專利名稱：植酸酶及其基因的克隆和表達(dá)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植酸酶及其基因的克隆和表達(dá)的方法。本發(fā)明也涉及產(chǎn)生這種植酸酶的菌株。
磷是一種所有動物生長都需要的重要礦物質(zhì)。磷占動物機體礦物質(zhì)總量的四分之一還多，其中80％的磷以羥磷灰石的形式存在于骨胳中。骨骼不僅作為身體的骨架，而且也是鈣、磷和其他礦物質(zhì)的貯存庫，當(dāng)需要時它們能動員到其它組織中。另外的20％的磷存在于肌肉、血液和其它軟骨組織中。它們作為許多有機化合物的組成成分，參與體內(nèi)幾乎每一種生命所需的生理生化反應(yīng)。由于磷有如此重要的生物學(xué)功能，所以在動物日糧中提供充足的磷是非常重要的。否則，組織的生長受到抑制、骨骼變軟變脆，長期磷缺乏會導(dǎo)致生長動物的佝僂病和成年動物的骨質(zhì)疏松癥，從而影響動物的生長。
目前在單胃動物如雞、豬等飼料中是添加無機磷如磷酸氫鈣來滿足動物對磷的需求。但是在主要以植物性飼料為主的動物日糧中本身就含有豐富的磷，只不過是因為它們主要以動物不能利用的植酸磷的形式存在而已。
植酸磷是谷物、豆類和油料等作物籽實中磷和肌醇的基本貯存形式，含量高達(dá)1-5％(Lolas M.Et al.Food Sci.421094-1097，1977).它占植物中總磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷卻因單胃動物體內(nèi)缺乏能分解植酸的酶而難以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.Alltech Technical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率僅在0-40％。
植酸磷不能被單胃動物有效利用，從而在飼喂過程中造成了許多問題，第一、造成磷源浪費。一方面飼料中的磷源不能得到有效利用，另一方面為了滿足動物對磷的需求，又必須在飼料中額外添加無機磷，提高了飼料成本。在實際生產(chǎn)中，添加無機磷時還常因無機磷中殘留有氟、重金屬等元素而造成動物中毒。第二、形成高磷糞便而污染環(huán)境。飼料中85％左右的植酸磷會被動物直接排出體外，糞便中大量的磷使水和土壤受到嚴(yán)重污染。目前許多歐洲國家如荷蘭等已因此問題開始限制畜禽的養(yǎng)殖數(shù)量。我國是畜牧生產(chǎn)大國，單胃動物占畜禽總數(shù)的比例遠(yuǎn)高于西方國家，因此，防止磷對環(huán)境的污染在我國更具有特殊的意義。第三、植酸磷還是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子，它在動物腸胃道的消化吸收過程中會與多種金屬離子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白質(zhì)螯合成相應(yīng)的不溶性復(fù)合物，從而降低了動物對這些營養(yǎng)元素的有效利用(Sharma C.B.et al.，且Phytochemistry.17201-204，1978).
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一種能水解植酸的酶類。它能將植酸磷降解為肌醇和磷酸。植酸酶廣泛存在于微生物中，如枯草芽孢桿菌(Paver，V.K.J.，Bacteriol.1511102-1108，1982)，假單孢桿菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸桿菌(Shirai K.，Letters Appl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大腸桿菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)。其中來源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)具有較好的耐熱性，在酸性條件下有較高的酶活性，被認(rèn)為是目前最有應(yīng)用前景的飼用植酸酶。它的最適pH值為2.5和5.5，最適溫度為55℃，特異比酶活性為10萬U/mg酶蛋白。
植酸酶的飼喂效果已在世界范圍內(nèi)得到了確證(Ware J.H.et al.，USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性飼料中磷的利用率提高60％，糞便中磷排泄量減少40％，還可降低植酸磷的抗?fàn)I養(yǎng)作用。因此對提高畜牧業(yè)生產(chǎn)效益及降低植酸磷對環(huán)境的污染有重要意義。
雖然植酸酶具有良好的飼喂效果，但到目前為止它還沒有在飼料工業(yè)上得到廣泛應(yīng)用，其根本原因在于，在天然微生物中植酸酶的表達(dá)量太低，從而難以大量獲得廉價的植酸酶產(chǎn)品，不能滿足飼料工業(yè)發(fā)展的要求(Han Y.W.，Animal Feed Sci.Technol.，24345-350，1989).隨著生物技術(shù)、基因工程等高新技術(shù)的發(fā)展，人們意識到通過基因工程的手段，利用生物反應(yīng)器來高效表達(dá)植酸酶基因可望達(dá)到大幅度提高植酸酶產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的目的(Conneely O.M.，Biotechnology in the Feed Industry，T.P.Lyons(Ed)，Alltech Technical Publications.Nicholasville，K Y.57-66，1992).
幾種微生物來源的植酸酶基因已得到了分離，如酵母Saccaromycescerevisiae(Bajwa W.，Nucleic Acids Res.127721-7739，1984)、Aspergillus niger(MacRae W.D.，Gene，71339-348，1988)、A.terreus和Myceliophthora thermophila(van Loon，Patent NO.EP 0684313A2，1995)、A.niger(ficuum)(van Hartimgsveldt et al.，Gene，12787-94，1993；Ehrlich K.C.，Biocem.Biophys.Res.Comm.19553-57，1993)、A.niger var.awamori(Piddington C.S.Gene，13355-62，1993)等。
植酸酶基因表達(dá)的研究主要集中在來源于A.niger(ficuum)的植酸酶基因phyA和phyB上。如1993年在A.niger ALK02268中表達(dá)了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表達(dá)量比原菌株提高了幾倍，約為329U/mL(Piddington C.S.，Gene，12787-94，1993)。同年，將來源于A.ficumm NRRL3135的phy基因?qū)Щ卦?，使phyA基因的拷貝數(shù)增加到15個以上，從而使植酸酶的表達(dá)量提高到7600U/mL(Van HartingsveldtW.et al.，Gene，12787-94，1993Van Gorcom R.F.M.et al，PantentNo.US 5436156，1995)。Moore E.等在A.oryzae中表達(dá)來源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和來源于A.niger 762的phyB基因，其結(jié)果也是使表達(dá)量分別提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.et al.，J.Ind.Microbiol，14396-402，1995)。另外，也曾有人嘗試了在Trichoderma中表達(dá)植酸酶基因phyA和phyB(Nevalainen H.K.M.et al.，Pantent No.Wo 94/03612，1994)以及嘗試了用基因工程的方法改造植酸酶基因使其具有更好的耐溫性并在黑曲霉中表達(dá)(Van Loon A.Patent No.EP0684313A2，1995)。以上的這些表達(dá)研究，從總體上看，其表達(dá)水平還較低，難以獲得大量產(chǎn)品，生產(chǎn)成本過高。
本發(fā)明的目的之一是篩選一種可產(chǎn)生高比活性植酸酶的天然菌株。同時，所產(chǎn)生的植酸酶在最適pH值、最適溫度等生理生化特性上還具有適合于在飼料中作為添加劑使用所要求的特性。
本發(fā)明按常規(guī)方法(cosgrove，D.J.et al.Aust.J.Biol.Sci.23339-343，1970)從土壤中篩選分泌植酸酶的黑曲霉天然菌株，進(jìn)一步對所產(chǎn)植酸酶進(jìn)行生理生化性質(zhì)研究(Vallah A.H.J.Prep.Biochem.，18459-471，1988)。本發(fā)明篩選出了具有高活性并且適于在飼料中使用的植酸酶產(chǎn)生菌株A.niger 963。
經(jīng)檢測，該菌株所產(chǎn)生的植酸酶PHYA2的比活為1000萬U/mg酶蛋白，而目前報道的植酸酶PHYA的比活為10萬U/mg(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)。適合于在飼料中使用的植酸酶應(yīng)具備的最基本特性之一是，在酸性條件下必需有較高的酶活性，因為植酸酶的主要作用場所是在單胃動物酸性的胃中(pH1.5-3.5)。本發(fā)明的植酸酶有兩個最適的pH值，分別為1.6-2.0之間和5.5-5.9之間，最佳點在約1.8和5.7，而且在pH1.6至5.9的整個范圍內(nèi)能維持較高的酶活性，這樣就更有利于它在動物胃中起作用，因而具備了在飼料中使用的優(yōu)良特性。另外，與已報道的并已在生產(chǎn)上有所應(yīng)用的黑曲霉植酸酶PHYA(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)相比，它們第一酶活峰分別為pH5.7和5.5，相差不大，但PHYA2的另一最適pH為1.8，而PHYA為2.5，同時它在pH1.8的酶活性為在pH5.7時的77％，在pH1.8至5.7的范圍內(nèi)的最低酶活性(在pH3.0)也有近40％左右的剩余酶活性，而PHYA分別為50％和25％(在pH3.0)。從這些數(shù)據(jù)來看，PHYA2比PHYA具有更適合于在飼料中使用的特性。表1.A.niger 963與A.niger var.awamori(A.ficuum NRRL3135)(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所產(chǎn)的植酸酶的異同點酶特性 A.niger 963 A.niger var.awamori(本發(fā)明) (A.ficuum NRRL3135)酶比活性 1000萬U/mg蛋白 10萬U/mg蛋白蛋白質(zhì)分子量 85kD 85/100kD最適pH值 1.8，5.7 2.5，5.5最適溫度(℃) 5550/58潛在糖基化位點9 10氨基酸序列同源性 91.6％基因序列同源性 91.8％本發(fā)明篩選出的黑曲酶菌株(Aspergillus niger)已于1997年11月24日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市中關(guān)村北一條13號，郵編100080)進(jìn)行了保藏。保藏號為CGMCC 0332.
本發(fā)明的目的之二是分離克隆此高比活的植酸酶編碼基因。從A.niger 963中提取基因組DNA，通過PCR方法(Maniatis T.，et al.Molecular cloning.New YorkCold Spring harbor laboratory，1982)釣出植酸酶基因phyA2，然后克隆到大腸桿菌的質(zhì)粒克隆載體如pPUC18、pPGEM等上，并進(jìn)一步對此基因進(jìn)行全序列分析。DNA全序列分析結(jié)果表明，phyA2結(jié)構(gòu)基因全長1506個核苷酸，其中+46～+147的102個核苷酸序列是一典型的真菌內(nèi)含子序列，其上有真菌內(nèi)含子的特征保守序列Donor序列-GTATGC、Lariat序列-GCTGAC及Acceptor序列-CAG。PhyA2基因編碼467個氨基酸，N端的19個氨基酸為信號肽，信號肽的切割位點在+19位的Gly之后。來源于黑曲霉的植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA2編碼的氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)了9個潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr，X為任意氨基酸)。從氨基酸推斷出的理論分子量約為52KD。從氨基酸序列上還找到了植酸酶的活性位點序列(Active-site sequence)CQVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52～+74。RHGERYPS是微生物來源的植酸酶活性位點中最保守的序列，在PHYA2上相應(yīng)的序列為RHGARYPT。PhyA2基因中G+C含量達(dá)到54.7％，密碼子第三位堿基的G+C含量更高達(dá)68.8％，在密碼子第三位堿基上高頻使用G和C堿基是曲霉中高表達(dá)蛋白編碼序列所具有的特征之一。phyA2與已報道的來源于Aspergillusniger(ficuum)var.awamori的植酸酶基因phyA(Van Gorcom R.F.M.etal.，Patent No.US 5436156，1995)相比較，在DNA序列上有123個核苷酸的差異，同源性為91.8％。編碼的氨基酸序列上有39個氨基酸不同，同源性為91.6％。在phyA編碼的PHYA蛋白上有10個潛在的糖基化位點，而在PHYA2上有9個，其中8個與PHYA上的位置相同。
phyA2結(jié)構(gòu)基因的DNA序列和推導(dǎo)出的氨基酸序列如圖5所示。
本發(fā)明的目的之三是提供一種針對各表達(dá)系統(tǒng)的不同特點，對植酸酶基因加以改造以使它能在特定的表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)的改造體。
基因的改造可利用已知的PCR技術(shù)、定點突變技術(shù)、基因設(shè)計后化學(xué)合成等技術(shù)來實現(xiàn)。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，我們除了將植酸酶基因phyA2原有的信號肽序列和內(nèi)含子除掉，另外還在分子水平上對基因的密碼子進(jìn)行了改造。具體是把第85位、146位、159位和466位的Arg密碼子CGG和CGA這兩種在酵母中極少使用的密碼子(Sharp，P.M.et al.Neucleic)點突變成酵母高頻使用的密碼子AGA。改造后的DNA序列如圖8所示。
類似思路也同樣可用來改造植酸酶基因使它在別的表達(dá)系統(tǒng)中各項表達(dá)，如借助桿狀病毒的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、霉菌表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)等。
在本發(fā)明的一個實方案中，將改造后的植酸酶基因插入到帶有a-因子信號肽序列的酵母表達(dá)載體上(購自Invitrogen)，經(jīng)轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，穩(wěn)定整合到酵母染色體上，此重組酵母經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后，表達(dá)的植酸酶蛋白在信號肽的引導(dǎo)下分泌到培養(yǎng)基中。
經(jīng)測定，植酸酶表達(dá)量達(dá)到500000U/mL，其表達(dá)水平是原始菌株A.niger 963的3000倍，比phyA2基因沒有改造的提高了37倍，也比國際最新的專利(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所報道的表達(dá)水平高80％。
本發(fā)明的目的之四是提供一種含有改造后的植酸酶基因的重組表達(dá)系統(tǒng)。
選擇高效表達(dá)系統(tǒng)-P.pastoris作為表達(dá)phyA2的生物反應(yīng)器。通過體內(nèi)重組使含有phyA2的酵母表達(dá)載體整合到酵母的基因組上，篩選出陽性重組子，并在分子水平上進(jìn)行驗證(Southern blotting、Northernblotting及SDS-PAGE等)。
其它的真核表達(dá)系統(tǒng)如桿狀病毒的昆蟲表達(dá)系統(tǒng)、霉菌表達(dá)系統(tǒng)、植物表達(dá)系統(tǒng)等也適應(yīng)與此植酸酶基因的高效表達(dá)。
本發(fā)明優(yōu)選的畢赤酵母(P.pastoris)表達(dá)系統(tǒng)與Van Gorcom R.F.M.等的專利(Patent No.US 5436156，1995)所采用的宿主菌霉菌相比，畢赤酵母具有很多方面的優(yōu)勢。第一，霉菌的生長繁殖周期比畢赤酵母長很多，第二，霉菌的營養(yǎng)生長是通過菌絲體尖端的伸長生長實現(xiàn)的，這種生長特性尤其適合固體培養(yǎng)，而并不適合現(xiàn)代發(fā)酵工藝所常用的液態(tài)發(fā)酵，一般而言固體發(fā)酵工效低，周期長，成本高，由此使獲得大量發(fā)酵產(chǎn)品的成本比之液態(tài)發(fā)酵要增加很多。相比之下，畢赤酵母是通過裂殖而增加營養(yǎng)體的，這種繁殖特性十分適合液態(tài)發(fā)酵；第三，霉菌營養(yǎng)體在生長發(fā)育期間需要提供足夠的較復(fù)雜的碳氮有機養(yǎng)分，這也會增加發(fā)酵成本，畢赤酵母營養(yǎng)體的生長發(fā)育主要利用廉價的簡單養(yǎng)分如甲醇、葡萄糖和氨水等，獲得同等量的營養(yǎng)體畢赤酵母比霉菌消耗的養(yǎng)分要便宜得多。酵母的高細(xì)胞密度、低成本發(fā)酵方法已經(jīng)建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，34403-404，1989)，發(fā)酵培養(yǎng)基中所使用的碳源、氮源、鹽、微量元素和生物素等都很便宜；第四，霉菌特有的霉味會降低牲畜的適口性，而畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)生的一種醬香味具有良好的誘食作用；第五，畢赤酵母含有多種大量的促進(jìn)生長的有機化合物，如低聚糖、核苷酸、各種氨基酸、短肽等，這些優(yōu)勢都是霉菌比不上的或所不具有的；第六，在真核生物表達(dá)系統(tǒng)中，酵母，包括畢赤酵母在內(nèi)無疑是研究得最為詳透的，在進(jìn)行分子生物學(xué)操作時，酵母比霉菌更為容易、方便和有效。到目前為止，我們還未見到有利用酵母表達(dá)、生產(chǎn)植酸酶的報道，但酵母作為一種良好的真核表達(dá)系統(tǒng)已成功地高效表達(dá)出許多具有生物活性的外源基因產(chǎn)物。第七、畢赤酵母本身具有很好的安全性，曾作為單細(xì)胞蛋白廣泛應(yīng)用，酵母培養(yǎng)基中不含有毒物質(zhì)和致熱源，所以重組酵母表達(dá)的植酸酶就可以不用分離純化而能直接以酵母培養(yǎng)物的形式添加到飼料中，可降低植酸酶的生產(chǎn)成本；第八、表達(dá)的植酸酶在信號肽的引導(dǎo)下會分泌到培養(yǎng)基中，這使植酸酶直接暴露出來而無需破碎酵母菌體，也為把包含植酸酶的酵母培養(yǎng)物直接作為飼料添加劑提供了可能；以上這些優(yōu)勢都是利用黑曲霉做為植酸酶表達(dá)受體(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所不具備的，它為利用重組酵母工業(yè)化大規(guī)模、低成本發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的目的之五是提供重組的植酸酶基因工程菌株的高密度發(fā)酵、植酸酶蛋白大量產(chǎn)生的方法，為植酸酶工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明參照Introvigen公司提供的發(fā)酵方法，使用葡萄糖作為菌體培養(yǎng)階段、碳源飼喂階段和碳源-甲醇混合飼喂階段的唯一碳源。具體方法為a.將菌株接種培養(yǎng)，然后按5-10％再接種于包含3-5％葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基10Xbasal salts中；b.通氣攪拌培養(yǎng)，在整個培養(yǎng)過程中氧飽和度不低于20％；c.18小時后，按照1 7-19ml/hr/L，優(yōu)選18.15ml/hr/L，的流量流動加入23-25％，優(yōu)選25％，的葡萄糖溶液繼續(xù)培養(yǎng)3小時以上，優(yōu)選4小時；d.按照4-6ml/hr/L，優(yōu)選5ml/hr/L，的流量流動加入23-27％，優(yōu)選25％，葡萄糖∶甲醇混合溶液(3-5∶1-2)，優(yōu)選(4∶1)，繼續(xù)培養(yǎng)3小時以上，優(yōu)選5小時；e.加入誘導(dǎo)劑甲醇，使甲醇的終濃度維持在0.1-0.5％，優(yōu)選0.3％，繼續(xù)培養(yǎng)3小時以上，優(yōu)選培養(yǎng)108-132小時。
與已有的以曲霉為生產(chǎn)菌株的發(fā)酵方法(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)相比，在發(fā)酵原料、發(fā)酵時間及最終的發(fā)酵產(chǎn)物植酸酶的量上均有所不同(表2)，在發(fā)酵原料的成本上，本發(fā)明全為較廉價的工業(yè)原料，而曲霉發(fā)酵時還需有甘露-葡聚糖、酵母提取物、水解酪蛋白等天然有機提取物，因而本項目的原料成本將比曲霉發(fā)酵低得多；發(fā)酵時間本項目為108-132小時，曲霉發(fā)酵為140-200個小時，在發(fā)酵過程中的能源消耗上本發(fā)明也有優(yōu)勢。而發(fā)酵的植酸酶產(chǎn)量(指單位體積發(fā)酵液中植酸酶產(chǎn)量)本項目要高出約一倍左右。再加上本發(fā)明生產(chǎn)的植酸酶無需純化而可以直接以酵母培養(yǎng)物的形勢做為添加劑，因而總的來說，本發(fā)明要比國外用基因工程曲霉來生產(chǎn)植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，USPatent No.5436156，1995)更有優(yōu)勢。表2.本發(fā)明發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶與國外專利中發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的比較本發(fā)明 國外曲霉發(fā)酵(Patent No.US 5436156.1995)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源 甘油或葡萄糖100g/L甘露-葡聚糖70g/L甲醇15％ 酵母提取物12.5g/L氮源 氨水5％ 水解酪蛋白25g/L無機鹽 磷酸 2％ 硫酸鉀2.0g/L硫酸鈣0.93g/L 硫酸鎂0.5g/L硫酸鉀18.2g/L 硫酸亞鐵 0.5g/L硫酸鎂14.9g/L 磷酸二氫鉀2g/L發(fā)酵時間(小時)108-132 140以上植酸酶產(chǎn)率(U/mL)50萬 28萬本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以對本發(fā)明的酶進(jìn)行各種改造，如用各種化學(xué)修飾基團(tuán)進(jìn)行修飾，如糖基化、磷酸化、N端氨基化、蛋白內(nèi)切割等；也可為改善其表達(dá)后的轉(zhuǎn)運而添加信號肽及在植酸酶蛋白前或后加上融合肽等，而不改變本發(fā)明酶的基本功能，如酶活性、底物特異性等。這些通稱為本發(fā)明酶的功能衍生物，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1 Aspergillus niger 963在含植酸鈣的篩選平板AS上形成的透明消解圈圖2 Aspergillus niger 963產(chǎn)生的植酸酶PHYA2的pH適性圖3 Aspergillus niger 963產(chǎn)生的植酸酶PHYA2的溫度適性圖4 植酸酶基因phyA2的克隆圖5 phyA2結(jié)構(gòu)基因DNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列小寫英文字母表示內(nèi)含子序列，內(nèi)含子序列中下劃線的序列依次表示內(nèi)含子donor、lariat及acceptor序列；垂直箭頭表示信號肽切割位點；在氨基酸N下劃線的表示潛在的糖基化位點；氨基酸序列下劃線指出植酸酶活性位點序列。
圖6 phyA2中信號肽編碼序列的和內(nèi)含子序列的去除過程圖7 phyA2點突變進(jìn)行密碼子優(yōu)化的過程圖8改造后的phyA2的DNA序列圖9重組酵母表達(dá)載體pPIC9A的物理圖譜圖10重組酵母的Sourthern blotting分析1.受體酵母P.pastoris GS1152，3，4.分別為酵母重組子P.pastorispPIC9A-6，7.9(EcoRI酶切)5，6，7.分別為酵母重組子P.pastorispPIC9A-6，7.9(BamH I酶切)圖11重組酵母的Northern blotting分析1.受體酵母P.pastoris GS1152，3.分別為酵母重組子P.pastorispPIC9B-12、pPIC9A-7圖12重組酵母的SDS-PAGE分析1.受體酵母P.pastoris GS1152，3.分別為酵母重組子P.pastoris pPIC9A-7，94，5.分別為酵母重組子P.pastoris pPIC9A-7，9，表達(dá)的植酸酶蛋白經(jīng)脫糖基化處理
6.蛋白分子量Marker圖13重組酵母P.pastoris pPIC9A-7表達(dá)的植酸酶的pH適性圖14重組酵母P.pastoris pPIC9A-7表達(dá)的植酸酶的溫度適性圖15在搖床水平上重組酵母植酸酶表達(dá)量與誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的關(guān)系●P.pastoris pPIC9A-7；▲P.pastoris pPIC9A-9圖16重組酵母在不同高細(xì)胞密度發(fā)酵方法中表達(dá)產(chǎn)物植酸酶的積累與誘導(dǎo)時間的關(guān)系■以甘油為碳源、甘油飼喂○以甘油為碳源、甘油-甲醇混合飼喂●以葡萄糖為碳源、葡萄糖-甲醇混合飼喂四、實施例1.菌株與載體大腸桿菌菌株E.coli DH5a、質(zhì)粒pUC18等購自Promega公司，酵母菌株P(guān)ichia pastoris GS115(His-Mut+)、質(zhì)粒pPIC9由加拿大Alberta大學(xué)D.Luo博士惠贈。
2.酶與試劑盒限制性內(nèi)切酶、連接酶、Taq酶、Mung bean酶為Boehringer公司產(chǎn)品。T7DNA sequence kit購于Pharmacia公司。In vitromutagenesis systems Kit、隨機引物標(biāo)記Kit和PCR Kit均購于Promega公司。
3.生化試劑DNA合成試劑為Milipore公司產(chǎn)品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成儀。IPTG、X-Gal、SDS及植酸鈉為Sigma公司產(chǎn)品。TEMED、過硫酸銨、丙烯酰胺及甲叉雙丙烯酰胺為Promega公司產(chǎn)品。
4.培養(yǎng)基黑曲霉生長培養(yǎng)基為PDA(20％馬鈴薯、2％蔗糖、2％瓊脂)；黑曲霉產(chǎn)酶篩選培養(yǎng)基為AS(0.1％植酸鈣、3％葡萄糖、0.5％NH4NO3、0.05％KCl、0.05％MgSO4.7H2O、0.03％MnSO4.4H2O、0.03％FeSO4.7H2O、1.5％瓊脂，pH 5.7)；黑曲霉產(chǎn)酶培養(yǎng)基為AP(1.5％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4.7H2O、0.05％KCl、0.003％FeSO4.7H2O、0.003％MnSO4.4H2O，pH5.7)。大腸桿菌培養(yǎng)基為LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培養(yǎng)基為YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％YeastNitrogen Base W/O amino acids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％賴氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％異亮氨酸、2％瓊脂糖)]；酵母選擇培養(yǎng)基為MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％瓊脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％瓊脂糖)；酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相與BMGY相同)。重組酵母發(fā)酵培養(yǎng)基為10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸鈣、1.82％硫酸鉀、1.49％硫酸鎂、0.413％氫氧化鉀、4％甘油或葡萄糖)；發(fā)酵中所用的微量鹽溶液PTM1(0.6％硫酸銅、0.008％碘化鈉、0.3％硫酸錳、0.02％鉬酸鈉、0.002％硼酸、0.05％氯化鈷、2％氯化鋅、6.5％硫酸亞鐵、0.025％生物素、0.5％硫酸)。
實施例1產(chǎn)生植酸酶的天然菌株的篩選土樣按常規(guī)稀釋后涂布于PDA平板上，28℃培養(yǎng)3-5天，待菌落出現(xiàn)后，挑取菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板AS上，28℃培養(yǎng)3天。能產(chǎn)生并分泌植酸酶的菌株將會分解篩選平板中的不溶性植酸鈣，形成透明消解圈。挑取產(chǎn)生透明消解圈的菌株接種于5mL液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基AP中，28℃搖振培養(yǎng)2天，按1％接種量轉(zhuǎn)接到50mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)3天。濾去菌體，上清液用來進(jìn)行酶活測定。測定方法為0.2mL的酶稀釋液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸鈉，37℃保溫30min，加入1mL 10％TCA終止酶活反應(yīng)，然后加入2mL硫酸亞鐵-鉬酸銨顯色液，700nm測定無機磷含量。對照為先在0.2mL的酶稀釋液中加入1mTCA使酶滅活，再加入同體積的底物保溫。一個酶活性單位(U)定義為在一定條件下，每分鐘釋放出1nmol無機磷所需酶量為一個酶活性單位。由于適合于在飼料中使用的植酸酶必須具備在酸性條件下具有高酶活性這一特性，所以首先在酸性條件下測定菌株分泌的植酸酶酶活性，即植酸鈉用pH2.5的HCl-甘氨酸緩沖液配制，使酶促反應(yīng)在pH2.5的緩沖體系中完成。在此條件下測到的最高酶活性為70U/mL，其產(chǎn)生菌株經(jīng)鑒定為黑曲霉Aspergillus niger，定名為Aspergillus niger 963。對Aspergillus niger963所產(chǎn)生的植酸酶PHYA2進(jìn)一步進(jìn)行pH適性和溫度適性的測定。pH適性的測定為底物植酸鈉用一系列不同pH值的緩沖液(pHl.4、1.8、2.4、3.0、3.4的HCl-Gly緩沖液；pH4.0、4.4、5.0、5.4、5.6、5.8、6.0的HAc-NaAc緩沖液；pH7.2、8.0、9.0的Tris-HCl緩沖液)配制，37℃下測定酶活性。結(jié)果(圖2)表明，其最適pH有兩個，分別為1.8和5.7。在pH1.8～5.7的范圍內(nèi)，植酸酶均具有較高的酶活性。酶促反應(yīng)在pH5.5、不同溫度下保溫所測到的植酸酶phyA2的溫度適性(圖3)表明，它的最適溫度為55℃。在37℃、pH5.7的條件下測到的植酸酶表達(dá)量為100U/mL，植酸酶絕對活性(比活性)為1000萬U/mg蛋白。以上結(jié)果表明，植酸酶PHYA2在酸性條件下具有高酶活性，具有適合于在飼料中使用的優(yōu)良特性。
實施例2克隆植酸酶基因phyA2菌株A.niger 963總DNA的提取采用中性裂解法，及菌株培養(yǎng)5天后收集菌絲，用液氮冷凍菌絲并研磨成粉狀，10mg菌絲中加入10mL SDS-TE緩沖液(4％SDS、10mmol/LTris、0.1mmol/LEDTA，pH8.0)在室溫下裂解5min，用等體積的酚、酚—氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀。根據(jù)已報道的來源于黑曲霉的不同植酸酶基因序列，設(shè)計合成PCR引物P1和P2P15’GCGAATTCTTTCTTCTCATAGGC 3’P25’CTGAATTCATCAAGGTAGTTCAG 3’這兩段引物序列都設(shè)計在植酸酶結(jié)構(gòu)基因序列之外，引物上設(shè)計的酶切位點均為EcoRI。以Aspergillus niger 963的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，反應(yīng)參數(shù)為94℃變性1min、55℃退火45sec、72℃延伸1min；循環(huán)30輪后72℃保溫10min。擴增出的約1.5Kb的DNA片斷用EcoRI酶切后通過瓊脂糖凝膠電泳回收目的片斷，與經(jīng)EcoRI酶切的載體pUC18于15℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌E.coliDH5a，涂板后挑選陽性重組子，得到重組質(zhì)粒pYY-1(圖4)。通過DNA全序列分析，測定了植酸酶基因的完整DNA序列(圖5)。phyA2結(jié)構(gòu)基因全長1506個核苷酸，其中+46～+147的102個核苷酸序列是一典型的真菌內(nèi)含子序列，其上有真菌內(nèi)含子的特征保守序列Donor序列-GTATGC、Lariat序列-GCTGAC及Acceptor序列-CAG。PhyA2基因編碼467個氨基酸，根據(jù)信號肽序列的結(jié)構(gòu)規(guī)則推斷，N端的19個氨基酸為信號肽，信號肽的切割位點在+19位的Gly之后。來源于黑曲霉的植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA2編碼的氨基酸序列上，發(fā)現(xiàn)了9個潛在的N-糖基化位點(Asn-X-Ser/Thr，X為任意氨基酸)。從氨基酸推斷出的理論分子量約為52KD。從氨基酸序列上還找到了植酸酶的活性位點序列(Active-site sequence)CQVTFAQVLSRHGARYPTDSKGK，它位于氨基酸序列的+52～+74。RHGERYPS是微生物來源的植酸酶活性位點中最保守的序列，在PHYA2上相應(yīng)的序列為RHGARYPT。
PhyA2基因中G+C含量達(dá)到54.7％，密碼子第三位堿基的G+C含量更高達(dá)68.8％，在密碼子第三位堿基上高頻使用G和C堿基是曲霉中高表達(dá)蛋白編碼序列所具有的特征之一。
實施例3植酸酶基因phyA2的改造為了使phyA2能在酵母中順利異源表達(dá)，我們首先去掉了phyA2中信號肽編碼序列和內(nèi)含子序列，具體方法為，參照信號肽編碼序列之后的核苷酸序列合成一個22個堿基的寡聚核苷酸片斷P3(5’GCGAATTCATGCTGGCAGTCCC3’)作為PCR引物，另一引物(5’TCGAATTCTAAGCAAAAC 3’)參照phyA2的3’端序列合成。由于內(nèi)含子序列是包含在信號肽編碼序列之中，所以用這對引物通過PCR的方法擴增到的phyA2基因就是除去信號肽編碼序列和內(nèi)含子序列的完整的植酸酶結(jié)構(gòu)基因編碼序列。PCR反應(yīng)的方法同例3。擴增出的DNA片斷用引物上設(shè)計的EcoRI酶切后插入到載體pUC18的EcoRI位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌后篩選陽性重組子。這樣就將無信號肽編碼序列和內(nèi)含子序列的phyA2基因克隆到了pUC18上，得到重組質(zhì)粒pYY-2(圖6)。
為了使PhyA2能在酵母中高效表達(dá)，我們進(jìn)一步根據(jù)酵母密碼子的選擇偏向?qū)hyA2的密碼子進(jìn)行優(yōu)化。我們發(fā)現(xiàn)在phyA2序列中，編碼第85位和446位Arg的密碼子為CGG，編碼第146位和159位Arg的密碼子為CGA，這兩種密碼子在酵母大量表達(dá)的蛋白基因中使用頻率為零，為了提高phyA2基因在酵母中的表達(dá)水平，我們通過點突變的方法進(jìn)行了密碼子優(yōu)化，將這兩種密碼子突變成酵母高頻使用的Arg密碼子AGA(使用頻率為86.6％)。具體方法(圖7)為，首先根據(jù)需突變的4個位點合成4段相應(yīng)的突變引物a15’GAGCGAGATATCC 3’；a25’ACCAGAGATACG 3’；a35’TCATCAGATCCT 3’；a45’GTACGAGAGATAG 3’。要突變的位點設(shè)計在引物的中間，兩側(cè)的序列與基因中需突變位點兩側(cè)的序列完全一致。然后按照點突變Kit(In vitromutagenesis systems Kit，Promega)中的說明，用相應(yīng)的突變引物逐個進(jìn)行點突變。通過序列分析證實了此基因已得到正確的突變。最后得到的突變質(zhì)粒定名為pYY-6。
經(jīng)以上兩步改造后的phyA2序列見圖8。
實施例4phyA2在酵母表達(dá)載體上的構(gòu)建用于構(gòu)建酵母表達(dá)載體的質(zhì)粒是pPIC9(帶有α-因子分泌信號)。首先將植酸酶基因插入到上述表達(dá)載體的信號肽序列的下游，與信號肽形成正確的閱讀框架，然后通過載體與酵母P.pastoris染色體基因組之間的同源重組事件使目的基因穩(wěn)定整合到酵母染色體上。具體的過程是將改造后及未經(jīng)點突變改造的植酸酶基因phyA2用EcoRI分別從質(zhì)粒pYY-6和pYY-2上酶切下后，電泳回收約1.4Kb的DNA片段，再將其分別插入到載體pPIC9上的EcoRI位點，得到了一個用于酵母轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體-pPIC9A和pPIC9B(圖9)。這樣就將帶有分泌信號的目的基因克隆到了AOX啟動子下游。
實施例5酵母轉(zhuǎn)化及篩選重組酵母株系質(zhì)粒pPIC9A和pPIC9B的DNA經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞后，通過體內(nèi)重組，目的基因可以整合到受體酵母基因組中。在外源誘導(dǎo)物甲醇存在的條件下，AOX1啟動子可以啟動其下游基因的表達(dá)，并且信號肽可以指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入酵母的分泌途徑，經(jīng)過切割，外源蛋白產(chǎn)物最終分泌至胞外，所產(chǎn)生的植酸酶PHYA2氨基酸序列與天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白經(jīng)過這樣的代謝途徑，可以進(jìn)行翻譯后修飾，例如糖基化、形成二硫鍵等，從而得到具有生物活性的蛋白產(chǎn)物。
首先用2～3倍過量的內(nèi)切酶Bg1II分別消化質(zhì)粒pPIC9A和pPIC9B的DNA(經(jīng)PEG法純化)，電泳檢測酶切是否完全，使之線性化。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗兩次，冷凍干燥，無菌水溶解，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 酵母菌株GS115接種于5mLYPD中30℃培養(yǎng)過夜，取0.5mL接種于500mLYPD中30℃培養(yǎng)使O.D.600＝1.3～1.5，1500×g離心5分鐘，用500mL冰預(yù)冷的無菌水洗滌沉淀，如上離心，以20mL冰預(yù)冷的1mol/l山梨醇懸浮沉淀，如上離心，以0.5mL冰預(yù)冷的1mol/l山梨醇懸浮沉淀。取40μl酵母細(xì)胞液加入線性化DNA1～5μg，轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的無菌電擊杯中冰浴5分鐘。在國產(chǎn)電擊儀LN-101上進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化酵母受體菌hisGS115，電擊參數(shù)為0.8kv，11.5μF。電擊后立即向電擊杯中加入0.5mL冰預(yù)冷的1mol/l山梨醇，然后將電擊杯中的溶液轉(zhuǎn)移到無菌的Eppendorf管中在RDB固體培養(yǎng)基上涂板，每板涂0.1mL，將培養(yǎng)皿倒置30℃培養(yǎng)至轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)。轉(zhuǎn)化子可在基本培養(yǎng)基(不含His)生長，由于載體中沒有酵母復(fù)制子，所以his4基因必須整合進(jìn)酵母基因組中才能表達(dá)。另外，由于轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞中AOX1基因受到破壞，所以它就不能再利用甲醇作為碳源。這樣，在以甲醇作為唯一碳源的培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)化子就不會生長(或者生長極緩慢)，表現(xiàn)為甲醇利用缺陷型(Mut-)。
用無菌牙簽從轉(zhuǎn)化平板上挑取His+重組子，首先接種到MM固體培養(yǎng)基上，在接種到MD固體培養(yǎng)基上，如此挑取His+重組子，30℃培養(yǎng)2天。尋找在MD平板上生長正常但在MM平板上有一點生長或完全不生長的克隆子。
為了篩選得到高表達(dá)的重組酵母菌株，直接檢測誘導(dǎo)培養(yǎng)基中植酸酶的表達(dá)情況。將His+Mut-轉(zhuǎn)化子首先在BMGY培養(yǎng)基(以甘油為碳源)中培養(yǎng)，待其生長至飽和狀態(tài)，移去BMGY，換入誘導(dǎo)培養(yǎng)基BMMY(以甲醇作為誘導(dǎo)物)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時后取上清液進(jìn)行植酸酶酶活性分析。通過表達(dá)植酸酶的酶活性測定，從phyA2經(jīng)突變改造后得到的重組酵母中初步篩選到3株高水平表達(dá)植酸酶的重組子，分別定名為P.Pastoris pPIC9A-6，7，9。phyA2未經(jīng)改造所得到的重組子表達(dá)量最高的三株分別定名為P.PastorispPIC9B-4，12，16。
實施例6在分子水平上證實植酸酶基因在酵母中的重組、轉(zhuǎn)錄及翻譯重組酵母菌株的甲醇利用缺陷型說明外源基因已經(jīng)準(zhǔn)確整合到酵母基因組中AOX1基因位點，從而破壞了該基因的功能。通過分子檢測也證實了這一點。通過酶解的方法破壞酵母的細(xì)胞壁，再用SDS破壞細(xì)胞膜從而釋放出染色體DNA再經(jīng)過進(jìn)一步的純化處理就可以得到較純的酵母基因組DNA。取5μg重組酵母基因組DNA進(jìn)行EcoRI和BamHI全酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行0.8％的瓊脂糖凝膠電泳，將凝膠中的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上進(jìn)行Southrenblotting分析。雜交所用探針為用BamHI從重組質(zhì)粒pYY-1上切下的長約1.0Kb的植酸酶基因片斷。探針酶切后電泳回收，用隨機引物標(biāo)記Kit標(biāo)記探針。結(jié)果(圖10)表明，不同的重組子(P.pastoris pPIC9A-6，7，9)DNA用phyA2基因兩端的EcoRI酶切后，在1.4kb處有一全長的phyA2基因特異雜交帶，這證明phyA2基因已整合到酵母基因組中。用phyA2基因內(nèi)的BamH1酶切后，外源基因整合到酵母基因組中的不同位點會出現(xiàn)不同的雜交帶，結(jié)果表明，重組酵母P.pastoris pPIC9A-6，7，9中，植酸酶基因的拷貝數(shù)分別為1、2、1個。
破碎酵母細(xì)胞提取酵母mRNA，取5μg酵母的mRNA進(jìn)行甲醛變性凝膠電泳，將凝膠上的mRNA吸印到尼龍膜上進(jìn)行Northern blotting分析。所用探針與Southren blotting分析使用的探針相同。結(jié)果(圖11)表明，無論phyA2是否經(jīng)過改造，重組酵母中的植酸酶基因得到了正常的轉(zhuǎn)錄。
取3μL無菌體的誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行SDS-PAGE分析(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺為29∶1)。所用分離膠濃度為8％，濃縮膠濃度為5％。電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮蘭R250染色30分鐘，接著用10％的冰乙酸脫色。結(jié)果(圖12)表明，表達(dá)的植酸酶分子量大小約為85kD，在用EndoH(Endo-β-N-acetylglycosaminidase H)脫糖基處理后，分子量降為64kD左右，這證明植酸酶基因不僅得到了表達(dá)、有效分泌，而且表達(dá)產(chǎn)物還能進(jìn)行蛋白翻譯后修飾—糖基化，而糖基化修飾也是植酸酶具備正常酶活性所必需的。
實施例7重組酵母表達(dá)的植酸酶的性質(zhì)分析重組酵母30℃誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時后，在37℃、pH5.5的條件下，對含表達(dá)產(chǎn)物的培養(yǎng)液進(jìn)行植酸酶酶活性測定，結(jié)果(表2)表明，1)不同的轉(zhuǎn)化子所表達(dá)的酶量有所差異，三個重組子P.pastoris pPIC9A-6，7，9分別為13488U/mL、15656U/mL、14656U/mL，比植酸酶基因未經(jīng)改造的高37倍。這充分證明了我們對植酸酶基因的改造是成功的。表2.酵母重組子中植酸酶表達(dá)量重組子 植酸酶活性(U/mL)整合的拷貝數(shù)A.niger 963 100 1Host P.Pastoris - -P.pastoris pPIC9A-6 13488 1P.pastoris pPICgA-7 15656 2P.pastoris pPIC9A-9 14636 1P.pastoris pPIC9B-4 372 2P.pastoris pPIC9B-12420 1P.pastoris pPIC9B-16351 1在37℃、不同pH值下對表達(dá)的植酸酶的酶活性測定結(jié)果(圖13)表明，表達(dá)的植酸酶的最適pH值有兩個，分別為1.8和5.7，在pH1.8～5.7的pH范圍內(nèi)，表達(dá)的植酸酶均能維持較高的酶活性。在pH5.5、不同溫度下的酶活性測定結(jié)果(圖14)表明，植酸酶的最適溫度為55℃。表達(dá)植酸酶的最適pH和最適溫度與原菌株A.niger 963所產(chǎn)的植酸酶相比并沒有明顯差別。
為了研究重組酵母植酸酶的表達(dá)量與誘導(dǎo)培養(yǎng)時間的關(guān)系，酵母重組子P.pastoris pPIC9A-7和9在誘導(dǎo)培養(yǎng)后每隔12小時取1mL培養(yǎng)液用于測定植酸酶活性，研究表明(圖15)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)36小時之內(nèi)，表達(dá)的植酸酶隨誘導(dǎo)時間的延長而增加，到36小時時達(dá)到高峰，再增加誘導(dǎo)表達(dá)時間，植酸酶的表達(dá)量僅緩慢增加。
實施例8重組酵母在5升發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶重組酵母在BMGY培養(yǎng)基中30℃搖床培養(yǎng)24小時，然后按5-10％接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中開始發(fā)酵。本發(fā)明探索了三種發(fā)酵方法，第一種為以甘油為碳源、甘油飼喂培養(yǎng)的發(fā)酵方法，具體如下1)菌株培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)基接種前先加如28％氨水使培養(yǎng)基的pH達(dá)到5.0(氨水同時也做為菌株生長的氮源)，再按每升培養(yǎng)基加入4.37mL PTM1，5-10％接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18-24小時，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量將由100％逐漸降低，當(dāng)碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80％以上，此時菌體濕重將達(dá)到110g/L。2)碳源飼喂階段。流加50％甘油(包含12mL/L PTM1)，流加量為18.15/hr/L，培養(yǎng)4小時。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20％。此時菌體濕重將達(dá)到220g/L。3)誘導(dǎo)表達(dá)階段。加如甲醇(含12mL/L PTM1)，使甲醇終濃度維持在0.3％，溶氧量始終大于20％。在誘導(dǎo)過程中每12小時取樣一次測定表達(dá)的植酸酶的積累量。第二種方法為以甘油為碳源、碳源-甲醇混合飼喂的方法。具體為在第一種方法的第二步即碳源飼喂階段完成后，增加一個碳源-甲醇混合飼喂階段，即流加50％甘油∶甲醇(4∶1)培養(yǎng)4小時，流加量為5mL/hr/L，控制溶氧量始終大于20％。接著再進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)階段。第三種方法為以葡萄糖為碳源、碳源-甲醇混合飼喂的方法。除了把碳源甘油換成葡萄糖外，其余與第二種方法完全相同。此三種方法對植酸酶的表達(dá)的影響見圖16。三種方法植酸酶的表達(dá)量為均可達(dá)到50萬U/mL發(fā)酵液，但第一種發(fā)酵誘導(dǎo)時間需要200小時，第二、三種方法可使誘導(dǎo)培養(yǎng)時間縮短到108-120小時，這樣，發(fā)酵時間的大幅度縮短會大大降低發(fā)酵能耗，降低生產(chǎn)成本。第三種方法因使用價格較甘油低廉得多的葡萄糖為碳源，將進(jìn)一步降低植酸酶的生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
1.一種植酸酶，其特征在于其活性位點序列為RHGARYPT。
2.按照權(quán)利要求1所述的植酸酶，其特征在于其最適pH值為pH1.6-2.0和pH5.5-5.9。
3.按照權(quán)利要求2所述的植酸酶，其特征在于其最適pH值約為pH1.8和pH5.7。
4.按照權(quán)利要求1所述的植酸酶，其特征在于其最大活性為1000萬U/mg，在pH1.8時的酶活性為在pH5.7時的77％剩余酶活性，在pH1.8至5.7的范圍內(nèi)的最低酶活性為40％剩余酶活性。
5.按照權(quán)利要求1所述的植酸酶，它產(chǎn)生于黑曲霉菌株CGMCC 0332。
6.按照權(quán)利要求1所述的植酸酶，其氨基酸序列如下MGVSAVLLPLYLLSGVTS18GLAVPASRNQSTCDTVDQ36GYQCFSETSHLWGQYAPF54FSLANKSAISPDVPAGCQ72VTFAQVLSRHGARYPTDS90KGKKYSALIEEIQQNATT108FKEKYAFLKTYNYSLGAD126DLTPFGEQELVNSGVKFY144QRYESLTRNIVPFIRSSG162SSRVIASGNKFIEGYQST180KLKDPRAQPGHSSPKIDV198VISEASTSNNTLDPGTCT216VSEDNELADDFEANFTAT234FVPSIRQSLENNLSGVAL252TDTEVTYLMDLCSFDTIS270TSTVDTKLSPFCDLFTHE288KWINYDYLQSLNKYYGHG306AGNPLGPTQGVCYANELI324SRLTHSPVHDYTSSNHIL342DSSQDTFPLNSTLYADFS360LNNGIISILFAWGLNKGT378KPLSSTTAENITQTDGFS396SAWTVPFASRMYVEMMQC414QSEQEPLVRVLVNDRVVP432LHGCPVDALGRCTRDSFV450KGLSFARSGGDWAECFA-467
7.編碼權(quán)利要求1-6中任意一項所述植酸酶的DNA序列。
8.按照權(quán)利要求7所述的DNA序列，其特征在于編碼Ar9的密碼子為AGA。
9.按照權(quán)利要求7所述的DNA序列，其核苷酸序列如下5＇1 ATGCTGGCAG TCCCCGCCTC GAGAAATCAG TCCACTTGCG ATACGGTCGA TCAGGGGTAT61 CAATGCTTCT CGGAGACTTC GCATCTTTGG GGCCAATACG CGCCGTTCTT TTCTCTGGCA121 AACAAATCGG CCATCTCCCC TGATGTTCCC GCCGGATGCC AAGTCACTTT CGCTCAGGTT181 CTCTCCCGCC ATGGAGCGAG ATATCCGACC GACTCCAAGG GCAAGAAATA CTCCGCTCTC241 ATCGAGGAGA TCCAGCAGAA CGCGACTACC TTCAAGGAGA AATATGCCTT CCTGAAGACA301 TACAACTACA GCCTGGGCGC GGATGACCTG ACTCCCTTTG GAGAGCAGGA GCTGGTCAAC361 TCCGGCGTCA AGTTCTACCA GAGATACGAG TCGCTCACAA GAAACATTGT TCCGTTCATC421 AGATCCTCAG GCTCCAGCCG CGTGATTGCC TCTGGCAATA AATTCATCGA AGGCTACCAG481 AGCACTAAGC TGAAGGATCC TCGTGCTCAG CCCGGCCATT CGTCGCCCAA GATCGACGTG541 GTCATTTCAG AGGCCAGCAC ATCCAACAAC ACTCTCGATC CGGGCACCTG CACCGTTTCC601 GAAGATAACG AATTGGCCGA TGACTTCGAA GCCAATTTCA CCGCCACGTT CGTCCCTTCC661 ATTCGTCAAA GTCTGGAGAA CAACTTGTCT GGCGTGGCTC TCACGGACAC AGAAGTGACC721 TACCTCATGG ACTTGTGCTC CTTCGACACG ATCTCCACCA GCACAGTCGA CACCAAGCTG781 TCCCCCTTCT GTGACCTGTT CACCCATGAA AAATGGATCA ACTACGACTA CCTCCAGTCC841 CTGAACAAGT ACTACGGCCA TGGCGCAGGT AACCCGCTCG GCCCGACCCA GGGCGTCTGC901 TACGCGAACG AGCTCATCTC CCGTCTCACC CATTCGCCTG TCCACGATTA CACCAGCTCC961 AACCACATAT TGGACTCGAG CCAGGATACT TTCCCGCTCA ACTCCACTCT CTATGCGGAC1021 TTTTCGCTTA ATAACGGCAT CATCTCTATC CTCTTTGCTT GGGGTCTGAA CAAGGGCACC1081 AAGCCGCTGT CTTCCACGAC CGCGGAGAAT ATCACCCAGA CCGATGGGTT CTCATCTGCC1141 TGGACGGTTC CTTTCGCGTC GCGCATGTAC GTCGAGATGA TGCAATGCCA GTCTGAGCAG1201 GAGCCTTTGG TCCGTGTCTT GGTTAATGAT CGCGTTGTTC CGCTGCATGG CTGTCCGGTT1261 GATGCTTTGG GGAGATGTAC GAGAGATAGC TTCGTGAAGG GTTTGAGCTT TGCCAGATCT1321 GGCGGTGATT GGGCGGAGTG TTTTGCTTAG 3＇
10.一種黑曲霉菌，保藏號為CGMCC 0332，其特征在于編碼植酸酶。
11.一種重組表達(dá)載體，其特征在于它含有權(quán)利要求7所述的DNA序列。
12.按照權(quán)利要求11所述的表達(dá)載體，它是酵母表達(dá)載體。
13.含有權(quán)利要求11所述表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化的酵母細(xì)胞。
14.一種發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的方法，包括a.將菌株接種培養(yǎng)，然后按5-10％再接種于包含3-5％葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基10XBasal salts中；b.通氣攪拌培養(yǎng)，在整個培養(yǎng)過程中氧飽和度不低于20％；c.18小時后，按照17-19ml/hr/L的流量流動加入23-25％的葡萄糖溶液繼續(xù)培養(yǎng)3小時以上；d.按照4-6ml/hr/L的流量流動加入23-27％葡萄糖甲醇＝3-5∶1-2混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3小時以上；e.加入誘導(dǎo)劑甲醇，使甲醇的終濃度維持在0.1-0.5％，繼續(xù)培養(yǎng)3小時以上。
15.按照權(quán)利要求14所述的方法，其特征在于，通氣攪拌培養(yǎng)18小時后，按照18.15ml/hr/L的流量流動加入25％的葡萄糖溶液繼續(xù)培養(yǎng)4小時；按照5ml/hr/L的流量流動加入25％葡萄糖∶甲醇＝4∶1混合溶液，繼續(xù)培養(yǎng)5小時；加入誘導(dǎo)劑甲醇，使甲醇的終濃度維持在0.3％，繼續(xù)培養(yǎng)108-132小時。
16.一種飼料，其特征在于它含有權(quán)利要求14所述發(fā)酵方法的發(fā)酵產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種具有高比活性的植酸酶以及表達(dá)該植酸酶的黑曲霉菌株CGMCC0332,并對其編碼基因進(jìn)行了克隆、基因改造,構(gòu)建了表達(dá)載體,并轉(zhuǎn)化受體菌,建立了重組酵母的高密度發(fā)酵大量產(chǎn)生植酸酶的方法。重組酵母中植酸酶的表達(dá)量可達(dá)到500000U/ml發(fā)酵液。高效表達(dá)植酸酶的重組酵母可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價生產(chǎn)飼料用植酸酶,同時發(fā)酵后的菌體還可以做為優(yōu)良的單細(xì)胞飼料蛋白。
文檔編號C12N15/55GK1184156SQ9712173
公開日1998年6月10日 申請日期1997年12月16日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月16日
發(fā)明者姚斌, 范云六, 王建華, 張春義, 李淑敏, 王亞茹, 丁宏標(biāo), 史秀云 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所, 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心