專利名稱：蛋白質(zhì)c衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，特別是血凝固紊亂的治療。最具體地說，本發(fā)明涉及人蛋白質(zhì)C分子的衍生物、使用這些衍生物的方法以及含有這些蛋白質(zhì)C衍生物的藥物組合物。
蛋白質(zhì)C是一種依賴于維生素K的血漿蛋白，該蛋白質(zhì)主要以無活性的二硫鍵結(jié)合雜二聚體形式進(jìn)行循環(huán)。該雜二聚體由一條約25千道爾頓的輕鏈和一條約41千道爾頓的重鏈組成。重鏈含有絲氨酸蛋白酶區(qū)域及其N末端活化肽，而輕鏈含有γ-羧基谷氨酸殘基區(qū)，該區(qū)域?qū)τ谝蕾囉阝}的膜結(jié)合和功能活性是必需的。借助于凝血酶/凝血調(diào)理素復(fù)合物的作用可將無活性的人蛋白質(zhì)C酶原轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨牡鞍踪|(zhì)C。所述復(fù)合物的作用是切下活化肽(循環(huán)酶原的158至169位殘基或前原酶原的200至211位殘基)形成活化的蛋白質(zhì)C。
蛋白質(zhì)C作為治療劑的作用已得到充分的認(rèn)識(shí)(參見例如，Bang等人的美國專利4，775，624公開了編碼人蛋白質(zhì)C酶原的DNA序列;Bang等人的美國專利4，992，373公開了制備活化人蛋白質(zhì)C的方法)。一種命名為FLIN的人蛋白質(zhì)C衍生物由Gerlitz等人在歐洲專利申請91301450.2中公開。該FLIN衍生物在活化肽的167位(前原酶原的206位)含有Phe殘基而不是Asp殘基，在重鏈內(nèi)的172位(前原酶原的214位)含有Asn殘基而不是Asp殘基。該該FLIN衍生物比野生型人蛋白質(zhì)C酶原更容易受凝血酶的激活。Gerlitz等人在歐洲專利申請91301446.0中公開了其他人蛋白質(zhì)C衍生物，命名為Q313和Q329。Q313衍生物在野生型酶原313位上含有一個(gè)Gln殘基而不是Asn殘基，而Q329衍生物在野生型酶原329位上含有一個(gè)Gln殘基而不是Asn殘基。這些Q313和Q329衍生物缺少一般情況下與野生型分子的這些位點(diǎn)上的Asn殘基相結(jié)合的碳水化合物結(jié)構(gòu)，因此這些衍生物的酰氨水解活性和功能活性增強(qiáng)。
本發(fā)明涉及經(jīng)過修飾的人蛋白質(zhì)C的衍生物，這些修飾作用是將天然人蛋白質(zhì)C分子的313位氨基酸從天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０?將天然人蛋白質(zhì)C分子的第167位氨基酸從天冬氨酸改變?yōu)楸奖彼?將天然人蛋白質(zhì)C分子的172位氨基酸從天冬氨酸改變?yōu)樘於０?。也可以通過將天然人蛋白質(zhì)C分子的329位上的野生型天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢揎椷@些分子。329位殘基的變化只能與313位殘基的變化同時(shí)發(fā)生，或者也可以與167位和172位殘基的變化同時(shí)發(fā)生。所說的人蛋白質(zhì)C衍生物比野生型人蛋白質(zhì)C分子或任何其他人蛋白質(zhì)C衍生物更易受凝血酶激活，并具有更強(qiáng)的功能活性。
本發(fā)明也公開并要求保護(hù)用于制備新的人蛋白質(zhì)C衍生物的重組DNA構(gòu)建體、載體和轉(zhuǎn)化體。此外，還公開和請求保護(hù)含有有效量的本發(fā)明人蛋白質(zhì)C衍生物和一種或多種可藥用賦形劑的藥物組合物，以及使用這些衍生物治療和預(yù)防疾病的方法。
為了在本文中公開和請求保護(hù)的本發(fā)明的目的，下列術(shù)語和簡寫定義如下。
Q313-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中已將天然人蛋白質(zhì)C分子313位上的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> Q329-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中已將天然人蛋白質(zhì)C分子329位上的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?。蛋白質(zhì)C衍生物Q313和Q329由Gerlitz等人(歐洲專利申請91301446.0)和Grinnell等人(J.Biol.Chem.2269778-9785，1991)公開，這些文獻(xiàn)的內(nèi)容引入本文作為參考。
Q3Q9-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中已將天然人蛋白質(zhì)C分子313位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０?將天然人蛋白質(zhì)C分子的329位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> F167-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中已將天然人蛋白質(zhì)C分子167位的天冬氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼?。蛋白質(zhì)C衍生物F167由Bang等人(歐洲專利申請88312201.2)和E hrlich等人(EMBO J.92367-2373，1990)公開，這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
LIN-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中天然人蛋白質(zhì)C分子172位的天冬氨酸殘基已改變?yōu)樘於０窔埢?br> FLIN-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中天然人蛋白質(zhì)C分子167位的天冬氨酸殘基已改變?yōu)楸奖彼釟埢?天然蛋白質(zhì)C分子172位的天冬氨酸殘基已改變?yōu)樘於０窔埢?。蛋白質(zhì)C衍生物L(fēng)IN和FLIN已由Gerlitz等人(歐洲專利申請91301450.2)和Grinnell等人(《蛋白質(zhì)C和相關(guān)抗凝劑》，Bruley，D.和Drohan，W.編，第13-46頁，Gulf Publishing Co.，Houston，1990)公開，這些文獻(xiàn)引入本文作為參考。
FLIN-Q313-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中已將天然人蛋白質(zhì)C分子167位的天冬氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼釟埢?將天然蛋白質(zhì)C分子172位的天冬氨酸殘基改變?yōu)樘於０窔埢?將天然蛋白質(zhì)C分子313位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> FLIN-Q3Q9-一種人蛋白質(zhì)C衍生物，其中已將天然人蛋白質(zhì)C分子167位的天冬氨酸殘基改變?yōu)楸奖彼釟埢?將天然蛋白質(zhì)C分子172位的天冬氨酸殘基改變?yōu)樘於０窔埢?將天然蛋白質(zhì)C分子313位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?將天然蛋白質(zhì)C分子329位的天冬酰胺殘基改變?yōu)楣劝滨０窔埢?br> GBMT轉(zhuǎn)錄單位-一種經(jīng)修飾的轉(zhuǎn)錄控制單位，它包括靠近腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(MLTF)上游調(diào)控成分的BK病毒P2增強(qiáng)子、腺病毒-2主要晚期啟動(dòng)子、一個(gè)其定位能刺激所說啟動(dòng)子的多聚GT成分，以及一個(gè)含有腺病毒拼接三重前導(dǎo)序列的DNA序列。
新生蛋白質(zhì)-由mRNA轉(zhuǎn)錄本經(jīng)轉(zhuǎn)譯產(chǎn)生的尚未進(jìn)行任何轉(zhuǎn)譯后修飾的多肽。但是，在蛋白質(zhì)從mRNA轉(zhuǎn)錄本全部轉(zhuǎn)譯前可能已開始進(jìn)行如谷氨酸殘基的γ-羧基化以及天冬氨酸殘基的羥基化這樣一些轉(zhuǎn)譯后修飾。
蛋白質(zhì)C活性-負(fù)責(zé)蛋白水解、酰氨水解、酯水解和生物學(xué)(抗凝或血纖維蛋白原溶解)活性的任何人蛋白質(zhì)C的特性。用于檢測蛋白質(zhì)抗凝活性的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，即見Grinnell等人，Bio/Technology 51189-1192，1987。
酶原-蛋白質(zhì)水解酶的無酶活性的前體。本文所用的蛋白質(zhì)C酶原一詞，是指已分泌的非活性形式的蛋白質(zhì)C，無論是一條鏈還是兩條鏈。
本公開中使用的所有氨基酸縮寫都是由美國專利和商標(biāo)局按37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)的規(guī)定得到認(rèn)可的縮寫。
本發(fā)明提供了已改變了糖基化模式并且還改變了活化區(qū)的人蛋白質(zhì)C衍生物。具體地說，這些衍生物包括Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9。Q3Q9衍生物在蛋白質(zhì)C分子的313和329位上含有谷氨酰胺殘基(而不是通常在這些位置上存在的天冬酰胺殘基)。FLIN-Q313衍生物在該分子的167位含有苯丙氨酸殘基;在該分子的172位含有天冬酰胺殘基(而不是通常在這些位置上存在的天冬氨酸殘基);并且在313位含有谷氨酰胺殘基(而不是通常在這些位置上存在的天冬酰胺殘基)。在FLIN-Q3Q9衍生物中，已將167位的殘基由天冬氨酸改變?yōu)楸奖彼?172位的殘基由天冬氨酸改變?yōu)樘於０?313位的殘基由天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０?329位的殘基由天冬酰胺改變?yōu)楣劝滨０贰?br> FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9衍生物由凝血酶單獨(dú)活化時(shí)顯示出極高的活化速率。再者，與其他野生型人蛋白質(zhì)C不同，F(xiàn)LIN-Q313和FLIN-Q3Q9兩種衍生物都可由人血漿凝固時(shí)產(chǎn)生的凝血酶激活，從而抑制進(jìn)一步形成凝塊。這種由凝塊激活的酶原比天然蛋白質(zhì)C的活化形式具有明顯較大的比活性和明顯較長的半存留期。因此本發(fā)明的衍生物可用作為位點(diǎn)激活的抗血栓形成劑，除在有顯著量的凝血酶生成的情況下，它沒有抗凝活性。
本發(fā)明還提供了用于制備蛋白質(zhì)C衍生物的DNA化合物。這些DNA化合物包含人蛋白質(zhì)C輕鏈的編碼序列，該序列的位置緊接野生型蛋白質(zhì)C酶原的前原肽序列的下游，并與之共處于轉(zhuǎn)譯閱讀框內(nèi)。這些DNA序列也編碼在蛋白質(zhì)C分子的成熟期間進(jìn)行加工的Lys-Arg二肽，以及活化肽和蛋白質(zhì)C分子的重鏈。在167位、172位和313位上氨基酸殘基的變化改變了該分子的活化過程，而在313和329位上氨基酸殘基的變化則改變了該分子的碳水化合物含量。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，由于遺傳密碼的簡并性，許多種DNA化合物都可以編碼上述多肽。Bang等人的美國專利4，775，624(其全部內(nèi)容引入本文作參考)公開并要求保護(hù)編碼野生型人蛋白質(zhì)C分子的DNA序列。據(jù)此，技術(shù)人員可以容易地確定，DNA序列中的哪些變化可用于構(gòu)建能編碼本發(fā)明所公開的具體多肽的另一些DNA順序，本發(fā)明并不限于通過保藏而公開的特定的DNA序列。因而，下文中和所附實(shí)施例中描述的本發(fā)明優(yōu)選的DNA化合物、載體以及轉(zhuǎn)化體的構(gòu)建，僅是為了說明而不限制發(fā)明范圍。另外，在313位和329位用Gln置換Asn是為了說明而不限制發(fā)明范圍，因?yàn)槌鼵ys或Pro外也可使用其他氨基酸置換。
本發(fā)明中所有的DNA化合物都是通過將人蛋白質(zhì)C基因進(jìn)行定位誘變制備的。然后將經(jīng)誘變的酶原編碼分子插入到真核表達(dá)載體中，使GBMT轉(zhuǎn)錄單位能驅(qū)動(dòng)酶原基因的表達(dá)。將這些載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌K12 AG1細(xì)胞中，并于1992年1月14日保藏在美國北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室(Peoria，Illinois 61604)并構(gòu)成該保藏機(jī)構(gòu)永久性原種培養(yǎng)物的一部分。具體的培養(yǎng)物及保藏號(hào)列于下表Ⅰ中。
表Ⅰ培養(yǎng)物 保藏號(hào)大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-Q3Q9 NRRL B-18938大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313 NRRL B-18939大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9 NRRL B-18940
利用常規(guī)方法獲得這些培養(yǎng)物并分離出質(zhì)粒，然后可直接轉(zhuǎn)染到真核宿主細(xì)胞中用于制備人蛋白質(zhì)C衍生物。優(yōu)選將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到能表達(dá)腺病毒E1A最早期基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞中，因?yàn)镚BMT轉(zhuǎn)錄控制單位中存在的BK增強(qiáng)子在E1A存在下可最有效地增強(qiáng)表達(dá)。Berg等人在歐洲專利申請91301451.0中對GBMT轉(zhuǎn)錄控制單位進(jìn)行了更詳細(xì)的描述，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考。技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到，許多宿主細(xì)胞都表達(dá)或可以使之表達(dá)大DNA病毒的最早期基因產(chǎn)物。用于表達(dá)本發(fā)明人蛋白質(zhì)C衍生物的最優(yōu)選的細(xì)胞系是人腎293細(xì)胞系，該細(xì)胞系已由Bang等人在美國專利4，992，373中公開，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考。在該細(xì)胞系中表達(dá)之后，利用Yan的美國專利4，981，952的方法，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化這些衍生物，上述文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
利用化學(xué)方法，或通過將限制性片段組合，或?qū)⒈绢I(lǐng)域內(nèi)的已知技術(shù)聯(lián)合使用，可合成本發(fā)明的DNA序列。可利用現(xiàn)有的DNA合成儀合成本發(fā)明的DNA化合物。
本發(fā)明的示例性載體包含GBMT轉(zhuǎn)錄單位，其定位可通過腺病毒晚期啟動(dòng)子刺激編碼序列的轉(zhuǎn)錄。本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，許多真核啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和表達(dá)載體都是本領(lǐng)域內(nèi)已知的，并可用于表達(dá)DNA序列以制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)C衍生物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還明白，在沒有增強(qiáng)子成分時(shí)真核表達(dá)載體也能起作用。本發(fā)明的關(guān)鍵方面并不在于用于表達(dá)衍生物的特定增強(qiáng)子或啟動(dòng)子，而在于新的DNA序列和從這些序列制備的相應(yīng)蛋白質(zhì)。
可將本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化至各種各樣的真核尤其是哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中并在其中表達(dá)。
在北方地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室保藏的載體都含有潮霉素抗性基因。但是，可方便地構(gòu)建不含選擇性標(biāo)記的載體，并可將其用于進(jìn)行瞬時(shí)性檢測分析，或?qū)⑵渑c其他含選擇性標(biāo)記的載體一起共轉(zhuǎn)化至細(xì)胞系中。本發(fā)明的載體還可包含能在大腸桿菌中進(jìn)行復(fù)制的序列，因?yàn)樵诖竽c桿菌中比在其他宿主有機(jī)體中制備質(zhì)粒DNA通常更為有效。
可以對本發(fā)明的示例性DNA序列和質(zhì)粒進(jìn)行許多修飾和改變。例如，遺傳密碼的簡并性允許在整個(gè)多肽編碼區(qū)和轉(zhuǎn)譯終止信號(hào)內(nèi)進(jìn)行核苷酸置換而不會(huì)改變所編碼的多肽編碼序列。可從人蛋白質(zhì)C的已知氨基酸或DNA序列推導(dǎo)出這些可置換的序列，并且可用下列常規(guī)合成方法或定位誘變方法構(gòu)建這些序列?？梢曰旧习凑誌takura等人(Science 1981056，1977)和Crea等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 755765，1978)的步驟完成合成方法。因此，本發(fā)明決不僅限于具體例舉的DNA序列和質(zhì)粒。
用于將酶原形式的人蛋白質(zhì)C活化為活化人蛋白質(zhì)C衍生物的方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的老方法。蛋白質(zhì)C可由凝血酶單獨(dú)激活，或由凝血酶/凝血調(diào)理素復(fù)合物，或用Russell′s蝰蛇毒液或采用各種其他手段激活。在用凝血酶激活后，可利用總酰氨水解分析或抗凝分析測定人蛋白質(zhì)C衍生物的活性。凝血酶激活試驗(yàn)和蛋白質(zhì)C分析試驗(yàn)(酰氨水解和抗凝)是按照Grinnell等人(Bio/Technology 51187-1192，1987)的方法完成的，該文獻(xiàn)的全部內(nèi)容引入本文作為參考。
可用本發(fā)明的重組人蛋白質(zhì)C衍生物預(yù)防和治療各種各樣的涉及血管內(nèi)凝血的獲得性疾病，包括深層靜脈血栓形成、肺栓塞、外周動(dòng)脈血栓形成、起源于心臟或外周動(dòng)脈的血栓、急性心肌梗塞、血栓形成性中風(fēng)、不穩(wěn)定性心絞痛、外周血管手術(shù)、器官移植和傳播性血管內(nèi)凝血。這些蛋白質(zhì)C衍生物也可有效地用于治療大量表現(xiàn)出陣發(fā)性深層靜脈血栓形成的雜合蛋白質(zhì)C缺陷癥患者，以及用于治療患有暴發(fā)性紫癜的純合蛋白質(zhì)C缺陷癥患者?；罨鞍踪|(zhì)C衍生物的另一種治療應(yīng)用是預(yù)防目前用低劑量肝素治療的深層靜脈血栓形成和肺栓塞。
按照已知方法可以將本發(fā)明的衍生物及其活化形式配制成可藥用的組合物，使本發(fā)明的人蛋白質(zhì)C衍生物或活化的蛋白質(zhì)C衍生物與可藥用的載體混合。合適的載體及其配制，包括其他人蛋白質(zhì)(如人血清白蛋白)，由Remington′s Pharmace utical Sciences(1980年第16版，Mack Publishing Co.，Osol等人編，引入本文作為參考)作了描述。這樣的組合物含有有效量的蛋白質(zhì)C衍生物或其活化形式，以及適量的載體，以便制備適于有效給予宿主的可藥用組合物。蛋白質(zhì)C衍生物組合物可非腸道給藥，或者通過可確保以有效形式釋放到血流中的其他方法給藥。
下面提供的實(shí)施例作為說明本發(fā)明的手段，不要誤認(rèn)為是限制本發(fā)明。
實(shí)施例1人蛋白質(zhì)C衍生物的制備基本上按照Bang等人的美國專利4，992，373(引入本文作為參考)的方法，從大腸桿菌細(xì)胞中分離本發(fā)明的表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化到293細(xì)胞中，在37℃下選擇轉(zhuǎn)化體，然后培養(yǎng)，以制備人蛋白質(zhì)C衍生物?；旧习凑誝an的美國專利4，981，952(引入本文作為參考)的方法從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中純化出衍生物。
實(shí)施例2抗凝活性按照Parkinson等人(J.Biol.Chem.26512602-12610，1990，引入本文作為參考)的描述，用10nM凝血酶與可溶性重組人凝血調(diào)理素TMD-75的復(fù)合物激活，獲得完全激活的蛋白質(zhì)C。利用活化的部分凝血致活酶時(shí)間凝血分析法測定活化分子的抗凝活性。結(jié)果列于表Ⅱ中。
表Ⅱ蛋白質(zhì)C 抗凝活性 相對活性(單位/mg)野生型 325+/-65 1Q313 577+/-17 1.8LIN 289+/-13 0.8F167 283+/-27 0.9FLIN 313+/-65 1FLIN-Q313 552+/-37 1.7實(shí)施例3活化速率在含有20mM Tris pH7.4、0.15M NaCl、0.1mg/ml BSA和3mM CaCl2的反應(yīng)混合物中，用人凝血酶(10nM)測定活化速率。在活化反應(yīng)中純化蛋白質(zhì)C(野生型和衍生物)的濃度是0.81至1.61μM。在不同的時(shí)間點(diǎn)從活化反應(yīng)混合物中移出等份樣品到96孔平板上測定活化速率，在加入終濃度為0.75mM的生色底物(S-2366)后，按在ThermoMax動(dòng)力學(xué)微量滴定平板讀數(shù)器(Molecular Devices)上405nm處光吸收單位/分的變化測定酰氨水解活性。利用測得的每一種蛋白質(zhì)的比活性，將光密度/分鐘變化值換算為活化蛋白質(zhì)C的生成量，并相對于活化時(shí)間作圖，從而測出活化速率。在所有試驗(yàn)中活化蛋白質(zhì)C的生成量低于總起始材料的10%。結(jié)果列于表Ⅲ中。
表Ⅲ蛋白質(zhì)C 由凝血酶 相對活化速度率活化的速率(ng/分)野生型 0.53+/-0.1 1Q329 0.23a0.4Q313 1.1+/-0.2 2Q3Q9 1.62a3.3LIN 2.2+/-0.4 4F167 6.3+/-1.0 12FLIN 15.9+/-4.0 30FLIN-Q313 32.3+/-6.4 61FLIN-Q3Q9 45.0a84a.沒有標(biāo)準(zhǔn)偏差的速率來自n＝2的實(shí)驗(yàn)另外，用凝血酶和凝血調(diào)理素以相同的分析系統(tǒng)測定了相對活化速率。所使用的凝血調(diào)理素分子是Parkinson等人(見上文)的可溶性人凝血調(diào)理素。結(jié)果列于表Ⅳ中。
表Ⅳ蛋白質(zhì)C 由凝血酶和凝血調(diào)理素活化的相對速率野生型 1aQ313 2.6+/-0.6LIN 2.1+/-0.2F167 3.5+/-0.8FLIN 2.7aFLIN-Q313 9.2+/-1.0a.沒有標(biāo)準(zhǔn)偏差的速率來自n＝2的實(shí)驗(yàn)實(shí)施例4在人血漿凝固中的抗凝活性以20nM的濃度將野生型人蛋白質(zhì)C和FLIN-Q313衍生物與Helena標(biāo)準(zhǔn)APTT試劑一起加入到人血漿中，并在37℃保溫5分鐘。加入終濃度為8mM的CaCl2啟動(dòng)血漿的凝固，并測定凝固時(shí)間。在同時(shí)進(jìn)行的平行實(shí)驗(yàn)中，將能中和活化蛋白質(zhì)C活性的單克隆抗體加入到對照血漿以及含有野生型蛋白質(zhì)C酶原或FLIN-Q313的血漿中。結(jié)果列于表Ⅴ。
表Ⅴ蛋白質(zhì)C 凝固時(shí)間(秒)+Ab -Ab無(對照) 30+/-4 32+/-3野生型 36+/-4 32+/-5FLIN-Q313 36+/-4 75+/-5通過改變野生型人蛋白質(zhì)C和FLIN-Q313衍生物的濃度測定在血漿凝固中誘導(dǎo)的凝固活性水平，數(shù)據(jù)以延長的凝固時(shí)間來表示。該分析中的基礎(chǔ)凝固時(shí)間為27至33秒。結(jié)果列于表Ⅵ中。
表Ⅵ蛋白質(zhì)C 劑量(nM) 延長的凝固時(shí)間(秒)野生型 8 0+/-3FLIN-Q313 8 20+/-6野生型 16 0+/-5FLIN-Q313 16 37+/-+6野生型 32 0+/-6FLIN-Q313 32 77+/-6野生型 64 0+/-5FLIN-Q313 64 235+/-6實(shí)施例5相對半存留期的測定通過用100nM活化人蛋白質(zhì)C、活化FLIN-Q313或酶原(非活化)FLIN-Q313與正常人血漿(加了檸檬酸鹽)共同保溫，測定血漿中人蛋白質(zhì)C的抑制。在最終反應(yīng)中血漿濃度為90%(V/V)，其余體積由含有3mM CaCl2、150mM NaCl、20mM Tris pH7.4和1mg/ml BSA的緩沖液組成。在所選擇的時(shí)間點(diǎn)取等份樣品，用終濃度為1mM的S-2366測定活化蛋白質(zhì)C的酰氨水解活性，或通過活化部分凝血致活酶時(shí)間來測定活化蛋白質(zhì)C活性。按照實(shí)施例4中描述的方法測定FLIN-Q313的凝塊激活活性水平。在約25分鐘后，活化蛋白質(zhì)C和活化FLIN-Q313的活性損失都在50%以上，而酶原FLIN-Q313在45分鐘后仍保留至少80%活性。
權(quán)利要求
1.一種人蛋白質(zhì)C衍生物，它選自Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9。
2.權(quán)利要求1的人蛋白質(zhì)C衍生物，它是Q3Q9。
3.權(quán)利要求1的人蛋白質(zhì)C衍生物，它是FLIN-Q313。
4.權(quán)利要求1的人蛋白質(zhì)C衍生物，它是FLIN-Q3Q9。
5.一種重組DNA分子，它編碼權(quán)利要求1的人蛋白質(zhì)C衍生物。
6.權(quán)利要求5的重組DNA分子，它編碼蛋白質(zhì)C衍生物Q3Q9。
7.權(quán)利要求5的重組DNA分子，它編碼蛋白質(zhì)C衍生物FLIN-Q313。
8.權(quán)利要求5的重組DNA分子，它編碼蛋白質(zhì)C衍生物FLIN-Q3Q9。
9.權(quán)利要求5的重組DNA分子，它是一種質(zhì)粒。
10.權(quán)利要求9的重組DNA分子，它選自pGT-h-Q3Q9質(zhì)粒(NRRL B-18938)、pGT-h-FLIN-Q313質(zhì)粒(NRRL B-18939)、pGT-h-FLIN-Q3Q9質(zhì)粒(NRRL B-18940)。
11.一種宿主細(xì)胞，它已用權(quán)利要求9的重組DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。
12.權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞，它選自293細(xì)胞和大腸桿菌細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，它是293/pGT-h-Q3Q9、293/pGT-h-FLIN-Q313、293/pGT-h-FLIN-Q3Q9、大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-Q3Q9(NRRL B-18938)、大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q313(NRRL B-18939)和大腸桿菌K12 AG1/pGT-h-FLIN-Q3Q9(NRRL B-18940)。
14.一種藥物制劑，它含有作為活性成分的選自Q3Q9、FLIN-Q313和FLIN-Q3Q9的蛋白質(zhì)C衍生物，以及一種或多種可藥用的載體、賦形劑或稀釋劑。
全文摘要
描述了具有高活性并且對凝血酶活化作用的依賴性較低的人蛋白質(zhì)C衍生物。這些衍生物在其較高的活化速率、功能活性和碳水化合物結(jié)構(gòu)方面與天然形式的人蛋白質(zhì)C不同。還描述了用于制備這些衍生物的DNA化合物、轉(zhuǎn)移載體、表達(dá)載體以及轉(zhuǎn)化體。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1080658SQ9310621
公開日1994年1月12日 申請日期1993年5月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年5月21日
發(fā)明者B·E·杰里茨, B·W·格林內(nèi)爾 申請人:伊萊利利公司