專(zhuān)利名稱(chēng)：：在植物種子中生產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素化合物和特產(chǎn)油類(lèi)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物，植物細(xì)胞和種子的遺傳修飾，特別是改變了類(lèi)胡蘿卜素生物合成和脂肪酸成分的遺傳修飾。
背景技術(shù)：
：類(lèi)胡蘿卜素是具有各種各樣應(yīng)用的色素。它們是存在于綠色植物，某些霉菌，酵母和細(xì)菌中的黃色-桔黃色-紅色脂類(lèi)。類(lèi)胡蘿卜素?zé)N是指胡蘿卜素，而其氧化的衍生物是指葉黃素。類(lèi)胡蘿卜素是較大的類(lèi)異戊二烯生物合成途徑的部分，其中除了類(lèi)胡蘿卜素以外，產(chǎn)生類(lèi)似于葉綠素和維生素E，維生素E活化劑這樣的化合物。植物中的類(lèi)胡蘿卜素途徑產(chǎn)生胡蘿卜素，例如α-和β-胡蘿卜素，和番茄紅素和胡蘿卜醇，例如葉黃素。類(lèi)胡蘿卜素的生物合成涉及C20前體香葉基PPi的兩個(gè)分子的縮合以產(chǎn)生第一個(gè)C40烴八氫番茄紅素。在一系列的依序的脫飽和反應(yīng)中，八氫番茄紅素產(chǎn)生番茄紅素。番茄紅素是環(huán)狀的胡蘿卜素，β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素的前體。胡蘿卜醇，玉米黃質(zhì)和葉黃素是分別通過(guò)β-胡蘿卜素和α-胡蘿卜素的羥化形成的。其顏色是在黃色到桔黃色范圍的光譜的胡蘿卜素，β-胡蘿卜素大量地存在于胡蘿卜的根部和植物的綠葉中。β-胡蘿卜素可用作為顏料物質(zhì)并且也可用作為哺乳動(dòng)物的維生素A的前體。商業(yè)生產(chǎn)β-胡蘿卜素的現(xiàn)行的方法包括從胡蘿卜分離，化學(xué)合成和微生物生產(chǎn)。已知許多作物和單一的油類(lèi)種子作物具有基本含量的類(lèi)胡蘿卜素，并且已經(jīng)顯示這樣的天然來(lái)源的類(lèi)胡蘿卜素的消費(fèi)對(duì)健康提供了各種有益的作用。下面的表提供了已經(jīng)報(bào)道的不同植物品種中類(lèi)胡蘿卜素的含量。不同作物的類(lèi)胡蘿卜素的含量(微克/克)已經(jīng)在各種各樣的生物體中研究了類(lèi)胡蘿卜素的生物合成途徑并且在從細(xì)菌到高等植物的范圍內(nèi)闡明了生物合成途徑。參見(jiàn)，例如Britton,G.(1988)類(lèi)胡蘿卜素的生物合成，第133-182頁(yè)，在T.w.Goodwin(ed.)，植物色素，1988,Academic出版社倫敦有限公司(倫敦)。也已經(jīng)從各種各樣的生物體包括噬夏孢歐文氏桿菌(Misawa等人(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172:6704-6712；草生歐文氏桿菌(申請(qǐng)WO91/13078,Armstrong等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA87:9975-9979)；莢膜紅球菌(Armstrong等人，(1989)Mol.Gen.Genet.216:254-268,Romer等人(1993)生物化學(xué)生物物理研究通訊196:1414-1421)；嗜熱棲熱菌(Hoshino等人(1993)應(yīng)用環(huán)境微生物學(xué)59:3150-3153)；藍(lán)藻類(lèi)細(xì)菌藍(lán)細(xì)菌屬的菌株(Genbank入藏號(hào)X63873)克隆了類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因。也可參見(jiàn)WO96/13149和本文記載的參考文獻(xiàn)。雖然基因已經(jīng)被闡明了，但是關(guān)于這些基因在植物中的使用知道很少。調(diào)查已經(jīng)顯示對(duì)轉(zhuǎn)基因植物中植物八氫番茄紅素合成酶(Psyl)基因的過(guò)量表達(dá)或表達(dá)的抑制能夠改變水果的類(lèi)胡蘿卜素含量。參見(jiàn)，Bird等人(1991)生物技術(shù)9:635-639；Bramley等人(1992)植物雜志2:343-349；和Fray和Grierson(1993)植物分子生物學(xué)，22:589-602。此外，如由Fray等人(1995)報(bào)道的，植物雜志8:693-701，水果八氫番茄紅素合成酶基因在轉(zhuǎn)基因番茄中的組成型表達(dá)通過(guò)使赤霉素途徑的代謝改道導(dǎo)致植株矮小。申請(qǐng)WO96/13149報(bào)道了關(guān)于加強(qiáng)在儲(chǔ)藏器官例如遺傳工程獲得的植物的塊莖和根中類(lèi)胡蘿卜素的積累。該申請(qǐng)涉及在特定的預(yù)定的非光合作用的儲(chǔ)藏器官中帶顏色的天然類(lèi)胡蘿卜素的產(chǎn)生增加。該申請(qǐng)的實(shí)施例涉及在轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根部和桔黃色的新鮮的馬鈴薯塊莖中帶色的類(lèi)胡蘿卜素的增加。這兩種組織是營(yíng)養(yǎng)性組織，不是種子，并且天然地具有高含量的類(lèi)胡蘿卜素。類(lèi)胡蘿卜素具有各種各樣的用途。通常，類(lèi)胡蘿卜素可用作為添加劑例如維生素添加劑，用作為基于植物油的食品和食品成分，用作為動(dòng)物飼料的飼料添加劑和用作為顏料。具體地說(shuō)，發(fā)現(xiàn)八氫番茄紅素可用于治療皮膚失調(diào)。參見(jiàn)，例如美國(guó)專(zhuān)利4,642,318。番茄紅素，α-和β-胡蘿卜素可用作為食品著色劑。也已經(jīng)證實(shí)消費(fèi)β-胡蘿卜素和番茄紅素對(duì)一定種類(lèi)的癌癥具有預(yù)防作用。另外，攝取的葉黃素與阻止眼睛的視網(wǎng)膜退化有關(guān)。植物油具有各種各樣的工業(yè)應(yīng)用和可食用的用途。新的植物油成分和/或從生物合成或天然植物來(lái)源獲得油成分的手段的改善是必須的。根據(jù)預(yù)定的油的應(yīng)用，需要各種不同的脂肪酸成分。對(duì)具有特定的脂肪酸成分的修飾的油的需求很大，特別是對(duì)于油酸含量高的油。參見(jiàn)，Haumann,B.F.(1996)INFORM7:320-334。如由Haumann報(bào)道的，理想的烹飪用油是低飽和性，高油酸和低亞麻油酸。此外，幾年來(lái)的研究已經(jīng)確定了單不飽和脂肪酸作為食用組成成分的價(jià)值。幾年來(lái)對(duì)于改善特定的油類(lèi)的脂肪酸分布進(jìn)行了嘗試。例如，植物油的氧化穩(wěn)定性是指其脂肪酸中的雙鍵的數(shù)目。就是說(shuō)，具有幾個(gè)雙鍵的分子被認(rèn)為是更穩(wěn)定的。因此，科學(xué)家們?cè)噲D降低α-亞麻油酸的含量以便改善半壽期和氧化穩(wěn)定性，特別是在加熱狀態(tài)下。對(duì)生產(chǎn)具有顯著含量的類(lèi)胡蘿卜素化合物的作物和特別是植物種子的方法的需求是顯而易見(jiàn)。另外改變植物和種子的脂肪酸含量是有益的。這樣的經(jīng)過(guò)改變的種子產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)價(jià)值是有用的并且提供了產(chǎn)生更穩(wěn)定的油類(lèi)的來(lái)源。沒(méi)有人報(bào)道基本上改變?cè)谥参锓N子中產(chǎn)生類(lèi)胡蘿卜素的含量和成分，特別是與提高類(lèi)胡蘿卜素的生產(chǎn)含量相關(guān)的方法。因此需要用于改變植物特別是種子中類(lèi)胡蘿卜素含量和用于生產(chǎn)具有修飾的類(lèi)胡蘿卜素成分和/或含量的油類(lèi)的方法。發(fā)明概述提供了具有改變的類(lèi)胡蘿卜素含量和/或修飾的脂肪酸成分的轉(zhuǎn)化的植物，植物細(xì)胞和種子。所述的植物，植物細(xì)胞和種子用至少一種類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化。還提供了制備和使用本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的成分的方法。該方法可用于改變植物特別是種子中類(lèi)胡蘿卜素的含量以及提高用于分子農(nóng)業(yè)的特定的化合物，例如用于生產(chǎn)特定的類(lèi)胡蘿卜素和維生素E。同時(shí)，轉(zhuǎn)化的成分特別是種子提供了修飾的油類(lèi)來(lái)源，該油類(lèi)是從種子提取的以便提供包括各種類(lèi)胡蘿卜素和類(lèi)胡蘿卜素混合物的天然來(lái)源的油類(lèi)產(chǎn)品。在本發(fā)明的特定的方面，轉(zhuǎn)化的種子能夠提供作為特定的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)品和/或作為修飾的特產(chǎn)油類(lèi)的來(lái)源，所述油類(lèi)具有改變的類(lèi)胡蘿卜素或維生素E成分和/或改變的脂肪酸成分，特別是具有增高的油酸含量和降低的亞油酸和亞麻油酸含量。附圖簡(jiǎn)述附圖1顯示SSU/crtB融合序列的核苷酸序列。附圖2提供在植物種子中表達(dá)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的構(gòu)建體。附圖2A顯示含有可操作連接到SSU/crtB序列的napin啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCGN3390。附圖2B顯示含有可操作連接到SSU/crtE序列的napin啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCGN3392。附圖2C含有可操作連接到SSU/crtI序列的napin啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCGN9010。附圖2D顯示含有可操作連接到SSU/crtB序列的napin啟動(dòng)子和含有可操作連接到SSU/crtI序列的napin啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCGN9009。附圖2E顯示含有可操作連接到SSU/crtB序列的napin啟動(dòng)子和可操作連接到反義ε-環(huán)化酶序列的質(zhì)粒pCGN9002。附圖2F顯示含有可操作連接到SSU/crtB序列的napin啟動(dòng)子和可操作連接到反義β-環(huán)化酶序列的napin啟動(dòng)子的質(zhì)粒pCGN9017。附圖3顯示對(duì)照種子的皂化樣品的分析結(jié)果。附圖4顯示pCGN3390轉(zhuǎn)化的種子的皂化樣品的分析結(jié)果。附圖5顯示pCGN3390轉(zhuǎn)化的種子的脂肪酸分析圖并且證實(shí)了18∶1脂肪酸的增加與18∶2和18∶3的降低相關(guān)。附圖6顯示pCGN3390轉(zhuǎn)化的種子的脂肪酸分析圖并且證實(shí)了18∶1的增加與18∶0和20∶0的增加相關(guān)，但是對(duì)于16∶0幾乎沒(méi)有效果。附圖7顯示pCGN3390轉(zhuǎn)化的種子的脂肪酸分析圖并且證實(shí)了18∶1的增加與20∶0的增加充分相關(guān)。附圖8顯示類(lèi)胡蘿卜素生物合成途徑。附圖9提供了歐洲油菜ε-環(huán)化酶cDNA克隆9-4的序列。附圖10提供了歐洲油菜ε-環(huán)化酶cDNA克隆7-6的序列。附圖11提供了歐洲油菜β-環(huán)化酶cDNA克隆的序列。附圖12提供了3390轉(zhuǎn)化的歐洲油菜植物的T2種子分析。附圖13提供了3390轉(zhuǎn)化的歐洲油菜植物的T3種子分析。發(fā)明詳述根據(jù)本發(fā)明，提供了用于增加植物，特別是植物種子的類(lèi)胡蘿卜素化合物的生產(chǎn)和用于改變脂肪酸成分的方法。該方法包括用至少一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞。這一步驟具有改變類(lèi)胡蘿卜素生物合成特別是提高下游產(chǎn)物的產(chǎn)生，以及提供新的具有所需的脂肪酸成分的種子油類(lèi)的作用。然后可以將第二個(gè)基因用于調(diào)整代謝活性以生產(chǎn)特定的類(lèi)胡蘿卜素化合物或進(jìn)一步改變脂肪酸的成分。令人驚奇的是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用早期的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化植物導(dǎo)致借助于類(lèi)胡蘿卜素途徑流出物顯著提高，導(dǎo)致特定的類(lèi)胡蘿卜素增高。就是說(shuō)，可以被進(jìn)一步加工以產(chǎn)生特異性類(lèi)胡蘿卜素的代謝活性提高。另外，轉(zhuǎn)化的種子可以證實(shí)由于類(lèi)胡蘿卜素基因表達(dá)的結(jié)果產(chǎn)生改變的脂肪酸成分，例如用本文描述的從用八氫番茄紅素合成酶基因轉(zhuǎn)化的植物的種子所看到的。因此，利用本發(fā)明的方法提供產(chǎn)生高含量的特定的類(lèi)胡蘿卜素和/或產(chǎn)生具有所需的脂肪酸成分的特產(chǎn)油類(lèi)的種子。在油菜的油類(lèi)種子中，例如用早期的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化導(dǎo)致產(chǎn)生其α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素和葉黃素的產(chǎn)生顯著提高的種子。另外，油菜種子顯示改變的脂肪酸成分并且產(chǎn)生植物油，所述植物油具有增高的油酸含量和降低的亞油酸和亞麻油酸含量。因此，轉(zhuǎn)化的種子提供了類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)物以及修飾的種子油類(lèi)的來(lái)源。以這種方式，能夠產(chǎn)生修飾的特產(chǎn)油類(lèi)并且提供了用于提取和純化的類(lèi)胡蘿卜素的新的來(lái)源。與類(lèi)胡蘿卜素兩個(gè)主要的植物來(lái)源，萬(wàn)壽菊花瓣和紅棕櫚油(中果皮)相比，本發(fā)明的油類(lèi)的穩(wěn)定性得到改善。雖然在儲(chǔ)藏于室溫下的空氣中的種子中觀察到不穩(wěn)定性，如在儲(chǔ)藏4星期后總的類(lèi)胡蘿卜素含量損失約20-30％,1-2星期之后僅損失10％所證實(shí)的。與之相反，棕櫚的中果皮必須在收獲后1或2天內(nèi)加工以便避免類(lèi)胡蘿卜素的大損失。此外，在氮?dú)鈼l件下將種子儲(chǔ)藏之后顯著降低了本發(fā)明的種子的類(lèi)胡蘿卜素的分解。為了生產(chǎn)具有類(lèi)胡蘿卜素生物合成增高的種子，用早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化的植物是足夠的。由于打算使早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因成為香葉基香葉基焦磷酸合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶和異戊烯基二磷酸(IPP)異構(gòu)酶，對(duì)于早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因可從各種各樣的來(lái)源獲得，大多數(shù)情況下，可以利用各種來(lái)源的基因。但是，認(rèn)識(shí)到由于共抑制，靶宿主植物的天然的植物基因的使用可以是令人滿意的，其中特定的酶的增高的表達(dá)是需要的。已經(jīng)分離了許多早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因并且可用于本發(fā)明的方法，參見(jiàn)例如已經(jīng)從莢膜紅球菌(Hahn等人，(1996)細(xì)菌學(xué)雜志178:619-624和本文記載的參考文獻(xiàn))，Genbank入藏號(hào)U48963和X82627,ClarkiaxantianaGenbank入藏號(hào)U48962、鼠耳芥，Genbank入藏號(hào)U48961、粟酒裂殖糖酵母，Genbank入藏號(hào)U21154，人Genbank入藏號(hào)X17025、乳克魯維氏酵母，Genbank入藏號(hào)X14230分離了IPP異構(gòu)酶。從噬夏孢歐文氏桿菌(Misawa等人(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172:6704-6712和申請(qǐng)WO91/13078)；和從植物來(lái)源，包括白扇羽豆(Aitken等人，(1995)植物生理學(xué)，108:837-838)、燈籠椒(Badillo等人，(1995)植物分子生物學(xué)27:425-428)和鼠耳芥(Scolnik和Bartely(1994)植物生理學(xué)，104:1469-1470；Zhu等人(1997)植物細(xì)胞生理學(xué)38:357-361)分離了香葉基香葉基焦磷酸合成酶。從許多來(lái)源包括噬夏孢歐文氏桿菌，莢膜紅色桿菌和植物(Misawa等人(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172:6704-6712,GenBank入藏號(hào)D90087，和申請(qǐng)WO91/13078,Amstrong等人，(1989)Mo1.Gen.Genet.216:254-268,Amstrong,G.A.“類(lèi)胡蘿卜素生物合成的遺傳分析和調(diào)節(jié)，R.C.Blankenship,M.T.Madigan，和C.E.Bauer(ed.)，不產(chǎn)氧的光合作用細(xì)菌；光合作用的進(jìn)展。KluwerAcademicPublishers,Dordrecht，荷蘭，Amstrong等人，(1990)Proc.Acad.Sci.USA87:9975-9979,Amstrong等人，(1993)酶學(xué)方法214:297-311,Scolnik和Bartely(1993)生物化學(xué)雜志268:27518-27521,Barmley等人，(1992)生物化學(xué)雜志267:5036-5039,Bartely等人，(1992)植物雜志2:291-343,Ray等人(1992)植物分子生物學(xué)，19:401-404,Ray等人(1987)核酸研究15:10578,Romer等人，(1994)生物化學(xué)和生物物理研究通訊196:1414-1421,Karvouni等人，(1995)植物分子生物學(xué)27:1153-1162,GenBank入藏號(hào)U32636,Z37543,L37405,X95596,D58420,U32636,Z37543,X78814,X82458,S71770,L27652,L23424,X68017,L25812,M87280,M38424,X69172,X63873,和X60441,Amstrong,G.A.(1994)細(xì)菌學(xué)雜志176:4795-4802和本文記載的參考文獻(xiàn)”分離了八氫番茄紅素合成酶，和從許多來(lái)源包括噬夏孢歐文氏桿菌Misawa等人(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172:6704-6712，和申請(qǐng)WO91/13078(GenBank入藏號(hào):L37405,X95596,D48420,X82458,S71770和M87280)；和從植物來(lái)源，包括玉米(Li等人(1996)植物分子生物學(xué)30:269-279)，番茄(Pecker等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4962-4966和Aracri等人(1994)植物生理學(xué)106:789)，和菜椒(燈籠椒)(Hugueney等人，(1992)生物化學(xué)雜志209:399-407),GenBank入藏號(hào)U37258,X59948,X78271，和X68058)分離了八氫番茄紅素脫飽和酶。通常參見(jiàn)Misawa等人(1990)細(xì)菌學(xué)雜志，172:6704-6712，歐洲專(zhuān)利0393690B1，美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,429.939,Bartely等人，(1992)生物化學(xué)雜志267:5036-5039,Bird等人(1991)生物技術(shù)9:635-639，和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,304,478，所有這些出版物引入本文作為參考。用早期類(lèi)胡蘿卜素基因(也稱(chēng)之為一級(jí)基因)轉(zhuǎn)化提高了類(lèi)胡蘿卜素途徑的生物合成活性，并且導(dǎo)致特定的類(lèi)胡蘿卜素例如α-和β-胡蘿卜素的產(chǎn)生增加。如在下面的實(shí)施例中更詳細(xì)描述的，通過(guò)表達(dá)作為一級(jí)基因的八氫番茄紅素合成酶，通常在轉(zhuǎn)化的植物的種子中獲得了類(lèi)胡蘿卜素含量大大增加，特別是α-和β-胡蘿卜素含量大大增加。從種子提取包括如此產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素的油類(lèi)以提供α-和β-胡蘿卜素的有價(jià)值的來(lái)源。這樣的油類(lèi)可用作為食品的色素，例如給人造黃油增加色素，或用作為食物油。具有高α-和β-胡蘿卜素含量的可食用的食物油對(duì)防止導(dǎo)致夜盲癥的維生素A缺乏是有利的。因此，轉(zhuǎn)化植物的產(chǎn)生和提供有用的食物油的高α-和β-胡蘿卜素油的提取在夜盲癥是普遍的問(wèn)題的區(qū)域例如在印度和亞洲是特別令人滿意的。除了高α-和β-胡蘿卜素含量以外，本文例舉的油類(lèi)中其它類(lèi)胡蘿卜素的含量也增加。例如，在來(lái)自于用八氫番茄紅素合成酶基因的植物的種子，以及來(lái)自于用GGPP合成酶基因轉(zhuǎn)化的植物的種子中葉黃素含量增加。此外，可以表達(dá)其它的一級(jí)基因以通過(guò)類(lèi)胡蘿卜素途徑提供更大的流出物。例如，在含有如上所述的八氫番茄紅素合成酶基因的油菜種子的油類(lèi)種子中，觀察到八氫番茄紅素的含量增加。因此，八氫番茄紅素脫飽和酶和番茄紅素合成酶的表達(dá)的增加導(dǎo)致所產(chǎn)生的類(lèi)胡蘿卜素例如α-和β-類(lèi)胡蘿卜素和葉黃素含量的進(jìn)一步增加。此外，表達(dá)番茄紅素合成酶和GGPP合成酶基因的植物是令人滿意的，并且通過(guò)將含有本文描述的這些基因的3390和3392植物進(jìn)行雜交可以產(chǎn)生。除了本文描述的類(lèi)胡蘿卜素的生產(chǎn)途徑以外，一旦通過(guò)表達(dá)一級(jí)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因或幾個(gè)基因已經(jīng)增加了生物合成活性，該途徑轉(zhuǎn)向生產(chǎn)特定的化合物。這樣的轉(zhuǎn)向涉及至少一個(gè)第二個(gè)有用基因(二級(jí)基因)的作用。二級(jí)基因可以編碼迫使特定的化合物產(chǎn)生的酶，或可選擇的是可以編碼終止該途徑以積累特定的化合物的基因。為了迫使產(chǎn)生特定的化合物，使用了編碼所需的類(lèi)胡蘿卜素化合物的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因在該途徑中表達(dá)。靶宿主植物的天然或外來(lái)的基因在所述的方法有用，包括例如來(lái)自于高等植物以外的來(lái)源例如細(xì)菌，包括歐文氏桿菌和紅色桿菌種類(lèi)的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因。為了終止該途徑以便積累特定的類(lèi)胡蘿卜素化合物，二級(jí)基因提供了抑制靶宿主植物的天然基因的轉(zhuǎn)錄的作用，其中由被抑制的基因編碼的酶能夠修飾所需的類(lèi)胡蘿卜素化合物。通過(guò)以該基因的有意義(共抑制)或反義方向轉(zhuǎn)錄被抑制的天然基因達(dá)到抑制。例如，為了使類(lèi)胡蘿卜素成分向高含量積累β-胡蘿卜素衍生的類(lèi)胡蘿卜素例如玉米黃質(zhì)，玉米黃質(zhì)二葡萄糖苷，阿拉伯黃質(zhì)和蝦青素的積累的方向改變，需要將番茄紅素ε-環(huán)化酶抑制以阻止α-胡蘿卜素和其衍生物類(lèi)胡蘿卜素，例如葉黃素的積累。與番茄紅素ε-環(huán)化酶抑制相結(jié)合，二級(jí)基因的表達(dá)增加對(duì)于特定的β-胡蘿卜素衍生的類(lèi)胡蘿卜素的積累的增加也是令人滿意的。例如，β-胡蘿卜素羥化酶表達(dá)的增加可用于產(chǎn)生玉米黃質(zhì)，而β-胡蘿卜素羥化酶和導(dǎo)入酮的酶的表達(dá)的增加可用于產(chǎn)生蝦青素。另一種可選的方法，為了積累番茄紅素，番茄紅素β環(huán)化酶或番茄紅素ε-環(huán)化酶和番茄紅素β環(huán)化酶的抑制對(duì)于降低番茄紅素轉(zhuǎn)變?yōu)棣?和β-胡蘿卜素是令人滿意的。本申請(qǐng)需要的二級(jí)基因包括但不限于用于生產(chǎn)玉米黃質(zhì)的β-胡蘿卜素羥化酶或crtZ(Hundle等人，(1993)FEBSLett.315:329-334,Genbank入藏號(hào)M87280)；編碼導(dǎo)入酮的酶的基因，例如ascrtW(Misawa等人(1995)細(xì)菌學(xué)雜志，177:6575-6584，和申請(qǐng)WO95/18220,WO96/06172)或β-C-4-加氧酶(crtO；Harker和Hirschberg(1997)FEBSLett.404:129-134)，用于生產(chǎn)阿拉伯黃質(zhì)；用于生產(chǎn)蝦青素的crtZ和crtW或crtO；用于生產(chǎn)葉黃素的ε-環(huán)化酶和ε-羥化酶；用于生產(chǎn)葉黃素和玉米黃質(zhì)的ε-羥化酶和crtZ；用于增加β-胡蘿卜素的產(chǎn)生的反義番茄紅素ε-環(huán)化酶(Genbank入藏號(hào)U50738)；用于生產(chǎn)番茄紅素的反義番茄紅素ε-環(huán)化酶和番茄紅素β-環(huán)化酶(Hugueney等人(1995)植物雜志8:417-424,CunninghamFXJr(1996)植物細(xì)胞8:1613-1626,Scolnik和Bartley(1995)植物生理學(xué)108:1343,Genbank入藏號(hào)X86452,L40176,X81787,U50739和X74599)；用于生產(chǎn)八氫番茄紅素的反義植物八氫番茄紅素脫飽和酶；等等。以這種方式，可以將該途徑進(jìn)行修飾以高產(chǎn)量地生產(chǎn)任何特定的需要的類(lèi)胡蘿卜素化合物。這樣的化合物包括但不限于α-玉米黃質(zhì)，β-玉米黃質(zhì)，ε-胡蘿卜素，六氫番茄紅素，四氫番茄紅素等等。利用本發(fā)明的方法，可以以高含量在所需要的種子中在類(lèi)胡蘿卜素途徑中生產(chǎn)需要的任何化合物。通過(guò)反義DNA序列轉(zhuǎn)化，可以將該途徑操作以降低特定的類(lèi)胡蘿卜素的含量，所述反義序列阻止化合物前體轉(zhuǎn)變?yōu)樘囟ǖ拇{(diào)節(jié)的類(lèi)胡蘿卜素。也可以選擇二級(jí)基因以改變植物的脂肪酸含量以生產(chǎn)特產(chǎn)油類(lèi)。例如，可以使用與特定的脂肪酸鏈長(zhǎng)度具有特異性的?；?ACP硫酯酶基因。參見(jiàn)例如USPN5,304,481；USPN5,455,167,WO95/13390,WO94/10288,WO92/20236,WO91/16421,WO97/12047和WO96/36719。其它所需的脂肪酸生物合成基因包括但不限于，β-酮?；?ACP合成酶(USPN5,510,255)，脂肪酰CoA合成酶(USPN5,455,947)，脂肪酰還原酶(USPN5,370,996)和硬脂酰-ACP脫飽和酶(WO91/13972)。特別有興趣的是使用倒捻子?；?ACP硫酯酶作為二級(jí)基因以修飾脂肪酸含量。如在WO96/36719和WO97/12047中描述的，通過(guò)表達(dá)倒捻子?；籄CP硫酯酶可以在種子中獲得高含量的硬脂酸鹽。為了將本文描述的高油酸特性的3390植物與描述于WO97/12047的5266高硬脂酸植物結(jié)合，將3390-1和5266-35之間和3390-1和5266-5之間進(jìn)行了雜交。從這些雜交產(chǎn)生的種子含有具有高硬脂酸，低亞油酸，低亞麻油酸和高類(lèi)胡蘿卜素表現(xiàn)型的油類(lèi)。本發(fā)明包括了用于生產(chǎn)包括一級(jí)基因或一級(jí)和二級(jí)基因的植物的方法。例如，可將所需的二級(jí)基因與一級(jí)基因(共轉(zhuǎn)化)同時(shí)用于轉(zhuǎn)化植物，將二級(jí)基因?qū)氲揭呀?jīng)用一級(jí)基因轉(zhuǎn)化的植物，或者另一種可選的方法，將表達(dá)一級(jí)基因和表達(dá)二級(jí)基因的轉(zhuǎn)化植物雜交以將兩種基因一起帶到相同的植物。通過(guò)將基因與組織特異性啟動(dòng)子結(jié)合，在植物的特定組織中可以改變類(lèi)胡蘿卜素的含量。因此，通過(guò)使用種子特異性轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域可以改變?cè)诜N子，包括胚和胚乳中的類(lèi)胡蘿卜素含量。這樣的區(qū)域公開(kāi)于例如美國(guó)專(zhuān)利5,420,034，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。以這種方式，轉(zhuǎn)化的種子提供了生產(chǎn)修飾的油類(lèi)的工廠?？梢允褂迷撔揎椀挠皖?lèi)，或者，可以分離油類(lèi)中的化合物。因此，本發(fā)明允許生產(chǎn)特定的所需的化合物以及特產(chǎn)油類(lèi)?？梢允褂帽磉_(dá)盒中的編碼所需酶的一級(jí)或二級(jí)基因以在轉(zhuǎn)化的植物組織中表達(dá)。為了改變所需植物的類(lèi)胡蘿卜素或脂肪酸含量，用至少一個(gè)包括連接到所需基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的表達(dá)盒轉(zhuǎn)化植物。這樣的表達(dá)盒提供了許多個(gè)限制性位點(diǎn)以便插入的基因處于調(diào)節(jié)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)控制下。轉(zhuǎn)錄起始可以是天然的，或類(lèi)似于宿主，或?qū)λ拗鞫允峭庠吹幕虍愒吹?。“外源”是指在將要?dǎo)入轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的野生型宿主中不存在轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。與儲(chǔ)藏蛋白質(zhì)例如napin,cruciferin,β-conglycinin，菜豆蛋白等等和涉及脂肪酸生物合成的蛋白質(zhì)例如?；d體蛋白質(zhì)(ACP)相關(guān)的那些轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域是特別需要的。參見(jiàn)，美國(guó)專(zhuān)利5,420,034，引入本文作為參考。從5’-3’轉(zhuǎn)錄方向，該轉(zhuǎn)錄盒將包括轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯起始區(qū)域，需要的DNA序列，和在植物中有作用的轉(zhuǎn)錄和作用終止區(qū)域。終止區(qū)域可以是天生具有轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域的，可以天生具有所需的DNA序列，或可以來(lái)源于另一個(gè)來(lái)源。便利的終止區(qū)域是從根癌土壤桿菌的Ti質(zhì)粒獲得的，例如章魚(yú)堿合成酶和胭脂堿合成酶終止區(qū)域。參見(jiàn)，例如Guerineau等人，(1991),Mol.Gen.Genet.,262:141-144；Proudfoot,(1991)，細(xì)胞，64:671-674；Sanfacon等人，(1991)，基因發(fā)展，5:141-149；Mogen等人，(1990)，植物細(xì)胞，2:1261-1272；Munroe等人，(1990)，基因，91:151-158；Ballas等人，(1989)，核酸研究，17:7891-7903；Joshi等人，(1987)，核酸研究，15:8627-9639。在大多數(shù)情況下，將本發(fā)明的所需基因用于靶擊質(zhì)體，例如葉綠體以便表達(dá)。以這種方式，當(dāng)沒(méi)有將所需的基因直接插入到質(zhì)體時(shí)，表達(dá)盒還含有編碼轉(zhuǎn)運(yùn)肽的基因以指導(dǎo)所需基因到質(zhì)體。這樣的轉(zhuǎn)運(yùn)肽是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的。參見(jiàn)，例如VonHeijne等人，(1991)植物分子生物學(xué)報(bào)道，9:104-126；Clark等人，(1989)生物化學(xué)雜志，264:17544-17550；della-Cioppa等人，(1987)植物生理學(xué)84:965-968；Romer等人(1993)生物化學(xué)和生物物理學(xué)研究通訊196:1414-1421；和Shah等人，(1986)科學(xué)233:478-481，用于本發(fā)明的植物類(lèi)胡蘿卜素基因可以使用天然的或異源的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。注意到，當(dāng)所需的基因或DNA序列是反義DNA，靶擊質(zhì)體是不需要的。構(gòu)建體也可以包括任何其它必要的調(diào)節(jié)子例如植物轉(zhuǎn)譯共有序列(Joshi,C.P.,(1987)，核酸研究，15:6643-6653)，可操作連接到所需的核苷酸序列的內(nèi)含子(Luehrsen和Walbot,(1991),Mol.Gen.Genet.,255:81-93)等等。在表達(dá)盒構(gòu)建體中包括5’引導(dǎo)序列是有利的。這樣的引導(dǎo)序列具有加強(qiáng)轉(zhuǎn)譯的作用。轉(zhuǎn)譯引導(dǎo)序列是本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的，并且包括細(xì)小核糖核酸病毒引導(dǎo)序列，例如，EMCV引導(dǎo)序列(腦心肌炎病毒5’非編碼區(qū)域)(Elory-Stein,O.Fuerst,T.R.和Moss,B.(1989)PNASUSA86:6126-6130)；poty病毒引導(dǎo)序列，例如TEV引導(dǎo)序列(煙草Etch病毒)(Allison等人，(1986)；MDMV引導(dǎo)序列(玉米矮狀花葉病毒)；病毒學(xué)，154:9-20)，人免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白質(zhì)(BiP),(Macejak,D.G.，和Samow,P.,(1991)，自然，353:90-94；來(lái)自于苜蓿花葉病毒的mRNA的包被蛋白質(zhì)的未轉(zhuǎn)譯的引導(dǎo)序列(AMVRNA4),(Jobling,S.A.和Gehrke,L.(1987)，自然，325:622-625)；煙草花葉病毒引導(dǎo)序列(TMV)，(Gallie,D.R.等人(1989),RNA分子生物學(xué))，第237-256；和玉米黃萎病斑駁病病毒引導(dǎo)序列(MCMV)(Lommel,S.A.等人，(1991)，病毒學(xué)，81:382-385。也參見(jiàn)，Della-Cippoa等人，(1987)，植物生理學(xué)，84:965-968)。根據(jù)當(dāng)所需的DNA序列將要表達(dá)時(shí)，合成具有植物優(yōu)選密碼子的序列或者具有葉綠體優(yōu)選的密碼子的序列是令人滿意的。植物優(yōu)選密碼子可以由以最大量在所需的特定的植物種類(lèi)中表達(dá)的蛋白質(zhì)最高頻率的密碼子決定。參見(jiàn)，EPA0359472；EPA0385962；WO91/16432；Perlak等人，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:3324-3328；和Murray等人，(1989)核酸研究17:477-498。以這種方式，將核苷酸序列改變?yōu)樽钸m合在任何植物中表達(dá)。將所有或任何部分的基因序列最佳化或合成是已知的。就是說(shuō)，合成的或部分最佳化的序列也可以使用，為了構(gòu)建葉綠體優(yōu)選的基因，參見(jiàn)USPN5,545,817。在制備轉(zhuǎn)錄表達(dá)盒時(shí)，對(duì)各個(gè)DNA片段進(jìn)行操作以便提供正確方向和如果合適的話，正確的閱讀框架的DNA序列。向著末端的方向，可以使用連接物或接頭以連接DNA片段或可以使用其它操作以提供便利的限制性位點(diǎn)，去除超流動(dòng)性的DNA，去除限制性位點(diǎn)等等。為了該目的，也可以使用體外誘變，引物修復(fù)，限制性，退火，切除，連接等等，其中可以涉及插入，缺失或替代，例如轉(zhuǎn)運(yùn)和易位?？梢砸栽S多的本領(lǐng)域內(nèi)已知的方式將本發(fā)明的重組DNA分子導(dǎo)入到植物細(xì)胞。本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到方法的選擇取決于植物類(lèi)型，即單子葉或雙子葉，轉(zhuǎn)化的靶。轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的合適的方法包括微注射(Crossway等人，(1986)生物技術(shù)4:320-334)，電擊穿(Riggs等人，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:5602-5606，土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化(Hinchee等人，(1988)生物技術(shù)6:915-921)和彈粒加速(參見(jiàn)，例如Sanford等人，美國(guó)專(zhuān)利4,945,050；和McCabe等人，(1988)生物技術(shù)6:923-926)，也參見(jiàn)Weissinger等人，(1988)遺傳學(xué)綜述年度報(bào)告22:421-477；Sanford等人，(1987)顆粒科學(xué)和技術(shù)5:27-37(onion)；Christou等人，(1988)植物生理學(xué)，87:671-674(大豆)；McCabe等人(1988)生物技術(shù)6:923-926(大豆)；Datta等人，(1990)生物技術(shù)8:736-740(水稻)；Klein等人，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)生物技術(shù)6:559-563(玉米)；Klein等人，(1988)植物生理學(xué)91:440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)生物技術(shù)8:833-839；和Gordon-Kamm等人，(1990)植物細(xì)胞2:603-618(玉米)。另一種可選的方法，可以直接轉(zhuǎn)化植物質(zhì)體。在高等植物中已經(jīng)報(bào)道了葉綠體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，參見(jiàn)，例如SVAB等人，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:8526-8530；SVAB&Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:913-917；Staub&Maliga(1993)EMBOJ.12:601-606。該方法依賴(lài)于含有選擇性標(biāo)記物的DNA的粒子槍的傳遞以及通過(guò)同源重組將該DNA靶擊到質(zhì)體基因組。在所述方法中，通過(guò)使用質(zhì)體基因啟動(dòng)子或通過(guò)反式激活靜止質(zhì)體產(chǎn)生的定位是便于從例如由T7RNA聚合酶識(shí)別的選擇性啟動(dòng)子序列表達(dá)的轉(zhuǎn)基因可以完成質(zhì)體基因表達(dá)。通過(guò)從核表達(dá)構(gòu)建體表達(dá)特定的RNA聚合酶并且利用轉(zhuǎn)運(yùn)肽將聚合酶靶擊到質(zhì)體可以激活靜止質(zhì)體基因。通過(guò)使用從合適的植物組織特異性啟動(dòng)子表達(dá)的核編碼的和特異于質(zhì)體的特異性RNA聚合酶可以以這樣的方法獲得組織特異性表達(dá)。這樣的系統(tǒng)已經(jīng)在McBride等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:7301-7305報(bào)導(dǎo)。根據(jù)常規(guī)方式可以將已經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞生長(zhǎng)為植株。參見(jiàn)，例如，McCormick等人，植物細(xì)胞報(bào)告(1986),5:81-84。然后將這些植物生長(zhǎng)，或者用相同的轉(zhuǎn)化的株系或不同的株系授粉，并且鑒別具有所需的表現(xiàn)型特性的獲得的雜種。生長(zhǎng)2或多代以確保穩(wěn)定地保持個(gè)體的表現(xiàn)型特性并且遺傳，然后收獲種子以確保已經(jīng)獲得的所需的表現(xiàn)型或其它特性。作為宿主細(xì)胞，可以使用任何植物品種。提供所需種子的植物品種是特別需要的。對(duì)于大多數(shù)情況，選擇產(chǎn)生高產(chǎn)量的種子的植物，包含的所需的種子特異性產(chǎn)物，或種子或種子部分是可食用的。所需的種子包括油類(lèi)種子，例如油類(lèi)種子油菜種子，棉花種子，大豆，紅花，太陽(yáng)花，椰子，棕櫚等等；谷物種子，例如，小麥，大麥，燕麥，莧，亞麻，蕎麥，triticale，水稻，玉米等等；其它可食用種子或具有可食用部分的種子包括西葫蘆，南瓜，芝麻，罌粟，葡萄，綠豆，花生，豌豆，菜豆，小蘿卜，苜蓿，可可，咖啡，樹(shù)結(jié)的堅(jiān)果例如胡桃，杏仁，山核桃，鷹嘴豆等等。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，種子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域與至少一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因結(jié)合使用。這增加了類(lèi)胡蘿卜素途徑的活性，并且改變了轉(zhuǎn)化的種子中的類(lèi)胡蘿卜素含量。以這種方式，可以選定特定的基因以促進(jìn)所需化合物的形成。當(dāng)選擇的基因是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因時(shí)，由于通過(guò)該途徑的流出物增加，轉(zhuǎn)化的種子的類(lèi)胡蘿卜素生物合成顯著增加。對(duì)于，用早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化的油菜種子，獲得了α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素的產(chǎn)生顯著增加并且在種子油類(lèi)中葉黃素以及改變的油類(lèi)脂肪酸成分增加較小。當(dāng)早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因是八氫番茄紅素合成酶時(shí)，特定的類(lèi)胡蘿卜素的顯著增加包括10-50倍的范圍內(nèi)的增加，優(yōu)選的是至少50-100倍的增加，更優(yōu)選的是，至少50-200倍的增加，例如在α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素含量的增加所看到的。在這種情況下，葉黃素含量也增加了，但是獲得了1.5-2倍的較低的增加。同時(shí)，總類(lèi)胡蘿卜素含量可以增加至少10-25倍，優(yōu)選的是25-60倍，更優(yōu)選的是增加25-100倍。因此，用八氫番茄紅素合成酶基因轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的種子其α-和β-胡蘿卜素和總類(lèi)胡蘿卜素有本質(zhì)上的增加，以及葉黃素和其它類(lèi)胡蘿卜素有較小的增加。在某些情況下，對(duì)于給定的類(lèi)胡蘿卜素化合物，對(duì)增加的倍數(shù)進(jìn)行定量測(cè)定是不可能的，因?yàn)槠浜刻鸵灾掠诓荒茉诜寝D(zhuǎn)化植物的種子中檢測(cè)。對(duì)于例如歐洲油菜的情況，在用crtB基因轉(zhuǎn)化的種子中檢測(cè)到各種含量的α-玉米黃質(zhì)，番茄紅素，八氫番茄紅素和六氫番茄紅素，但是在未轉(zhuǎn)化的歐洲油菜植物的種子中沒(méi)有檢測(cè)到。當(dāng)早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因是GGPP合成酶時(shí)，葉黃素和β-胡蘿卜素可以獲得1.5-2倍的增加。在用crtE(GGPP合成酶)基因轉(zhuǎn)化的歐洲油菜植物種子中也可以檢測(cè)到番茄紅素。在這種情況下總的類(lèi)胡蘿卜素也增加約2倍。因此，已經(jīng)進(jìn)行遺傳工程加工以表達(dá)增加含量的八氫番茄紅素和GGPP合成酶的植物是類(lèi)胡蘿卜素的有用的來(lái)源。通過(guò)用第二基因轉(zhuǎn)化，用早期類(lèi)胡蘿卜素基因轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)的代謝能量可以匯集到選定的代謝化合物。如上討論的，通過(guò)啟動(dòng)所需的類(lèi)胡蘿卜素的形成或另一種可選的方法通過(guò)將該途徑終止以允許建立化合物，將第二基因設(shè)計(jì)為啟動(dòng)特定的類(lèi)胡蘿卜素的合成。因此，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的種子中可以產(chǎn)生所需的顯著量的類(lèi)胡蘿卜素。已經(jīng)用一級(jí)早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的種子也提供了新的油類(lèi)成分的來(lái)源。八氫番茄紅素合成酶用作為一級(jí)基因，例如導(dǎo)致種子油類(lèi)中油酸含量本質(zhì)上增加。而本質(zhì)上增加是指從約5％到約40％，具體是從約20％到約40％，更具體地說(shuō)從約30％到約40％的增加。因此，已經(jīng)用一級(jí)早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化的本發(fā)明的種子提供了具有高油酸含量的修飾的油類(lèi)的來(lái)源。就是說(shuō)，可以將類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因，特別是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因用于生產(chǎn)重量百分?jǐn)?shù)具有至少70％油酸的種子。通過(guò)本發(fā)明可以改變?nèi)魏畏N子中油酸含量，即使這些種子天然具有高油酸含量。通過(guò)本發(fā)明對(duì)天然具有高油酸含量的種子的改變可以導(dǎo)致總油酸含量高至80％。重要的是，亞油酸和亞麻油酸含量也降低。而亞油酸脂肪酸含量的降低從約10％到25％，優(yōu)選從約25％到約40％，更優(yōu)選的是從約35％到約60％。而亞麻油酸含量的降低是指從約10％到約30％，優(yōu)選的是約30％到約60％，更優(yōu)選的是約50％到約75％。因此，本發(fā)明的方法導(dǎo)致產(chǎn)生比天然存在的油類(lèi)更具有氧化穩(wěn)定性的油類(lèi)。本發(fā)明的修飾的油類(lèi)是低飽和的，高油酸和低亞麻油酸的。此外，本發(fā)明提供了單不飽和脂肪酸含量高的油類(lèi)，它作為可食用成分是重要的。基于本文公開(kāi)的方法，可以將種子油類(lèi)進(jìn)行修飾以將油類(lèi)加工為高油酸含量和高含量的所需的類(lèi)胡蘿卜素。高油酸和高α-和β-胡蘿卜素油類(lèi)具有較長(zhǎng)的半壽期，因?yàn)橛退岷挺?和β-胡蘿卜素含量提供穩(wěn)定性。也注意到這樣的油類(lèi)作為類(lèi)胡蘿卜素的來(lái)源比天然的紅棕櫚油是更令人滿意的，該油類(lèi)含有高含量的飽和的脂肪酸。因此本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的種子提供了類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)物以及修飾的脂肪酸的來(lái)源。當(dāng)計(jì)劃生產(chǎn)所需的特定的類(lèi)胡蘿卜素化合物時(shí)，可以利用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的方法用于純化類(lèi)胡蘿卜素化合物。以相同的方式，可以利用本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員可獲得的方法生產(chǎn)從油類(lèi)純化的類(lèi)胡蘿卜素。通常參見(jiàn)，WO96/13149和Favati等人，(1988)食品科學(xué)雜志53:1532和這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。除了種子中類(lèi)胡蘿卜素含量改變以外，可以改變維生素E的含量，優(yōu)選的是增加。具有維生素E，特別是α-維生素E含量增加這樣的種子是令人滿意的，因?yàn)棣?維生素E是維生素E家屬的最重要的形式。維生素E對(duì)人類(lèi)和其它動(dòng)物的營(yíng)養(yǎng)是必要的。根據(jù)在體內(nèi)具有保持紅血細(xì)胞的完整性的功能，如在細(xì)胞的呼吸中是必要的維生素E，參與了DNA的生物合成，并且作為具有保護(hù)細(xì)胞免受致癌物作用的抗氧化劑可以獲得證據(jù)。因此，具有增加的維生素E含量的種子和油類(lèi)是令人滿意的。本發(fā)明提供了α-維生素E含量具有將近50％的增加的油類(lèi)，使用本發(fā)明的方法可以使種子油類(lèi)具有更高的增加，直到2-5倍。另外發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化的種子和胚胎可用作為可篩選的標(biāo)記物。就是說(shuō)，由于類(lèi)胡蘿卜素含量增高的結(jié)果，基于顏色通過(guò)目測(cè)可以決定和選擇轉(zhuǎn)化的種子和胚胎。轉(zhuǎn)化的種子或胚胎由于類(lèi)胡蘿卜素含量增高顯示從黃色到桔黃色到紅色范圍內(nèi)的顏色。因此，當(dāng)植物轉(zhuǎn)化方法涉及胚胎發(fā)生階段，例如在對(duì)于棉花或大豆的轉(zhuǎn)化，可以將類(lèi)胡蘿卜素基因作為標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)化試驗(yàn)以允許目測(cè)選擇轉(zhuǎn)化體。另外，如下面的實(shí)施例中進(jìn)一步描述的，易于鑒定分離的種子。為了描述而不是為了限制提供下面的實(shí)施例。試驗(yàn)實(shí)施例Ⅰ表達(dá)構(gòu)建體和植物轉(zhuǎn)化A．噬夏孢歐文氏桿菌類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因與SSU的融合體(1)八氫番茄紅素合成酶通過(guò)PCR將SSU引導(dǎo)序列和crtB基因序列連接。SSU/crtB融合體的序列顯示于附圖1。如下所述將從核苷酸5057到5363(根據(jù)Misawa等人(1990)(見(jiàn)上文)的編號(hào))的crtB基因與SSU引導(dǎo)序列連接。在SSU引導(dǎo)序列起始位點(diǎn)的上游包含BglⅡ位點(diǎn)以便有助于克隆。在crtB的5057位的核苷酸胸腺嘧啶被改變?yōu)橄汆堰室栽赟SU引導(dǎo)序列/crtB接點(diǎn)處制備第一個(gè)氨基酸甲硫氨酸，和拼接位點(diǎn)cys-met-asn。SSU的天然拼接位點(diǎn)是cys-met-gln。注意Misawa等人(1990)(見(jiàn)上文)指出crtB的編碼序列的起始位點(diǎn)是在核苷酸5096。因此，在crtB的編碼序列的公開(kāi)的位點(diǎn)的上游和在crtB/SSU融合體的SSU拼接位點(diǎn)之后有13個(gè)氨基酸。從歐文氏桿菌crtB上游序列轉(zhuǎn)譯的這些氨基酸中的12個(gè)和增加了一個(gè)是甲硫氨酸。然后將從5363(EcoRⅤ)到6009(EcoRⅠ)的crtB結(jié)合到SSU-crtB融合體以獲得完整的SSU-crtB融合體構(gòu)建體，將該構(gòu)建體命名為pCGN3373(附圖1)。(2)八氫番茄紅素脫飽和酶Misawa等人(植物雜志(1993)4:833-840)描述了包含融合到Rubisco豆的小亞單位的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列的噬夏孢歐文氏桿菌crtI基因的質(zhì)粒。將含有SSU-crtI融合體和nos3’終止區(qū)域的該質(zhì)粒的約2.1kb的XbaⅠ/EcoRⅠ片段克隆到從napin5’啟動(dòng)子表達(dá)的位置。(3)GGPP合成酶獲得了含有融合到噬夏孢歐文氏桿菌crtE基因的SSU轉(zhuǎn)運(yùn)肽的類(lèi)似的構(gòu)建體。pCGN3360的約1.2片段的BglⅡ/BamHⅠ片段上存在SSU-crtE融合體。B．用于植物轉(zhuǎn)化的表達(dá)構(gòu)建體(1)八氫番茄紅素合成酶用BglⅡ和BamHⅠ切割攜帶整個(gè)SSU/crtB融合體的pCGN3373以切除SSU/crtB融合體。將獲得的片段連接到pCGN3223的napin表達(dá)盒的BamHⅠ位點(diǎn)(參見(jiàn)WO94/10288描述了napin表達(dá)盒)。用HindⅢ消化獲得的構(gòu)建體pCGN3389以切除napin5’-SSU/crtB-napin3’片段，然后將它克隆到HindⅢ裂解的pCGN1559PASS，產(chǎn)生pCGN3390。pCGN1559PASS是用于土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的兩性載體例如由McBride等人描述的(植物分子生物學(xué)(1990)14:269-276)和通過(guò)用含有下面的限制性消化位點(diǎn)Asp718/AscⅠ/PacⅠ/XbaⅠ/BamHⅠ/SwaⅠ/Sse8387(PstI)/HindⅢ的接頭區(qū)域替代pCGN1559接頭區(qū)域從pCGN1559制備。在附圖2A提供了pCGN3390的圖譜。(2)八氫番茄紅素脫飽和酶將如上所述的包括napin5’/SSU-crtⅠ融合體/nos3’構(gòu)建體的片段克隆到用于植物轉(zhuǎn)化的兩性載體，導(dǎo)致產(chǎn)生pCGN9010。在附圖2C提供了pCGN9010的圖譜。(3)GGPP合成酶用BglⅡ和BamHⅠ切割攜帶整個(gè)SSU/crtE融合體的pCGN3360以切除SSU/crtE融合體。將獲得的1.2kb的片段連接到pCGN3223的napin表達(dá)盒的BamHⅠ位點(diǎn)。用HindⅢ消化獲得的構(gòu)建體pCGN3391以切除napin啟動(dòng)子-SSU/crtE/napin3’片段，然后將它克隆到HindⅢ裂解的pCGN1559PASS，產(chǎn)生pCGN3392。在附圖2B提供了pCGN3392的圖譜。(4)八氫番茄紅素合成酶十八氫番茄紅素脫飽和酶將來(lái)自于pCGN3389的napin5’-SSU/crtB-napin3’片段和存在于pCGN9010的napin5’/SSU-crtⅠ融合體/nos3’片段插入到兩性載體，導(dǎo)致產(chǎn)生pCGN9009，顯示于附圖2D。(5)反義ε-環(huán)化酶+八氫番茄紅素合成酶通過(guò)PCR，利用從鼠耳芥ε-環(huán)化酶基因設(shè)計(jì)的引物分離歐洲油菜ε-環(huán)化酶基因(CunnunghamFXJr(1996)植物細(xì)胞8:1613-1626)。在附圖9(克隆9-4)和10(克隆7-6)提供了歐洲油菜ε-環(huán)化酶基因的序列。通過(guò)cDNA克隆9-4的XhoⅠ/BamHⅠ片段克隆到用XhoⅠ和BglⅠ消化的napin表達(dá)盒(pCGN3233)制備反義構(gòu)建體。將napin5’-反義ε-環(huán)化酶-napin3’片段與napin5’-SSU/crtB-napin3’片段一起克隆到兩性載體用于植物轉(zhuǎn)化，獲得的pCGN9002顯示了附圖2E。(6)反義β-環(huán)化酶十八氫番茄紅素合成酶通過(guò)PCR，利用從鼠耳芥β-環(huán)化酶基因設(shè)計(jì)的引物分離歐洲油菜β-環(huán)化酶基因(CunnunghamFXJr(1996)植物細(xì)胞8:1613-1626)。在附圖11提供了歐洲油菜β-環(huán)化酶cDNA32-3的序列。通過(guò)將β-環(huán)化酶cDNA克隆克隆到用XhoⅠ消化的napin表達(dá)盒(pCGN3223)制備反義構(gòu)建體。選擇以反義方向含有β-環(huán)化酶的克隆。將napin5’-反義β-環(huán)化酶-napin3’片段與napin5’-SSU/crtB-napin3’片段一起克隆到兩性載體用于植物轉(zhuǎn)化，獲得的pCGN9017顯示了附圖2F。C．植物轉(zhuǎn)化如Radke等人，(應(yīng)用遺傳學(xué)理論(1988)75:685-694和植物細(xì)胞報(bào)告(1992)11:499-505)的描述獲得了含有如上所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)化的歐洲油菜。實(shí)施例2轉(zhuǎn)基因植物的分析A．目測(cè)觀察和分離比例在開(kāi)花期后21天，28天和35天對(duì)212/86的napin-SSU引導(dǎo)序列/crtB植物進(jìn)行標(biāo)記。當(dāng)在28天收獲第一個(gè)植株3390-1時(shí)，一些種子明顯呈桔黃色。AT35dpa，桔黃色是明顯的，足以獲得分離比例。桔黃色種子的這種趨勢(shì)已經(jīng)繼續(xù)被看到，并且在已經(jīng)獲得的收獲的17個(gè)品系的各種中看到。下面的表1顯示分離比例一覽表。表1B．發(fā)育的種子的類(lèi)胡蘿卜素分析如下所述開(kāi)花期后約35天從收獲的種子提取類(lèi)胡蘿卜素。在200微升的70％丙酮/30％甲醇中研磨轉(zhuǎn)基因植株3390-1的桔黃色種子的8個(gè)種子樣品和212/86品種油菜對(duì)照植株的8個(gè)種子樣品。然后將研磨的種子混合物在離心機(jī)旋轉(zhuǎn)約5分鐘并且去除上清液。用沉淀的種子材料進(jìn)行另外兩次的70％丙酮/30％甲醇提取并且收集所有上清液合并并且標(biāo)記為A/M提取物。在提取過(guò)程的此時(shí)，對(duì)照種子沉淀是白色的，而轉(zhuǎn)基因種子的種子沉淀具有桔黃色。然后將沉淀用醚提取兩次并且合并獲得的上清液和標(biāo)記為E提取物。然后如下所述將A/M提取物轉(zhuǎn)移到醚。向提取物加入450微升醚和600微升的水，隨后去除醚層。然后用400微升的醚將A/M提取物洗滌兩次以上，合并來(lái)自于三個(gè)A/M洗液的醚組分。用400微升的水將如上所述的E提取物洗滌并且與A/M醚組分合并。用氮?dú)鈱⒑喜⒌拿呀M分吸脹到體積為約300微升并且用注射用微過(guò)濾器過(guò)濾。用約100微升醚浸洗樣品小管并且類(lèi)似地將浸洗液過(guò)濾并且與起始濾液合并。此時(shí)總體積為約150微升。將50微升的樣液儲(chǔ)藏于-20℃直到用于進(jìn)一步分析，如下所述將獲得的100微升樣品皂化。將溶于甲醇的100微升的10％的氫氧化鉀(KOH)加入到各個(gè)100微升的樣品并且將該混合物在黑暗的室溫下儲(chǔ)藏約2小時(shí)。然后將400微升的水加入到該樣品，去除醚相。為了進(jìn)行更好的醚分離，用飽和的氯化鈉替代水。然后用100微升的醚提取該水溶液2次以上，合并醚樣品并且用水洗滌。然后在RaininmicrosorbC18柱(25厘米長(zhǎng)度，4.6毫米外部直徑)上，以每分鐘1.5毫升的流速，通過(guò)HPLC分析方法對(duì)皂化的樣品進(jìn)行分析。用于洗脫的梯度如下A=乙腈B=己烷/二氯甲烷(1∶1)C=甲醇起始溶液是70∶20∶10(A∶B∶C)。在2.5分鐘時(shí)該溶液在5分鐘內(nèi)蔓延為65∶25∶10(A∶B∶C)并且在12.5分鐘內(nèi)保持該狀況。然后在2分鐘內(nèi)該溶液蔓延為70∶20∶10(A∶B∶C)，隨后在注射下一次樣品之前延遲3分鐘。在450和280納米處連續(xù)監(jiān)測(cè)洗脫樣品的吸收值并且使用已知的化學(xué)和生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)以鑒別各種吸收峰。在附圖3和4，分別提供對(duì)照和pCGN3390轉(zhuǎn)化種子的皂化的樣品的分析結(jié)果。觀察到轉(zhuǎn)基因植株種子的α-和β-胡蘿卜素和八氫番茄紅素的含量明顯增加，以及羥基化的類(lèi)胡蘿卜素，葉黃素的含量增加較小。C．crtB轉(zhuǎn)基因植株的成熟的種子的類(lèi)胡蘿卜素和維生素E分析將成熟的3390T2種子送到分析實(shí)驗(yàn)室利用本領(lǐng)域內(nèi)已知的標(biāo)準(zhǔn)的HPLC方法進(jìn)行定量分析。這些分析的結(jié)果顯示于下面的表2?；衔锖恳晕⒖?克表示?；诜N子的顏色選擇命名為“醬紫色(Maroon)”的種子。與該品種的野生型植株的種子的棕黑色外形相反，具有桔黃色胚的種子在成熟時(shí)顯示紫醬色。根據(jù)顏色不能選擇的種子命名為“Random”。因?yàn)閷?duì)于Kan,3390-1分離為3∶1,“Random”群體包括無(wú)效比例。紫醬色群體僅含有轉(zhuǎn)基因。由于從該群體排除無(wú)效的嘗試，包含純合體是有利的。表2*nd=未檢測(cè)在非轉(zhuǎn)基因的樣品中，“其它”包括大多數(shù)非常極性的化合物，例如新黃質(zhì)，紫黃質(zhì)等等。在轉(zhuǎn)基因的樣品中，“其它”包括這些和另外的化合物，例如δ-胡蘿卜素，鏈孢紅素和單環(huán)化的類(lèi)胡蘿卜素。附圖12列出了來(lái)自于歐洲油菜品種Quantum(SP30021)的轉(zhuǎn)化植株的3390T2種子的類(lèi)胡蘿卜素分析的結(jié)果。附圖13列出了來(lái)自于歐洲油菜品種212/86(SP001)的轉(zhuǎn)化植株的3390T3種子的類(lèi)胡蘿卜素分析的結(jié)果。上述結(jié)果顯示由于crtB基因表達(dá)的結(jié)果成熟種子中α-和β-胡蘿卜素的含量顯著增加。通常，類(lèi)胡蘿卜素總體的增加是非常高的，對(duì)于著色的類(lèi)胡蘿卜素如果包括八氫番茄紅素和六氫番茄紅素，近乎50倍，和高達(dá)60倍。顯然通過(guò)類(lèi)異戊二烯途徑的流出物已經(jīng)急劇增加。另外，注意到α-維生素E(維生素E)含量也增加近乎50％。D．繁殖研究將10個(gè)3390-1的成熟的種子和10個(gè)212/86對(duì)照的種子種植于土壤，在大的人能穿過(guò)的生長(zhǎng)室內(nèi)生長(zhǎng)。轉(zhuǎn)基因的種植比對(duì)照晚1-2天出現(xiàn)，但是，所有10個(gè)種子發(fā)芽。當(dāng)它們開(kāi)始出現(xiàn)時(shí)，轉(zhuǎn)基因植株是淡粉色，但是1-2天以后變?yōu)榫G色。在第一片真葉出現(xiàn)時(shí)，沒(méi)有觀察到顏色的不同。從轉(zhuǎn)基因和對(duì)照種子生長(zhǎng)的植株正常發(fā)育。E．脂肪酸分析通過(guò)從轉(zhuǎn)基因植株3390-1和3390-8收獲的單個(gè)T2種子的GC分析測(cè)定成熟種子的脂肪酸成分。對(duì)從Random(R)和Maroon(M)(如上定義)群體獲得的單個(gè)種子進(jìn)行分析并且與從212/86對(duì)照(SP001-1)獲得的種子比較。下面的表3提供了這些分析的結(jié)果，以％重量表示總的脂肪酸量。表33390-1和3390-8品系的脂肪酸成分</tables>上述資料顯示來(lái)自于各個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的種子的油酸(18∶1)有本質(zhì)上的增加。油酸的增加是亞油酸和亞麻油酸消耗的結(jié)果，在轉(zhuǎn)基因品系中這兩者的量降低。也觀察到18∶0和20∶0脂肪酸增加?；谶@些資料，可以鑒別在Random群體中存在的無(wú)效種子并且在表3中用星號(hào)(*)標(biāo)記。來(lái)自于各個(gè)轉(zhuǎn)基因品系的所有Maroon群體的種子有觀察到的改變的脂肪酸成分，證實(shí)改變的脂肪酸成分是crtB基因表達(dá)的結(jié)果。附圖5-7提供了在轉(zhuǎn)基因種子中的脂肪酸成分資料的趨勢(shì)，這種趨勢(shì)指明了脂肪酸成分的變化與觀察到的18∶1含量的增加的正負(fù)關(guān)系。18∶1的增加與18∶2和18∶3的降低相關(guān)(附圖5)。18∶1增加也與18∶0和20∶0的增加相關(guān)，但是對(duì)16∶0的作用幾乎沒(méi)有看到(附圖6)。18∶0的增加也與20∶0的增加相關(guān)(附圖7)。F．來(lái)自于crtE轉(zhuǎn)基因植株的成熟種子的類(lèi)胡蘿卜素分析在被轉(zhuǎn)化的成熟的3392歐洲油菜植株的T2種子中分析類(lèi)胡蘿卜素以表達(dá)噬夏孢歐文氏桿菌crtE基因。在植株3392-SP30021-16的種子中觀察到葉黃素和β-胡蘿卜素的含量增加約2倍。在這些種子中也檢測(cè)到番茄紅素和在未轉(zhuǎn)化的對(duì)照植株的種子中沒(méi)有檢測(cè)到。對(duì)來(lái)自于另外的3392轉(zhuǎn)化體的種子進(jìn)行分析沒(méi)有顯示類(lèi)胡蘿卜素含量有顯著的增加。實(shí)施例3crtB植株的雜交A．轉(zhuǎn)基因油類(lèi)的特性為了評(píng)估napin-crtB轉(zhuǎn)基因植株的高油酸特性以及所表達(dá)的其它油類(lèi)特性，制備3390-1-6-8與山竹果硫酯酶(5266)和肉豆蔻硫酯酶(3854；參見(jiàn)WO96/23892)的雜交。將兩個(gè)低亞油酸(LPOO4和LP30108)品種制備雜交。對(duì)分離的種子進(jìn)行類(lèi)胡蘿卜素和脂肪酸成分的半種子分析，下面的表4和5顯示了平均半種子值。表4從3390雜交獲得的半種子的類(lèi)胡蘿卜素含量雜交葉黃素番茄紅素α-胡蘿卜素β-胡蘿素總數(shù)F13390-SP001-1-6-8×SP3002121.626.2271.5413.1732F13390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-5-2618.021.7187.9284.1511F13390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-35-216.222.1223.0318.4579F13390-SP001-1-6-8×5266-SP30021-35-1219.522.9196.8312.8552F13390-SP001-1-6-8×LP30108-1923.722.7213.4355.0614F1LP30108-19×F13390-SP001-1-6-816.419.6156.7224.5417表5從3390雜交獲得的半種子的脂肪酸成分菌株_1D％14∶0％16∶0％18∶0％18∶1％18∶2％18∶3％20∶0(3390-SP001-1-6-8X0.053.551.7074.7811.295.710.73SP30021)(3390-SP001-1-6-8X0.063.8411.3762.8611.065.083.385266-SP30021-35-12)(3390-SP001-1-6-8X0.063.6811.2764.809.815.163.045266-SP30021-35-2)3390-SPOO1-1-6-8X0.063.6615.3660.789.304.773.875266-SP30021-5-26(3390-SP001-1-6-1X2.699.803.6564.629.724.571.513854-SP30021-20-3)(3390-SP001-1-6-1X6.1416.355.1254.918.234.232.033854-SP30021-20-1)(3390-SP001-1-6-1X0.073.8211.6764.5211.463.143.085266-LP004-2-31)(3390-SP001-1-6-8X0.053.801.4473.6614.023.930.67LP30108-19)(LP30108-19X0.043.311.7979.699.262.970.753390-SP001-1-6-8)SPOO1-4-100.074.440.9956.0621.7914.310.443390-SPOO1-1-6-80.043.461.4477.269.305.710.63如上面所述的結(jié)果，通過(guò)轉(zhuǎn)化的植物中早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因在優(yōu)選地在植物種子組織中表達(dá)的啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制下進(jìn)行表達(dá)可以獲得α-和β-胡蘿卜素急劇增加(100到200倍)和總類(lèi)胡蘿卜素增加60倍。在流出物中這樣的增加啟動(dòng)如上所述的特產(chǎn)產(chǎn)物的產(chǎn)生途徑，也導(dǎo)致產(chǎn)生α-維生素E(維生素E)的產(chǎn)生增加。此外，在轉(zhuǎn)基因植物的種子中也可以改變脂肪酸成分是顯然的。以這種方式，可以將種子用于產(chǎn)生新的產(chǎn)品以便生產(chǎn)特定的類(lèi)胡蘿卜素，以提供高油酸等等。本說(shuō)明書(shū)中提到的所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)代表了本發(fā)明涉及的領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員的含量。所有出版物和專(zhuān)利申請(qǐng)以相同的程度引入本文作為參考，就象各個(gè)單個(gè)的出版物或?qū)＠暾?qǐng)?zhí)禺惖睾蛦蝹€(gè)地引入本文作為參考一樣。雖然，借助于說(shuō)明和為了清楚理解的目的的實(shí)施例詳細(xì)地描述了本發(fā)明，但是在本申請(qǐng)所附加的權(quán)利要求書(shū)的范圍可對(duì)其進(jìn)行一些改變和修飾是顯而易見(jiàn)的。權(quán)利要求1．用于改變宿主植物的種子的類(lèi)胡蘿卜素含量的方法，所述方法包括用一個(gè)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述宿主植物，所述構(gòu)建體包括作為可操作連接成分的來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、至少一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的DNA編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域。2．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素含量被提高了。3．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼選自于下列組的酶香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶，β-胡蘿卜素羥化酶，ε-羥化酶，番茄紅素ε-環(huán)化酶，番茄紅素β-環(huán)化酶和由crtW編碼的蝦青素生物合成酶。4．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的DNA編碼序列通過(guò)反義或共抑制降低了所述宿主植物的天然的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的表達(dá)。5．根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因選自于下列組番茄紅素ε-環(huán)化酶，番茄紅素β-環(huán)化酶，ε-羥化酶，β-羥化酶，和八氫番茄紅素脫飽和酶。6．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因不是所述宿主植物的天然基因。7．根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因來(lái)自于原核生物。8．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述宿主植物是油類(lèi)種子油菜植物。9．根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于優(yōu)選地在油菜種子組織中表達(dá)的基因。10．根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于napin基因。11．提高宿主植物種子的類(lèi)胡蘿卜素生物合成的流出物含量的方法，所述方法包括用構(gòu)建體轉(zhuǎn)化所述宿主植物，所述構(gòu)建體包括作為可操作連接成分的來(lái)自于優(yōu)選在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、一級(jí)基因的DNA編碼序列、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其中所述的一級(jí)基因是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因。12．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼選自于下列組的酶香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶和異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶。13．根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼八氫番茄紅素合成酶。14．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的基因來(lái)自于原核生物。15．根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述的基因是crtB。16．根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述宿主植物用第二早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化。17．根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的一級(jí)基因編碼八氫番茄紅素合成酶，并且所述第二早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼八氫番茄紅素脫飽和酶。18．根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于優(yōu)選地在油菜種子組織中表達(dá)的基因。19．根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于napin基因。20．提高宿主植物的種子的α-和β-胡蘿卜素含量的方法，所述的方法包括用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述的宿主植物，所述表達(dá)盒包括作為可操作連接成分的來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、一級(jí)基因的DNA編碼序列和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其中所述的一級(jí)基因是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因，所述基因選自于下列組香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶。21．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述種子的葉黃素含量提高了。22．根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼八氫番茄紅素合成酶。23．根據(jù)權(quán)利要求20或21所述的方法，其中所述的基因來(lái)自于非高等植物來(lái)源。24．根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的基因是crtB。25．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的宿主植物是油類(lèi)種子油菜植物。26．根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于優(yōu)選地在油菜種子組織中表達(dá)的基因。27．根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于napin基因。28．用于在種子中生產(chǎn)所需的類(lèi)胡蘿卜素化合物的方法，所述方法包括獲得產(chǎn)生所述種子的轉(zhuǎn)化的植物，所述植物具有和表達(dá)其基因組可操作連接到質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的一級(jí)基因和來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，其中所述的一級(jí)基因是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因；和至少一個(gè)二級(jí)基因，它可操作連接到來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，其中所述二級(jí)基因編碼該途徑的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因，以使所述類(lèi)胡蘿卜素化合物可操作連接到質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，或通過(guò)抑制能夠修飾所述類(lèi)胡蘿卜素化合物的酶的表達(dá)提供了導(dǎo)致所述類(lèi)胡蘿卜素化合物積累的DNA序列的轉(zhuǎn)錄，其中所述抑制是通過(guò)反義或共抑制所述的酶獲得的。29．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼選自于下列組的酶香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶。30．根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼八氫番茄紅素合成酶。31．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的二級(jí)基因編碼選自于下列組的酶β-胡蘿卜素羥化酶，由crtW編碼的蝦青素生物合成酶，和ε-羥化酶，或其中所述的二級(jí)基因抑制編碼番茄紅素ε-環(huán)化酶、番茄紅素β-環(huán)化酶或八氫番茄紅素脫飽和酶的內(nèi)源性植物基因的轉(zhuǎn)錄。32．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的二級(jí)基因編碼β-胡蘿卜素羥化酶。33．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的二級(jí)基因編碼由crtW編碼的蝦青素生物合成酶。34．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的植物表達(dá)兩個(gè)二級(jí)基因。35．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的二級(jí)基因是crtZ和crtW。36．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的二級(jí)基因?qū)е乱种品鸭t素ε-環(huán)化酶的轉(zhuǎn)錄。37．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的二級(jí)基因?qū)е乱种品鸭t素ε-環(huán)化酶和番茄紅素β-環(huán)化酶的轉(zhuǎn)錄。38．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的二級(jí)基因編碼ε-羥化酶。39．根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的二級(jí)基因是ε-羥化酶和crtZ。40．根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述的二級(jí)基因編碼八氫番茄紅素脫飽和酶。41．根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的種子是油菜。42．根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于優(yōu)選地在油菜種子組織中表達(dá)的基因。43．根據(jù)權(quán)利要求42所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于napin基因。44．用于改變所需植物的種子的脂肪酸含量的方法，所述方法包括用一個(gè)表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述的植物，該表達(dá)盒包括作為可操作連接的成分的來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、一級(jí)基因的DNA編碼序列，和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其中所述的一級(jí)基因是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因。45．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼選自于下列組的酶香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶。46．根據(jù)權(quán)利要求45所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼八氫番茄紅素合成酶。47．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的植物是油菜種子作物作物，它選自于下列組油類(lèi)種子油菜，棉花，大豆，紅花，太陽(yáng)花，椰子，棕櫚和谷物。48．根據(jù)權(quán)利要求47所述的方法，其中所述的植物是油類(lèi)種子油菜。49．根據(jù)權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的基因是crtB。50．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于優(yōu)選地在油菜種子中表達(dá)的基因。51．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域來(lái)自于napin基因。52．根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中所述的種子包括增加的油酸。53．根據(jù)權(quán)利要求52所述的方法，其中所述的種子的亞油酸和/或亞麻油酸脂肪酸含量降低。54．篩選轉(zhuǎn)化的種子或轉(zhuǎn)化的胚的方法，所述的方法包括用一個(gè)表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述的植物，該表達(dá)盒包括作為可操作連接成分的來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，至少一個(gè)類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因的DNA編碼序列，和轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼選自于下列組的酶香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶和選擇顯示黃色、桔黃色或紅色的所述的轉(zhuǎn)化的種子或轉(zhuǎn)化的胚。55．根據(jù)權(quán)利要求54所述的方法，其中所述早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因是八氫番茄紅素合成酶。56．根據(jù)權(quán)利要求55的方法，其中所述植物是油類(lèi)種子油菜植物和其中所述的轉(zhuǎn)化胚顯示桔黃色。57．在植物轉(zhuǎn)化中將類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因用作為標(biāo)記基因的方法，其中所述的方法包括用所需的基因和類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因轉(zhuǎn)化植物，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因可操作連接到轉(zhuǎn)運(yùn)肽和來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域，和通過(guò)篩選顯示黃色、桔黃色或紅色的胚或從所述的轉(zhuǎn)化植物的種子篩選具有黃色、桔黃色到紅色的種子而選擇所述的轉(zhuǎn)化的植物。58．根據(jù)權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因選自于下列組香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶。59．根據(jù)權(quán)利要求58所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因是八氫番茄紅素合成酶。60．產(chǎn)生具有改變的類(lèi)胡蘿卜素含量的種子的轉(zhuǎn)基因植物。61．根據(jù)權(quán)利要求60所述的植物，其中所述的種子中至少一種所需的類(lèi)胡蘿卜素化合物含量增高，所述化合物選自于下列組α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素，番茄紅素，葉黃素，玉米黃質(zhì)，角黃素，八氫番茄紅素，α-玉米黃質(zhì)，β-玉米黃質(zhì)，ζ-玉米黃質(zhì)，六氫番茄紅素，鏈孢紅素和蝦青素。62．根據(jù)權(quán)利要求61所述的植物，其中所述的種子產(chǎn)生增高含量的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素、葉黃素。63．根據(jù)權(quán)利要求62所述的植物，其中所述的種子還具有改變的脂肪酸成分。64．根據(jù)權(quán)利要求63所述的植物，其中所述的種子具有增高含量的油酸和降低含量的亞油酸和/或亞麻油酸。65．具有改變的類(lèi)胡蘿卜素含量的轉(zhuǎn)化的種子。66．根據(jù)權(quán)利要求65所述的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述的種子中至少一種所需的類(lèi)胡蘿卜素化合物的含量增高，所述化合物選自于下列組α-胡蘿卜素，β-胡蘿卜素，番茄紅素，葉黃素，玉米黃質(zhì)，角黃素，α-玉米黃質(zhì)，β-玉米黃質(zhì)，ζ-玉米黃質(zhì)，六氫番茄紅素，鏈孢紅素和蝦青素。67．根據(jù)權(quán)利要求66所述的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述的種子產(chǎn)生增高含量的α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素、葉黃素。68．根據(jù)權(quán)利要求65所述的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述的種子具有改變的脂肪酸成分。69．根據(jù)權(quán)利要求68所述的轉(zhuǎn)化的種子，其中所述的種子具有增高含量的油酸和降低含量的亞油酸和/或亞麻油酸。70．用于提高宿主植物的種子的維生素E含量的方法，所述方法包括用表達(dá)盒轉(zhuǎn)化所述的宿主植物，該表達(dá)盒包括作為可操作連接成分的來(lái)自于優(yōu)選地在植物種子中表達(dá)的基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽、一級(jí)基因的DNA編碼序列、轉(zhuǎn)錄終止區(qū)域，其中所述的一級(jí)基因是早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因，選自于下列組香葉基香葉基焦磷酸鹽合成酶，八氫番茄紅素合成酶，八氫番茄紅素脫飽和酶，異戊烯基二磷酸異構(gòu)酶。71．根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的早期類(lèi)胡蘿卜素生物合成基因編碼八氫番茄紅素合成酶。72．根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中在所述種子中α-維生素E含量提高至少50％。73．根據(jù)權(quán)利要求71所述的方法，其中所述的基因來(lái)自于非高等植物來(lái)源。74．根據(jù)權(quán)利要求73所述的方法，其中所述的基因是crtB。75．根據(jù)權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的宿主植物是油類(lèi)種子油菜植物。76．由權(quán)利要求1,11,20,28,44和70任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的種子。77．由權(quán)利要求1,11,20,28,44,54,57和70任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的植物。78．從由權(quán)利要求1,11,20,28,44和70任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的種子提取的油類(lèi)。79．從由權(quán)利要求1,11,20,28和70任一項(xiàng)所述的方法產(chǎn)生的種子提取的粉。80．根據(jù)權(quán)利要求1,11,20,28和70任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的種子來(lái)自于選自于下列組的植物油類(lèi)種子油菜，棉花，大豆，紅花，太陽(yáng)花，椰子，棕櫚，小麥，大麥，水稻，玉米，燕麥，莧，西葫蘆，南瓜，芝麻，罌粟，葡萄，綠豆，花生，豌豆，菜豆，小蘿卜，苜蓿，可可，咖啡，樹(shù)生堅(jiān)果。81．根據(jù)權(quán)利要求80所述的方法，其中所述種子來(lái)自于油類(lèi)種子作物植物，選自于下列組油類(lèi)種子油菜，棉花，大豆，紅花，太陽(yáng)花，棕櫚，椰子和谷物。全文摘要提供了用于生產(chǎn)具有改變的類(lèi)胡蘿卜素、脂肪酸和維生素E成分的植物和種子的方法。該方法對(duì)于提高油料種子植物中類(lèi)胡蘿卜素含量和提供所需的高油酸種子油類(lèi)具有特定的用途。文檔編號(hào)C12P7/64GK1227609SQ97197150公開(kāi)日1999年9月1日申請(qǐng)日期1997年8月8日優(yōu)先權(quán)日1996年8月9日發(fā)明者克里斯蒂娜·K·休梅克申請(qǐng)人:卡爾金公司