采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法，利用雙酚A對人乳腺癌細胞（MCF-7）的作用作為細胞增殖活性的研究模型；先將多壁碳納米管滴涂在玻碳電極上固定粘纖蛋白RGDSK，隨后將細胞固定在修飾電極的表面，然后以此細胞電極為工作電極，鉑電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，基于差分脈沖伏安法的電化學(xué)方法，檢測MCF-7細胞的增殖情況，并且根據(jù)電流與污染物的作用濃度和作用時間的繪制出線性關(guān)系曲線。與現(xiàn)有傳統(tǒng)檢測細胞增殖活性的MTT技術(shù)相比，細胞電極與傳統(tǒng)方法的檢測結(jié)果基本一致，同時可以避免傳統(tǒng)檢測過程中化學(xué)試劑對檢測人員的傷害，操作也較傳統(tǒng)方法快速易與操作，并且檢測結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性和較高的靈敏度，為檢測污染物的細胞毒性提供了一個新平臺，具有重要的實際應(yīng)用意義。
【專利說明】采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及屬于生物化學(xué)、電化學(xué)分析與環(huán)境監(jiān)測【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是涉及一種采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在過去的40年里，大量的證據(jù)表明環(huán)境化學(xué)品如殺蟲劑和工業(yè)化學(xué)物質(zhì)，已經(jīng)在野生動物和人類體內(nèi)起到了類激素作用。環(huán)境激素大多數(shù)為有機污染物，我們使用的農(nóng)藥，如2，4- 二氯苯氧乙酸、甲氧滴滴涕等有機氯農(nóng)藥等。這類物質(zhì)可對人體和動物體內(nèi)正常的激素功能施加影響，抑制內(nèi)分泌系統(tǒng)，使內(nèi)分泌系統(tǒng)失調(diào)，導(dǎo)致各種生物生殖功能下降，進而阻礙生殖、發(fā)育等機能；有些作用于生命體的最基本單元——細胞，影響細胞的生長和代謝作用，破壞細胞正常的分裂增殖過程甚至有引發(fā)惡性腫瘤與生物絕種的危害。
[0003]細胞的增殖過程在生物的生命中扮演著重要的作用。如果細胞增殖發(fā)生紊亂，細胞則發(fā)生癌變。在生命科學(xué)中，細胞增殖的過程采用體外培養(yǎng)的腫瘤細胞作為模型，在培養(yǎng)過程中給予一定濃度的藥物或者加入外源光照等，考察細胞質(zhì)增殖活性的變化。檢測細胞增殖的方法主要包括細胞計數(shù)法、盼臺蘭染色法、以及MTT等方法。其中MTT方法是一種最易實現(xiàn)也是最常見的檢測細胞增殖活性的方法，它是根據(jù)測得的吸光度值(0D值)來判斷活細胞數(shù)量，OD值越大，細胞增殖活性越強。但是MTT實驗過程中，有機溶劑(例如DMS0)會對實驗人員造成一定損傷；且實驗操作中人為操作過程具有不確定性，容易對實驗結(jié)果造成影響，使得這種方法存在一定的局限性。
[0004]電化學(xué)方法具有操作簡單、快速，成本低，可以在線監(jiān)測，環(huán)境友好等特點。BPA(雙酚A)是一種典型的類雌激素性質(zhì)的物質(zhì)，對MCF-7細胞增殖具有促進作用。這一典型的現(xiàn)象能夠為我們提供一個模型體系，從而考察我們制備的電化學(xué)(細胞電極)方法相比MTT方法在檢測細胞增殖活性方面的優(yōu)越性。最終，基于差分脈沖伏安法(DPV)的電化學(xué)方法，檢測了 MCF-7細胞增殖的情況，與MTT實驗結(jié)果十分吻合。本文提出了一種新穎檢測細胞增殖活性的方法，為檢測污染物的細胞毒性提供了一個新平臺，具有重要的實際應(yīng)用意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法，本發(fā)明利用電化學(xué)方法中的差分脈沖伏安法(DPV)，快速靈敏檢測MCF-7細胞增殖的情況，這與傳統(tǒng)的檢測細胞增殖活性的MTT實驗結(jié)果十分吻合，同時避免了傳統(tǒng)方法對實驗人員的毒性以及檢測的不確定性。這種新穎的檢測細胞增殖活性方法，具有檢測范圍寬，靈敏度高，重復(fù)性能好等優(yōu)點，為檢測污染物的細胞毒性提供了一個新平臺，具有重要的實際應(yīng)用意義。
[0006]本發(fā)明提出的采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法，具體步驟如下:
(I)MCF-7細胞的培養(yǎng)
用標(biāo)準培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，CO2細胞培養(yǎng)箱(5% CO2, 37° C)孵育細胞，每天換液一次。細胞呈單層生長到70%左右即進行細胞傳代。去除培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)殘液，加入0.04% EDTA,漱洗后吸出，再加入10(T200uL 0.25%胰酶(覆蓋整個瓶底)，37°C孵育3-5分鐘。電鏡下觀察細胞形態(tài)變化，待細胞變圓，折光增強，用含血清培養(yǎng)液中止消化，反復(fù)吹打瓶壁，制成細胞懸液，移入離心管，1500rpm，室溫離心5分鐘后，去上清，用新鮮培養(yǎng)液懸浮沉淀；
(2)采用BPA對MCF-7細胞的作用作為研究模型，制備MCF-7細胞電極
將玻碳電極分別用1.0,0.3,0.05微米的三氧化二鋁粉末研磨光滑，分別在濃HN03:H2S04 (1:1)和乙醇溶液中超聲，清洗干凈的玻碳電極表面滴涂先前制備的多壁碳納米管，紅外燈下干燥后，在制備好的玻碳電極表面滴涂多肽RGDSK，將電極在37 V下恒溫培養(yǎng)3小時取出備用，4 V保存；隨后，將培養(yǎng)好的MCF-7細胞滴涂在玻碳電極表面，37 V恒溫培養(yǎng)2小時后取出，得到MCF-7細胞電極，立即進行電化學(xué)掃描；MCF-7細胞電極用于檢測不同時間和劑量BPA作用于MCF-7細胞后，觀察細胞增殖活性的變化；
(3)基于差分脈沖伏安法的電化學(xué)方法，檢測MCF-細胞增殖情況
利用電化學(xué)工作站中三電極體系，步驟⑵制備得到的MCF-7細胞電極為工作電極、鉬片為對電極、飽和甘汞電極為參比電極進行電化學(xué)檢測，電解質(zhì)為含有5mM的K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]的10Mm/L的PBS溶液，溶液PH值為7.4，利用循環(huán)伏安法(CV)和差分脈沖伏安法(DPV)對裸玻碳電極和修飾后的MCF-7細胞電極做了基本的電化學(xué)表征。根據(jù)電流與標(biāo)準溶液濃度的線性關(guān)系繪制工作曲線，檢測MCF-7細胞的增殖情況。
[0007]電極的組裝與表征
1984年確定肽鏈RGD為纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)與其受體的特異性結(jié)合位點，具有粘結(jié)劑的作用。生物公司合成了環(huán)肽RGDSK用于細胞和基底的粘合劑，使用電阻率低、導(dǎo)電性能穩(wěn)定的玻碳電極(GCE)作為基底電極。因此，選擇具有雌激素受體(ER)的人卵巢上皮癌細胞(MCF-7，-ER)進行體外實驗；制備合成細胞電極，電極的電鏡表征圖如圖2所示，利用快速靈敏的電化學(xué)方法進行細胞毒性的檢測，并與傳統(tǒng)的生物方法比較，取得了理想的結(jié)果。較傳統(tǒng)的MTT方法，電化學(xué)方法更加便捷和安全。
[0008]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下的優(yōu)點:
(O電化學(xué)方法和MTT方法的結(jié)果在很寬的范圍內(nèi)都是一致的，證明了我們引入的電化學(xué)方法的準確性。
[0009](2)電化學(xué)方法具有信號穩(wěn)定，靈敏度高，對檢測人員身體無危害等特點，并且檢測結(jié)果準確，這樣避免了傳統(tǒng)方法的缺陷。
[0010](3)在檢測過程中，采用了多壁碳納米管放大電信號，粘纖蛋白RGDFK很好的將細胞與電極表面附著，提出了一種新穎的細胞電極和細胞毒性的檢測方法。
[0011](4)本發(fā)明的電化學(xué)檢測方法實現(xiàn)了對細胞毒性的檢測，采用的儀器廉價便攜，方法簡單易行，并具有較高的靈敏度，且與傳統(tǒng)生物方法結(jié)果一致，是電化學(xué)方法在生物領(lǐng)域的拓展和應(yīng)用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為采用分子印跡功能化的修飾電極的光電化學(xué)分析裝置的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0013]圖2為MCF-7細胞組裝在修飾電極前后的電鏡圖。
[0014]圖3實施例1電化學(xué)方法檢測不同時間BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。
[0015]圖4實施例1電化學(xué)方法檢測不同濃度BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。
圖5實施例2電化學(xué)方法檢測不同時間BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。
圖6實施例2電化學(xué)方法檢測不同濃度BPA作用MCF-7細胞增殖活性及與MTT方法比較。
【具體實施方式】
[0016]下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明進行詳細說明。
[0017]實施例1
本1984年確定肽鏈RGD為纖粘連蛋白(fibronectin，F(xiàn)N)與其受體的特異性結(jié)合位點，具有粘結(jié)劑的作用。生物公司合成了環(huán)肽RGDSK用于細胞和基底的粘合劑，使用電阻率低、導(dǎo)電性能穩(wěn)定的玻碳電極(GCE)作為基底電極。因此，選擇具有雌激素受體(ER)的人卵巢上皮癌細胞(MCF-7，-ER)進行體外實驗；制備合成細胞電極，電極的電鏡表征圖如圖2所示，利用快速靈敏的電化學(xué)方法進行細胞毒性的檢測，并根據(jù)細胞毒性檢測實驗的要求，設(shè)定BPA濃度效應(yīng)為1000 nMUOO ηΜ、10 ηΜ、1 ηΜ、0.I ηΜ的遞減濃度，孵育24 h, BPA對MCF-7細胞的作用效果如示意圖3所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著BPA作用濃度的不斷遞增，細胞不斷增殖，可見BPA的加入促進了細胞的增殖。且在相同的作用濃度下，進行MTT實驗，利用MTT和電化學(xué)方法所對應(yīng)的增值率基本一致。示意圖4。
[0018]實施例2
以環(huán)肽RGDSK用于細胞和基底的粘合劑，使用電阻率低、導(dǎo)電性能穩(wěn)定的玻碳電極(GCE)作為基底電極。因此，選擇具有雌激素受體(ER)的人卵巢上皮癌細胞(MCF-7，-ER)進行體外實驗；制備合成細胞電極。實驗中，我們根據(jù)檢測細胞增殖活性的一般方法，設(shè)定檢測濃度和時間，我們可以發(fā)現(xiàn)，首先，BPA確實是促進了 MCF-7細胞的增殖，這與文獻的報道是一致的；其次，電化學(xué)方法和MTT方法的結(jié)果在很寬的范圍內(nèi)都是一致的，證明了我們引入的電化學(xué)方法的準確性。時間效應(yīng)為48 h、24 h、12 h、8 h、4 h，采用1000 nM的BPA濃度，BPA對MCF-7細胞的作用效果如圖5所示?？梢园l(fā)現(xiàn)，隨著BPA作用時間的不斷遞增，細胞不斷增殖，可見BPA的加入促進了細胞的增殖。且不同的時間點，利用MTT和電化學(xué)方法所對應(yīng)的增值率基本一致。示意圖6。
[0019]實施例3
此外，我們還在其他細胞和不同環(huán)境雌激素作用的MCF-7細胞中推廣使用了這種檢測方法，我們選擇了 HEK293細胞中分別加入環(huán)境污染物BPA、BDE，利用我們的細胞電極進行檢測。因為HEK293細胞對環(huán)境污染物BDE本身的響應(yīng)就大于對BPA的響應(yīng)，且其他實驗和文獻都發(fā)現(xiàn)，上述兩種污染物是抑制HEK293細胞增殖的，這與細胞電極的檢測結(jié)果是一致的。可見我們的細胞電極是可以得到通用的，但是檢測的結(jié)果不是很準確，而且與加入BPA的MCF-7細胞比較發(fā)現(xiàn)，其靈敏度較低，這表明我們開發(fā)的電化學(xué)方法對MCF-7細胞的專一性更強。當(dāng)然，一些本身就具有電化學(xué)活性的細胞對此實驗方法并不適用，特此說明。
[0020]細胞電極采用以下步驟制作:以制備的細胞電極為工作電極，Pt電極為輔助電極，飽和甘汞電極為參比電極，在三電極體系中，將玻碳電極分別用1.0,0.3,0.05微米的三氧化二鋁粉末研磨光滑，分別在濃HNO3 =H2SO4 (1:1)和乙醇溶液中超聲，清洗干凈的電極表面滴涂先前制備的多壁碳納米管，紅外燈下干燥后，在制備好的電極表面滴涂多肽RGDSK，將電極在37 V下恒溫培養(yǎng)3小時取出備用，4 V保存。隨后，將培養(yǎng)好的MCF-7細胞滴涂在電極表面，37 V恒溫培養(yǎng)2小時后取出，立即進行電化學(xué)掃描。細胞電極用于檢測不同時間和劑量BPA作用于MCF-7后，細胞增殖活性的變化。
[0021]利用電化學(xué)工作站中三電極體系，制備的細胞電極為工作電極、鉬片為對電極、飽和甘汞電極為參比電極進行電化學(xué)檢測，電解質(zhì)為含有5mM的K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]的10Mm/L的PBS溶液，實驗裝置圖如圖1所示。
【權(quán)利要求】
1.一種采用細胞電極電化學(xué)檢測細胞增殖活性的方法，其特征在于具體步驟如下: (1)MCF-7細胞的培養(yǎng) 用標(biāo)準培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，5% CO2, 37° C的CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育細胞，每天換液一次；細胞呈單層生長到68-72%即進行細胞傳代；去除培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)殘液，加入0.04% EDTA,漱洗后吸出，再加入10(T200uL 0.25%胰酶(覆蓋整個瓶底)，37°C孵育3_5分鐘；電鏡下觀察細胞形態(tài)變化，待細胞變圓，折光增強，用含血清培養(yǎng)液中止消化，反復(fù)吹打瓶壁，制成細胞懸液，移入離心管，1500rpm，室溫離心5分鐘后，去上清，用新鮮培養(yǎng)液懸浮沉淀； (2)采用BPA對MCF-7細胞的作用作為研究模型，制備MCF-7細胞電極 將玻碳電極分別用1.0,0.3,0.05微米的三氧化二鋁粉末研磨光滑，分別在體積比為濃HN03和H2S04以及乙醇溶液中超聲，清洗干凈的玻碳電極表面滴涂先前制備的多壁碳納米管，紅外燈下干燥后，在制備好的玻碳電極表面滴涂多肽RGDSK，將玻碳電極在37 V下恒溫培養(yǎng)3小時取出備用，4 V保存；隨后，將培養(yǎng)好的MCF-7細胞滴涂在玻碳電極表面，37 V恒溫培養(yǎng)2小時后取出，得到MCF-7細胞電極，立即進行電化學(xué)掃描；MCF-7細胞電極用于檢測不同時間和劑量BPA作用于MCF-7細胞后，觀察細胞增殖活性的變化； (3)基于差分脈沖伏安法的電化學(xué)方法，檢測MCF-細胞增殖情況 利用電化學(xué)工作站中三電極體系，步驟⑵制備得到的MCF-7細胞電極為工作電極、鉬片為對電極、飽和甘汞電極為參比電極進行電化學(xué)檢測，電解質(zhì)為含有5mM的KJFe(CN)6]/K4 [Fe (CN)6]的10Mm/L的PBS溶液，利用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法對裸玻碳電極和修飾后的MCF-7細胞電極做了基本的電化學(xué)表征；根據(jù)電流與污染物作用濃度和作用時間的繪制出線性關(guān)系曲線，檢測MCF-7細胞的增殖情況。
【文檔編號】G01N27/30GK103954663SQ201410137557
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月8日
【發(fā)明者】曹同成, 尹蓉, 趙國華, 顧靚 申請人:同濟大學(xué)