專利名稱：來自枯草芽孢桿菌的植酸酶,編碼所述植酸酶的基因,該基因產(chǎn)物的生產(chǎn)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植酸酶，編碼植酸酶的核酸以及植酸酶的生產(chǎn)方法和它的用途。
背景技術(shù)：
亞磷是生長(zhǎng)的必需元素。在許多食品和動(dòng)物飼料中，亞磷主要是以磷酸鹽的形式存在，并且同被稱作植酸酶(肌醇六磷酸激酶)的分子共價(jià)結(jié)合。由于肌醇六磷酸自身沒有被消化好并且磷酸鹽在很大程度上是在動(dòng)物的小腸內(nèi)被吸收的，磷酸鹽在肌醇六磷酸中螯合并且沒有在動(dòng)物的小腸內(nèi)被吸收，而是經(jīng)過消化道并且被排泄掉。這造成亞磷對(duì)土地和水系的生態(tài)負(fù)擔(dān)增加。另外，由于植酸酶可同許多必需礦質(zhì)元素形成螯和物，并且抑制它們?cè)谙纼?nèi)的吸收，因此，植酸酶會(huì)降低食品或飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。
另一個(gè)同肌醇六磷酸的低消化率相關(guān)的問題是需要向動(dòng)物飼料中加入無機(jī)磷酸鹽，這樣會(huì)使飼料的價(jià)格增加。
肌醇六磷酸是由被稱作植酸酶的酶所轉(zhuǎn)化的，該酶催化肌醇六磷酸水解成為肌醇和無機(jī)磷酸鹽。在麩皮和植物種子中有植酸酶并且已知可用各種微生物，包括酵母，真菌和細(xì)菌來生產(chǎn)植酸酶。
在已知的真菌植酸酶中，Yamada等將土曲霉植酸酶純化到均質(zhì)(農(nóng)業(yè)生物化學(xué)，32(10)(1968),1275-1282)，并且顯示出該植酸酶的最適pH值為4.5，在pH值為4.5時(shí)最適溫度為70℃并且在30到60℃的溫度范圍內(nèi)是熱穩(wěn)定的。但是，所述酶在中性pH值下，特別是在pH值為7.0時(shí)則完全失活。
另外，H.J.Ullah和D.M.Gibson分離并鑒定了無花果曲霉植酸酶(Preparative Biochemistry,17(1)(1987),63-91)，并且顯示出該植酸酶具有兩個(gè)最適pH值，一個(gè)是2.2，另一個(gè)是5.0-5.5，在pH值為5.0時(shí)，最適溫度為58℃并且在pH為5.0時(shí)直到68℃時(shí)都是熱穩(wěn)定的。但是，正如土曲霉植酸酶的情況一樣，無花果曲霉植酸酶在pH值為7.0時(shí)也失去活性。
已經(jīng)對(duì)來自土曲霉(EP 684 313)和無花果曲霉(EP 420 358)以及黑曲霉awamori變種(Piddington等，(1993)基因，133,55-62)的編碼植酸酶的DNA序列做了鑒定并進(jìn)行了重組表達(dá)。
也知道象枯草芽孢桿菌(V.K.Powar和V.Jagannathan,(1982)細(xì)菌學(xué)雜志，151(3),1102-1108)和枯草芽孢桿菌(納豆變種)(M.Shimizu,(1992)生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物化學(xué)，56(8),1266-1269和日本專利申請(qǐng)6-38745)一類的細(xì)菌也可以作為植酸酶的來源。
用SDS-PAGE將Shimizu(上文)描述的枯草芽孢桿菌(納豆變種)植酸酶純化至均質(zhì)，顯示出的分子量在36和38kD之間。當(dāng)在含有0.1M馬來酸，2mM的氯化鈣和1.6mM的肌醇六磷酸鈉的分析溶液中于37℃下測(cè)定時(shí)，該酶的最適pH值在6.0和6.5之間，當(dāng)在含有0.1M的Tris-HCl緩沖液，2mM的氯化鈣和1.6mM的肌醇六磷酸的溶液中于37℃下測(cè)定時(shí)，該酶的最適pH為7.0。該植酸酶的最適溫度為60℃而且當(dāng)該酶在上面提到的含有Tris-HCl緩沖液的溶液中溫浴15分鐘時(shí)，該酶直到50℃時(shí)還是穩(wěn)定的。在含有所述Tris-HCl的溶液中純化的枯草芽孢桿菌(納豆變種)植酸酶的報(bào)道比活為8.7U/mg蛋白。將一個(gè)單位的植酸酶定義為在這樣的分析條件下，每分鐘釋放1微摩爾的磷酯酰肌醇所需要的酶量。始終使用這一定義。
Powar等(如上文)描述了從枯草芽孢桿菌中分離出分子量為36.5kD并且具有肌醇六磷酸專一性的植酸酶制劑。這種酶制劑是用SDS-PAGE所純化，并且發(fā)現(xiàn)包括兩種植酸酶同功酶，當(dāng)在含有0.1M的Tris-HCl緩沖液，0.5mM的氯化鈣和0.34mM的肌醇六磷酸鈉的檢測(cè)溶液中于30℃下測(cè)定時(shí)，該酶所顯示出的最適pH值在7.0和7.5之間。在60℃下，該植酸酶同功酶混合物顯示出最大的活性并且直到70℃都是穩(wěn)定的。所報(bào)道的在上述檢測(cè)溶液中測(cè)定的純化酶的比活為8.5到9.0U/mg蛋白。另外，據(jù)Powar等人(上文)報(bào)道，純化的同功酶混合物具有水解蛋白的活性，這樣會(huì)導(dǎo)致活性的喪失。
目前還不知道芽孢桿菌植酸酶的氨基酸序列和編碼芽孢桿菌植酸酶的核酸序列。
在處理食品和動(dòng)物飼料的過程中向食品和動(dòng)物飼料中添加天然或重組的植酸酶，從而使肌醇六磷酸經(jīng)酶轉(zhuǎn)化為可消化的磷酸鹽，已經(jīng)有了關(guān)于這種想法的描述。JP-A-38745描述了用純化的天然存在的枯草芽孢桿菌(納豆變種)植酸酶在處理飼料和食品中的用途。另外EP420358和EP684 313中描述了曲霉植酸酶在動(dòng)物飼料中的用途。
而且，也有人建議在已經(jīng)被處理過的動(dòng)物飼料中加入植酸酶以使所述植酸酶的酶促反應(yīng)發(fā)生在動(dòng)物的消化道內(nèi)。
但是，在處理食品或動(dòng)物飼料的溫度和/或pH值下(一般是65到95℃,pH5.5到7.5)以及在單胃動(dòng)物的小腸內(nèi)的pH值下(一般是37-41℃,pH5.5到7.5)，上述曲霉植酸酶或者失活或者喪失了大部分活性。
而且，在上述條件下，上述芽孢桿菌植酸酶的比活及其相對(duì)活性非常低。
發(fā)明概述因?yàn)樵谑称诽幚磉^程中所用的、以及動(dòng)物的消化道內(nèi)的溫度和/或pH值有所不同，所以希望提供一種在處理食品和動(dòng)物飼料的溫度和/或pH值下、以及在動(dòng)物的消化道內(nèi)的溫度和/或pH下仍然具有較高比活和較高相對(duì)活性的植酸酶，從而既能使植酸酶的效果在處理食品和飼料的過程中以及在動(dòng)物消化道的消化過程中能夠達(dá)到最大，又能減少由動(dòng)物飼料中含有的肌醇六磷酸被消化后所產(chǎn)生的亞磷對(duì)環(huán)境的影響。
而且，為了能夠更經(jīng)濟(jì)地生產(chǎn)所述食品和動(dòng)物飼料，也需要一種能夠大量生產(chǎn)滿足上面標(biāo)準(zhǔn)的植酸酶的方法。
本發(fā)明的目的之一是提供一種具有高比活的植酸酶，在食品和飼料的處理過程中能夠具有高的相對(duì)活性和/或在養(yǎng)殖動(dòng)物的消化道內(nèi)能夠具有高的相對(duì)活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供編碼本發(fā)明中植酸酶的核酸分子。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)所述植酸酶的方法以及將所述植酸酶提供給所述動(dòng)物。
下面詳細(xì)的說明書會(huì)使本發(fā)明的其它目的更加清楚。
本發(fā)明的主題是植酸酶或其功能衍生物，是以所述植酸酶的比活至少是20U/mg蛋白為特征的，其中所述的比活是通過在含有100mMTris-HCl,pH7.5,1mM的氯化鈣，和1.6mM的肌醇六磷酸鈉溶液中于37℃下使植酸酶溫浴30分鐘而測(cè)定出來的。在上述條件下測(cè)定時(shí)，優(yōu)選地，本發(fā)明植酸酶在具有的比活至少29U/mg蛋白，更優(yōu)選地是80U/mg蛋白，最優(yōu)選地是88U/mg蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案，所述植酸酶的最適pH值至少有一個(gè)是pH6.5，其中所述的最適pH是通過在含有100mM的Tris-馬來酸，1mM的氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下使植酸酶溫浴30分鐘而測(cè)定出來的，或者最適pH值至少有一個(gè)是pH7.0，其中所述的最適pH是通過在含有100mM的Tris-HCl,1mM的氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下使植酸酶溫浴30分鐘，或者通過在含有麩皮提取物，1mM的氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下使該植酸酶溫浴30分鐘而測(cè)定出來的。
在食品或飼料的處理過程中以及養(yǎng)殖動(dòng)物的消化道中，植酸酶具有相當(dāng)高的活性是有利的，這樣可使該酶在兩種情況下都能較好地行使其功能。同所述植酸酶在養(yǎng)殖動(dòng)物的消化道內(nèi)，優(yōu)選地是嗉囊和/或小腸內(nèi)的活性相比較，在處理飼料或食品的過程中，本發(fā)明的植酸酶的活性優(yōu)選地是大于等于30％，更優(yōu)選地是大于等于35％，最優(yōu)選地是大于等于37％。
另外，優(yōu)選地，所述植酸酶在有動(dòng)物小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的消化酶存在時(shí)能夠行使其功能。在動(dòng)物小腸內(nèi)發(fā)現(xiàn)的酶包括象胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶和脂酶一樣的胰酶。
本發(fā)明涉及的植酸酶具有上述一個(gè)或多個(gè)特性。
本發(fā)明的植酸酶可從微生物中獲得，優(yōu)選的微生物是芽孢桿菌菌株，更優(yōu)選的是選自包括枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的菌群，最優(yōu)選的是于1996年8月1日保藏在位于蘇格蘭的國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏有限公司(NCIMB)的枯草芽孢桿菌B13株，登記號(hào)為NCIMB-40819。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的植酸酶含有與SEQ ID NO:1相應(yīng)的氨基酸序列或其功能衍生物。在涉及到植酸酶時(shí)，整個(gè)說明書中的術(shù)語“其功能衍生物”是用來說明具有本發(fā)明植酸酶功能特性的植酸酶衍生物。植酸酶的功能衍生物包括天然存在的，合成的或重組生產(chǎn)的肽或肽的片段，具有一個(gè)或多個(gè)氨基酸缺失、取代或添加而仍具有本發(fā)明植酸酶一般特性的突變體或變異體。
本發(fā)明的另一個(gè)主題是一個(gè)分離的核酸或其功能衍生物，該核酸編碼具有上述特性中的一種或多種的植酸酶。優(yōu)選地，所述核酸含有與SEQ ID NO:1相應(yīng)的DNA序列或其功能衍生物，或含有能夠同與SEQID NO:1相應(yīng)的DNA序列或其功能衍生物雜交的DNA序列。
本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是一個(gè)分離出的核酸，該核酸編碼植酸酶或其功能衍生物，并且所述核酸是以其能夠與根據(jù)SEQ ID NO:1的DNA雜交并編碼所述植酸酶為特征的，所述植酸酶具有的最適pH值大于等于5.0而且比活至少為10U/mg蛋白，這一比活是在含有100mM的馬來酸-Tris,1mM的氯化鈣和1.6mM的肌醇六磷酸鈉的檢測(cè)溶液中于37℃下30分鐘后測(cè)定出的。
所述核酸優(yōu)選的是DNA分子。在涉及到編碼植酸酶的核酸時(shí)，整個(gè)說明書中的術(shù)語“其功能衍生物”是用來說明具有編碼植酸酶的功能特性的核酸衍生物。編碼本發(fā)明植酸酶的核酸功能衍生物包括天然存在的，合成的或重組生產(chǎn)的核酸或其片段，具有一個(gè)或多個(gè)核酸缺失、取代或添加而仍編碼具有本發(fā)明特性的植酸酶的突變體或變異體。編碼本發(fā)明植酸酶的核酸變異體包括根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域公知的遺傳密碼簡(jiǎn)并性原理的等位變異體和變異體。編碼本發(fā)明植酸酶的核酸突變體包括通過定點(diǎn)誘變技術(shù)產(chǎn)生的突變體(例如見，Botstein,D.和Shortle,D.,1985,科學(xué)229:1193-1201和Myer,R.M.,Lerman,L.S.,和Maniatis,T.,1985,科學(xué)229:242-247)，易錯(cuò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(例如見，Leung,D.W.,Chen,E.,和Goeddel,D.V.,1989,Technique 1:11-15；Eckert,K.A.和Kunkel,T.A.,1991，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法應(yīng)用1:17-24；和Cadwell,RC.和Joyce,G.F.,1992，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方法應(yīng)用2:28-33)和/或本領(lǐng)域公知的化學(xué)誘導(dǎo)突變技術(shù)(見例如，Elander,R.P在基礎(chǔ)生物技術(shù)中的“微生物篩選，選擇和菌株的進(jìn)展”，J.Bu’lock和B.Kristiansen編輯，學(xué)院出版社，紐約，1987,217)。
本發(fā)明的主題也涉及一種生產(chǎn)本發(fā)明核酸產(chǎn)物的方法，其特征是，含有上述核酸的探針在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠同被懷疑含有所述核酸的樣品進(jìn)行雜交以及回收所述核酸。將所述探針用于雜交的標(biāo)準(zhǔn)方法包括Southern印跡(例如見，Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1989)，PCR和RT-PCR(例如見，PCRProtocol方法和應(yīng)用指南，Innis,M.A.,Gelfand,D.H.,Sninsky,J.J.和White,T.J.編輯，學(xué)院出版社紐約，1990)。雜交的優(yōu)選標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件是6x SSC,0.5％SDS，在50℃下過夜，或用于Southern印跡和PCR的功能等同的條件下，優(yōu)選的反應(yīng)條件是5mM的鎂離子，Taq酶，94℃下兩分鐘預(yù)解鏈，并于92℃下20秒鐘循環(huán)30次以解鏈，在50℃下30秒鐘退火并在72℃下1分鐘進(jìn)行延伸反應(yīng)，或在其功能等同的條件下。
本發(fā)明的主題也涉及一個(gè)含有本發(fā)明DNA分子的載體。優(yōu)選地，所述載體的特征是，所述DNA分子可有效地連接到能夠使所述DNA序列表達(dá)植酸酶的調(diào)節(jié)序列中。優(yōu)選地，所述DNA分子含有能夠使所述植酸酶進(jìn)行分泌的前導(dǎo)序列。所述調(diào)節(jié)序列可包括原核或真核調(diào)節(jié)序列。
本發(fā)明所設(shè)計(jì)的DNA序列或載體所表達(dá)的本發(fā)明植酸酶的成熟形式可以帶有或不帶有天然植酸酶信號(hào)序列或在芽孢桿菌其它原核或真核細(xì)胞中行使功能的信號(hào)序列，這要根據(jù)本發(fā)明植酸酶是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)還是分泌到細(xì)胞外而定。既可通過去除信號(hào)序列也可通過部分去除所述信號(hào)序列來實(shí)現(xiàn)表達(dá)。
本發(fā)明的主題還涉及用上述核酸或載體轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞選自包括大腸桿菌，芽孢桿菌屬，乳桿菌和乳球菌的菌群。
本發(fā)明的主題還涉及用上述核酸或載體轉(zhuǎn)化的真核細(xì)胞。優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞選自包括曲霉屬，腐質(zhì)霉屬，畢赤氏酵母屬，木霉屬，糖酵母屬，以及象大豆，玉米和油菜籽一樣的植物類群。
本發(fā)明的主題也涉及到植酸酶重組產(chǎn)物的生產(chǎn)方法，該方法的特征是，在適宜的條件下培養(yǎng)上述真核或原核宿主細(xì)胞并回收所述植酸酶。
關(guān)于本發(fā)明植酸酶的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是根據(jù)上述方法獲得植酸酶。
本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是能夠生產(chǎn)本發(fā)明植酸酶的微生物細(xì)胞或孢子的用途，即作為微生態(tài)制劑或可直接用于飼養(yǎng)動(dòng)物的微生物產(chǎn)品。所述用途的優(yōu)選的實(shí)施方案是本發(fā)明中產(chǎn)植酸酶的芽孢桿菌屬和乳桿菌屬。
本發(fā)明的進(jìn)一步的主題也是本發(fā)明植酸酶在食品或動(dòng)物飼料中的用途。
本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是含有植酸酶的食品或動(dòng)物飼料。優(yōu)選地，所述食品或動(dòng)物飼料含有作為添加劑的植酸酶，且在所述動(dòng)物的消化道內(nèi)，優(yōu)選地在所述動(dòng)物的嗉囊和/或小腸內(nèi)是有活性的，優(yōu)選地，所述動(dòng)物選自由包括家禽的鳥類，包括牛、羊和豬的反芻動(dòng)物類以及包括魚和蝦的水生養(yǎng)殖動(dòng)物類所構(gòu)成的類群。優(yōu)選地，所述添加劑在食品或飼料的處理過程中是有活性的。
本發(fā)明進(jìn)一步的主題也是用于生產(chǎn)食品或動(dòng)物飼料的方法，該方法是以將本發(fā)明的植酸酶同所述食品或動(dòng)物飼料相混合為特征的。所述植酸酶在處理前以干燥產(chǎn)品形式添加，或者在處理前或處理后以液態(tài)產(chǎn)品添加。如果使用的是干粉，應(yīng)當(dāng)將植酸酶以液態(tài)形式稀釋到象被研磨的谷物一樣的干燥載體上。
本發(fā)明的主題也涉及食品或動(dòng)物飼料的生產(chǎn)方法，該方法的特征是，將能夠表達(dá)本發(fā)明植酸酶的原核細(xì)胞和/或孢子加入到所述食品或動(dòng)物飼料中。
本發(fā)明的主題也涉及在肌醇和無機(jī)磷酸鹽的產(chǎn)物中，有或沒有輔助磷酸酶時(shí)本發(fā)明植酸酶的用途。
本發(fā)明的進(jìn)一步的主題是減少動(dòng)物糞尿中亞磷水平的方法，這種方法的特征是，所述動(dòng)物是用本發(fā)明的動(dòng)物飼料喂養(yǎng)的，飼料的用量能夠有效地轉(zhuǎn)化所述動(dòng)物飼料中含有的肌醇六磷酸。定義在整個(gè)說明書中將術(shù)語“植酸酶”定義為一種能夠催化肌醇六磷酸水解并釋放無機(jī)磷酸鹽的蛋白或多肽。
在整個(gè)說明書中將植酸酶的比活定義為含有植酸酶的溶液中每毫克蛋白的單位(U)數(shù)，其中所述植酸酶作為一個(gè)單獨(dú)的電泳帶可通過SDS-PAGE檢測(cè)出來。1個(gè)單位是指當(dāng)所述酶在含有100mM的Tris-HCl,pH7.5,1mM氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下溫浴30分鐘時(shí)，每分鐘釋放1微摩爾Pi所需的酶量。
在整個(gè)說明書中將植酸酶的相對(duì)活性定義為，同所述酶在最適溫度和/或pH值時(shí)的活性相比，該酶在一定的溫度和/或pH值條件下的活性。
附圖的簡(jiǎn)要說明

圖1植酸酶的SDS-PAGE凝膠純化(方法)；圖2純化的植酸酶的等電聚焦凝膠；圖3在不同的溫度下，pH值對(duì)植酸酶活性的影響；圖4在給定的緩沖液中pH值對(duì)植酸酶的溫度活性分布圖的影響；圖5在不同的溫度下，pH值對(duì)小麥麩皮提取物中植酸酶活性的影響；圖6pH值對(duì)小麥麩皮提取物中植酸酶溫度活性分布圖的影響；圖7在相當(dāng)于處理飼料和消化過程中的溫度和pH值的條件下，植酸酶的相對(duì)活性；圖8用從氨基酸序列中推導(dǎo)出的引物以使編碼枯草芽孢桿菌植酸酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)的結(jié)果；圖9枯草芽孢桿菌植酸酶的基因結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的詳細(xì)描述通過下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更加詳盡的說明。實(shí)施例1在整個(gè)研究過程中所用的枯草芽孢桿菌B13保藏在位于蘇格蘭的國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏有限公司(NCIMB)，登記號(hào)為NCIMB-40819。培養(yǎng)基用每升含有5g酵母提取物，10g胰化蛋白胨和10gNaCl的Luria培養(yǎng)基培養(yǎng)接種物以生產(chǎn)植酸酶。
用小麥麩皮提取物作為生產(chǎn)酶的培養(yǎng)基并按如下面方法來制備。用1000毫升在121℃下高壓滅菌60分鐘的水對(duì)100克小麥麩皮進(jìn)行提取。用六層干酪慮布過濾提取物，然后加水將提取物的體積調(diào)節(jié)到1升。向該提取物中添加0.4g的(NH4)2SO4,0.2g的7水硫酸鎂，10g酪胨，0.5g磷酸二氫鉀和0.4g磷酸氫二鉀。提取物最終的pH為6.5。將提取物基質(zhì)在121℃下高溫滅菌15分鐘。在接種前，加入5％的氯化鈣(已經(jīng)過濾滅菌的)使其最終濃度為0.2％。酶的生產(chǎn)接種物從添加有0.2％氯化鈣的Luria培養(yǎng)基的冷凍原種中長(zhǎng)出。最初的接種物于30℃下在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)中生長(zhǎng)24小時(shí)。向小麥麩皮培養(yǎng)基中逐次加入10％的接種物使培養(yǎng)物按比例逐步增加。將5升批次的培養(yǎng)物在小麥麩皮培養(yǎng)基中于30℃下振蕩培養(yǎng)91小時(shí)以生產(chǎn)酶。蛋白質(zhì)分析用牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)生產(chǎn)商的建議，用Bio-Rad ProteinMicroassay Procedure測(cè)定了蛋白質(zhì)的濃度。植酸酶的純化除非另有說明，所有的純化步驟都是在0-4℃下進(jìn)行的。將細(xì)菌在7000xg下離心沉淀30分鐘。測(cè)定所收集上清液的體積并加入氯化鈣使最終濃度達(dá)到1mM。在不斷攪拌的過程中向上清液中加入3個(gè)體積的冰乙醇(-20℃)使酶沉淀出來。持續(xù)攪拌45分鐘使沉淀反應(yīng)過夜。通過在1800xg下離心20分鐘來收集沉淀。所得的沉淀用冰乙醇(-20℃)洗滌一次再用冰丙酮(-20℃)洗滌一次。在氮?dú)饬鞯臈l件下，將過量的丙酮從沉淀中蒸發(fā)掉，然后用冷凍干燥法完成干燥。
干燥的沉淀被溶解在100mM的Tris-HCl,pH7.5，并添加有1mM氯化鈣的300ml溶液中。在不斷攪拌下向該溶液中緩緩加入硫酸銨直到飽和度為65％。將溶液在4℃下溫浴過夜，于4℃下在9000xg的轉(zhuǎn)速下離心60分鐘以使該溶液澄清然后加入硫酸銨使飽和度達(dá)到85％，再將溶液在4℃下溫浴過夜，然后加入硫酸銨使飽和度達(dá)到85％。按前面的方法收集沉淀然后溶解在100mM的Tris-HCl,pH7.5，并添加有1mM氯化鈣的溶液中。在-20℃下保存酶制劑的等分試樣。當(dāng)在實(shí)驗(yàn)中要使用時(shí)，通過用PD-10(Pharmacia)凝膠過濾層析柱凝膠過濾酶制劑到所需給定的緩沖液中。純化植酸酶的方案如表1所示。
表1純化的植酸酶的比活度
分子量和等電點(diǎn)的測(cè)定根據(jù)生產(chǎn)商的建議，以Phamacia低分子量電泳校準(zhǔn)試劑盒作為標(biāo)準(zhǔn)，用SDS 8-25％的梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳(PhastGelSDS-page)在Pharmacia Phast電泳儀中測(cè)定上面純化的植酸酶的分子量。以PharmaciaIEF校準(zhǔn)試劑盒作為標(biāo)準(zhǔn)，用PhastGel IEF 3-9等電聚焦凝膠在相同的系統(tǒng)中測(cè)定等電點(diǎn)。
用SDS-PAGE測(cè)定的B13植酸酶的分子量為43,000(圖1)。B13植酸酶等電點(diǎn)pH為6.5(圖2)。底物特異性通過用每種酶的標(biāo)準(zhǔn)活性分析，測(cè)定了植酸酶的底物特異性(在0.1M的Tris-HCl,pH為7.5)。除了肌醇六磷酸外，β-磷酸甘油，6-磷酸-D-葡萄糖，對(duì)硝基苯基磷酸，ATP,ADP,AMP,1,6-二磷酸果糖，3-磷酸甘油酸，雙-(對(duì)硝基苯基)磷酸和α,β-亞甲基腺苷-5’-二磷酸都被用作不同的底物。底物特異性的分析結(jié)果如表2所示。
表2植酸酶的底物特異性
酶分析除非另有說明，通過將150μl的酶制劑同2mM的肌醇六磷酸鈉一起在添加有1mM氯化鈣的100mM pH為7.5的Tris-HCl緩沖液中于37℃下溫浴30分鐘而測(cè)定植酸酶的活性。溫浴后，通過加入750μ1 5％的三氯乙酸以終止反應(yīng)。在加入1500μl顯色劑(4倍體積的1.5％鉬酸銨在5.5％硫酸中的溶液和1倍體積的2.7％的硫酸亞鐵；Shimizu,M.,1992；生物科學(xué)、生物技術(shù)、生物化學(xué)56:1266-1269)后，根據(jù)與磷酸鹽在700nm處的標(biāo)準(zhǔn)分光光度值的比較來測(cè)定磷酸鹽的解離。一個(gè)單位的酶活被定義為在實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘釋放1微摩爾Pi所需的酶量。比活以每毫克蛋白的酶活性單位來表示。在表3中總結(jié)了上述方法所純化的植酸酶的特性。
表3植酸酶的特性
pH和溫度活性分布圖植酸酶的pH和溫度活性分布圖是在給定的緩沖液和小麥麩皮提取物中分析得到的。于37℃的最適條件下，分析中所用的酶濃度給出了30分鐘溫浴期間的線性正磷酸鹽的解離。
所用的給定緩沖液是100mM的甘氨酸pH3.0,100mM的琥珀酸pH5.0,100mM的Tris-馬來酸pH5.0,6.0,7.0以及8.0,100mM的Tris-HCl pH7.5,8和9。所有緩沖液中都添加2mM的肌醇六磷酸鈉和1mM的氯化鈣。在這些緩沖液中于不同的溫度下(37,45,55,65,75℃)進(jìn)行酶分析。將600μl緩沖液加熱到相應(yīng)的溫度，并加入150μl的酶制劑以起始反應(yīng)。經(jīng)30分鐘溫浴后反應(yīng)被終止，并用前面描述的方法測(cè)定解離的無機(jī)正磷酸鹽。重復(fù)進(jìn)行酶分析。在酶分析的開始和結(jié)束時(shí)測(cè)定反應(yīng)混合物的準(zhǔn)確pH值。按照上面的描述測(cè)定蛋白濃度并在不同的pH值和不同的溫度下計(jì)算酶的比活度。
將50g小麥麩皮溶解在500ml蒸餾水中，接著在121℃下高壓滅菌60分鐘以制備小麥麩皮提取物。用干酪濾布過濾該提取物，并用蒸餾水將體積調(diào)整到500ml，然后在15,000rpm轉(zhuǎn)速下將提取物離心15分鐘并收集上清液。將上清液等分試樣的pH值調(diào)整為3.0,5.5,7.0,8.0和9.0，用蒸餾水按1∶10的比例稀釋并添加2mM的肌醇六磷酸鈉和1mM的氯化鈣。將600μl的pH值被調(diào)整過的小麥麩皮提取物加熱到所需溫度(37,55和75℃)并通過加入150μl的酶制劑來起始反應(yīng)。溫浴30分鐘后反應(yīng)被終止，并按照上面所描述的方法測(cè)定解離的無機(jī)正磷酸鹽。重復(fù)進(jìn)行酶分析。在酶分析的開始和結(jié)束時(shí)測(cè)定反應(yīng)混合物的準(zhǔn)確pH值。pH值對(duì)酶活性的影響用給定的緩沖液和調(diào)整了pH值的小麥麩皮測(cè)定pH范圍從3.0到8.5之間植酸酶的相對(duì)活性。很明顯，不僅緩沖液的pH值，而且緩沖液的酸性組份也影響植酸酶的活性。為了覆蓋pH值的范圍，使用了四種不同緩沖液或通過加入HCl或NaOH而調(diào)整了pH值的小麥麩皮提取物。由于加入酶會(huì)影響反應(yīng)物的pH值，所以在30分鐘溫浴的開始和結(jié)束時(shí)測(cè)定了每種試樣混合物的準(zhǔn)確pH值。在反應(yīng)過程中，pH值的變化是較小的。
在pH值活性圖譜的確過程中用了準(zhǔn)確的反應(yīng)pH值。
圖3a到3e顯示了在37和75℃之間的5個(gè)不同的溫度之下，B13植酸酶在給定的緩沖液中的pH活性圖譜。不論溫度是多少，植酸酶在pH值為7.5時(shí)都顯示出最大活性。
一般地，動(dòng)物混合飼料的pH值范圍是5.5到7.5。
植酸酶的最適溫度是55℃。在上述給定緩沖液中，pH值對(duì)植酸酶溫度活性圖譜的影響如圖4所示。
小麥麩皮提取物可能提供了一種比任何給定緩沖液更接近于飼料和動(dòng)物消化時(shí)的環(huán)境。我們?cè)?7,55和75℃下測(cè)定了植酸酶的pH活性圖譜。該酶在小麥麩皮提取物中的活性是其在給定緩沖液中活性的兩倍(圖5a到5c)。該圖譜同由給定緩沖液中得到的圖譜沒有差異(圖6)。
圖7說明了在類似于飼料加工和適用于烤焙的小雞的消化過程中的pH值和溫度條件下，兩個(gè)植酸酶的比活度。用于本圖的數(shù)據(jù)是從上述實(shí)驗(yàn)中得到的(圖5a到5c)。實(shí)施例2編碼植酸酶基因的克隆N-端序列的測(cè)定用Edman降解法，經(jīng)Perkin-Elmer Procice測(cè)序系統(tǒng)測(cè)定由SDS-PAGE純化的枯草芽孢桿菌B13植酸酶的N-端序列。得到了25個(gè)氨基酸長(zhǎng)的N-端序列。為了獲得該氨基酸序列的更多信息，用lysC酶消化純化的植酸酶以獲得內(nèi)源性肽并用反相高效液相層析純化消化產(chǎn)物。在反相高效液相層析純化后，脂環(huán)化的植酸酶也進(jìn)行LysC消化。用相同的系統(tǒng)測(cè)定通過反相高效液相層析純化的植酸酶中未脂環(huán)化的肽的序列。使植酸酶脂環(huán)化以鑒定是否存在硫橋。脂環(huán)化和未脂環(huán)化的植酸酶LysC消化產(chǎn)物的反相高效液相層析譜沒有差別，這表明植酸酶中沒有硫橋。
測(cè)定19個(gè)純化肽的序列，得到14個(gè)序列互不相同的肽(第5到23個(gè)氨基酸)和總共227個(gè)氨基酸。所有肽的序列如表4所示，包括相當(dāng)于植酸酶N-端的序列。用質(zhì)譜儀測(cè)定肽的分子量并與所計(jì)算的分子量相比較。
表4通過N-端氨基酸序列得到的肽
*N-端序列用PCR鑒定編碼植酸酶的序列以這些肽的序列為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了PCR引物(見表5)。用PTC-255DNAEngine和Perkin-Elmer Taq聚合酶實(shí)施所有PCR反應(yīng)。
表5在各種最適條件下，PCR引物只得到一個(gè)片段
N=A,T,G或C；I=肌苷；以按照Sambrook等(上文)分離的枯草芽孢桿菌B13 DNA為模板，用這些引物在不同的退火溫度下(45,50,55和60℃)和不同的鎂濃度(1.25,2.5,5和10mM)下進(jìn)行PCR反應(yīng)，以使PCR反應(yīng)條件最優(yōu)化。選擇出下面的PCR方案在進(jìn)行92℃下2秒鐘的解鏈循環(huán)前，先在94℃下預(yù)解鏈2分鐘，50℃下退火30秒鐘，72℃下擴(kuò)增60秒鐘在，反應(yīng)在5mM濃度的鎂中進(jìn)行。在每種最適條件下，表5所給出的引物只擴(kuò)增一個(gè)片段。這些擴(kuò)增的PCR片段如圖8所示。
將最長(zhǎng)的PCR片段(用引物6465和6470所擴(kuò)增的)克隆到pCR 2.1載體中(Invitrogen Corp.,Inc.,圣地亞哥，美國(guó))并用Sanger雙脫氧法測(cè)定其序列。這樣的結(jié)果是鑒定出了本發(fā)明植酸酶的部分DNA序列(準(zhǔn)確長(zhǎng)度為989bp)。植酸酶基因PCR產(chǎn)物的限制酶分析為了證實(shí)這些PCR片段是植酸酶片段，使用了限制酶HinfⅠ，它能夠?qū)⒆疃痰腜CR片段裂解為兩個(gè)長(zhǎng)度大約為100bp的片段。用HinfⅠ切割所得片段同從N-末端得到的片段的大小一樣。也用EcoRⅠ切割PCR片段，用EcoRⅠ切割的兩個(gè)最長(zhǎng)的植酸酶PCR片段證實(shí)了圖9所示的草圖。植酸酶基因所編碼植酸酶的Southern印跡分析如Sambrook等所描述(上文，1989)，從枯草芽孢桿菌B13中分離出基因組DNA。所用限制酶來自Boehringer-Mannheim那些酶。用EcoRⅠ部分消化枯草芽孢桿菌B13 DNA并在瓊脂糖凝膠中分離消化片段。將分離的片段Southern印跡到尼龍膜上。將尼龍膜同32P標(biāo)記的N-端寡核苷酸探針，GA(C/T)CC(G/A/T)TA(C/T)CA(C/T)TT(C/T)AC(G/A/T)GTNAA(C/T)GC(G/A/T)GC(G/A/T)GAAAC，進(jìn)行雜交以測(cè)定含有推定植酸酶基因的片段的近似大小。Southern印跡顯示出有同圖9給出的基因結(jié)構(gòu)一致，大小約為1700bp和1000bp的兩條帶?？莶菅挎邨U菌B13基因組文庫的篩選按照生產(chǎn)商的建議，用StratageneλZapⅡ/EcoRⅠ/CIAP克隆試劑盒將EcoRⅠ部分消化的枯草芽孢桿菌B 13 DNA克隆到λZapⅡ中。用Boehringer-Mannheim的EasyToHyb雜交試劑盒，根據(jù)生產(chǎn)商提供的建議，以上述用洋地黃毒苷標(biāo)記的最長(zhǎng)PCR片段(989bp)為雜交引物，對(duì)λZapⅡ文庫進(jìn)行篩選。
用100,000pfu的λZapⅡ枯草芽孢桿菌B13基因組文庫噬菌體侵染XL-1Blue MRF’宿主細(xì)胞。將被侵染的細(xì)胞用TOP瓊脂糖在LB瓊脂平皿上涂平板。將形成的噬菌斑轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并用經(jīng)洋地黃毒苷標(biāo)記的989bp的雜交探針進(jìn)行篩選。發(fā)現(xiàn)一些幾乎沒有背景的強(qiáng)陽性克隆。將這些陽性克隆集中并用于第二輪雜交中。在第二輪雜交中，陽性噬菌斑仍然呈陽性，將它們集中并用輔助噬菌體切割以得到pBluescript SK(-)噬菌粒。得到的噬菌粒被轉(zhuǎn)化到大腸桿菌宿主細(xì)胞中并將小量制備所得DNA用于分析插入DNA和DNA的序列。編碼植酸酶基因DNA序列的鑒定編碼植酸酶的DNA序列和推測(cè)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。由SEQ ID NO:1所推測(cè)植酸酶前蛋白分子量大約是41,900道爾頓，推測(cè)成熟蛋白(即沒有信號(hào)序列的蛋白)的分子量大約為39,000道爾頓。這同用SDS-PAGE所測(cè)定的植酸酶的分子量一致(圖1)。
成熟蛋白N-末端相對(duì)于SEQ ID NO:1的第30個(gè)氨基酸(Leu-30)。實(shí)施例3重組植酸酶在大腸桿菌中的表達(dá)用也含有用于克隆到載體pQE-30和pQE-60(Qiagen,Chatsworth,CA，美國(guó))中的限制位點(diǎn)的引物，通過PCR擴(kuò)增編碼成熟肽的DNA。在各種情況下，5’引物編碼MfeⅠ位點(diǎn)(與Eco RⅠ相容)以及后面跟隨的一個(gè)核糖體結(jié)合位點(diǎn)和成熟蛋白的氨基末端。用于構(gòu)建pQE-30的3’引物與天然蛋白終止密碼子以及后面跟隨的一個(gè)用于克隆的SalⅠ位點(diǎn)的下游雜交。將所得的PCR產(chǎn)物克隆到用EcoRⅠ/SalⅠ消化的pQE-30中。這一構(gòu)建體應(yīng)當(dāng)生產(chǎn)同在氨基末端帶有甲硫氨酸的成熟天然產(chǎn)物一樣的蛋白質(zhì)。
用于pQE-30和pQE-60構(gòu)建體的5’引物GTTTCTCAATTGAAGGAGGAATTTAAATGCTGTCCGATCCTTATCATTTTACMfeⅠ RBS MetLeuSerAspProTyrHisPhe用于pQE-30構(gòu)建體的3’引物AATAAGTCGACGTACGACCGGATTCCGGCTGTGCTSalⅠ用于pQE-30構(gòu)建體的3’引物編碼蛋白的C端(不含終止密碼子)以及后面跟隨的BglⅡ克隆位點(diǎn)。載體序列提供了編碼組氨酸標(biāo)記的核苷酸以便于所表達(dá)蛋白的純化。將PCR產(chǎn)物克隆到用Eco RⅠ/BglⅡ消化的pQE-60中。可按照生產(chǎn)商的建議(Qiagen)，用Ni-NTA樹脂從細(xì)胞裂解物中純化這一構(gòu)建體所表達(dá)的酶。
用于pQE-60構(gòu)建體的3’引物AATAAAGATCTTTTTCCGCTTCTGTCGGTCAGTTBglⅡ然后將所述構(gòu)建體轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主M15/pREP4細(xì)胞系中(Quiagen)。使M15/pREP4細(xì)胞系處于感受態(tài)并用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化(Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.,分子克隆，實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，冷泉港出版社，冷泉港，紐約，1989)。該細(xì)胞系含有一個(gè)質(zhì)粒(pREP4)，該質(zhì)粒能組成型地表達(dá)乳糖阻遏蛋白。這使在開放閱讀框上游具有兩個(gè)乳糖阻遏蛋白識(shí)別序列的pQE-30和pQE-60中的表達(dá)構(gòu)建體能夠被強(qiáng)烈抑制。載體用了能夠有效地被大腸桿菌RNA聚合酶識(shí)別的噬菌體T5啟動(dòng)子。這些構(gòu)建體在添加有氨芐青霉素，二甲氧基苯基青霉素和卡那霉素的LB培養(yǎng)基中于37℃下培養(yǎng)過夜。在新鮮培養(yǎng)基中將過夜培養(yǎng)物稀釋到1∶30并生長(zhǎng)至OD600值為0.8，在這時(shí)用1.5mM的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。在經(jīng)過另外3小時(shí)的生長(zhǎng)后，收集并洗滌細(xì)胞，并通過超聲處理裂解。通過離心清除裂解物的殘?jiān)?。清除后的裂解物的等分試樣也用于酶分析。?2℃下，在反應(yīng)緩沖液(100mM Tris-100mM的馬來酸，pH7,1mM的氯化鈣和2mM的肌醇六磷酸鈉)中分析30分鐘。所得結(jié)果如表6所示。
表6
序列表(1)一般資料(ⅰ)申請(qǐng)人(A)姓名芬恩飼料國(guó)際有限公司(B)街道P.O.BOX777(C)城鎮(zhèn)Marlborough(D)城市威斯特郡(E)國(guó)家英國(guó)(F)郵政編碼(ZIP):SN8 1XN(ⅱ)發(fā)明名稱植酸酶，編碼所述植酸酶的基因，植酸酶的生產(chǎn)方法和用途(ⅲ)序列數(shù)目2(ⅳ)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)介質(zhì)類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0,Versopm#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度1290個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型DNA(基因組)(ⅵ)最初來源(A)生物體枯草芽孢桿菌(B)菌株B13(ⅸ)特征(A)名稱/關(guān)鍵詞CDS(B)位置91.1239(ⅹⅰ)序列描述SEQ IDNO:1接原文第28頁到第31頁的序列表1CACATTTGAC AATTTTCACA AAAACTTAAC ACTGACAATC ATGTATATAT GTTACAATTG60AAGTGCACGT TCATAAAAGG AGGAAGTAAA ATG AAT CAT TCA AAA ACA CTT TTG114Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu1 5TTA ACC GCG GCG GCC GGA CTG ATG CTC ACA TGC GGT GCG GTG TCT TCC 162Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser10 15 20CAG GCA AAG CAT AAG CTG TCC GAT CCT TAT CAT TTT ACC GTG AAT GCA 210Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala25 30 35 40GCG GCG GAA ACG GAA CCG GTT GAT ACG GCC GGT GAC GCG GCT GAT GAT 258Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp45 50 55CCT GCG ATT TGG CTG GAC CCC AAG ACT CCT CAG AAC AGC AAA TTG ATT306Pro Ala Ile Trp Leu Asp Pro Lys Thr Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile60 65 70ACG ACC AAT AAA AAA TCA GGT TTA GTC GTT TAC AGC CTT GAT GGT AAG354Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys75 80 85ATG CTT CAT TCC TAT AAT ACC GGG AAG CTG AAC AAT GTC GAT ATC CGT402Met Leu His Ser Tyr Asn Thr Gly Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg90 95 100TAT GAT TTT CCG TTG AAC GGC AAA AAA GTC GAT ATC GCG GCA GCA TCC450Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys Lys Val Asp Ile Ala Ala Ala Ser105 110 115 120AAT CGG TCT GAA GGA AAA AAT ACC ATT GAG ATT TAC GCT ATT GAT GGA498Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly125 130 135AAA AAC GGC ACA TTA CAA AGC ATG ACA GAT CCA GAC CAT CCG ATT GCA546Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Met Thr Asp Pro Asp His Pro Ile Ala140 145 150ACA GCA ATT AAT GAG GTA TAC GGT TTT ACC TTA TAC CAC AGT CAA AAA594Thr Ala Ile Asn Glu Val Tyr Gly Phe Thr Leu Tyr His Ser Gln Lys155 160 165ACA GGA AAA TAT TAC GCG ATG GTG ACA GGA AAA GAG GGT GAA TTT GAA642Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Val Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu170 175 180CAA TAC GAA TTA AAG GCG GAC AAA AAT GGA TAC ATA TCC GGC AAA AAG690Gln Tyr Glu Leu Lys Ala Asp Lys Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys185 190 195 200GTA CGG GCG TTT AAA ATG AAT TCC CAG ACG GAA GGG ATG GCA GCA GAC738Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser Gln Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp205 210 215GAT GAA TAC GGC AGG CTT TAT ATC GCA GAA GAA GAT GAG GCC ATT TGG786Asp Glu Tyr Gly Arg Leu Tyr Ile Ala Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp220 225 230AAG TTC AGC GCC GAG CCG GAC GGC GGC AGT AAC GGA ACG GTT ATC GAC834Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Asp235 240 245CGT GCC GAC GGC AGG CAT TTA ACT CGT GAT ATT GAA GGA TTG ACG ATT882Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr Arg Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile250 255 260TAC TAC GCT GCT GAC GGG AAA GGC TAT CTG ATG GCA TCA AGC CAG GGA930Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly265 270 275 280AAC AGC AGC TAC GCC ATT TAT GAC AGA CAA GGA AAG AAC AAA TAT GTT978Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Asp Arg Gln Gly Lys Asn Lys Tyr Val285 290 295GCG GAT TTT CGC ATA ACA GAC GGT CCT GAA ACA GAC GGG ACA AGC GAT 1026Ala Asp Phe Arg Ile Thr Asp Gly Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp300 305 310ACA GAC GGA ATT GAC GTT CTG GGT TTC GGA CTG GGG CCT GAA TAT CCG 1074Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro315 320 325TTC GGT ATT TTT GTC GCA CAG GAC GGT GAA AAT ATA GAT CAC GGC CAA 1122Phe Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp Gly Glu Asn Ile Asp His Gly Gln330 335 340AAG GCC AAT CAA AAT TTT AAA ATC GTG CCA TGG GAA AGA ATT GCT GAT 1170Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Ile Val Pro Trp Glu Arg Ile Ala Asp345 350 355 360CAA ATC GGT TTC CGC CCG CTG GCA AAT GAA CAG GTT GAC CCG AGA AAA 1218Gln Ile Gly Phe Arg Pro Leu Ala Asn Glu Gln Val Asp Pro Arg Lys365 370 375CTG ACC GAC AGA AGC GGA AAA TAAACATGCA AAAAGCAGCT TATACAAGCT 1269Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys380GCTTTTTGCA TGTGAAGAAC G 1290(2)SEQ ID NO:2的資料(ⅰ)序列特征(A)長(zhǎng)度383個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ⅱ)分子類型蛋白質(zhì)(ⅹⅰ)序列描述SEQ ID NO:2:Met Asn His Ser Lys Thr Leu Leu Leu Thr Ala Ala Ala Gly Leu Met1 5 10 15Leu Thr Cys Gly Ala Val Ser Ser Gln Ala Lys His Lys Leu Ser Asp20 25 30Pro Tyr His Phe Thr Val Asn Ala Ala Ala Glu Thr Glu Pro Val Asp35 40 45Thr Ala Gly Asp Ala Ala Asp Asp Pro Ala Ile Trp Leu Asp Pro Lys50 55 60Thr Pro Gln Asn Ser Lys Leu Ile Thr Thr Asn Lys Lys Ser Gly Leu65 70 75 80Val Val Tyr Ser Leu Asp Gly Lys Met Leu His Ser Tyr Asn Thr Gly85 90 95Lys Leu Asn Asn Val Asp Ile Arg Tyr Asp Phe Pro Leu Asn Gly Lys100 105 110Lys Val Asp Ile Ala Ala Ala Ser Asn Arg Ser Glu Gly Lys Asn Thr115 120 125Ile Glu Ile Tyr Ala Ile Asp Gly Lys Asn Gly Thr Leu Gln Ser Met130 135 140Thr Asp Pro Asp His Pro Ile Ala Thr Ala Ile Asn Glu Val Tyr Gly145 150 155 160Phe Thr Leu Tyr His Ser Gln Lys Thr Gly Lys Tyr Tyr Ala Met Val165 170 175Thr Gly Lys Glu Gly Glu Phe Glu Gln Tyr Glu Leu Lys Ala Asp Lys180 185 190Asn Gly Tyr Ile Ser Gly Lys Lys Val Arg Ala Phe Lys Met Asn Ser195 200 205Gln Thr Glu Gly Met Ala Ala Asp Asp Glu Tyr Gly Arg Leu Tyr Ile210 215 220Ala Glu Glu Asp Glu Ala Ile Trp Lys Phe Ser Ala Glu Pro Asp Gly225 230 235 240Gly Ser Asn Gly Thr Val Ile Asp Arg Ala Asp Gly Arg His Leu Thr245 250 255Arg Asp Ile Glu Gly Leu Thr Ile Tyr Tyr Ala Ala Asp Gly Lys Gly260 265 270Tyr Leu Met Ala Ser Ser Gln Gly Asn Ser Ser Tyr Ala Ile Tyr Asp275 280 285Arg Gln Gly Lys Asn Lys Tyr Val Ala Asp Phe Arg Ile Thr Asp Gly290 295 300Pro Glu Thr Asp Gly Thr Ser Asp Thr Asp Gly Ile Asp Val Leu Gly305 310 315 320Phe Gly Leu Gly Pro Glu Tyr Pro Phe Gly Ile Phe Val Ala Gln Asp325 330 335Gly Glu Asn Ile Asp His Gly Gln Lys Ala Asn Gln Asn Phe Lys Ile340 345 350Val Pro Trp Glu Arg Ile Ala Asp Gln Ile Gly Phe Arg Pro Leu Ala355 360 365Asn Glu Gln Val Asp Pro Arg Lys Leu Thr Asp Arg Ser Gly Lys370 375 380
權(quán)利要求
1．植酸酶或其功能衍生物，其特征為所述植酸酶具有至少20U/mg蛋白的比活，其中所述比活是通過在含有100mM Tris-HCl,pH7.5,1mM氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下，將所述植酸酶溫浴30分鐘而測(cè)定的。
2．根據(jù)權(quán)利要求1的植酸酶，其特征為所述植酸酶有一個(gè)大于等于6.5的最適pH值，其中所述最適pH值是在含有100mM Tris-馬來酸，1mM氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下將所述植酸酶溫浴30分鐘而測(cè)定的，或者所述植酸酶有一個(gè)大于等于7.0的最適pH值，其中所述最適pH值是在含有100mM Tris-HCl,1mM氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中或者在含有小麥麩皮提取物，1mM的氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下，將所述植酸酶溫浴30分鐘而測(cè)定的。
3．根據(jù)權(quán)利要求1或2的植酸酶，其特征為所述植酸酶在動(dòng)物小腸內(nèi)有消化酶存在時(shí)能夠行使功能。
4．根據(jù)權(quán)利要求1到3中的任一植酸酶，其特征為在食品或飼料的處理過程中，同飼養(yǎng)動(dòng)物消化道中的植酸酶相比，所述植酸酶的比活大于等于30％。
5．根據(jù)權(quán)利要求1到4中的任一植酸酶，其特征為所述植酸酶是從微生物中得到的。
6．根據(jù)權(quán)利要求1到5中的任一植酸酶，其特征為所述微生物是芽孢桿菌的一株。
7．根據(jù)權(quán)利要求1到6中的任一植酸酶，其特征為所述芽孢桿菌的菌株選自包括枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌的菌群。
8．根據(jù)權(quán)利要求1到7中的任一植酸酶，其特征為所述芽孢桿菌菌株是枯草芽孢桿菌BS13株，該菌株保藏在位于蘇格蘭的國(guó)家工業(yè)和海洋細(xì)菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏號(hào)為NCIMB-40819。
9．根據(jù)權(quán)利要求1到8中的任一植酸酶，其特征為所述植酸酶含有根據(jù)SEQ ID NO:1的氨基酸序列或其功能衍生物。
10．分離核酸或其功能衍生物，編碼根據(jù)權(quán)利要求1到9中的任一植酸酶。
11．根據(jù)權(quán)利要求10的核酸，其特征為所述核酸含有一個(gè)根據(jù)SEQID NO:1的DNA序列或其功能衍生物。
12．根據(jù)權(quán)利要求10的核酸，其特征為所述核酸同根據(jù)SEQ IDNO:1的DNA序列或其功能衍生物雜交。
13．一個(gè)分離的編碼植酸酶的核酸序列，其特征為所述核酸序列同根據(jù)SEQ ID NO:1的DNA雜交并編碼植酸酶，該植酸酶具有大于或等于5.0的最適pH值以及至少10U/mg蛋白的比活，該比活是在含有100mM Tris-馬來酸，1mM氯化鈣，以及1.6mM的肌醇六磷酸鈉的溶液中于37℃下溫浴植酸酶30分鐘而測(cè)定的。
14．根據(jù)權(quán)利要求10到13的任一核酸，其特征為所述核酸是DNA分子。
15．含有根據(jù)權(quán)利要求14的DNA分子的載體。
16．根據(jù)權(quán)利要求15的載體，其特征為所述DNA分子被有效地連接到能夠使所述DNA序列表達(dá)植酸酶的調(diào)節(jié)序列上。
17．根據(jù)權(quán)利要求16的載體，其特征為所述DNA分子含有一個(gè)能夠使所述植酸酶分泌的引導(dǎo)序列。
18．用根據(jù)權(quán)利要求10到17的任一核酸或載體所轉(zhuǎn)化的原核宿主細(xì)胞。
19．根據(jù)權(quán)利要求18的原核宿主細(xì)胞，其特征為所述宿主細(xì)胞選自包括大腸桿菌，芽孢桿菌屬，乳酸桿菌屬以及乳酸球菌屬的群體。
20．用根據(jù)權(quán)利要求10到17的任一核酸或載體所轉(zhuǎn)化的真核宿主細(xì)胞或生物體。
21．根據(jù)權(quán)利要求20的真核宿主或生物體，其特征為所述宿主細(xì)胞選自包括曲霉屬，腐質(zhì)霉屬，畢赤氏酵母屬，木霉屬，糖酵母屬，以及象大豆，玉米和油菜籽一樣的植物類群。
22．植酸酶重組產(chǎn)物的制備方法，其特征為在適宜的條件下培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求18到21的任一宿主細(xì)胞或生物體并回收所述植酸酶。
23．根據(jù)權(quán)利要求1到9的任一植酸酶在食品或動(dòng)物飼料中的用途。
24．含有根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一植酸酶的食品或動(dòng)物飼料。
25．根據(jù)權(quán)利要求24的食品或動(dòng)物飼料，其特征為所述食品或動(dòng)物飼料含有在所述動(dòng)物消化道中具有活性的植酸酶作為添加劑。
26．根據(jù)權(quán)利要求24的食品或動(dòng)物飼料，其特征為所述食品或動(dòng)物飼料含有在食品或動(dòng)物飼料處理過程中具有活性的植酸酶作為添加劑。
27．生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求24到26的食品或動(dòng)物飼料的方法，其特征為所述植酸酶是以液態(tài)形式噴灑到所述食品或動(dòng)物飼料上。
28．生產(chǎn)根據(jù)權(quán)利要求24到26的食品或動(dòng)物飼料的方法，其特征為所述植酸酶是以干燥產(chǎn)品的形式同所述食品或動(dòng)物飼料相混合的。
29．根據(jù)權(quán)利要求24到26的動(dòng)物飼料是用于選自由包括家禽的鳥類，包括牛、羊和豬的反芻動(dòng)物以及包括魚和蝦的水生養(yǎng)殖動(dòng)物所構(gòu)成的類群。
30．根據(jù)權(quán)利要求1到9的任一植酸酶是用于生產(chǎn)肌醇，無機(jī)磷酸鹽和磷酸化的中間產(chǎn)物。
31．降低動(dòng)物糞尿中植酸酶水平的方法，其特征為用一定量能夠有效轉(zhuǎn)化所述動(dòng)物飼料中植酸酶的根據(jù)權(quán)利要求24到26的動(dòng)物飼料來飼養(yǎng)動(dòng)物。
32．編碼根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一植酸酶的核酸的生產(chǎn)方法，其特征為含有根據(jù)權(quán)利要求10到13中任一核酸的引物同懷疑含有的所述核酸的試樣雜交以及回收所述核酸。
33．用能夠表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到9中任一植酸酶的的原核細(xì)胞或孢子作為微生態(tài)制劑或直接飼養(yǎng)動(dòng)物的微生物。
34．含有能夠表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到9的植酸酶的原核細(xì)胞或孢子的食品或動(dòng)物飼料。
35．食品或動(dòng)物飼料的生產(chǎn)方法，其特征為將能夠表達(dá)根據(jù)權(quán)利要求1到9的植酸酶的原核細(xì)胞和/或孢子加到食品或動(dòng)物飼料中。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有的比活至少為20U/mg蛋白的植酸酶或其功能衍生物。本發(fā)明還涉及編碼所述植酸酶的核酸和生產(chǎn)植酸酶的方法以及植酸酶在農(nóng)業(yè)、食品和動(dòng)物飼料處理過程中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1228120SQ97197336
公開日1999年9月8日 申請(qǐng)日期1997年8月12日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月13日
發(fā)明者尤哈·阿帕雅拉蒂, 佩卡·?；鶎? 雅納·凱魯武奧, 馬爾科·勞拉尤斯, 安德魯·摩根, 佩伊維·努爾米寧, 奧斯莫·西卡寧 申請(qǐng)人:芬恩飼料國(guó)際有限公司