ4)、μ、α(如α1、α2)、δ或ε型重鏈，包括各自的等位變種?？梢詫μ囟ǖ暮愣▍^(qū)(例如IgG1)、變種或恒定區(qū)局部等進(jìn)行篩選來裁選效應(yīng)器功能。例如，突變的恒定區(qū)(變種)能被融入一個融合蛋白，降低其對Fc受體的結(jié)合和/或固定互補體的功能(參見，實施例3；還可以參見，Winteretal.,GB2,209,757B；Morrisonetal.,WO89/07142；Morganetal.,WO94/29351,December22,1994)。如果存在的話，人框架區(qū)(例如輕鏈可變區(qū)的)最好來源于人抗體可變區(qū)，后者同抗原結(jié)合區(qū)供體的類似物或相應(yīng)區(qū)域具有序列同源性。人化免疫球蛋白中人源部分的框架區(qū)的其他來源包括人可變的共有序列[參見，實施例2；又參見，Kettleborough,C.A.etal.,ProteinEngineering4:773-783(1991)；Carteretal.,WO94/04679,1994年3月3日發(fā)表]。例如，用來獲得非人源部分的抗體或可變區(qū)的序列可以與Kabat,EA.所描述的人類序列相比較[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]。在優(yōu)選的實施方案中，人化免疫球蛋白鏈的框架區(qū)來自于擁有至少65％，最好70％的與非人供體序列同源的人類可變區(qū)(例如，小鼠Act-1)。人源部分也可來自于一種人抗體，在特定區(qū)域(如FR)和非人源供體的對應(yīng)區(qū)域(如FR)相比，至少擁有65％，最好70％的序列同源。例如，在實施例2中，在鼠Act-1和人GM607’CL輕鏈可變區(qū)之間總體序列同源程度是71.4％，鼠Act-1和人21/28’CL重鏈可變區(qū)之間是68.1％。在一個實施方案中，人化免疫球蛋白包括的框架區(qū)(FR)中至少要有一個是來自于人源抗體的單個鏈或多個鏈。因此，F(xiàn)R包括來自一個或一個以上的人抗體源的FR1和/或FR2和/或FR3和/或FR4。特定人化鏈的人源部分最好包括人源可變區(qū)的FR1、FR2、FR3和FR4(例如，來自人化免疫球蛋白鏈，來自一種人類共同序列)。在本發(fā)明中使用的人源的合非人源的免疫球蛋白部分與他們各自母體的或他們的各變種的免疫球蛋白或免疫球蛋白部分具有序列同源。這些變種包括那些由于在一個或多個位點發(fā)生添加、缺失或替換而形成的各種突變體。如上述，非人源CDR實質(zhì)上和其母體是相同的，最好是完全一致。如實施例2所述，人源框架區(qū)可能發(fā)生變化，在某個位點上被非人源供體的相應(yīng)位點所替換。框架區(qū)可能發(fā)生一個或多個突變，包括缺失、插入和單或多氨基酸的替換。一些這樣的替換模式見實施例2中人化Act-1抗體的替換模式。對于某特定的人化抗體或抗體鏈，框架突變可按本文所屬設(shè)計。人化免疫球蛋白最好有與非人源供體相似的或更好的α4β7整合蛋白親合性。有多種方法可以制備變種，包括非人源供體部分發(fā)生突變或者人源受體部分發(fā)生突變。本發(fā)明的人化免疫球蛋白具有人α4β7結(jié)合特性，并且包括對異二聚體中α4和/或β7鏈的決定簇有結(jié)合能力的人化免疫球蛋白(包括片段)。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的人化免疫球蛋白最好具有至少一種屬于鼠Act-1抗體特性的功能，例如，結(jié)合功能(例如，具有對α4β7整合蛋白的特異結(jié)合性，具有相同或相似的抗原決定部位特性)，和/或抑制功能(在體內(nèi)和/或體外對α4β7依賴性黏附的抑制能力，例如，抑制α4β7結(jié)合于MAdCAM-1，或者抑制α4β7攜帶細(xì)胞結(jié)合于它的配體)。因此，優(yōu)選的人化免疫球蛋白具有鼠Act-1抗體的結(jié)合特性，抗原決定部位特性[能同鼠Act-1，一種嵌合的Act-1抗體(見實施例1)，或者同人化Act-1(LDP-02)競爭結(jié)合α4β7(例如，在一個攜帶α4β7細(xì)胞上)]，和/或抑制功能。具有與α4β7整合蛋白特異結(jié)合性的人化免疫球蛋白的結(jié)合功能，可以通過標(biāo)準(zhǔn)免疫學(xué)實驗來檢測，例如，用來指示人化免疫球蛋白和α4β7形成復(fù)合物的檢測[例如，包括α4β7的膜片段，α4β7的攜帶細(xì)胞，如人淋巴細(xì)胞(CD4+α4hi,β1lo亞單位的淋巴細(xì)胞)，包括編碼對α4β7進(jìn)行表達(dá)的α4和/或β7的核酸的人淋巴細(xì)胞株或重組宿主細(xì)胞)。對具有所需特性的人化免疫球蛋白的鑒別和/或分離的方法(如從一個文庫中)還包括結(jié)合和/或黏附實驗等等，(如，一種方法是檢測α4β7攜帶細(xì)胞黏附于它的一個配體[例如第二個表達(dá)MAdCAM，嵌合的MAdCAM-Ig的細(xì)胞)]，或者其它的適宜的方法。本發(fā)明中用到的人源和非人源免疫球蛋白部分，包括輕鏈，重鏈和輕重鏈的一部分。這些免疫球蛋白部分可以取自或衍生自免疫球蛋白(如從頭合成某一部分)，或由對具有所需要的性質(zhì)(例如，對α4β7整合蛋白的結(jié)合，序列相似性)的免疫球蛋白或其鏈進(jìn)行編碼的核酸來產(chǎn)生合表達(dá)而獲得。具有人源和非人源特定部位(例如，抗原結(jié)合區(qū)，CDR,FR,C區(qū))的人化免疫球蛋白，可以通過合成和/或重組核酸構(gòu)建相應(yīng)編碼功能的基因(cDNA)來獲得，為得到一條鏈的片段，需要將一個或多個終止子導(dǎo)入到預(yù)期的位點。例如，利用PCR突變技術(shù)改變現(xiàn)有DNA序列，使構(gòu)建出的DNA能夠編碼新設(shè)計的人化可變區(qū)[Kamman,M.,etal.,Nucl.AcidsRes.17:5404(1989)]?；谙嗤幕蚍浅Ｏ嗨频娜丝勺儏^(qū)，編碼新CDR的PCR引物能和人化可變區(qū)的DNA模板雜交[Sato,k.,etal.,CancerResearch53:851-856(1993)]。如果沒有相似的DNA序列作為模板，則需要合成一段寡聚核苷酸來產(chǎn)生能編碼可變區(qū)序列的核酸[Kolbinger,F.,ProteinEngineering8:971-980(1993)]。編碼信號肽的一段序列也能摻入該核酸(例如，合成或摻入一個載體)。如果無法得到天然信號肽段，也可以用其他抗體的信號肽[Kettleborough,C.A.,ProteinEngineering4:773-783(1991)]。通過這些方法，本文中所描述的方法和其他可行的方法，都可以制備出變體(見實施例5)。在一個實施方案中，克隆的可變區(qū)可以發(fā)生突變，從中篩選出對具有所需要的特異性的變體進(jìn)行編碼的核酸序列(如，從一個噬菌體文庫，Krebber,etal.,U.S.5,514,548；Hoogenboometal.,WO93/06213，發(fā)表于1993年4月1日)。核酸及其含有這些核酸的構(gòu)建物本發(fā)明涉及分離的和/或重組的(包括高純度)編碼人化免疫球蛋白或編碼輕、重鏈的核酸。這里所指“分離的”核酸是指從基因組DNA或細(xì)胞RNA中分離出來的核酸(它存在于細(xì)胞內(nèi)或基因文庫)，包括用下述方法或其他方法獲得的核酸化學(xué)合成、聯(lián)合使用生物的和化學(xué)的方法、重組核酸并被分離[參見Daugherty,B.L.etal.,NucleicAcidsRes.,19(9):2471-2476(1991)；Lewis,A.P.andJ.S.Crowe,Gene,101:297-302(1991)]。這里所指“重組的”核酸是指用重組DNA技術(shù)制備的核酸，包括依靠人為重組方法獲得的核酸，例如，多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)和/或用限制性內(nèi)切酶克隆到載體中?！爸亟M”核酸也指細(xì)胞里以天然機理發(fā)生重組事件而獲得的核酸，但需要將經(jīng)設(shè)計的核酸導(dǎo)入細(xì)胞，以篩選出期望的重組事件。本發(fā)明還特別涉及分離的和/或重組的編碼人化Act-1免疫球蛋白(例如本發(fā)明中含有鼠Act-1單克隆抗體源非人部分的人化免疫球蛋白)及其鏈的核酸。在一個實施方案里，輕鏈包括衍生自Act-1抗體輕鏈源的三個互補決定區(qū)，重鏈包括衍生自Act-1抗體重鏈源的三個互補決定區(qū)。這種核酸包括，(a)編碼具有人化Act-1免疫球蛋白重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的多肽的核酸[例如，圖11中的重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:19)，圖9中的重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:15)]，(b)編碼具有人化Act-1免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的多肽的核酸[例如，圖12中的輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:21)，圖7中的輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:12)]，(c)編碼人化Act-1免疫球蛋白輕或重鏈可變區(qū)中至少一個功能部分的核酸(例如，人化免疫球蛋白中足夠結(jié)合抗原的部分)。由于遺傳密碼的簡并性，編碼特定多肽的可能有多種核酸。在一個實施方案里，核酸中所包含的可變區(qū)序列被描述或?qū)嵸|(zhì)上被描述于圖11(SEQIDNO:18)，或者被描述或?qū)嵸|(zhì)上被描述于圖12(SEQIDNO:20)，包括雙鏈或單鏈聚核苷酸。[盡管有多種圖能夠描述比可變區(qū)大得多的多肽(例如，包括信號肽編碼序列或恒定區(qū)編碼序列的一部分)，特定圖中可變區(qū)的圖例說明意味著包括圖示序列的可變區(qū)部分]。符合這些標(biāo)準(zhǔn)的分離的和/或重組的核酸，包括那些能夠編碼與上面討論的人化Act-1抗體或它的變種的序列相等的序列的核酸。本發(fā)明中的核酸可以用來制備特異結(jié)合α4β7整合蛋白的人化免疫球蛋白。例如，編碼本發(fā)明中人化免疫球蛋白的核酸(DNA)可以被整合到一合適結(jié)構(gòu)中(如一個載體)，進(jìn)一步操縱其序列或者在合適的宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)所編碼的多肽。特異結(jié)合α4β7整合蛋白的人化免疫球蛋白的制備方法本發(fā)明的另一方面涉及特異結(jié)合α4β7的人化免疫球蛋白的制備方法。例如，在合適的宿主細(xì)胞里，對編碼特異結(jié)合α4β7的人化免疫球蛋白的一個或多個重組核酸進(jìn)行表達(dá)，從而獲得人化免疫球蛋白。本發(fā)明也提供了適于特異結(jié)合人化免疫球蛋白表達(dá)的構(gòu)建物或表達(dá)載體。構(gòu)建物可以被導(dǎo)入一合適的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生能表達(dá)人化免疫球蛋白的細(xì)胞，并可以在培養(yǎng)基中生長和維持。合適的宿主細(xì)胞可以是原核生物，包括細(xì)菌，例如大腸桿菌(E.coli)、蘇云金桿菌(B.subtilis)和/或其他合適的細(xì)菌，或者真核生物，例如真菌或酵母細(xì)胞(如Pichiapastoris,Aspergillusspecies,Saccharomycescerevisiae,Schizosaccharomycespombe,Neurosporacrassa)，或者其他低級真核細(xì)胞，以及高級真核細(xì)胞，例如昆蟲細(xì)胞[如sf9昆蟲細(xì)胞(WO94/26087,O’Connor,1994年11月24日發(fā)表)]或哺乳動物細(xì)胞[如COS細(xì)胞，NSO細(xì)胞，SP2/0，中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO),HuT78細(xì)胞，293細(xì)胞]。[見Ausubel,F.M.etal.,eds.CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandJohnWiley&amp;SonsInc.,(1993)]。產(chǎn)生特異結(jié)合α4β7整合蛋白的人化免疫球蛋白的宿主細(xì)胞，可以如下述制備。例如，含有對所需的人化免疫球蛋白的全部或部分編碼序列的核酸可以被插入到一核酸載體中，例如DNA載體，如質(zhì)粒，病毒或其他適于表達(dá)的復(fù)制子。有多種載體可供選擇，包括單拷貝或多拷貝載體，或者整合到宿主細(xì)胞染色體中的載體。合適的表達(dá)載體可以包含許多組成部分，包括但不僅限于下述成分中的一個或幾個成分復(fù)制起點；可選擇的標(biāo)記基因；一個或多個表達(dá)調(diào)控因子，例如，轉(zhuǎn)譯控制因子(如啟動子，增強子，終止子)，和/或一個或多個翻譯信號；用于膜靶向或膜分泌的信號序列或前導(dǎo)序列。在一個構(gòu)建物中，信號序列可以由載體提供，也可以有其他來源，例如，免疫球蛋白的轉(zhuǎn)譯和/或翻譯信號可以用來指導(dǎo)表達(dá)。合適的宿主細(xì)胞含有用于表達(dá)的啟動子，啟動子可以是組成型，也可以是誘導(dǎo)型，例如，將啟動子可工作地連接到編碼人化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的核酸上，從而指導(dǎo)多肽的表達(dá)。對于原核細(xì)胞(例如，適合大腸桿菌的啟動子有l(wèi)ac、tac、T3、T7)和真核細(xì)胞(適合真核細(xì)胞的酵母乙醇脫氫酶(ADH1)、SV40、CMV)都有多種啟動子可供選擇。此外，典型的表達(dá)載體包括有可供篩選的標(biāo)記物，用來篩選帶有載體的宿主細(xì)胞，如果是復(fù)制表達(dá)載體，則包括起源和復(fù)制區(qū)段。對具有抗生素或藥物抗性的產(chǎn)物進(jìn)行編碼的基因通常用作可篩選的標(biāo)記物，并且可以用于原核細(xì)胞(例如，β-內(nèi)酰胺酶基因(抗青霉素)，抗四環(huán)素的Tet基因)和真核細(xì)胞[例如，新霉素(G418或遺傳霉素)，gpt(霉菌酚酸)，青霉素或潮霉素抗性基因]。二氫葉酸還原酶標(biāo)記基因允許通過二氫葉酸在多種宿主細(xì)胞中進(jìn)行篩選。編碼營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記物的基因(例如LEU2,URA3,HIS3)是酵母菌常用的篩選標(biāo)記。倍受關(guān)注的載體還有病毒(如桿狀病毒)、噬菌體和能夠整合到宿主基因組中的載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒。本發(fā)明也涉及帶有這些表達(dá)載體的細(xì)胞。例如，通過某種適合待篩選宿主細(xì)胞的方法(如轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、電滲透、傳染)，可以將編碼特異結(jié)合α4β7人化免疫球蛋白重鏈和輕鏈的核酸，或構(gòu)建物(一個或多個構(gòu)建物)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞，以便這些核酸能夠可工作地連接到一個或多個表達(dá)控制因子上(例如，在載體中，在細(xì)胞內(nèi)的過程所創(chuàng)造的構(gòu)建物中的核酸被整合到宿主細(xì)胞基因組中)。宿主細(xì)胞在適于表達(dá)的條件下生長(例如，存在誘導(dǎo)物，存在含有適當(dāng)鹽、生長因子、抗生素、營養(yǎng)補充物等的培養(yǎng)基)，從而生產(chǎn)出所編碼的多肽。如果需要，還可以從中(宿主細(xì)胞、培養(yǎng)液、奶汁)分離出所編碼的蛋白(如人化Act-1抗體)。此過程包括在轉(zhuǎn)基因動物宿主細(xì)胞中的表達(dá)(見WO92/03918,GenPharmInternational,1992年3月19日發(fā)表)?？梢灾苽淙诤系鞍?，其中，人化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈在N端、C端或融合蛋白的中間位置，連接到一個非免疫蛋白部分上(天然情況下，免疫球蛋白沒有此部分)。例如，一些實施例是將免疫球蛋白基因插入一合適的表達(dá)載體，如pET載體(pET-15b,Novagen)，噬菌體載體(pCANTAB5E,Pharmacia),或別的載體(pRIT2T蛋白A融合載體，Pharmacia)。所得到的構(gòu)建物被導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)后，利用恰當(dāng)?shù)挠H合基質(zhì)從細(xì)胞溶鮑物中分離或純化融合蛋白{見CurrentProtocolsinMolecularBiology[Ausubel,F.M.etal.,eds.,vol2,Suppl.26,pp.16.4.1-16.7.8(1991)]}。治療方法及組合物本發(fā)明提供了人化免疫球蛋白，它們能夠(1)在體外和/或在體內(nèi)結(jié)合α4β7整合蛋白；和/或(2)調(diào)節(jié)α4β7整合蛋白的活性或功能，例如(a)結(jié)合功能(α4β7結(jié)合MAdCAM-1，纖連蛋白和/或VCAM-1的能力)和/或(b)淋巴細(xì)胞滲透功能，包括富集和/或聚集于組織(抑制淋巴細(xì)胞遷向內(nèi)皮黏膜組織的能力)。優(yōu)選的是，人化免疫球蛋白能夠在體外和/或在體內(nèi)選擇性結(jié)合α4β7，以及抑制α4β7介導(dǎo)的反應(yīng)。在一個實施方案里，人化免疫球蛋白可以同α4β7整合蛋白結(jié)合，抑制了α4β7與它的配體中的一個或一個以上的結(jié)合(例如，MAdCAM-1,VCAM-1，纖連蛋白)，從而抑制組織的淋巴細(xì)胞滲透(包括組織中淋巴細(xì)胞的富集和/或集中)，最好具有選擇性。在體外和/或在體內(nèi)，此人化免疫球蛋白能夠抑制在黏膜組織中α4β7攜帶細(xì)胞與腸內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞黏附作用，這些黏膜組織包括消化道相關(guān)組織、淋巴樣器官或淋巴細(xì)胞(尤其是T細(xì)胞或B細(xì)胞)。在一個最佳實施例中，人化免疫球蛋白(例如，Act-1)可以抑制α4β7與MAdCAM-1和/或纖連蛋白的反應(yīng)。本發(fā)明的人化免疫球蛋白在科研、診斷和治療等諸多領(lǐng)域都是十分有價值的。例如，它們能夠用來探測、分離和/或純化α4β7整合蛋白或它的變種(例如，采用親合純化法或其他方法)，能用來研究α4β7整合蛋白的結(jié)構(gòu)(如構(gòu)型)與功能。本發(fā)明的人化免疫球蛋白也可以用于診斷(在體外)或者在治療(包括預(yù)防)中調(diào)節(jié)α4β7的功能。本發(fā)明的人化免疫球蛋白可用于檢測和/或測量樣品中α4β7整合蛋白的水平(例如，組織或體液，例如炎癥滲出液、血液、血清、腸液，攜帶α4β7的細(xì)胞等)。例如，從個體獲得樣品(組織和/或體液)，用合適的免疫學(xué)方法檢測和/或測量α4β7的表達(dá)，這些方法包括酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，化學(xué)發(fā)光實驗，放射免疫實驗和免疫組織學(xué)等。在一種實施方案中，提供了檢測樣品內(nèi)α4β7整合蛋白的方法，該方法包括，在適于人化免疫球蛋白特異結(jié)合α4β7的條件下，將樣品與本發(fā)明的人化免疫球蛋白相接觸，檢測所形成的抗體-α4β7整合蛋白復(fù)合物。在應(yīng)用該方法時，可以用人化免疫球蛋白來區(qū)分正常組織與炎癥組織(人體的)的α4β7活性和/或表達(dá)(免疫組織學(xué)的角度)，從而發(fā)現(xiàn)IBD或其他疾病與α4β7表達(dá)增加(受感染組織的)之間的聯(lián)系。本發(fā)明的人化免疫球蛋白能用來評價正常組織和炎癥組織中α4β7整合蛋白的存在情況，從而對疾病的發(fā)生、疾病進(jìn)程和/或者抗α4β7整合蛋白治療炎癥的療效等進(jìn)行評價。本發(fā)明人化免疫球蛋白也能用來調(diào)節(jié)[例如抑制(減弱或防止)]α4β7整合蛋白的結(jié)合功能和/或淋巴細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)滲透功能。例如，對于組織淋巴細(xì)胞(如淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞)滲透性疾病(包括組織中淋巴細(xì)胞的富集和/或積聚)，尤其是表達(dá)MAdCAM分子的組織，可以用抑制α4β7與其配體(一個或多個配體)結(jié)合的人化免疫球蛋白來治療，為達(dá)到治療效果，將有效劑量的本發(fā)明的人化免疫球蛋白提供給個體(例如，哺乳動物，如人或別的靈長目動物)?？捎么朔ㄖ委煹难装Y疾病包括在下列組織的淋巴細(xì)胞滲透性疾病胃腸道(包括腸內(nèi)皮)、其他黏膜組織、或表達(dá)MAdCAM-1分子的組織(如腸相關(guān)組織，包括大小腸黏膜固有層的小靜脈；和哺乳動物腺體(乳腺))。相似地，因淋巴細(xì)胞與表達(dá)MAdCAM-1細(xì)胞(如內(nèi)皮細(xì)胞)結(jié)合而導(dǎo)致的組織淋巴滲透性疾病，也可根據(jù)本發(fā)明來治療。在特別優(yōu)選的實施方案中，此法能用于治療炎性腸道疾病(IBD)，例如潰瘍性結(jié)腸炎、Crohn’s病、回腸炎、腹腔疾病、非熱帶性口炎性腹瀉、關(guān)節(jié)病血清反應(yīng)陰性腸病、顯微性或膠原性結(jié)腸炎、嗜酸性胃腸炎、直腸結(jié)腸切除及回腸吻合術(shù)后直腸瓣間小囊炎癥。胰腺炎和胰島素依賴型糖尿病也可以用此法治療。據(jù)報道，不僅BALB/c和SJL老鼠，而且NOD(非肥胖性糖尿病)老鼠的外分泌胰管也能表達(dá)MAdCAM-1，在胰島素疾病早期，NOD老鼠炎癥胰島內(nèi)皮上誘導(dǎo)出MAdCAM-1，其中以地址素為主[Hanninen,A.,etal.,J.Clin.Invest.,92:2509-2515(1993)]。此外，表達(dá)α4β7的淋巴細(xì)胞在胰島上聚集，α4β7介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞與發(fā)炎胰島管的結(jié)合也與MAdCAM-1有關(guān)[Hanninen,A.,etal.,J.Clin.Invest.,92:2509-2515(1993)]。可以用本發(fā)明的方法治療的黏膜組織炎癥疾病包括乳腺炎(哺乳動物腺體)、膽囊炎、膽管炎或邊周性膽囊炎(膽管和肝臟周圍組織)、慢性支氣管炎、慢性竇炎、氣喘和移植排異反應(yīng)(例如在胃腸道上)。象Crohn’s病一樣，炎癥常常擴散到黏膜表面以外，類似地，導(dǎo)致間隙纖維變性、過敏性肺炎、膠原疾病、肉樣瘤病和其他自發(fā)疾病的慢性肺部炎癥，也能用此法治療。人化免疫球蛋白要以能達(dá)到抑制α4β7結(jié)合其配體的有效劑量給藥。在治療中，有效劑量可以達(dá)到所需要的治療(包括預(yù)防)效果(例如，足夠減輕或防止α4β7參與的結(jié)合和/或信號的劑量，從而抑制淋巴細(xì)胞黏附和滲透和/或伴發(fā)的細(xì)胞反應(yīng))。人化免疫球蛋白可以是單劑量或者是多份劑量。劑量可以根據(jù)本領(lǐng)域熟知的方法來確定，并且受下列因素影響個體年齡、敏感性、耐受性、身體狀況?？贵w的合適劑量可以是從0.1毫克/公斤體重到10毫克/公斤體重。根據(jù)本方法，人化免疫球蛋白可以單獨給藥，或者搭配給藥，可以在給其他藥物之前、同時或之后給藥。在一種實施方案里，給藥的是多于一種的抑制α4β7結(jié)合其配體的人化免疫球蛋白。在另一實施方案里，可抑制淋巴細(xì)胞結(jié)合內(nèi)皮上配體的單克隆抗體，包括抗MAdCAM-1、抗VCAM-1、抗ICAM-1抗體，與人化免疫球蛋白配合給藥。在另外的一種實施方案中，一種額外的藥物活性成分與人化免疫球蛋白配合給藥(例如消炎化合物硫酸沙利比林、非甾體消炎藥或類固醇消炎藥)。可以有多種給藥途徑，它們包括但并不僅限于腸胃外給藥(靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下注射)，口服給藥(飲食)，局部給藥，吸入給藥(支氣管內(nèi)、鼻內(nèi)或口腔吸入給藥、鼻內(nèi)滴注)，或者直腸給藥，具體途徑視疾病和治療條件定。腸胃外給藥是最佳給藥途徑。根據(jù)不同的給藥途徑來選擇不同的藥物劑型(溶液、乳劑)。適宜的含有人化抗體的組合物可以用生理學(xué)可接受的載體來制備。對于溶液和乳劑，適用的載體包括水或醇/水溶液、乳濁或懸浮液，包括鹽水和緩沖液。腸胃外給藥所用載體包括氯化鈉溶液，Ringer’s葡萄糖，糖鹽水，乳糖化Ringer’s或者固定油。靜脈內(nèi)給藥所用載體可以包括多種添加劑，保存劑，或液體，營養(yǎng)劑或電解補充劑(見Remington’sPharmaceuticalSciences,17thEditionMackPublishingCo.,PA,1985)。吸入給藥可以將藥物溶解，再裝入一種合適的噴霧器中(例如，霧化器，噴灑器，和壓力氣溶膠噴霧器)。實施例本發(fā)明由下列實施例予以進(jìn)一步說明，但它們不是要限制本發(fā)明的。如實施例1所描述，進(jìn)行了鼠Act-1抗體的純化和序列分析。編碼鼠Act-1抗體輕重鏈可變區(qū)的cDNA被PCR擴增且測序。用蛋白質(zhì)測序測得Act-1kappa輕鏈可變區(qū)(VL)的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)它和VL基因DNA序列衍生出的氨基酸序列完全一致。同樣，絕大部分重鏈可變區(qū)(VH)的氨基酸序列也已測知，并且和VH基因DNA序列衍生出的氨基酸序列一致。這些結(jié)果說明從雜交細(xì)胞株中克隆到正確的鼠Act-1可變區(qū)基因功能性嵌合Act-1抗體被產(chǎn)生，證實了克隆到正確的基因。特別值得注意的是，編碼鼠Act-1輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的DNA分別與人kappa輕鏈恒定區(qū)DNA和人γ-1或γ-4重鏈恒定區(qū)DNA相連。嵌合的抗體也被用于和人化Act-1mAb(變形的Act-1mAbLDP-02)之間的比較分析。為制備良好結(jié)合α4β7的人化Act-1抗體，設(shè)計出變形的人可變區(qū)(實施例2)。為方便設(shè)計，建立了一個鼠Act-1可變區(qū)的分子模型。鼠Act-1抗體中直接參與抗原結(jié)合的區(qū)域，互補決定區(qū)或CDR被移植到特定的人可變區(qū)中。在人可變區(qū)框架區(qū)(FR)上制造少量位點的氨基酸改變。這種改型的人Act-1可變區(qū)在特定人輕鏈可變區(qū)FR上有單個氨基酸改變，在特定人重鏈可變區(qū)FR上有5個氨基酸改變，每個改變都是將人型轉(zhuǎn)變成鼠型。如實施例3所描述，對改型的人Act-1可變區(qū)進(jìn)行編碼的DNA被構(gòu)建，并連接于人恒定區(qū)DNA序列，所生成的核酸被用來制備人化Act-1免疫球蛋白。人化Act-1抗體在哺乳細(xì)胞里表達(dá)(實施例3)，和鼠Act-1抗體比較，測其與人α4β7的結(jié)合(實施例4)。如表5所示，人化Act-1抗體保留了鼠Act-1也有的抗原決定部位結(jié)合特異性，而且與天然的鼠抗體相比，還表現(xiàn)出意外的增強的親合性。在設(shè)計中鑒別出幾個人化Act-1抗體的變種(實施例2和5)。例如，可以在如下的一個或一個以上位點發(fā)生額外的改變輕鏈突變體M4V(位點4的Met→Val突變)，重鏈突變體R38K(位點38的Arg→Lys突變)，重鏈突變體A40R(位點40的Ala→Arg突變)。此外，重鏈突變體173T(位點73的Ile→Thr回復(fù)突變)，在位點73保留原存在于人框架區(qū)同樣位點的蘇氨酸。既能夠在單一鏈上制造一個或多個位點改變，又能夠在多條鏈上制造多種位點改變。實施例1Act-1VH和VL區(qū)的克隆及鼠-人Act-1嵌合免疫球蛋白的構(gòu)建和表達(dá)Act-1VH和VL區(qū)的克隆根據(jù)制造商實驗手冊上的方法，利用TRIzol試劑(Gibco/BRL)從產(chǎn)Act-1單克隆抗體的雜種細(xì)胞提取RNA[Lazarovits,A.I.etal.,J.Immunol.,133(4):1857-1862(1984)；providedbyA.I.,LazarovitsandR.B.,Colvin)]。根據(jù)制造商的實驗手冊用Ig-引物試劑盒(Novagen)對重鏈和輕鏈可變區(qū)基因進(jìn)行PCR擴增，簡述之，1.5μgRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系中包括2.0μl5XMMLV緩沖液(5X=250mMTris-HCl,pH8.3,25℃,375mMKCl,15mMMgCl2),1.0μl100mMDTT(二硫蘇糖醇)，0.5μl10mMdNTP混合液(dATP、dCTP、dTTP、dGTP各10mA)，0.5μl寡聚dT(1μg/μl),0.25μl乙酰BSA(4mg/ml),1.0μl適用的Ig-3’引物(10pmol/μl),0.5μlMMLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200單位/μl)和無RNase水，總體積為10μl?；旌衔镉?7℃溫育5分鐘，42℃下30分鐘，99℃下5分鐘，每個Ig-3’引物在單獨的反應(yīng)中使用。根據(jù)制造商的實驗手冊，可變區(qū)在逆轉(zhuǎn)錄材料中被擴增，簡述之，8μl的逆轉(zhuǎn)錄材料同下列物質(zhì)混合4μl2.5mMdNTP,5μl10X反應(yīng)緩沖液(10X=100mMTris-HCl,pH8.8,25℃,500mMKCl,15mMMgCl2,1％TritonX-100),2.5μlIg-5’前導(dǎo)引物(10pmol/μl)(每個引物在獨立的反應(yīng)中使用)，0.25μl(1.25單位)AmpliTaqDNA多聚酶(Perkin-Elmer)，用水補足到50μl。以MuIgVH5’-A,MuIgVH5’-B,MuIgkVL5’-A和MuIgkVL5’-B為引物的擴增反應(yīng)，其循環(huán)參數(shù)分別為94℃1分鐘，50℃1分鐘，72℃2分鐘，循環(huán)35次，然后72℃延續(xù)6分鐘。所有其他5’端引物的擴增反應(yīng)同樣適用該條件，除了退火溫度上升為60℃。不管是用MuIgGVH3’-2或MuIgMVH3’-1作3’端引物，還是用MuIgVH5’-B或MuIgVH5’-E作5’端引物，都能成功擴增重鏈可變區(qū)。用MuIgkVL3’-1作3’端引物和用MuIgkVL5’-G作5’端引物可以成功擴增出輕鏈可變區(qū)。引物序列如下MuIgGVH3’-2(SEQIDNO:56):5’-CCCAAGCTTCCAGGGRCCARKGGATARACIGRTGGMuIgMVH3’-1(SEQIDNO:57):5’-CCCAAGCTTACGAGGGGGAAGACATTTGGGAAMuIgVH5’-B(SEQIDNO:58):5’-GGGAATTCATGRAATGSASCTGGGTYWTYCTCTTMuIgVH5’-E(SEQIDNO:59):5’-ACTAGTCGACATGAAGWTGTGGBTRAACTGGRTMuIgκVL3’-1(SEQIDNO:60):5’-CCCAAGCTTACTGGATGGTGGGAAGATGGAMuIgκVL5’-G(SEQIDNO:61):5’-ACTAGTCGACATGGATTTWCARGTGCAGATTWTCAGCTT用瓊脂糖凝膠純化出擴增片段，用Ig-Prime試劑盒將之共價結(jié)合到pT7BlueT載體中(Novagen)，根據(jù)制造商的實驗手冊，用此共價連接混合物轉(zhuǎn)化試劑盒中提供的NovaBlue細(xì)胞。用T7啟動子引物和U-19mer引物，對包含合適尺寸插入的白色集落進(jìn)行測序。退火發(fā)生在插入位的對面，正好在pT7Blue載體多克隆位點的外面。根據(jù)制造商的實驗手冊，用測序酶T7DNA多聚酶試劑盒(USB/AmershamLifeScience)在儀器小制備量DNA上測序。多個獨立的重鏈可變區(qū)克隆的共同DNA序列(SEQIDNO:1)及其編碼的氨基酸序列(SEQIDNO:2)，被示于圖1。簡并引物導(dǎo)致序列中某些簡并，起始密碼是核苷酸13-15編碼的Met，預(yù)測的先導(dǎo)物多肽酶切割位點位于核苷酸67-69編碼的Ser和核苷酸70-72編碼的Gln之間(核苷酸13-69編碼前導(dǎo)肽)。本圖中，鼠恒定區(qū)的一部分起始于由殘基433-435編碼的Ala。多個獨立的輕鏈可變區(qū)克隆的DNA序列(SEQIDNO:5)及氨基酸序列(SEQIDNO:6)，示于圖3。不同于重鏈可變區(qū)，被擴增序列并不簡并，可能因為所用引物并非很簡并，以及可變區(qū)僅由單一的引物對擴增而來。嵌合重鏈基因的構(gòu)建構(gòu)建了嵌合性鼠-人重鏈基因，人重鏈恒定區(qū)的來源是一個含有野生型人γ1恒定區(qū)的克隆(由HermanWaldmann博士提供(牛津大學(xué)))；被標(biāo)為3818的構(gòu)建物包括整合在pEE6表達(dá)載體(Celltech)的人化抗CD18重鏈基因，對應(yīng)于人化CD18重鏈基因同一區(qū)域的恒定區(qū)被克隆到pEE6.hCMV中，具體如Sims,M.J.etal.,J.Immunol.,151(4):2296-2308(1993)andWO93/02191,1993年2月4日所述，這些文獻(xiàn)的教導(dǎo)都通過在此引述而全部合并于本文。用HindⅢ和EcoRⅠ酶解，可以從表達(dá)載體上釋放出人化抗CD18抗體重鏈可變區(qū)和恒定區(qū)(野生型γ-1)的序列，回收1.421bp含有重鏈基因的片段，亞克隆到pCR-ScriptTM(Stratagene)的HindⅢ和EcoRⅠ位點，形成一個稱為pCR-CD18H的質(zhì)粒。在抗-CD18重鏈基因可變區(qū)和恒定區(qū)之間的連接部位有一個SpeⅠ限制性酶切點，用HindⅢ和SpeⅠ酶切pCR-CD18H，釋放出重鏈可變區(qū)，此區(qū)由如下述制備的鼠Act-1可變區(qū)替代。合成出兩個引物，使整合入新的限制性內(nèi)切酶位點，引物是5’端引物(SEQIDNO:41):HindⅢ5’-T[AAGCTT]CCGCCATGGGATGGAGC3’端引物(SEQIDNO:42):SpeⅠ5’-GGTGAC[ACTAGT]GCCTTGACCCCAG黑體印刷的核苷酸說明與模板序列不同，被標(biāo)為H2B#34的帶有如圖2中的核酸序列(SEQIDNO:3)和氨基酸序列(SEQIDNO:4)的獨立的鼠Act-1重鏈克隆，可作為模板，在上述5’和3’端引物作用下，可擴增鼠可變區(qū)，同時在起始密碼5’端導(dǎo)入一個HindⅢ位點，在J區(qū)3’端導(dǎo)入一個SpeⅠ位點。PCR片段被直接亞克隆到pCR-ScriptatTM，形成pCR-mACT1HV質(zhì)粒，正確的序列得到證實。通過HindⅢ和SpeⅠ酶能從pCR-mACT1HV上釋放出片段，再插入pCR-CD18H的HindⅢ和SpeⅠ位點，替代抗CD18可變區(qū)形成pCR-mhACT1Hchi。用HindⅢ和EcoRⅠ釋放出嵌合的重鏈基因(鼠Act-1可變區(qū)加上人γ1恒定區(qū))，再克隆回到pEE6hCMV-B載體，包括hCMV啟動子，形成了一個名為pEE6mhACT1Hchi的構(gòu)建物。嵌合性輕鏈基因的構(gòu)建以類似重鏈的方式構(gòu)建了嵌合性鼠-人輕鏈基因。然而，對于嵌合性輕鏈，導(dǎo)入了一個新的限制性酶切位點KasⅠ到構(gòu)建物中，是以一條名為KG#87的鼠Act-1輕鏈可變區(qū)克隆為模板對一個可變區(qū)片段進(jìn)行PCR擴增，以包含有人化抗CD18kappa輕鏈基因的結(jié)構(gòu)體為模板讀kappa輕鏈恒定區(qū)進(jìn)行PCR擴增，從而獲得此位點[由HermanWaldmann博士提供(牛津大學(xué))，3819構(gòu)建物包含有存在于pEE12表達(dá)載體的人化抗CD18輕鏈]。恒定區(qū)對應(yīng)于Sims,M.J.所描述克隆于pEE12的人化CD18輕鏈基因的恒定區(qū)[Sims,M.J.etal.,J.Immunol.,151(4):2296-2308(1993)和WO93/02191,1993年2月4日發(fā)表]?？勺儏^(qū)引物為5’端引物(SEQIDNO:43)HindⅢ5’-T[AAGCTT]CCGCCATGAAGTTGCCT3’端引物(SEQIDNO:44)KasⅠ5’-[GGCGCC]GCATCAGCCCGTTTT黑體印刷的核苷酸說明與模板的序列不同，編碼區(qū)內(nèi)兩位點的核苷酸改變，位點423T→G，位點426A→G，在圖3中產(chǎn)生了KasⅠ位點，它們是靜息的，不改變氨基酸序列。kappa恒定區(qū)的引物為5’端引物(SEQIDNO:45)KasⅠ5’-C[GGCGCC]ATCTGTCTTCATC3’端引物(SEQIDNO:46)HindⅢ5’-[AAGCTT]CTAACACTCTCC輕鏈可變區(qū)和恒定區(qū)分別在各自的模板和引物下進(jìn)行擴增，PCR產(chǎn)物分別被亞克隆到pCR-ScriptTM中以確證序列。用HindⅢ和KasⅠ酶解從載體上釋放出每個片段，經(jīng)凝膠純化后共價整合到3819pEE12表達(dá)載體的HindⅢ位點，已經(jīng)事先用HindⅢ酶解從該載體釋放出人化抗CD18輕鏈基因，最后所得構(gòu)建物命名為pEE12mhACTlLchi。嵌合性免疫球蛋白的表達(dá)為組建包括嵌合重鏈和輕鏈基因的表達(dá)載體，用BglⅡ和BamHⅠ酶從pEE6表達(dá)載體上(pEE6mhACT1Hchi)釋放出整個重鏈基因加CMV啟動子，該片段再共價整合到pEE12輕鏈基因表達(dá)載體(pEE12mhACT1Lchi)的BamHⅠ位點，得到了包含嵌合輕鏈基因和嵌合重鏈基因的命名為pEE12mhLHchi的單一質(zhì)粒，這兩條基因都分別受到CMV啟動子的轉(zhuǎn)譯調(diào)控。pEE6hCMV-B和pEE12表達(dá)載體和Celltech公司的谷氨酸合成酶基因擴增系統(tǒng)，已在前面描述過[見，WO86/05807(Celltech),WO87/04462(Celltech),WO89/01036(Celltech),EP0323997B1(Celltech)，和WO89/10404(Celltech)，這些有關(guān)的教導(dǎo)都通過在此引述而全部合并于本文]。為短暫地表達(dá)嵌合的抗體，可以通過電滲透將20μgpEE12mhLHchi轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞(AmericanTypeCultureCollection,12301ParklawnDrive,Rockville,MD,20852)，用胰蛋白酶-EDTA處理從組織培養(yǎng)瓶中收集對數(shù)期的COS-7細(xì)胞，對細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，用Hank’s平衡鹽溶液(HBSS)洗滌一次，將細(xì)胞分散于濃度為1.5×107cells/ml的HBSS中，取0.8mlHBSS即有1.2×107個細(xì)胞與20μg質(zhì)粒DNA混合，于室溫孵育10分鐘，將此DNA/細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)入0.4cm電滲透試管，用Bio-RadGenePulser供以250伏特，960μF的電流，電滲透后于室溫孵育10分鐘，再將細(xì)胞轉(zhuǎn)入20ml培養(yǎng)基中(Dulbecco’s改良型Eagle’s培養(yǎng)基(DMEM)+10％FCS)，于162cm2的組織培養(yǎng)瓶(Costar)中培養(yǎng)。5天后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液的上清液，測試其對表達(dá)α4β7的HuT78細(xì)胞的染色能力，HuT78細(xì)胞(一種人類T細(xì)胞株)由AmericanTypeCultureCollection提供(12301ParklawnDrive,Rockville,MD20852,AssessionNo.ATCC71B161)。100μl的被瞬間轉(zhuǎn)化的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液，不成功轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞培養(yǎng)上清液，純化的鼠Act-1抗體(10μg/ml)，或各自純化的鼠(鼠IgGl,kappa(MOPC21),10μg/ml，來自Sigma)和人(人IgG1,10μg/ml來自Sigma)型不相關(guān)的同型對照抗體，在冰上和1×105HuT78細(xì)胞一起孵育30分鐘，用含有2％小牛血清(FCS)和0.01％疊氮化鈉(FACS緩沖液)的冰凍的PBS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，在冰上和恰當(dāng)?shù)臒晒廨o助抗體孵育30分鐘[連有AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗-鼠IgG(H+L)的熒光FITC或者連有AffiniPureF(ab’)2片段山羊抗-人IgG(H+L)的熒光FITC(JacksonImmnoResearch)]。30分鐘后，用FACS緩沖液洗滌細(xì)胞兩次，再溶解于300ml的同種緩沖液中，用BectonDickinsonFACscan細(xì)胞流計分析細(xì)胞。圖4A表示和鼠同型不相關(guān)對照抗體MOPC21(IgG1,kappa)相比，對鼠Act-1mAb的染色。圖4B表示和人同型不相關(guān)對照抗體(IgG1,kappa)以及不成功轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞上清比較，嵌合的Act-1抗體對HuT78細(xì)胞的染色。因此，和鼠Act-1抗體相比，此嵌合的抗體對HuT78細(xì)胞的染色是類似的?？偟膩碚f，這些數(shù)據(jù)說明我們成功地克隆及表達(dá)了正確的鼠Act-1可變區(qū)。氨基酸序列分析對純化的鼠Act-1重輕鏈進(jìn)行氨基酸序列分析，以證實從雜合子中分離到的輕重鏈可變區(qū)cDNA的特性，對輕鏈進(jìn)行的實驗是這樣的在氮氣保護下，0.3M硼酸鈉，0.15M氯化鈉溶液，37℃下2個小時，用2mMDTT降解鼠Act-1(5mg/ml)，加入碘化乙酰胺，溶液濃度調(diào)為10mM，室溫下保持4小時，非變性條件下的SDS-PAGE電泳分析結(jié)果證實了此蛋白被定量降解。蛋白質(zhì)溶液進(jìn)一步在PBS中透析，取一部分透析干凈的樣品過Superdex75柱(16/60,Pharmacia)(run1)，重鏈和輕鏈都從同一柱上通過二者洗脫，體積一樣，說明兩鏈依然相連。另一份樣品用8M尿素處理，在變性條件下(6M尿素)過superdex75柱(run2)，二者還是在柱中一起洗脫，可能是由于沒有打開折疊的緣故。SDS-PAGE電泳分析證實，從兩種凝膠過濾洗脫下來的兩樣品中都有全部兩條鏈的存在。對這些樣品進(jìn)行N端測序(CommonwealthBiotechnologies,Inc.)，結(jié)果如下樣品2:DVVVTQTPLSLPVSFDGQV(SEQIDNO:47)樣品1:DVVVTQTPLSL(SEQIDNO:48)所得序列與從DNA推導(dǎo)出的成熟的輕鏈N端序列相一致，這里以及其他的分析重鏈序列的嘗試，說明重鏈N端可能被封閉了，因此，對重鏈進(jìn)行了內(nèi)部肽段的氨基酸序列分析。用木瓜蛋白酶切割以簡化抗體F(ab)2’片段的氨基酸測序。pH3.0,0.1M檸檬酸鈉，37℃下2個小時，在抗體木瓜蛋白酶為1∶200的比例下，用木瓜蛋白酶切割鼠Act-1，通過SDS-PAGE分析來評價反應(yīng)是否結(jié)束，用蛋白質(zhì)G和蛋白質(zhì)A柱純化蛋白質(zhì)依上述方法將樣品降解并烷基化，用制備型SDS-PAGE(15％)將重鏈和輕鏈分開，切割重鏈片段，并在1ml0.1％SDS和緩沖液中電泳2小時。對樣品用2ngAsp-N蛋白質(zhì)內(nèi)切酶切割樣品30分鐘，片段用SDS-PAGE(17.5％)分離。降解產(chǎn)物在0.1MHepes,PH8.0,0.1％SDS中被動洗脫過夜，并進(jìn)行N端測序(CommonwealthBiotechnologies,Inc.)。從17Kda片段得到的序列為DYAIDYWG(SEQIDNO:49)，存在于重鏈克隆中(圖1，序列AIDY對應(yīng)于JH4區(qū)的起始位)。實施例2鼠Act-1可變區(qū)的分子模型為幫助設(shè)計CDR-移植的可變區(qū)，建立起一個鼠Act-1可變區(qū)的分子模型，利用已建立的同源性建模方法，模型化類似于免疫球蛋白的確定特性的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，在UNIX操作系統(tǒng)下用SiliconGraphicsIRIS4D工作站建立分子模型，使用分子模型軟件包QUANTA(PolygenCorp.,Waltham,MA)和Brookhaven蛋白質(zhì)晶體圖譜數(shù)據(jù)庫。第一步，依據(jù)類似的，明確了結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白可變區(qū)FRs，模型化一種新型可變區(qū)的框架區(qū)(FRs)。由于相同的氨基酸側(cè)鏈被維系在原來的方位，因此就可以象在鼠Act-1抗體中那樣，利用最大重疊過程以保持chi轉(zhuǎn)角，從而替換突變的側(cè)鏈。絕大多數(shù)新型可變區(qū)CDR的建模都是基于典型的CDR結(jié)構(gòu)[Chothia,C.,andA.M.Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)；Chothia,C.,etal.,Nature342:877-883(1989)；Tramontano.A.,etal.,J.Mol.Biol.215:175-182(1990)；Chothia,C.,etal.,J.Mol.Biol.227:799-817(1992)]。而在重鏈可變區(qū)CDR3的情況下，卻沒有已知的典范結(jié)構(gòu)，只能是根據(jù)存在于任何結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)的類似環(huán)結(jié)構(gòu)，來建立CDR環(huán)的模型。最后，為了緩解不需要的原子接觸以及優(yōu)化范德華力和靜電作用，如同在QUANTA中所做的，通過CHARMm勢能使模型能量最小化[Brooks,B.R.,J.Comp.Chem.4:187-217(1983)]。對于鼠Act-1可變區(qū)，是根據(jù)鼠單克隆抗體4-4-20Fab片段FR，來建立輕鏈可變區(qū)FR的模型[Herron,J.N.,etal.,Proteins.Structure,FunctionandGenetics5:271-280(1989)]。根據(jù)鼠單克隆抗體D11.15Fab片段的FR來建立重鏈可變區(qū)的FR的模型[Chitarra,V.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA90:7711-7715(1993)]。建模所基于的鼠Act-1抗體和可變區(qū)之間不同的那些氨基酸側(cè)鏈被替換掉，然后通過排列于殘基35-39,43-47,84-88和98-102之間的空間[其定義如Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)],Fab4-4-20抗體的輕鏈被添加到D11.15輕鏈上面，從而將這兩個異源可變區(qū)(4-4-20Kappa輕鏈可變區(qū)和D11.15重鏈可變區(qū))安排到各自正確的方位。Chothia,C.等人認(rèn)為，mAbAct-1輕鏈可變區(qū)的CDR1(L1)適用于L1典范亞群4[Chothia,C.etal.,Nature342:877-883(1989)]鼠Fab4-4-20(見上述)的L1環(huán)與典型的亞群4，在氨基酸長度上相同，氨基酸序列上相似，二者也匹配。因此，基于Fab4-4-20的L1環(huán)，對L1環(huán)建模。同樣地，mAbAct-1輕鏈可變區(qū)的CDR2(L2)和CDR3(L3)既匹配各自的典范亞群1環(huán)結(jié)構(gòu)，又匹配各自對應(yīng)的Fab4-4-20CDR，因此，基于Fab4-4-20的CDRL2和L3，模型化Act-1Kappa輕鏈可變區(qū)的L2和L3環(huán)。mAbAct-1重鏈可變區(qū)的CDR1(H1)適合Chothia,C.定義的H1典范亞群1[Chothia,C.etal.,Nature342:877-883(1989)]，相對應(yīng)的鼠mAbD11.15(見上述)H1環(huán)也是這樣。而且mAbD11.15CDR1環(huán)與mAbAct-1H1在長度上相同，在氨基酸序列上十分類似。因此，如同輕鏈的情況，基于重鏈可變區(qū)CDR1環(huán)對該環(huán)建模。很難定義重鏈可變區(qū)(H2)的CDR2，但其似乎對應(yīng)于H2典范亞群2。再者，D11.15抗體的H2環(huán)也匹配相同的典范亞群，在氨基酸序列上類似，因此可以基于D11.15的H2環(huán),對mAbAct-1的H2環(huán)建模。如上所討論的，重鏈可變區(qū)CDR3是高度可變的，不能劃分出可鑒定的結(jié)構(gòu)群組。為建立H3環(huán)的模型，鑒定出有相同長度和類似氨基酸序列的環(huán)，最好是從其他抗體上找，并以此為基礎(chǔ)去建立模型。有三種環(huán)在環(huán)大小上匹配Act-1CD3，分別來自于三種抗體，在測試全部三個環(huán)結(jié)構(gòu)對模型的空間不適應(yīng)之后，選出人抗體Pot的H3環(huán)[Fan,Z.C.,etal.,J.Mol.Biol.228:188-207(1992)]來建立mAbAct-1H3環(huán)的模型。調(diào)節(jié)了整個模型的明顯空間不適應(yīng)后，按照在QUANTA上所做的，將模型能量最小化。CDR-移植可變區(qū)的設(shè)計設(shè)計CDR-移植可變區(qū)的第一步是選取充當(dāng)人可變區(qū)基礎(chǔ)的人輕鏈和重鏈可變區(qū)。測試并比較了兩種人可變區(qū)的選擇方法，一種方法是，從人可變區(qū)不同亞類的共同序列中選擇人可變區(qū)[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]。比較嚙齒類輕重鏈可變區(qū)與人共同序列，最相似的人輕、重鏈共同序列從6個人λ輕鏈可變區(qū)亞群、4個人Kappa輕鏈可變區(qū)亞群、3個人重鏈可變區(qū)亞群中挑選出來[見Kettleborough，C.A.,ProteinEngineering4:773-783(1991)]。另一種方法是從所有已發(fā)表的人可變區(qū)序列中挑選人可變區(qū)[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]。比較嚙齒類與人的輕、重鏈可變區(qū)氨基酸序列，挑選出那些與嚙齒類可變區(qū)有較高相似性的人可變區(qū)。利用來源于同一種人抗體的輕、重鏈可變區(qū)，以保證兩可變區(qū)能夠較好地相互組合[Queen,C.,etal.,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA86:10029-10033(1989)]。然而這里所講的被挑選為模板的人輕重鏈可變區(qū)來源于兩種不同的人的抗體，這樣一來，挑選出與嚙齒類可變區(qū)有更高相似性的人可變區(qū)是可能的。有許多成功的CDR-移植抗體范例是基于來自兩個不同人抗體的可變區(qū)。研究得最好的一個例子就是改型的人CAMPATH-1抗體[Riechmann,L.,etal.,Nature332:323-327(1988)]。為設(shè)計改型的人Act-1可變區(qū)，將鼠Act-1可變區(qū)與鼠和人可變區(qū)的所有亞群的共同序列進(jìn)行比較[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]。結(jié)果概括于表1和表2。鼠ACT-1輕鏈可變區(qū)最類似于鼠Kappa輕鏈亞群Ⅱ的共同序列，總體一致性是83.9％，在FR中的一致性是87.5％(表1)。對于人抗體序列，鼠ACT-1輕鏈可變區(qū)最類似于人Kappa輕鏈亞群Ⅱ的共同序列，總體一致性是72.3％，在FR中的一致性是78.8％(表1)。表1．鼠Act-1Kappa輕鏈可變區(qū)與鼠、人Kappa輕鏈可變區(qū)亞群共同序列的比較比較鼠ACT-1Kappa輕鏈可變區(qū)與鼠、人Kappa輕鏈可變區(qū)不同亞群的共同序列的氨基酸序列，分別都連同或不連同CDR一起比較，列出了有最高相似性鼠和人亞群之間的相同性百分比以及相似性百分比。鼠ACT-重鏈可變區(qū)最類似于鼠重鏈亞群ⅡB的共同序列，總體一致性是83.5％，在FR中的一致性是94.3％(表2)。對于人抗體序列，鼠ACT-1重鏈可變區(qū)最類似于人重鏈亞群Ⅰ的共同序列，總體一致性是68.6％，在FR中的一致性是75.9％(表2)。結(jié)果證實，鼠ACT-1可變區(qū)是十分典型的鼠可變區(qū)，同樣也說明，人可變區(qū)亞群能充當(dāng)人可變區(qū)模板的良好來源和CDR-移植的受體。表2鼠.ACT-1重鏈可變區(qū)與鼠、人重鏈可變區(qū)亞群共同序列的比較比較鼠ACT-1重鏈可變區(qū)與鼠、人重鏈可變區(qū)不同亞群的共同序列的氨基酸序列，分別都連同或不連同CDR一起比較，列出了有最高相似性鼠和人亞群的相似百分比以及相同百分比。也比較了鼠ACT-1可變區(qū)與全部已記錄的鼠和人可變區(qū)范例中的個別序列[Kabat,EA.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)；UWGCGpackage(UniversityofWisconsin)]。對于人抗體序列，鼠ACT-1輕鏈可變區(qū)十分類似于人Kappa輕鏈可變區(qū)的序列，后者源于人抗體GM607’CL[Klobeck,H.-G.,etal,Nature,309:73-76(1984)]。圖5排列出鼠ACT-1輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:7)和人GM607’CL輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:8)的氨基酸序列，正如我們所料，人GM607’CL輕鏈可變區(qū)是人Kappa輕鏈可變區(qū)亞群Ⅱ中的一員。鼠ACT-1和人GM607’CL輕鏈可變區(qū)之間的總體序列相同性是71.4％。鼠ACT-1重鏈可變區(qū)十分類似于人抗體21/28’CL重鏈可變區(qū)的序列[Dersimonian,H.,etal.,J.Immunol.,139:2496-2501(1987)]。圖6排列出鼠ACT-1重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:9)和人21/28’CL重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:10)的氨基酸序列，正如我們所料，人21/28’CL重鏈可變區(qū)是人Kappa輕鏈可變區(qū)亞群Ⅱ中的一員，鼠ACT-1和人GM607’CL輕鏈可變區(qū)之間的總體序列相同性是68.1％。根據(jù)這些比較，人GM607’CL輕鏈可變區(qū)被挑選為設(shè)計改型人ACT-1輕鏈可變區(qū)的模板，人21/28’CL重鏈可變區(qū)被挑選為設(shè)計改型人ACT-1重鏈可變區(qū)的模板。設(shè)計過程的第二步，將嚙齒類CDR插入選定的人輕、重鏈可變區(qū)。由Kabat定義的[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]整個嚙齒類CDR連到人FR上面，形成一個簡單的CDR-移植。某些情況下，在簡易CDR移植中被人化的嚙齒類抗體，表現(xiàn)出對抗原很低或沒有結(jié)合。研究人FR氨基酸序列很重要，以決定是否有氨基酸殘基可能在影響同抗原的結(jié)合，或者是直接通過與抗原的作用，或間接地通過改變CDR環(huán)的位置。第三步，決定出改變?nèi)薋R中哪些氨基酸殘基，來獲得良好的抗原結(jié)合性。在此階段，嚙齒類可變區(qū)模型在設(shè)計中十分有用。同樣有用的還有Chothia所定義的CDR典范結(jié)構(gòu)[Chothia,C.,etal.,Nature342:877-883(1989)]。在人化可變區(qū)中保留任何屬于典范結(jié)構(gòu)的嚙齒類氨基酸殘基是十分重要的。比較將被人化的嚙齒類抗體序列與其他嚙齒類抗體的相似序列，能夠幫助確定在特定位點是否有異?；蛘呦∮邪被?。這將暗示著那個位點的嚙齒類氨基酸在抗原結(jié)合中發(fā)揮重要作用。通過研究嚙齒類可變區(qū)模型，可能預(yù)測特定位點上的氨基酸是否影響與抗原的結(jié)合。當(dāng)個別抗體的可變區(qū)被用作設(shè)計的基礎(chǔ)，那么我們建議，比較這個人序列與此類人可變區(qū)亞群中的共同序列，標(biāo)出任何顯著不尋常的氨基酸。大多數(shù)情況下，人FR中的少量氨基酸被認(rèn)為將發(fā)生改變，改變成嚙齒類可變區(qū)在那個位點上的氨基酸。表3和表4概括出改型的人ACT-1可變區(qū)如何被設(shè)計出來的。表3列出了設(shè)計改型人mAbACT-1VL區(qū)所用的氨基酸序列，第4欄列出了將被人化的鼠ACT-1輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:7)，第5欄列出了鼠ACT-1可變區(qū)所屬于的鼠可變區(qū)亞群的一致序列(SEQIDNO:50)(鼠K-Ⅱ)，第6欄列出了最類似鼠ACT-1可變區(qū)的人可變區(qū)亞群的一致序列(SEDIDNO:51)(人κ-Ⅱ)，第7欄列出了充當(dāng)模板的人可變區(qū)氨基酸序列(GM607’CL)(SEQIDNO:8)，第8欄列出了所設(shè)計的改型人ACT-1可變區(qū)(SEDIDNO:52)的氨基酸序列(ACT-1RHVκ)。表4列出了設(shè)計改型人MABACT-1VH區(qū)所用的氨基酸序列，第4欄列出了將被人化的鼠ACT-1重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:9)，第5欄列出了鼠ACT-1可變區(qū)所屬于的鼠可變區(qū)亞群的一致序列(SEQIDNO:53)(鼠ⅡB)，第6欄列出了最類似鼠ACT-1可變區(qū)的人可變區(qū)亞群的一致序列(SEDIDNO:54)(人Ⅰ型)，第7欄列出了充當(dāng)模板的人可變區(qū)氨基酸序列(21/28’CL)(SEQIANO:10)，第8欄列出了所設(shè)計的改型人ACT-1可變區(qū)(SEDIDNO:55)的氨基酸序列(ACT-1RHVH)。表3和表4中倒數(shù)第二列，說明在鼠ACT-1和選定的人FR之間不同的FR殘基位點(表面的或內(nèi)藏的)，最后一欄列出可變區(qū)此位點的有關(guān)評述。表3所用符號(*)不變殘基(在列5和列6中)，如Kabat共同序列所定義的(指Kabat亞類中有95％或更高的出現(xiàn)率)[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)],或者CDR環(huán)典范結(jié)構(gòu)的一部分(在列8中)，如Chothia所定義的[Chothia,c.,etal.,Nature342:877-883(1989)]CDR典范結(jié)構(gòu)的一部分；黑體，表示FR和CDR中人類氨基酸殘基被對應(yīng)的鼠殘基替換的位點；下劃線，表示FR中人類殘基不同于鼠的位點；(Δ)，表示人FR中的變化次數(shù)；(鼠AbACT-1)，表示鼠ACT-1抗體VL區(qū)的氨基酸序列；(鼠κ-Ⅱ)，屬于亞群Ⅱ的鼠KappaVL區(qū)的一致序列(Kabat,E.A,etal.,Supra)；(人κ-Ⅱ)，屬于亞群Ⅱ的人VL區(qū)的共同序列(Kabat,E.A,etal.，通上)；(GM607’CL)，表示人GM607’CL抗體的氨基酸序列[Klobeck,H.-G.,etal.,Nature309:73-76(1984)]；(表面的或內(nèi)藏的)，表示在全部兩條抗體可變區(qū)鏈上氨基酸與其他殘基的相對位置；(ACT-1RHVκ)，表示變型人mAbACT-1VL區(qū)的氨基酸序列。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。</tables>表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。</tables>表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表3．在變形的人mAbAct-1VL區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。</tables>表4所用符號(*)不變殘基(在列5和列6中)，如由Kabat的共同序列所定義(指Kabat亞類中有95％或更高的出現(xiàn)率)[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)],或者如在列8中由Chothia定義的(Chothia,c.,etal.,Nature342:877-883(1989))CDR典范結(jié)構(gòu)的一部分；(黑體)表示在FR和CDR中人類氨基酸殘基被對應(yīng)的鼠殘基替換的位點；(下劃線)表示FR中人類殘基不同于鼠的位點；(Δ)表示人FR中的變化次數(shù)；(鼠AbACT-1)表示鼠ACT-1抗體VL區(qū)的氨基酸序列；(鼠ⅡB)表示屬于亞群ⅡB的鼠VH區(qū)的共同序列(Kabat,E.A,etal.,Supra)；(人Ⅰ)表示屬于亞群Ⅰ的人VH區(qū)的共同序列(Kabat,E.A,etal.,Supra)；(人抗體21/28’CL的氨基酸序列(Dersimonian,H.,etal.,J.Immunol.,139:2496-2501(1987))；(表面的或內(nèi)藏的)表示在全部兩條抗體可變區(qū)鏈上氨基酸與其他殘基的相對位置；(Act-1RHVH)表示變型人mAbAct-1VH區(qū)的氨基酸序列。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位。<p>表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。</tables>表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。<p>表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。</tables>表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。表4．在變形的人mAbAct-1VH區(qū)的設(shè)計中所使用的氨基酸序列的對位(續(xù))。為設(shè)計改型的人ACT-1輕鏈可變區(qū)(表3)，人FR中的1個殘基被改為鼠相應(yīng)位點的氨基酸，改變發(fā)生在FR1的位點2[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]。具體地講，人GM607’CL輕鏈可變區(qū)中的異亮氨酸被改為鼠ACT-1輕鏈可變區(qū)中的丙氨酸。kappa輕鏈可變區(qū)的該位點被視為對于維持L1環(huán)方位和結(jié)構(gòu)十分關(guān)鍵的位點之一[Chothia,C.,etal.,Nature342:877-883(1989)]，也即“典范的氨基酸”之一。由于其在環(huán)構(gòu)型上的重要性，這些鼠框架區(qū)殘基通常保留在改型可變區(qū)中。在FR1的位點4中，鼠型是一個丙氨酸，人型是一個甲硫氨酸，由Val變成Met都不是劇烈的改變，因為兩種氨基酸都是非極性憎水的殘基，因此人序列中的Met被用于改型人ACT-1可變區(qū)中。然而，模型顯示，Val被埋于L1和L2環(huán)之間，當(dāng)埋于旦白質(zhì)時，Val的平均體積為142埃3，而Met約為171埃3，更大的Met殘基可能會導(dǎo)致L1和L2環(huán)全部或其中之一發(fā)生構(gòu)型變化。通過在改型人ACT-1輕鏈可變區(qū)位點4引入改變，由Met變成Val，可以提高它的抗原結(jié)合性。為設(shè)計改型的人ACT-1重鏈可變區(qū)(表4)，人FR中的5個殘基被改為鼠相應(yīng)位點的氨基酸。FR1的位點24和FR3的位點71[Kabat,E.A.,etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)],存在于鼠序列的氨基酸殘基被保留在改型人ACT-1重鏈可變區(qū)中，因為這兩個氨基酸分別是H1環(huán)和H2環(huán)典范結(jié)構(gòu)的一部分[Chothia,C.,etal.,Nature,342:877-883(1989)]。由于這些位點發(fā)生任何氨基酸改變都將破壞H1環(huán)和H2環(huán)的堆積和最終結(jié)構(gòu)，因此這些關(guān)鍵位點的鼠型殘基都被保留到人化重鏈可變區(qū)中。在FR2的位點48，人序列的Met被改變成原存在于鼠ACT-1序列中的異亮氨酸。Met替換成異亮氨酸是不尋常的。更重要的是，模型顯示異亮氨酸被埋在H2環(huán)的內(nèi)部。結(jié)果是，在這個內(nèi)藏位點發(fā)生的改變可能影響H2環(huán)的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而干擾了抗原結(jié)合。在FR3的位點69，人序列的異亮氨酸被改變成原存在于鼠Act-1序列中的亮氨酸。盡管Leu替換Ile并非是不尋常的，模型顯示Leu被埋在H2環(huán)內(nèi)部，因此象位點48那樣，此位點的改變將影響H2環(huán)的構(gòu)象，破壞抗原結(jié)合性。最后，在FR3的位點73，人序列的蘇氨酸被改變成原存在于鼠Act-1序列中的異亮氨酸。在鼠亞群ⅡB或人亞群Ⅰ中，以前從未見過FR3上此位點是個Ile[Kabat,E.A.,etal.,FifthEdition,U.S.DepartmentofHealthandHumanServices,U.S.GovernmentPrintingOffice(1991)]，這意味著此位點的Ile可能在抗原結(jié)合上發(fā)揮重要作用。模型中，位點73的Leu呈現(xiàn)在臨近抗原結(jié)合位的表面上，根據(jù)α4β7整合蛋白上配體的大小和方位，它可能直接參與抗原結(jié)合。然而，做為一個表面殘基位點，如果鼠型氨基酸未被包括在改型人抗體中，該抗體作為一個整體將有很低的免疫原性。在改型抗體的派生物中，異亮氨酸將被人型Thr替代，重新測試新形成的結(jié)構(gòu)體，以確定第二次改變是否將保持類似的抗原結(jié)合水平。除了在最初改型人ACT-1重鏈可變區(qū)設(shè)計中人FR的5個變化外，還有2個其他的改變，可能增強其抗原結(jié)合性，模型顯示殘基鼠mAbAct-1重鏈可變區(qū)的38Lys和40Arg被置于H2環(huán)的內(nèi)部，并且堆積在CDR2中63Phe的旁邊(表4的編號)。然而，這些殘基也是位于重鏈可變區(qū)的核心部位，如果它們被用來替換對應(yīng)的人型氨基酸(38Arg和40Ala)，它們可能帶來其他的可能是不利的效果。因此，F(xiàn)R2中位點38和40的改變未被包括進(jìn)改型人的mAbAct-1重鏈可變區(qū)中。但是，這兩個修改的全部或之一可以被用在改型重鏈上以提高抗原結(jié)合性。結(jié)論建立鼠Act-1可變區(qū)的模型，主要基于已知結(jié)構(gòu)的其他抗體可變區(qū)。該模型被用來設(shè)計人化Act-1可變區(qū)，特別值得注意的是，在改型的人可變區(qū)中保留了抗原結(jié)合位點。設(shè)計了改型的人Act-1輕鏈可變區(qū)或改型的人Act-1重鏈可變區(qū)(表3和表4)。改型的人Act-1輕鏈可變區(qū)是基于鼠Act-1輕鏈可變區(qū)的CDR和人GM607’CL抗體輕鏈可變區(qū)的FR。在人FR的位點2有一個氨基酸改變。改型的人Act-1重鏈可變區(qū)是基于鼠Act-1重鏈可變區(qū)的CDR和人21/28’CL抗體重鏈可變區(qū)FR的。在人FR的位點24、48、69、71、73分別有5個氨基酸改變。此外，在設(shè)計改型人Act-1可變區(qū)的其它版本時，Kappa輕鏈FR1的位點4和重鏈FR2的位點38、40都應(yīng)當(dāng)特別考慮。由于重鏈FR3的位點73在抗體的表面，因此也被認(rèn)為參與由鼠型到人型氨基酸的回復(fù)突變。實施例3對改型可變區(qū)進(jìn)行編碼的核酸的構(gòu)建從生化方面(部分氨基酸測序)和功能方面(嵌合抗體對HuT78細(xì)胞的染色)證實克隆到正確的重鏈和輕鏈可變區(qū)之后，如上述設(shè)計了改型的氨基酸序列。接下來設(shè)計并制備編碼改型抗體鏈的基因。人化ACT-1的設(shè)計、構(gòu)建和表達(dá)測定實施例2所述的人化抗體的一級氨基酸序列后，該序列逆翻譯成簡并的核酸序列，利用MacVector(Kodak,ScientificImagingSystems)4.5.3版，分析潛在的限制性內(nèi)切酶位點，選擇出整合有限制性內(nèi)切酶位點，而且保留一級氨基酸序列的核酸。圖11列出重鏈核酸序列(SEQIDNO:18)和氨基酸序列(SEQIDNO:19)，圖12列出輕鏈核酸序列(SEQIDNO:20)和氨基酸序列(SEQIDNO:21)，同時標(biāo)出用于亞克隆的限制性內(nèi)切酶位點。依照下法，構(gòu)建人化Act-1重、輕鏈可變區(qū)。利用AppliedBiosystemDNASynthesizerModel392(圖13)合成輕鏈重迭互補寡聚核苷酸L1-L6(SEQIDNO:22-27)和重鏈的H1-H10(SEQIDNO:28-37)。在55攝氏度去保護過夜，在Speed-Vac上干燥，重溶于100ml水中，在Bio-Spin6柱上脫鹽(Bio-Rad)。在260mm測量吸收值來測定寡聚核苷酸的濃度，用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳純化核酸。這些寡聚核苷酸各自100μg混合于2倍體積的染色液(95％甲酰胺，20mMEDTA，0.05溴酚蘭，0.05％三甲苯胺FF)，65攝氏度加熱2分鐘，250V，在1XTBE電泳3小時，用溴化乙錠染色，紫外燈下顯色，將有正確長度的寡聚核苷酸切除下來，置于試管，用水和電解質(zhì)透析，用苯酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1,V/V)(Gibco/BRL)抽提寡聚核苷酸兩次，加入0.1倍體積3M醋酸鉀(pH6)和2倍體積冷乙醇使沉淀，離心，用70％乙醇洗滌一次，真空干燥，溶于50μl水中。將等摩爾的(大約100μg,50μl水中)純化核酸與等體積的(100μl)2X退火緩沖液(2X=1MNaCl,40mMTris-HCl,pH2.5,2mMEDTA)混合，使互補的寡聚核苷酸退火。95攝氏度10分鐘，使變性，然后在65攝氏度溫育8小時。照上述方法用乙醇沉淀退火寡聚核苷酸，再溶于40μl水中。加入2μl大片段DNA多聚酶`(Klenow),5μl2.5mMdNTP和5μl10x緩沖液(10X=10mMTris-HCl,10mMMgCl2,1mMDTT,pH7.9,25攝氏度)，補足體積到52μl，使退火寡聚核苷酸延長。室溫下溫育1小時，再加入1μldNTP和1μlKlenow，37攝氏度溫育半小時。請注意重鏈片段A不必進(jìn)行延長。通過12％聚丙烯酰胺凝膠電泳，從單鏈、未退火的核酸中純化出退火的、延長的片段，溴乙錠染色，紫外光顯色，切下正確長度的片段，如上述透析回收核酸，用苯酚/氯仿/異戊醇洗滌兩次，乙醇沉淀，溶解于10μl水中。三個輕鏈片段(LA、LB&amp;LC)和五個重鏈片段(被稱為HA-HE)獨立地共價連入pCR-ScriptTM，除了如以下所述之外，按照操作手冊用pCR-Script試劑盒(Stratagene)轉(zhuǎn)化XL-1藍(lán)超級感受態(tài)細(xì)胞。用pCR-LA和pCR-LB片段轉(zhuǎn)化DM1(Gibco/BRL)感受態(tài)細(xì)胞，以避開Dcm甲基化酶，后者可封閉限制性內(nèi)切酶MscⅠ對DNA的降解。挑選白色集落，根據(jù)實驗手冊用測序酶T7DNA多聚酶試劑盒對小制備量DNA測序。在插入位對面退火的T3和T7啟動子，被用于測序。利用合成過程中已整合到序列中的限制性位點，編排人化重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)片段的亞克隆。重鏈片段HA-HD在每個序列的末端包括一個額外的AgeI限制性位點，從而可以如下述進(jìn)行按順序的對這些片段的亞克隆。用限制性內(nèi)切酶SpeⅠ和AgeⅠ降解pCR-HA和pCR-HB的小制備量DNA。DNA曾經(jīng)被1％瓊脂糖疑膠電泳過。從膠上回收141bp片段HB，在SpeⅠ和AgeⅠ位點整合到pCR-HA，形成pCR-HAB，接下來，利用XbaⅠ和AgeⅠ從pCR-HC上釋放112bp片段HC，在XbaⅠ和AgeⅠ位點整合到pCR-HAB，形成質(zhì)粒pCR-AC。利用片段HD的限制性質(zhì)位點NheⅠ和AgeⅠ以及片段E的BestⅡ和AgeⅠ，將片段HD(141bp)和HC(130bp)整合到一個測序質(zhì)粒中，這個最后得到的包含pCR-Scipt中全部五個重鏈可變區(qū)片段的質(zhì)粒，稱為pCR-HAE。所有的降解都是利用小制備量DNA，在37攝氏度溫育至少2個小時，除了對BstEⅡ之外，它的最佳培養(yǎng)溫度在65攝氏度。16攝氏度過夜進(jìn)行共價連結(jié)，利用T4DNA連接酶和1∶10載體，按比例整合，次日轉(zhuǎn)化到DH5α亞克隆感受態(tài)細(xì)胞(Gibco/BRL)。用HindⅢ和AgeⅠ降解pCR-HAE，釋放出pCR-ScriptTM的Act-1人化重鏈可變區(qū)。用該411bp片段替換pEE6mhACT1Hchi(實施例1)的鼠可變區(qū)序列，該質(zhì)粒已被HindⅢ和AgeⅠ降解，生成pEE6hCMV-B里的人化Act-1重鏈。最后得到的質(zhì)粒為pEE6hACT1H，通過測序確定正確的DNA序列。用BspEⅠ和MscⅠ降解pCR-ScriptTM的輕鏈片段A，所得153bp片段被用于替換pCR-ScriptTM中鼠輕鏈可變區(qū)的BspEⅠ到MscⅠ部分，這個質(zhì)粒為pCR-LhAmBC。MscⅠ和NruⅠ降解的輕鏈片段B、NruⅠ和kasⅠ降解的輕鏈片段C，被整合到pCR-LhAmBC的MscⅠ和KasⅠ位點，替換所剩下的鼠序列。降解、連接和轉(zhuǎn)化過程如前述，除了最后一次轉(zhuǎn)化之外，所有轉(zhuǎn)化都用DM1感受態(tài)細(xì)胞。用HindⅢ和KasⅠ降解pCR-ScriptTM的人化輕鏈可變區(qū)和質(zhì)粒pEE12mhACT1Lchi(實施例1)。通過凝膠純化360bp輕鏈可變區(qū)片段和315bp輕鏈恒定區(qū)，共價連入pEE12的HindⅢ位點，形成pEE12hACT1L，測序以證實正確的方位和核苷酸序列。根據(jù)構(gòu)建嵌合抗體的同樣方法(見實施例1，嵌合免疫球蛋白的表達(dá))，構(gòu)建一個包含人化重、輕鏈基因的表達(dá)載體。唯一不同的是，由于人化重鏈可變區(qū)有一額外的BglⅡ位點，當(dāng)用BglⅡ切割時，只進(jìn)行部份降解以生成正確的片段，含有人化重鏈和人化輕鏈基因的載體，被標(biāo)為pEE12hACT1LH。根據(jù)構(gòu)建嵌合抗體的同樣方法(見實施例1，嵌合免疫球蛋白的表達(dá))，臨時表達(dá)全部人化抗體和細(xì)胞染色。圖14顯示，同不相關(guān)同型對照抗體(IgG1,Kappa)相比，用鼠-人嵌合性Act-1抗體或人化Act-1抗體對HuT78細(xì)胞的染色結(jié)果。將pEE12hACT1LH用電穿孔法滲透到NSO細(xì)胞中，形成穩(wěn)定的NSO細(xì)胞轉(zhuǎn)染體，即一個骨髓瘤細(xì)胞株(MethodsinEnzymol.73(B):3-46(1981)；EuropeanCollectionofAnimalCellCultures,PHLSCAMR,PortonDown,Salisbury,WiltshireSP4OJG,U.K.,ECACCNo.85110503)。在NSO細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)用SalⅠ限制性內(nèi)切酶降解40μg穩(wěn)定轉(zhuǎn)染體pEE12hACT1LH,使成線狀，該酶切割構(gòu)建物中細(xì)菌質(zhì)粒部分。用乙醇加1/10體積的醋酸鈉溶液中沉淀線性DNA,70％乙醇洗滌，干燥，重新溶解于無菌水中。呈指數(shù)生長的NSO細(xì)胞生長于非選擇性培養(yǎng)基Dulbecco’sModifiedEagles’Medium(高葡萄糖)，2mML-谷酰胺，沒有丙酮酸鈉，4500mg/L葡萄糖，25mMHEPES緩沖液(GIBCO/BRL,CatalogNO.12430-021)，加上10％小牛血清(Gibco/BRL,CatalogNO.16000-044)。離心收集NSO細(xì)胞，洗滌，再溶于冷PBS，以便在加入DNA后，細(xì)胞濃度為107cells/ml。將線狀質(zhì)粒DNA(40μg)加入到冰上電滲透管的107細(xì)胞中。細(xì)胞和DNA溫和地混勻，避免產(chǎn)生氣泡，在冰上保留10分鐘，擦干管外部，用GenePulser(Bio-Rad)兩次連續(xù)的1500V,3μf脈沖進(jìn)行處理。在將管子置于冰中10分鐘。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞移到96孔盤中，50μl非選擇性培養(yǎng)液中分別三種濃度，3×105,7.5×104和1.5×104細(xì)胞/ml,37攝氏度下溫育24小時。隨后在全部孔中都加入150μl選擇性培養(yǎng)基[無谷酰胺Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基，4500mg/L葡萄糖，4mg/L的醇鹽酸，110mg/L丙酮酸鈉，無硝酸鐵，無L-谷酰胺(JRHBioSciences,CatalogNo.51435-78P)]，加上1XGS補充物(50XGS補充物由JRHBioscience提供，CatalogNo.58672-77P)，加上10％透析小牛血清(Gibco/BRL,CatalogNo.26300-061)。置于培養(yǎng)箱中，直到出現(xiàn)實質(zhì)性的細(xì)胞死亡和出現(xiàn)生存集落的分離。一旦出現(xiàn)谷酰胺不依賴性轉(zhuǎn)染體集落，便篩選單集落的孔洞，收集進(jìn)行組織培養(yǎng)的上清液，按下述用ELISA檢測人IgG的分泌情況。后面研究將要用的產(chǎn)抗體克隆3A9，也通過這種方法獲得。類似上述方法進(jìn)行第二次轉(zhuǎn)染，不同的是篩選指標(biāo)為L-甲硫氨酸sulphoximine(MSX，一種谷酰胺合成酶抑制劑)。用檢測人IgG分泌的ELISA普查陽性集落。將100μl濃度為2.5mg/mlpH9.5溶于碳酸鹽緩沖液中的AffiniPureF(ab’)2片段驢抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories)涂于ELISA板上，在4攝氏度過夜，用PBS吐溫20洗滌板四次，用200μlPBS、1％BSA于37攝氏度2個小時，封閉ELISA板，洗滌后，和100μl穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的NSO上清液一起37攝氏度溫育15分鐘，溶于PBS1％BAS的1mg/ml人IgGlKappa溶液用作標(biāo)準(zhǔn)品。新鮮的NSO培養(yǎng)基(DME+GS補充物)作為陰性對照。洗滌板，并和以0.5μl/ml溶于PBS(無Ca2+/Mg2+)的連有過氧化物酶的100μl的AffiniPureF(ab’)2片段驢抗人IgG(H+L)(JacksonImmunoResearchLaboratories)，在37攝氏度溫育15分鐘。5mgO-二鹽酚苯二胺(OPD)藥片(Sigma)溶解于12ml檸檬酸緩沖液(0.1M,pH5.0)，然后加入12μl30％過氧化氫。洗滌除去次要抗體，加入100μl溶有OPD的基質(zhì)。用12.5％硫酸中止反應(yīng)，在DynatechPlateReader上于490nm檢測板子。通過限制稀釋度為2、1和0.5cells/孔，克隆陽性孔。當(dāng)來自單一克隆的全部孔，經(jīng)ELISA檢測為抗體產(chǎn)生陽性時，可以認(rèn)為克隆到了該細(xì)胞株。用蛋白質(zhì)A親合層析[PorosA/M4.6/100mm,5mL/min，利用Bio-Cad工作站(PerseptiveBiosystems,Inc.)]從過渡的細(xì)胞培養(yǎng)上清或從穩(wěn)定的細(xì)胞轉(zhuǎn)染體培養(yǎng)液純化人化Act-1抗體。柱子用PBS平衡，經(jīng)0.2微米過濾器過濾的細(xì)胞培養(yǎng)上清液上柱，每次所給上柱量依據(jù)抗體濃度不同而不同，通常上柱抗體量不超過15mg，洗脫速度5ml/min。結(jié)合后，第一次用PBS洗柱子，至OD280nm=0。然后用至少50倍柱體積的量洗第二次，接著用0.1M醋酸鈉，pH5.0洗脫柱子，最后用0.1M檸檬酸鈉，pH3.5洗脫。洗脫液按每5毫升一收集，用200μl,1.5MNa2CO3pH12調(diào)pH中性。合并含抗體部份后，通過超濾濃縮至期望的濃度(centricon,30,000KDacutoff,Amicon)。Fc-突變的變種的構(gòu)建構(gòu)建了一種無Fc結(jié)合(Fc-突變)的人化Act-1抗體。該抗體和人化Act-1抗體有相同的可變區(qū)(圖11和圖12)，有相同的人IgG1恒定區(qū)，不同的是在IgG1重鏈恒定區(qū)還有兩個氨基酸的替換，這樣設(shè)計是為了取消FcR識別和Fc結(jié)合性能(Leu235-Ala235,Gly237-Ala237)。按如下構(gòu)建Fc-突變衍生體的重鏈的編碼核酸。稱為3678的構(gòu)建物(由HermanWaldmann博士提供，牛津大學(xué))在pEE12載體中編碼人化抗-CD18抗體的輕鏈和重鏈[WO93/02191(發(fā)表于February4,1993)；Sims,M.J.,etal,J,Immunol151(4):2296-2308(1993)]，但是在IgG1重鏈恒定區(qū)還通過位點定向的突變導(dǎo)入了兩個氨基酸替換(Leu235-Ala235,Gly237-Ala237)，用AgeⅠ和EcorⅠ將之降解，釋放包含有γ恒定區(qū)突變體的900bp片段。該片段被用來替換pEE6hACT1H中在AgeⅠ/EcoRⅠ位點的重鏈野生型γ-1恒定區(qū)，生成pEE6hACT1H/FCmut。在用類似方法構(gòu)建包含兩個鏈的其他構(gòu)建物時，要制備包含有改型輕鏈基因和Fc-突變改型重鏈基因的單結(jié)構(gòu)體(pEE12hACT1LH/FCmut)。實施例4人化ACT-1抗體LDP-O2的特性描述起始的特性研究是利用pEE12hACT1LH/FCmut過渡轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體來進(jìn)行的。如上述制備和純化此抗體，在下面被稱為“1°HUMACT-1”，后面帶有組號。利用如上述制備的(用線性pEE12hACT1LH/FCmut轉(zhuǎn)染的)鼠細(xì)胞株NSO穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染體所產(chǎn)生的抗體，進(jìn)行額外的檢測。該抗體制備在下面被稱為“LDP-02/3A9/Lot1”。“LDP-02/3A9/Lot#1”抗體所用在的下述研究包括SDS-PAGE,Western雜交分析，等電聚焦，氨基酸組成分析，品系雜交，滴定，互補介入溶胞檢測，ADCC檢測，結(jié)合抑制檢測。“1°HUMACT-1Lot#7”被用于親合檢測#1-2,1°HUMACT-1#8-9用于親合檢測#3-5和C1q結(jié)合試驗。A、物理、化學(xué)性質(zhì)；1.SDS-PAGE為幫助確立特征，首先描述第一個制備樣品的特性并評估純度，分別在降解的和不降解的條件下進(jìn)行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，考馬斯亮蘭染色。將80μl,0.82mg/mlLDP-02/3A9/Lot#1加到一個微管中，抗體溶于檸檬酸緩沖液，與160μlTris緩沖液(0.5mM,pH8.8)交換三次，交換后樣品的最終體積為135μl，蛋白質(zhì)濃度為0.486mg/ml，分別用降解的和不降解的緩沖液稀釋2倍，蛋白質(zhì)濃度為0.243mg/ml。將13μl的0.243mg/ml等份試樣溶液內(nèi)(含3.16μg蛋白質(zhì))，裝入SDS凝膠的樣品道里，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，對照品包括Mark12分子重量標(biāo)準(zhǔn)物(Novex,#L5677)。在非降解條件下，LDP-02/3A9/Lot#1表現(xiàn)出一條主要條帶，分子量略低于200,000道爾頓，幾個次要組份在116,300-200,000道爾頓之間，另外三個次要組份分子量大約為97,400道爾頓、略大于55,400道爾頓的組份、和略小于31,000道爾頓的組份。用激光光密度儀掃描凝膠，定量分析各染上色的條帶，計算各自百分比(表5)，結(jié)果顯示分子量約為200,000的主要組份占所有染色條帶的84.4％。該主要組份代表的是完整的抗體分子，分子量55,000和31,000的組份則分別代表單一的重鏈和輕鏈。在降解條件下，電泳凝膠上有兩個主要組份，一個約為55,400道爾頓，代表全部條帶的68.6％，第二個略低于31,000道爾頓，代表30.5％的比例(表5)，這兩個分子量同免疫球蛋白G的重鏈、輕鏈的相吻合，這些數(shù)據(jù)說明，樣品中大約99％要么是完整的抗體，要么包含抗體的輕鏈或重鏈。除兩個主要條帶外，還發(fā)現(xiàn)有一個略小于66,300道爾頓的次要組份。從這個分析來看，與完整的免疫球蛋白G相吻合的高分子量種類作為主要條帶而存在于LDP-02/3A9/Lot#1中。其中還有多個次要條帶。在降解條件里，有兩個主要條帶，他們的電泳特征和免疫球蛋白G的輕鏈、重鏈相同。表5純化數(shù)據(jù)簡表考馬斯亮藍(lán)，非降解條件樣品條帶面積百分比(主要成分)LDP-02/3A9/Lot#1584.4％純化數(shù)據(jù)簡表考馬斯亮藍(lán)，降解條件樣品條帶低分子量面積低分子量面積百分比百分比LDP-02/3A9/Lot#1968.6％30.5％2.Western雜交分析對樣品和標(biāo)準(zhǔn)物按如上所述的SDS-PAGE進(jìn)行分析。簡述之，以4-20％Tris-甘氨酸凝膠分析非降解和降解的樣品。NovexMark12分子量標(biāo)準(zhǔn)物也在膠上跑，兩種樣品，2.1μl和4.5μl，它們的0.2143mg/ml等份試樣溶液，分別含有0.51μg和1.09μg蛋白質(zhì)的樣品，分別裝上SDS凝膠。SDS-PAGE電泳后，根據(jù)NovexWesternTransferApparatus指導(dǎo)，將樣品蛋白從凝膠轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。所用轉(zhuǎn)移緩沖液是1XTris-甘氨酸溶于2％甲醇的溶液。約2小時后，從轉(zhuǎn)移儀器上取出硝酸纖維素斑點，浸于DDI水中。然后，在Tris緩沖液(20mM)中37攝氏度，35分鐘封閉斑點，緩沖液中含有3％明膠和0.1％吐溫20。取出斑點，用Tris緩沖液洗滌兩次。用20mMTris-3％BSA溶液稀釋山羊抗鼠IgG抗體溶液1000倍，生成山羊抗鼠IgG溶液，將之加到斑點上，2-8攝氏度溫育過夜。然后，用Tris緩沖液洗滌斑點，每5分鐘換一次溶液，共換4次。用20mMTris-3％BSA溶液稀釋連接堿性磷酸酶的抗山羊IgG5000倍，加到斑點中，于室溫保持2小時，用Tris緩沖液洗滌，每5分鐘換一次，共換四次緩沖液。往斑點上一次性加入10mlBCIP/NBT(5-溴-4-氯-3’-磷酸吲哚p-甲苯胺鹽/氯化氮藍(lán)四唑)，攪拌，室溫下反應(yīng)。將斑點浸于Tris緩沖液終止反應(yīng)，用山羊抗一人IgG代替山羊抗一鼠IgG，重復(fù)上述操作。用抗一鼠IgG試劑，在非降解和降解條件下，都能在硝酸纖維素斑點上找到0.51μg和1.09μg的IgG樣品。這些條帶的密度隨濃度升高而升高。在非降解條件，能發(fā)現(xiàn)一個比20,000道爾頓標(biāo)記物略快的主要條帶。還有幾個輕微弱的條帶，其中兩個跑得比主要條帶慢，三個比主要條帶快。在降解條件下，發(fā)現(xiàn)兩個對應(yīng)于免疫球蛋白G重鏈和輕鏈的條帶。在非降解和降解條件下，利用抗一人IgG試劑，能在硝酸纖維素斑點中清楚地找到0.51μg和1.09μg的IgG樣品。這些條帶的密度隨濃度升高而升高。在非降解條件下，發(fā)現(xiàn)一個略小于200,000道爾頓的主要條帶。用抗鼠IgG能檢測到斑點上的幾個微弱條帶。當(dāng)用抗人IgG檢測，免疫染色的密度強于所有條帶。還檢測到在其他斑點不能發(fā)現(xiàn)的額外的條帶，這可能是因為這些條帶對應(yīng)于IgG片段，但缺乏能被抗鼠IgG所識別的表位。在降解條件下，檢測到對應(yīng)于免疫球蛋白G重鏈的一條帶。因為抗體是對人IgG的Fc部分為特異性的，所以沒找到輕鏈。幾個次要條帶，用抗鼠IgG不能被發(fā)現(xiàn)，而用抗人IgG卻能發(fā)現(xiàn)。這種差異可能是因為存在有缺乏與抗鼠IgG結(jié)合的表位的IgG片段。3、等電聚焦對LDP-02/3A9/Lot#1進(jìn)行等電聚焦(IEF)，用考馬斯亮蘭染色，將LDP-02/3A9/Lot#1的實驗結(jié)果和一起聚焦的IEF標(biāo)準(zhǔn)物進(jìn)行比較。將80μl，濃度為0.82mg/ml的LDP-02/3A9/Lot#1加到微管中。含有抗體的檸檬酸緩沖液與160μl的Tris緩沖液(0.5mM,PH8.8)交換三次，最后樣品體積為135μl，最終濃度計算為0.486mg/ml。用2XIEF樣品緩沖液稀釋溶液兩倍，濃度變?yōu)?.243mg/ml。取該溶液13μl，內(nèi)含3.16μg蛋白質(zhì)，裝入IEF膠中。對照物包括IEF標(biāo)準(zhǔn)物pI3.6-9.3(Sigma,Cat#1-3018)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物繪制標(biāo)準(zhǔn)圖譜，8種IEF標(biāo)準(zhǔn)物的平均泳動距離對各自的pI值。對應(yīng)這些數(shù)據(jù)的曲線的負(fù)性斜率為0.03459，截距8.91857,R2=0.99206。表6包括6個IEF標(biāo)準(zhǔn)品和LDP-02/3A9/Lot#1的平均泳動距離，也包括計算出來的LDP-02/3A9/Lot/的pI值。利用標(biāo)準(zhǔn)圖的曲線參數(shù)，計算LDP-02/3A9/Lot#1的5個條帶大約pI值為7.88,7.95,8.09,8.26和8.43，以pI8.09的峰最為顯著(表6)，這個主要峰的pI和基于氨基酸一級序列推算的pI7.91相適應(yīng)。表6標(biāo)準(zhǔn)泳動距離*pI1凝集素3.3mm8.8凝集素9.5mm8.6凝集素17.88mm8.2肌紅蛋白59.3mm6.8碳酸酐酶Ⅰ74.0mm6.6碳酸酐酶Ⅱ92.5mm5.9β-乳球蛋白A105.8mm5.1胰蛋白酶抑制物122.0mm4.6樣品泳動距離PI1LDP-02/3A9/Lot#1(帶1)14.0mm8.43LDP-02/3A9/Lot#1(帶2)19.0mm8.26LDP-02/3A9/Lot#1(帶3)24.0mm8.09LDP-02/3A9/Lot#1(帶4)28.0mm7.95LDP-02/3A9/Lot#1(帶5)30.0mm7.88*平均值1基于標(biāo)準(zhǔn)曲線(pI對泳動距離)，其中樣品pI=截距-斜率(樣品泳動距離)4．氨基酸組成分析進(jìn)行了氨基酸組成分析，并確定了LDP-02/3A9/LOT#1的蛋白質(zhì)含量、氨基酸組成、和其特性。取出三份45μl樣品進(jìn)行水解，用6NHCL蒸汽于165℃水解60分鐘。做為對照，在水解試管中，還包含一種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，其已經(jīng)與LDP-02/3A9/LOT#1一起被水解。在分析LDP-02/3A9/Lot#1之前和之后，色譜分析氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品。蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)包括以牛血清白蛋白作為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(TektagenSolutionControl:310:197A)，而氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品是氨基酸水解混合液(TektagenSolutionControl:310:199A)。實驗方法包括用離子交換HPLC分析再溶解的蛋白質(zhì)水解液或游離氨基酸溶液，過柱后與茚三酮反應(yīng)顯色，雙波長測定吸收值，分析氨基酸標(biāo)準(zhǔn)得到一校正表，與之對照計算在兩種波長的吸收。表7列出了氨基酸組成，LDP-02/3A9/LOT#1的蛋白質(zhì)濃度為0.709mg/ml。對缺乏定量的W和C進(jìn)行修正，蛋白質(zhì)濃度被校正為0.740mg/ml，數(shù)據(jù)和相關(guān)計算概括于表8。對于LDP-02/3A9/LOT#1，用6NHCL蒸汽在165℃水解一個時間點(60分鐘)。從標(biāo)準(zhǔn)蛋白(BSA)得來的校正因子，被運用于蛋白質(zhì)含量的確定(表8)。在這種實驗條件下，由于存在一個共同洗脫的半胱氨酸峰，因此脯氨酸的摩爾百分比，可能略有提高(表7)。脯氨酸定量的準(zhǔn)確性具有樣品依賴性，基于樣品水解物中半胱氨酸的含量。對于此分析，已經(jīng)利用BSA校正因子，對脯氨酸含量進(jìn)行了校正(表8)，校正的準(zhǔn)確性具有樣品依賴性，基于BSA(6.0％)中和樣品中半胱氨酸的相對量。以相對百分比(頻度或摩爾百分比)表示的預(yù)測的LDP-02氨基酸組成，基于重鏈和輕鏈的核苷酸序列(預(yù)測的％)，真實的氨基酸分析結(jié)果(真實的％)被列于表9，比較預(yù)測值與真實值，便得出很好的相關(guān)系數(shù)，除脯氨酸之外，其已經(jīng)在前面有敘述，由于共同洗脫的半胱氨酸峰而使脯氨酸值偏高。表71相關(guān)因子為0.958，基于W和C含量分別為1.8％和2.4％。表8蛋白質(zhì)含量確定1蛋白質(zhì)含量不對半胱氨酸和胰蛋白胨校正。2對每一個檢測的氨基酸都用BSA校正因子來校正。3總水解的ng=(總注入的ngx重新配制的體積)/注入的體積(50μl)。表9氨基酸組分</tables>5．MALDI-TOFMS分析用MALDI-TOFMS分析LDP-02/3A9/LOT#1，得到分子量。檢測到一個集中于149,808Da的主要峰。集中于74,927Da的峰代表主要峰中的+2離子種類。應(yīng)當(dāng)注意到+2離子物質(zhì)并不精確地是M+H離子的一半，這個細(xì)微偏差在±0.2％之間，可能是由于實驗不準(zhǔn)確所導(dǎo)致。根據(jù)預(yù)測的抗體一級序列，預(yù)期的分子量為147,154Da，與實測的IgG分子量相差2,654Da，這最可能是由于分子內(nèi)糖基化造成的，這個差異值說明分子糖基化水平約為1.8％.B．親合力首先用人源HUT-78細(xì)胞在細(xì)胞流計上滴定LDP-02/3A9/LOT#1和鼠Act-1(Lot#2)。簡述之，1.0×106HUT-78細(xì)胞溶于100μl生物素化鼠Act-1(Lot#2)、生物素化鼠IgG1(Lot#1,LeukoSite,Inco,)、生物素化LDP-02/3A9/LOT#1溶液，或者溶解于生物素化人IgG(JacksonImmunoResearchAvondalePALot25794)，4℃20分鐘，此后移走抗體。除非特別聲明，全部試劑稀釋于0.15MPBS/1.0％FCS/0.1％疊氮化鈉。兩種抗體的各種濃度包括30μg/ml(僅限于鼠Act-1)、15μg/ml、7.5μg/ml，隨后各自按1∶10稀釋。移走主要抗體后，將細(xì)胞溶解于100μl按1∶200稀釋的鏈霉菌素藻紅蛋白的溶液(DakoCorpCarpinteria,CA)。用200μl的PBS洗滌，將細(xì)胞重新溶解于0.5ml的PBS/1％福爾馬林溶液，冷藏直至進(jìn)行分析。在FACScan(BectonDickinsonCorp.,SanJose,CA)上分析樣品，用488nm激光激發(fā)藻紅旦白。對每個樣品，最少分析10000個細(xì)胞，計算半峰平均頻道熒光(MFC)，所有樣品重復(fù)操作兩次。滴定研究顯示，用鼠ACT-1和LDP-02/3A9/LOT#1(圖15)，在大約1.0μg/ml的濃度，能有最大熒光。對于能達(dá)到MFC的濃度，LDP-02比鼠ACT-1更低(生物素化鼠ACT-1Lot#2是0.1μg/ml，LDP-02/3A9/Lot#是0.02μg/ml)。利用細(xì)胞統(tǒng)計以及LDP-02、鼠ACT-1抗體對人源HUT78細(xì)胞結(jié)合的交叉競爭，相對評價親合力(和特異性)。簡述之，1.0×106HuT-78細(xì)胞溶解于100μl的0.1μg/ml帶有不同濃度非連結(jié)1°HUMACT-1或帶有非連結(jié)ACT-1的生物素化鼠ACT-1(LOT#2)溶液，4℃20分鐘，取出抗體。在另一個獨立實驗里，所用溶液是100μl的0.02μg/ml帶有不同濃度非連結(jié)鼠ACT-1(LOT#2)和非連結(jié)LDP-02/3A9/LOT#1的生物素化LDP-02/3A9/LOT#1溶液。維持穩(wěn)定的生物素化抗體的濃度，是在如上述相同條件下導(dǎo)致染色HUT-78細(xì)胞有MCF值的那個濃度。除了特別聲明，所有試劑均稀釋于0.15MPBS/1.0％FCS0.1％疊氮化鈉。兩種抗體濃度在半對數(shù)增長范圍內(nèi)波動，從2×10-6M到5×10-11M。移去主要抗體后，將細(xì)胞溶于100μl按1∶200稀釋的鏈霉菌素藻紅旦白溶液(DakoCorpCarpinteria,CA)。用200μl的PBS洗滌后，再溶于0.5ml的PBS/1％福爾馬林，冰箱冷藏直至分析。在FACScan(BectonDickinsonCorp.,SanJose,CA)上分析樣品，用488nm波長激光激發(fā)藻紅旦白。對每個樣品最少分析10000個細(xì)胞，計算MCF。每個樣品重復(fù)操作兩次，IC50是生物素化同型抗體中導(dǎo)致MCF減半的非結(jié)合抗體的濃度。對LDP-02(1°HUMACT-1)和鼠ACT-1之間進(jìn)行5次獨立的交叉競爭實驗，從而估計其親合力。當(dāng)用生物素化鼠ACT-1當(dāng)作實驗中保持穩(wěn)定的抗體，統(tǒng)計出來LDP-02(5.43±0.86nM)的平均IC50值(±1SEM)比鼠ACT-1(7.94±1.17nM；P=0.02雙尾t實驗兩個成對樣品的平均值)的要低。而不相關(guān)的人IgG1或鼠IgG1沒有競爭效果(全部實驗概括于表10，一個實驗列于圖16)。相似地，當(dāng)生物素化LDP-02/3A9/LOT#1用作實驗中穩(wěn)定抗體，需要有比LDP-02/3A9/LOT#1更高濃度的非結(jié)合鼠Act-1，從HuT-78細(xì)胞膜競爭LDP-02(IC50=6.3nM對4.3nM)。在每一個實驗里，LDP-02的IC50比鼠ACT-1的要低，這些結(jié)果說明LDP-02對鼠ACT-1所識別的配體有特異性，它的親合性優(yōu)于鼠抗體的。表10鼠ACT-1和人化ACT-1(LDP-02)親和性分析P=0.02TWo-tailt-Test:PairedTWoSampleforMeansC．種類交叉反應(yīng)性用細(xì)胞流計來衡量種類交叉反應(yīng)性。將100μl抽自于人、狗、貓、豚鼠或老鼠的EDTA-抗凝集血加到FACS管中。移走血漿，將血細(xì)胞層重新溶于100μl生物素LDP-02/3A9/LOT#1、不相關(guān)生物素化人IgG(JacksonImmunoResearch,Avondale,PA)、生物素化鼠ACT-1LOT#2、或不相關(guān)生物素化鼠IgG1(DakoCorp.,Carpinteria,CA)，終濃度為15μg/ml。除了特別聲明，全部試劑均稀釋于0.15MPBS/1％FCS/0.1％疊氮化鈉。樣品和抗體一起在4℃保持20分鐘，洗除抗體。細(xì)胞和100μl按1∶200稀釋的鏈霉菌素藻紅旦白溶液(SouthernBiotechnologyAssociates,Inc.,Birmingham,AL)在4℃保持20min。按照實驗手冊用一種商業(yè)溶胞試劑FACS溶胞液(BectonDickinson,SanJvseCA)溶胞紅細(xì)胞。用PBS洗滌后，將細(xì)胞再溶于0.5mlPBS/1％福爾馬林，冰箱冷藏直至進(jìn)行分析。在FACScan(BectonDickinsonCorp.,SanJose,CA)上分析樣品，用488nm波長激光激發(fā)藻紅旦白。對每個樣品最少分析10000個細(xì)胞，淋巴細(xì)胞捕獲門被置于前方，90度的光散參數(shù)。生物素化LDP-02/3A9/LOT#1以一種異源染色識別人淋巴細(xì)胞的一個亞群，該模式類似于鼠ACT-1的，不同于人或鼠同型對照物。此外，檢測狗的或貓的淋巴細(xì)胞時，LDP-02/3A9/LOT#1和鼠ACT-1都有一種類似于人淋巴細(xì)胞的異源染色模式，在這種條件下，LDP-02/3A9/LOT#1或鼠ACT-1不能識別豚鼠或老鼠的淋巴細(xì)胞。D.Clq結(jié)合根據(jù)上述方法，用細(xì)胞流計評價LPD-02結(jié)合人補體Clq的能力[Sims,M.J.etal.,J.Immunol.151:2296-2308(1993)]。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)Ficoll密度分離法，分離人邊周血單核細(xì)胞(PBMCs)。用10％普通的兔血清/PBS封閉375000個細(xì)胞，4℃下10分鐘。沖洗后，細(xì)胞與100μl下列物質(zhì)溫育(a)CAMPATH-IH(TherapeuticAntibodyCenter,Cambridge,U.K.)；(b)人IgG1(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO)，(c)LDP-01[CD-18抗體的衍生物，描述于WO93/02191(1993年2月4日發(fā)表)，以及Sims,M.J.,etal.,J.Immunol.151(4):2296-2308(1993),在IgG1重鏈恒定區(qū)有兩個位點的氨基酸替換(Leu235→Ala235和Gly237→Ala237)，也叫作“FcRmutCD18”,TherapeuticAntibodyCenter,Cambridge,U.K.],或(d)LDP-02(1℃humACT-1Lot#8/9)濃度為10μg/ml,4℃下20min。CAMPATH-1H作為一種陽性對照，LDP-01和人IgG1作為陰性對照，全部試劑均用2％BSA/PBS稀釋，2％BSA/PBS也作為一種陰性對照物單獨加入。洗除抗體，將細(xì)胞重溶于50μl人補體C1q(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO),10μg/ml4℃下30min。然后洗滌細(xì)胞，重懸浮于200μl的FITC-結(jié)合兔抗一人C1q(DakoCorp.,Carpinteria,CA)抗體，濃度為20μg/ml,4℃下20min。用200μl的PBS洗滌后，再溶于0.5ml的PBS/1％福爾馬林，凍箱冷藏直至分析。在FACScan(BectonDickinsonCorp.,SanJose,CA)上分析樣品，用488nm波長激光激發(fā)藻紅旦白。對每個樣品最少分析10000個細(xì)胞，記算平均頻道熒光(MCF)。人PBM與CAMPATH-1H結(jié)合的人C1q一起溫育，導(dǎo)致MCF有一個顯著漂移，而PBMC與LDP-01、BSA或人IgG一起溫育所誘導(dǎo)的染色模式都相似，都有低背景染色。PBMC與LDP-02預(yù)先溫育所形成的染色模式和陰性對照的相同，說明在這種條件下LDP-02不結(jié)合C1q。E補體介導(dǎo)的溶胞如前述方法，檢測LDP-02/3A9/Lot#1參與補體介導(dǎo)細(xì)胞溶胞的能力(Bindon,C.I.,etal.Transplantation,40:538-544(1985))。無菌收集肝素化人血，收集血漿并立即置于冰上。在一層Ficoll-Hypaque上，密度1.077g/ml，離心15分鐘，分離邊周血單核細(xì)胞(PBMC)，用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，培養(yǎng)基包括RPMI1640/10％FCS/100U/ml青霉素/100μg/ml鏈霉素/2.0MmlL-谷酰胺。將2千5百萬個細(xì)胞在含150μCi51鉻酸鈉的無菌鹽水中37℃溫育1小時(E.I.duPontdeNemours&amp;Co.Inc.,Wilmington,DE)。用培養(yǎng)液洗滌兩次，重新懸浮成106/ml。將50μl該懸浮液(5.0×104個細(xì)胞)加到U形底微滴度盤的孔中，盤中有100μl下列物質(zhì)之一(a)CAMPATH-1H(TherapeuticCenter,Cambridge,U.K.),(b)CAMPATH-1G(TherapeuticCenter,Cambridge,U.K.),(c)人IgG1(SigmaChemicalCo.,St.Louis,MO),(d)LDP-02/3A9/Lot#1，或(e)LDP-01(FcRmutCD18,TherapeuticAntibodyCenter,Cambridge,U.K.)，濃度分別為50,25,5,2.5，和0.5μg/ml。CAMPATH-1抗體作為陽性對照，人IgG1和LDP-01作為陰性對照。額外的孔包含溶于含有100μl0.1％Triton-X-100的完全培養(yǎng)基中的細(xì)胞。同Triton-X-100溫育的細(xì)胞被用來測量總放射性，而無抗體的對照孔被用來測定自發(fā)的放射性。室溫下溫育15分鐘后，50μl自體血漿作為補體來源，加到每個孔中，終濃度為20％。37℃下溫育45分鐘，100g離心2分鐘，收集100μl上清液，用CobraⅡgammaCounter(PackardInstruments,DownersGrove,IL)測定放射性，每個樣品重復(fù)操作2次，利用公式計算51Cr的特異放射性百分比特異放射性=(實驗-自發(fā)性)X100％/(總體-自發(fā)性)如以前所報道[BindonetalTransplantation40:538-544(1985)]，CAMPATH-1H和CAMPATH-1G以一種劑量依賴性方式誘導(dǎo)出高達(dá)35％的人PBMC補體介導(dǎo)溶胞。此外，人IgG1和LDP-01對照物不誘導(dǎo)任何可檢測到的細(xì)胞溶胞，LDP-02在高于和包括25μg/ml的任何試驗濃度下不參與細(xì)胞溶胞作用(圖17)。F．抗體依賴性的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞毒作用(ADCC)人CD3+胚細(xì)胞被用作靶細(xì)胞，來測量LDP-02參與ADCC作用的能力。CD3+胚細(xì)胞于外包被抗CD3抗體RT66的24孔板上產(chǎn)生的，RT66在PBS中稀釋成5μg/ml。在一層1.077g/mlFicoll-Hypaque上離心15分鐘分離PBMC細(xì)胞，洗滌，重溶于完全培養(yǎng)基，這些操作如前面所述。將2百萬個細(xì)胞加到24孔板的每個孔中，37℃5％CO2，溫育4天。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，37℃5％CO2培養(yǎng)，培養(yǎng)基含有10單位/毫升的人重組IL-2(GenzymeCorp.,Cambridge,MA)。三天后，10×106CD3胚細(xì)胞在含150μCi51鉻酸鈉的無菌鹽水(E.I.duPontdeNemours&amp;Co.Inc.,Wilmington,DE；Lot#95M682)中溫育于37℃45分鐘。用完全培養(yǎng)液洗滌兩次，重懸浮成2×105cells/ml，取50μl懸液(10,000個細(xì)胞)加到U形底96孔微滴定板的孔中，孔中含有50μlCAMPATH-1H(TherapeuticAntibodyCenter,Cambridge,UK)或LDP-02/3A9/Lot#1，終濃度為50,5,2.5,0.5,0.25μg/ml。細(xì)胞與抗體在室溫下溫育30分鐘，效應(yīng)細(xì)胞(效應(yīng)器靶=50∶1)加到每個孔中，效應(yīng)細(xì)胞是來自不同供體的0.5x106個新分離的PBMC’(ficoll-hypaque梯度，在37℃用完全培養(yǎng)基洗兩次)。額外的孔中，加入在培養(yǎng)基中的100μl5％Triton-x-100(FisherScientinc,FairLawn,NJ)。用與Triton-x-100溫育的細(xì)胞測量總放射性，而無抗體與效應(yīng)細(xì)胞的對照被用來測量自發(fā)放射性。室溫下100g離心2分鐘，37℃5％CO2溫育20小時，此后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到V形底96孔板上，室溫下沉淀。收集100μl上清液，用CobraⅡgammacounter(PackardInstruments,DownersGrove,IL)測定放射性。每個樣品重復(fù)操作2次，利用公式計算51Cr的特異放射性百分比。特異放射性=(實驗-自發(fā)性)×100％/(總體-自發(fā)性)如以前所證實的[Sims,M.J.etal.,J.Immunol.,151(4):2296-2308(1993)],CAMPATH-1H以一種劑量依賴性方式參與ADCC，在濃度≥5.0μg/ml誘導(dǎo)大約30％特定的51Cr放射性。在任何檢測濃度的包含LDP-02的孔中未檢測到任何特定放射性。G．對粘附MAdCAM-1的抑制作用用熒光標(biāo)記的α4β7+RPMI8866細(xì)胞(人B淋巴細(xì)胞)和嵌合的MAdCAM-1來測量LDP-02抑制α4β7粘附MAdCAM-1過程的能力，嵌合的MAdCAM-1包括人MAdCAM-1的整個胞外區(qū)域融合于人IgG1Fc區(qū)域(來自于同一構(gòu)建物的恒定區(qū)，被用于Fc-突變LDP-02的恒定區(qū))。1．嵌合MAdCAM-IgG的構(gòu)建人MAdCAM-1克隆pcDhuMAd4[在pCDNA3中的克隆4cDNA；Shyjan,A.M.etal.,J.Immunol.,156:2851-2857(1996)，該文獻(xiàn)通過在此引述而全文合并于本文]被用作人MAdCAM-胞外區(qū)域PCR擴增的模板，該區(qū)域與人IgG1恒定區(qū)融合[國際申請?zhí)朠CT/US96/02153(WO96/24673),1996年2月12日申請，是1995年9月1日申請的美國專利申請08/523,004的后續(xù)申請，該后續(xù)申請又是1995年2月10日申請的美國專利08/386,857的后續(xù)申請]。為構(gòu)建MAdCAM-IgG嵌合體，合成出包含人MAdCAM-1編碼序列的5端(ATG密碼子，黑體)的引物HUMADIG4/2(SEG1DNO:62)。HindⅢ5’-GGAAGCTTCCACCATGGATTTCGGACTGGCCC-3’這個5’端引物和3’引物HUMAD1G3結(jié)合擴增出編碼人MAdCAM-1整個胞外部分的區(qū)域。3’端引物HUMAD1G3(SEQIDNO:63)有下列序列；SpeⅠ5’-GGACTAGTGGTTTGGACGAGCCTGTTG-3’在引物上設(shè)計有5’端的HindⅢ位點和3’端的SpeⅠ位點。使用Invitrogen(SanDiago,CA)的PCR試劑盒和這些引物，PCR擴增MAdCAM片段。用HindⅢ和SpeⅠ降解擴增產(chǎn)物，生成克隆用末端，利用GlassmaxDNA分離系統(tǒng)(Gibco,Bethesda,MD)凝膠電泳純化。用SpeⅠ和EcoRⅠ從構(gòu)建物上切下包含CH1,H(鉸鏈)，CH2和CH3區(qū)的約1Kb左右的片段，該構(gòu)建物編碼含有Fc-突變?nèi)撕愣▍^(qū)的人免疫球蛋白重鏈。該構(gòu)建物中人恒定區(qū)對應(yīng)于CAMPATH-1H重鏈的PCR擴增產(chǎn)物[Reichmann,L.etal.,Nature,322:323-327(1988),Sims,M.J.etal.(J.Immunol.,151:2296-2308(1993)andWaldmannetal.(WO93/02191,1993年2月4日(23頁)，這些文獻(xiàn)都通過在此引述而全文合并于本文]。通過寡聚核苷酸直接突變，在構(gòu)建物恒定區(qū)設(shè)計了突變(Leu235-Ala235,Gly237-Ala237)，減少了對人Fcγ受體的結(jié)合。因此在MAdCAM-Ig融合子中除了引入了Leu235-Ala235,Gly237-Ala237突變外，含有SpeⅠ-EcoRⅠ恒定區(qū)[Simsetal.J.Immunol.,151:2296-2308(1993)andWaldmannetal.(WO93/02191)]。用GlassmaxDNA分離系統(tǒng)(Gibco,Bethesda,MD)凝膠電泳分離編碼Fc-突變IgG1恒定區(qū)的1kb的SpeⅠ-EcoRⅠ片段。恒定區(qū)片段和包含MAdCAM整個胞外區(qū)的HindⅢ-SpeⅠ片段整合到HindⅢ、EcoRⅠ酶切過的pEE12載體上[Stephens,P.L.andM.L.Cockett,Nucl.AcidsRes.,17:7110(1989)andBebbington,C.R.andC.C.G.Hentschel,1987,Theuseofvectorsbasedongeneamplificationfortheexpressionofclonedgenesinmammaliancells,(AcademicPress,N.Y.)]。得到細(xì)菌DH10B株的轉(zhuǎn)化子，集落生成后，用限制性內(nèi)切酶圖譜分析微小質(zhì)粒。編碼含有MAdCAM-1整個胞外區(qū)融合蛋白的構(gòu)建物(構(gòu)建物HuMAdIg21)與Fc-突變IgG1恒定區(qū)融合，在整個MAdCAM-1部分進(jìn)行測序，以確證各部分之間正確的融合，以及PCR過程未引入突變。這個構(gòu)建體在NSO細(xì)胞里生長，通過標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)A親合層析純化產(chǎn)物。2．粘附實驗用碳酸鹽緩沖液稀釋嵌合MAdCAM-1至2.5μg/ml,pH9.5，取50μl涂在一個高結(jié)合性平底96孔板(Costar)上，37℃保持1小時，在一個微板自動清洗器上(Bio-TekInstruments,WinooskiVT)用洗滌緩沖液(50mMTrisHCl,0.14MNaCl,1mMMnCl2,pH7.2)洗滌孔穴。用稀釋于PBS的100μl的10％FBS封閉，37℃,1.5小時。首先用20ml的PBS(4℃)洗滌RPMI8866細(xì)胞[一種表達(dá)α4β7(而不是α4β1)的人B淋巴細(xì)胞(Erle,D.J,etal,J,Immunol,153:517(1994)；由Erle博士贈送)]，重溶于PBS濃度成為4.0×106cells/ml。BCECF(2’,7’-雙-(2-羧乙基)-5-(和6)-羧基熒光素，乙酰氧基酯；MolecularProbes,Inc.,Eugene,OR)溶解于DMSO成50μg/ml，再加入到細(xì)胞懸液中，最終稀釋度為1∶500,37℃溫育30min后，用檢測緩沖液洗滌細(xì)胞(HBSS和2％小牛血清，25mMHEPES，青霉素/鏈毒素，PH7.2)，在V形底96孔板的每一個孔中加入50,000個細(xì)胞。細(xì)胞再溶解于100μl下列物質(zhì)之一(a)鼠Act-1；(b)鼠IgG1(SigmaChemical,Co.,St,Louis,MO)；(c)LDP-02/3A9/Lot#1；(d)人IgG1(SigmaChemicalCo.,st,Louis,MO),濃度為15.0-0.00075μg/ml在檢測緩沖液中，室溫下溫育10min。洗滌外覆MAdCAM-1的板，除去封閉緩沖液，將這些熒光標(biāo)記的RPMI8866細(xì)胞加到每個孔中。板置于40RPM的平板振蕩器上(NewBrunswick,ScientmcCo.,Inc,Edison,NJ)，室溫下30min，用鋁箔包裹。未被結(jié)合的細(xì)胞通過一次洗滌便可除去，接下來，在熒光聚焦分析儀上(IDEXXLaboratoriesInc.,Westbrook,ME)測量熒光強度(485nm激發(fā)，535nm讀數(shù))。通過公式，根據(jù)相對熒光單位計算出每孔中結(jié)合細(xì)胞的百分比。結(jié)合細(xì)胞％=(洗滌前RFU/洗滌后RFU)x100LDP-02和鼠Act-1都以一種劑量依賴性方式抑制RPMI8866細(xì)胞對人MAdCAM的粘附(圖18A-18B)。半抑制粘附濃度(IC50)相對類似于鼠Act-1的(0.0018μg/ml)和LDP-02的(0.0014μg/ml)，因此，LDP-02起碼和鼠Act-1一樣能夠抑制α4β7介導(dǎo)的對MAdCAM-1的粘附。實施例5額外的人化抗體如上所述，實施例2中的改型抗體的多個變種能夠提高其親合性和/或降低抗原性。這樣的構(gòu)建物包括但不僅限于下列一種或一種以上的突變輕鏈的M4V的突變，重鏈的R38K突變，重鏈A40R突變，重鏈I73T回復(fù)突變。突變可以是單個發(fā)生(例如，一條鏈上一個突變)，也可以是聯(lián)合發(fā)生。例如，圖19所示的是用改型抗體(在實施例2中設(shè)計的)或用在輕鏈上有一個額外突變(MV4)和在重鏈上有兩個額外突變(R38K，A40R)的衍生體對HuT78染色的結(jié)果。這兩種抗體有相似的染色模式(圖19)。根據(jù)實驗手冊用轉(zhuǎn)化子位點直接突變試劑盒(Clontech)改變核苷酸序列，從而形成突變。用克隆到pCR-ScriptTM的可變區(qū)片段制造出在重鏈和輕鏈可變區(qū)都有突變。順式寡核苷酸ScaⅠ/StuⅠ(Clontech)用于順式寡聚核苷酸。突變寡聚核苷酸(SEQ1DNO:38-40)的序列如下H/R38K(SEQIDNO:38)5’-CTGGCCAACGH/I73T(SEQIDNO:39)5’-CACATTGACTGTAGACACTTCCGCTAGCACAGCCL/M4V(SEQIDNO:40)5’-CCGGAGGTGATGTTGTGGTGACTC對于其他的操作，包括亞克隆到表達(dá)載體pEE6hcMV-B和pEE12，構(gòu)建包含重鏈和輕鏈基因的表達(dá)質(zhì)粒等，都如對主要的改型抗體的描述。瞬間轉(zhuǎn)染和細(xì)胞染色也都如對主要的改型抗體的描述。等同原則本領(lǐng)域的技術(shù)人員們都知道或者都能夠肯定，使用不超過常規(guī)的實驗方法，都可以獲得本發(fā)明的許多其他等價方案。這些等價也能夠達(dá)到本項發(fā)明同樣的效果，這些等價方法也被包括在下面的權(quán)利要求中。權(quán)利要求1．一種對α4β7整合蛋白有結(jié)合特異性的人化免疫球蛋白，其特征在于所述的免疫球蛋白包括非人源抗原結(jié)合區(qū)和至少一部分的人源免疫球蛋白。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，所述的人源免疫球蛋白部分來自于人恒定區(qū)。3．根據(jù)權(quán)利要求2所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，人恒定區(qū)是γ類型的。4．根據(jù)權(quán)利要求2所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，抗原結(jié)合區(qū)是嚙齒類的。5．根據(jù)權(quán)利要求2所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，抗原結(jié)合區(qū)來自于Act-1單克隆抗體。6．根據(jù)權(quán)利要求1所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，抗原結(jié)合區(qū)包括嚙齒類源互補決定區(qū)，并且人源免疫球蛋白部分衍生自人框架區(qū)。7．根據(jù)權(quán)利要求6所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，互補決定區(qū)來自于Act-1單克隆抗體。8．一種對α4β7整合蛋白有結(jié)合特異性的人化免疫球蛋白，其特征在于，包括重鏈和輕鏈；輕鏈包括與α4β7特異性結(jié)合的衍生自非人源抗體的互補決定區(qū)和衍生自人源輕鏈的框架區(qū)；重鏈包括與α4β7特異性結(jié)合的衍生自非人源抗體的互補決定區(qū)和衍生自人源重鏈的框架區(qū)。9．根據(jù)權(quán)利要求8所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，所述的免疫球蛋白能與鼠Act-1競爭對α4β7的結(jié)合。10．根據(jù)權(quán)利要求8所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，所述的輕鏈包括衍生自Act-1抗體的輕鏈的三個補決定區(qū)，重鏈包括衍生自Act-1抗體重鏈的三個互補決定區(qū)。11．根據(jù)權(quán)利要求8所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，所述人源輕鏈?zhǔn)荊M607’CL抗體的輕鏈。12．根據(jù)權(quán)利要求8所述的人化免疫球蛋白，其特征在于，所述人源重鏈?zhǔn)侨?1/28’CL抗體的重鏈。13．一種人化免疫球蛋白輕鏈，其特征在于，包括鼠Act-1抗體輕鏈的CDR1,CDR2,CDR3，和輕鏈框架區(qū)。14．根據(jù)權(quán)利要求13所述的人化免疫球蛋白輕鏈，其特征在于，所述人框架區(qū)來自于GM607’CL抗體的輕鏈。15．根據(jù)權(quán)利要求14所述的人化免疫球蛋白輕鏈，其特征在于，所述輕鏈包含SEQIDNO:21的可變區(qū)。16．一種被分離的核酸，其特征在于，該核酸編碼權(quán)利要求15所述人化免疫球蛋白輕鏈。17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的被分離的核酸，其特征在于，包含編碼SEQIDNO:20序列的可變區(qū)。18．一種人化免疫球蛋白重鏈，其特征在于，包括Act-1抗體的CDR1,CDR2,CDR3，和人重鏈框架區(qū)。19．根據(jù)權(quán)利要求18所述人化免疫球蛋白重鏈，其特征在于，人框架區(qū)來自于人21/28’CL抗體的框架區(qū)。20．根據(jù)權(quán)利要求19所述的人化免疫球蛋白重鏈，其特征在于，包含SEQIDNO:19的可變區(qū)。21．一種被分離的核酸，其特征在于，編碼權(quán)利要求20中所述人化免疫球蛋白重鏈。22．根據(jù)權(quán)利要求21所述的被分離的核酸，其特征在于，包含SEQIDNO:18的可變區(qū)的編碼序列。23．一種人化免疫球蛋白輕鏈，其特征在于，所述的輕鏈具有包括如圖7(SEQIDNO:12)所示輕鏈可變區(qū)中氨基酸序列的至少一個功能單元的氨基酸序列。24．根據(jù)權(quán)利要求23所述的人化免疫球蛋白輕鏈，其特征在于，所述的輕鏈包括含有圖7所示信號肽(SEQIDNO:12)和圖7所示輕鏈可變區(qū)中至少一個功能單元的氨基酸序列(SEQIDNO:12)的氨基酸序列。25．一種被分離的核酸，其特征在于，包括編碼權(quán)利要求23所述人化免疫球蛋白輕鏈的核酸。26．根據(jù)權(quán)利要求25所述的被分離的核酸，其特征在于，包括SEQIDNO:11的可變區(qū)的編碼序列。27．一種人化免疫球蛋白重鏈，其特征在于，所述的重鏈包括含圖9所示重鏈可變區(qū)至少一個功能區(qū)的氨基酸序列的(SEQIDNO:15)的氨基酸序列。28．根據(jù)權(quán)利要求27所述人化免疫球蛋白重鏈，其特征在于，所述的重鏈包括含圖9所示信號肽(SEQIDNO:15)和圖9所示重鏈可變區(qū)中至少一個功能區(qū)(SEQIDNO:15)的氨基酸序列的氨基酸序列。29．一種被分離的核酸，其特征在于，其編碼權(quán)利要求27所述的人化免疫球蛋白重鏈。30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的被分離的核酸，其特征在于，所述的核酸包括SEQIDNO:14的可變區(qū)的編碼序列。31．一種表達(dá)載體，其特征在于包括編碼人化免疫球蛋白輕鏈的融合基因，所述基因包括特異結(jié)合α4β7整合蛋白的非人源抗體輕鏈衍生的CDR和衍生自人源輕鏈的框架區(qū)的核苷酸序列。32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述的非人源抗體是鼠Act-1抗體。33．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求31的表達(dá)載體。34．一種表達(dá)載體，其特征在于，包含編碼人化免疫球蛋白重鏈的融合基因，所述的基因包括特異結(jié)合α4β7整合蛋白的非人源抗體重鏈衍生的CDR和人源重鏈衍生的框架區(qū)的核苷酸序列。35．根據(jù)權(quán)利要求34所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述非人源抗體是鼠Act-1抗體。36．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包含權(quán)利要求34所述的表達(dá)載體。37．一種宿主細(xì)胞，其特征在于，包括編碼人化免疫球蛋白輕鏈的第一重組核酸和編碼人化免疫球蛋白重鏈的第二重組核酸所述第一重組核酸包括對鼠Act-1抗體輕鏈衍生的CDR和人源輕鏈衍生的框架區(qū)進(jìn)行編碼的核苷酸序列；以及所述第二重組核酸包括對鼠Act-1抗體重鏈衍生的CDR和人源重鏈衍生的框架區(qū)進(jìn)行編碼的核苷酸序列。38．一種制備人化免疫球蛋白的方法，其特征在于，在適合人化免疫球蛋白表達(dá)的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求37中的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)人化免疫球蛋白的鏈并制備出人化免疫球蛋白。39．根據(jù)權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，還包括分離人化免疫球蛋白的步驟。40．一種編碼人化免疫球蛋白輕鏈或重鏈的融合基因，其特征在于，包含a)編碼鼠Act-1單克隆抗體衍生的抗原結(jié)合區(qū)的第一核酸序列；b)編碼至少一部分人免疫球蛋白恒定區(qū)的第二核酸序列。41．一種抑制攜帶α4β7的第一細(xì)胞和攜帶其配體的第二細(xì)胞的結(jié)合的方法，其特征在于使所述的第一細(xì)胞和有效量的權(quán)利要求1中的人化免疫球蛋白相結(jié)合。42．一種抑制黏膜組織的淋巴細(xì)胞滲透作用的方法，其特征在于，包括給病人提供有效劑量的權(quán)利要求1中的人化免疫球蛋白。43．一種治療表達(dá)MAdCAM-1的組織的淋巴細(xì)胞滲透性疾病的方法，其特征在于，提供給病人有效劑量的如權(quán)利要求1所述的人化免疫球蛋白。44．根據(jù)權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述疾病是一種由于淋巴細(xì)胞和表達(dá)MAdCAM的消化道內(nèi)皮相結(jié)合所導(dǎo)致的組織淋巴細(xì)胞滲透性疾病。45．一種治療腸炎癥疾病的方法，其特征在于，提供給病人有效劑量的權(quán)利要求1中所述的人化免疫球蛋白。46．根據(jù)權(quán)利要求1所述人化免疫球蛋白，其特征在于，可用于治療或診斷。47．根據(jù)權(quán)利要求1所述人化免疫球蛋白，其特征在于，可用于治療組織淋巴細(xì)胞滲透性疾病(如炎癥)。48．根據(jù)權(quán)利要求1所述人化免疫球蛋白，其特征在于，可用于治療腸炎癥疾病。49．根據(jù)權(quán)利要求1所述人化免疫球蛋白在制造治療組織淋巴細(xì)胞滲透性疾病的藥物(如炎癥)中的應(yīng)用。50．根據(jù)權(quán)利要求1所述的人化免疫球蛋白在制造治療腸炎癥疾病的藥物中的應(yīng)用。51．一種藥物組合物，其特征在于，其組成包括權(quán)利要求1所述的人化免疫球蛋白和適宜的載體。全文摘要本發(fā)明涉及具有對α4β7整聯(lián)蛋白結(jié)合特異性的人化免疫球蛋白，包括非人源的抗原結(jié)合區(qū)域(例如，嚙齒類起源的)和至少一部分的人源免疫球蛋白(例如，人構(gòu)架區(qū)，人恒定區(qū))。在一個實施方案中，人化的免疫球蛋白可以鼠ACt－1競爭對α4β7整合蛋白的結(jié)合。在一個優(yōu)選的實施方案中，人化的免疫球蛋白的抗原結(jié)合區(qū)包括鼠Act－1抗體的重鏈和輕鏈的各自互補性決定區(qū)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及人化的免疫球蛋白的輕鏈和重鏈，包括編碼本發(fā)明的人化免疫球蛋白或免疫球蛋白鏈的序列的核酸(例如，單鏈抗體)，包括本發(fā)明的核酸的構(gòu)建物，包括本發(fā)明的核酸的宿主細(xì)胞，用于制備人化的免疫球蛋白。人化的免疫球蛋白可以用于對人體疾病的診斷和治療，例如，控制淋巴細(xì)胞對黏膜組織的滲入(包括征集和/或積累)。文檔編號C12P21/08GK1227607SQ97197221公開日1999年9月1日申請日期1997年8月6日優(yōu)先權(quán)日1996年8月15日發(fā)明者保羅·D·波納斯,道格拉斯·J·倫格勒,S·特倫·瓊斯,沃特·紐曼,卓思·塞爾丹哈,瑪麗·M·班第哥申請人:羅克塞特有限公司