本發(fā)明涉及一種分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，屬于微生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

目前優(yōu)質(zhì)飼料蛋白原料的主要來源是魚粉，魚粉資源稀缺，受各種因素的影響，價(jià)格不斷上漲，導(dǎo)致養(yǎng)殖成本增加，因而需要尋求價(jià)格低廉、來源可靠的植物蛋白來代替。豆粕是大豆經(jīng)過提取油脂后的副產(chǎn)物，粗蛋白質(zhì)含量高，氨基酸組成均衡，富含多種礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)成分，是畜牧養(yǎng)殖業(yè)使用量很大的一種優(yōu)質(zhì)蛋白源。但豆粕中含有胰蛋白酶抑制因子、大豆抗原蛋白等多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，嚴(yán)重影響動(dòng)物對(duì)豆粕蛋白的消化吸收，容易造成腹瀉等問題。采用微生物發(fā)酵的方法，通過微生物的生化代謝功能將蛋白降解或轉(zhuǎn)化為多肽，不但能改善豆粕蛋白品質(zhì)，而且可以降解豆粕中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)具有特有的發(fā)酵香味，可以改善飼料的適口性。

單菌種發(fā)酵，菌種單一，蛋白分解不徹底，且風(fēng)味較單一。而多菌種混合發(fā)酵，各菌種可以進(jìn)行互補(bǔ)，如乳酸菌產(chǎn)生乳酸，使之具有酸香味，有較好的誘食性；酵母菌可產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白；枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶等，分解大分子蛋白質(zhì)為小肽、氨基酸，利于消化。但同時(shí)接種進(jìn)行發(fā)酵，各菌種最佳發(fā)酵環(huán)境要求有差異，不能達(dá)到最佳發(fā)酵效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，方法簡(jiǎn)單易操作，所得產(chǎn)品蛋白含量高、益生菌含量高、可基本消除抗?fàn)I養(yǎng)因子。

所述的分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：對(duì)豆粕進(jìn)行雜質(zhì)清理，然后利用粉碎機(jī)將豆粕粉碎至30-40目；

2)配料：粉碎后的豆粕按照0.7-1.2:1的料水比加入蒸餾水，浸泡；

3)滅菌：浸泡之后的豆粕在110-130℃條件下高壓蒸汽滅菌15-30min，冷卻后備用；將大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為5-15％后進(jìn)行滅菌，然后將大豆糖蜜稀釋液分為培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c冷卻備用；

4)菌種活化：將枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌分別接種到培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c中培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌在搖床轉(zhuǎn)速為80-160rpm，溫度為35-40℃條件下培養(yǎng)12-24h，酵母菌在轉(zhuǎn)速為80-160rpm，溫度為28-33℃條件下培養(yǎng)12-24h，乳酸菌在溫度為35-40℃條件下靜置培養(yǎng)12-24h后備用；

5)初步發(fā)酵：將枯草芽孢桿菌接種到滅菌的豆粕中，在溫度為34-37℃條件下通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵20-40h；

6)二次發(fā)酵：將酵母菌和乳酸菌接種到初步發(fā)酵的豆粕中，停止通風(fēng)，在28-34℃條件下厭氧發(fā)酵20-40h；

7)干燥：發(fā)酵完成后的豆粕在40-55℃條件下低溫干燥至水分含量≤12％，得所述的生物活性飼料。

步驟1)所述的豆粕為高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕。優(yōu)選利用發(fā)明名稱為一種利用高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)低變性膨化豆粕的方法，申請(qǐng)?zhí)枮?016104076028的方法生產(chǎn)的低變性膨化豆粕。

步驟2)所述的豆粕和蒸餾水的料水比為0.8-1.0:1；浸泡時(shí)間為30-40min。

步驟3)所述的大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為5-8％。

步驟4)所述的枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌培養(yǎng)后的菌液濃度分別為枯草芽孢桿菌＞5×10¹⁰cfu/ml，酵母菌＞5×10⁸cfu/ml，乳酸菌＞5×10⁸cfu/ml。

步驟5)所述的枯草芽孢桿菌接種量為豆粕質(zhì)量的3-8％。

步驟5)所述的枯草芽孢桿菌接種量為豆粕質(zhì)量的4-5％。

步驟6)所述的酵母菌和乳酸菌接種比例為1:1，接種總量為豆粕質(zhì)量的2-6％。

所述的生物活性飼料粗蛋白含量＞52％，乳酸含量＞3.9％，活菌含量≥5×10¹⁰cfu/g，尿素酶活性≤0.02mg/(min·g)。

與現(xiàn)有技術(shù)相比本發(fā)明的有益效果是：

以高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕為原料，該豆粕生產(chǎn)成本低，粗蛋白含量高，抗?fàn)I養(yǎng)因子含量低(尿素酶活性＜0.50mg/(min·g))，且變性程度低，殘油率低，滲透性能好，蛋白溶解度高，易于被微生物利用。

使用大豆糖蜜稀釋液作為培養(yǎng)基，無需特制的培養(yǎng)基，工藝簡(jiǎn)單，成本較低，同時(shí)解決了大豆糖蜜的廢物利用問題。根據(jù)微生物生長(zhǎng)特性，多菌種協(xié)同發(fā)酵，通過調(diào)整發(fā)酵條件及接種工藝，滿足不同菌種的生長(zhǎng)需求，枯草芽孢桿菌在氧氣充足條件下，產(chǎn)生大量的蛋白酶，將豆粕中大分子蛋白酶解為小分子的肽(三氯乙酸法(tca法)測(cè)得生物活性飼料中小肽含量＞18％，一般發(fā)酵飼料在9％-10％左右)，利于消化吸收；酵母菌產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的菌體蛋白，可顯著改善蛋白質(zhì)品質(zhì)；乳酸菌由于基本處于厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)生大量的乳酸等有機(jī)酸，本發(fā)明生產(chǎn)的生物活性飼料中乳酸含量＞3.9％，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的活性飼料中的乳酸含量一般在2.5％左右，其特有的酸香味及濃郁的發(fā)酵香味具有誘食性。乳酸含量如此之高，動(dòng)物飼料中不需要額外添加酸化劑。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

所述的分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：對(duì)高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕進(jìn)行雜質(zhì)清理，然后利用粉碎機(jī)將豆粕粉碎至30目；

2)配料：粉碎后的豆粕按照0.7:1的料水比加入蒸餾水，浸泡30min；

3)滅菌：浸泡之后的豆粕在110℃條件下高壓蒸汽滅菌15min，冷卻后備用；將大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為5％后進(jìn)行滅菌，然后將大豆糖蜜稀釋液分為培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c冷卻備用；

4)菌種活化：將枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌分別接種到培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c中培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌在搖床轉(zhuǎn)速為80rpm，溫度為35℃條件下培養(yǎng)12h，酵母菌在轉(zhuǎn)速為80rpm，溫度28℃條件下培養(yǎng)12h，乳酸菌在溫度為35℃條件下靜置培養(yǎng)12h后備用，培養(yǎng)后的菌液濃度分別為枯草芽孢桿菌＞5×10¹⁰cfu/ml，酵母菌＞5×10⁸cfu/ml，乳酸菌＞5×10⁸cfu/ml；

5)初步發(fā)酵：將枯草芽孢桿菌接種到滅菌的豆粕中，接種量為豆粕質(zhì)量的3％，在溫度為34℃條件下通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵20h；

6)二次發(fā)酵：將酵母菌和乳酸菌按照1:1的比例接種到初步發(fā)酵的豆粕中，接種總量為豆粕質(zhì)量的2％，停止通風(fēng)，在28℃條件下厭氧發(fā)酵20h；

7)干燥：發(fā)酵完成后的豆粕在40℃條件下低溫干燥至水分含量10％，得所述的生物活性飼料。

所述的生物活性飼料粗蛋白含量53％，乳酸含量3.91％，活菌含量5×10¹⁰cfu/g，尿素酶活性0.01mg/(min·g)。

實(shí)施例2

所述的分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：對(duì)高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕進(jìn)行雜質(zhì)清理，然后利用粉碎機(jī)將豆粕粉碎至40目；

2)配料：粉碎后的豆粕按照1.2:1的料水比加入蒸餾水，浸泡40min；

3)滅菌：浸泡之后的豆粕在130℃條件下高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后備用；將大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為15％后進(jìn)行滅菌，然后將大豆糖蜜稀釋液分為培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c冷卻備用；

4)菌種活化：將枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌分別接種到培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c中培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌在搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，溫度為40℃條件下培養(yǎng)24h，酵母菌在轉(zhuǎn)速為160rpm，溫度33℃條件下培養(yǎng)24h，乳酸菌在溫度為40℃條件下靜置培養(yǎng)24h后備用，培養(yǎng)后的菌液濃度分別為枯草芽孢桿菌5×10¹¹cfu/ml，酵母菌2×10⁹cfu/ml，乳酸菌9×10⁸cfu/ml；

5)初步發(fā)酵：將枯草芽孢桿菌接種到滅菌的豆粕中，接種量為豆粕質(zhì)量的8％，在溫度為37℃條件下通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵40h；

6)二次發(fā)酵：將酵母菌和乳酸菌按照1:1的比例接種到初步發(fā)酵的豆粕中，接種總量為豆粕質(zhì)量的6％，停止通風(fēng)，在34℃條件下厭氧發(fā)酵40h；

7)干燥：發(fā)酵完成后的豆粕在55℃條件下低溫干燥至水分含量12％，得所述的生物活性飼料。

所述的生物活性飼料粗蛋白含量58％，乳酸含量4.21％，活菌含量9×10¹¹cfu/g，尿素酶活性0.005mg/(min·g)。

實(shí)施例3

所述的分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：對(duì)高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕進(jìn)行雜質(zhì)清理，然后利用粉碎機(jī)將豆粕粉碎至35目；

2)配料：粉碎后的豆粕按照1.1:1的料水比加入蒸餾水，浸泡38min；

3)滅菌：浸泡之后的豆粕在120℃條件下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后備用；將大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為11％后進(jìn)行滅菌，然后將大豆糖蜜稀釋液分為培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c冷卻備用；

4)菌種活化：將枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌分別接種到培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c中培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌在搖床轉(zhuǎn)速為100rpm，溫度為38℃條件下培養(yǎng)20h，酵母菌在轉(zhuǎn)速為90rpm，溫度30℃條件下培養(yǎng)14h，乳酸菌在溫度為37℃條件下靜置培養(yǎng)19h后備用，培養(yǎng)后的菌液濃度分別為枯草芽孢桿菌8×10¹⁰cfu/ml，酵母菌9×10⁸cfu/ml，乳酸菌8×10⁸cfu/ml；

5)初步發(fā)酵：將枯草芽孢桿菌接種到滅菌的豆粕中，接種量為豆粕質(zhì)量的4％，在溫度為36℃條件下通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵30h；

6)二次發(fā)酵：將酵母菌和乳酸菌按照1:1的比例接種到初步發(fā)酵的豆粕中，接種總量為豆粕質(zhì)量的3％，停止通風(fēng)，在30℃條件下厭氧發(fā)酵30h；

7)干燥：發(fā)酵完成后的豆粕在45℃條件下低溫干燥至水分含量8％，得所述的生物活性飼料。

所述的生物活性飼料粗蛋白含量57％，乳酸含量3.94％，活菌含量8×10¹⁰cfu/g，尿素酶活性0.009mg/(min·g)。

實(shí)施例4

所述的分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：對(duì)高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕進(jìn)行雜質(zhì)清理，然后利用粉碎機(jī)將豆粕粉碎至35目；

2)配料：粉碎后的豆粕按照0.8:1的料水比加入蒸餾水，浸泡32min；

3)滅菌：浸泡之后的豆粕在115℃條件下高壓蒸汽滅菌20min，冷卻后備用；將大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為5％后進(jìn)行滅菌，然后將大豆糖蜜稀釋液分為培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c冷卻備用；

4)菌種活化：將枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌分別接種到培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c中培養(yǎng)枯草芽孢桿菌在搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，溫度為39℃條件下培養(yǎng)20h，酵母菌在轉(zhuǎn)速為110rpm，溫度32℃條件下培養(yǎng)21h，乳酸菌在溫度為38℃條件下靜置培養(yǎng)15h后備用，培養(yǎng)后的菌液濃度分別為枯草芽孢桿菌6×10¹⁰cfu/ml，酵母菌7×10⁸cfu/ml，乳酸菌6×10⁸cfu/ml；

5)初步發(fā)酵：將枯草芽孢桿菌接種到滅菌的豆粕中，接種量為豆粕質(zhì)量的4％，在溫度為35℃條件下通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵25h；

6)二次發(fā)酵：將酵母菌和乳酸菌按照1:1的比例接種到初步發(fā)酵的豆粕中，接種總量為豆粕質(zhì)量的4％，停止通風(fēng)，在31℃條件下厭氧發(fā)酵32h；

7)干燥：發(fā)酵完成后的豆粕在50℃條件下低溫干燥至水分含量9％，得所述的生物活性飼料。

所述的生物活性飼料粗蛋白含量54％，乳酸含量3.98％，活菌含量9.0×10¹⁰cfu/g，尿素酶活性0.01mg/(min·g)。

實(shí)施例5

所述的分步發(fā)酵制備生物活性飼料的方法，包括以下步驟：

1)預(yù)處理：對(duì)高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕進(jìn)行雜質(zhì)清理，然后利用粉碎機(jī)將豆粕粉碎至35目；

2)配料：粉碎后的豆粕按照1:1的料水比加入蒸餾水，浸泡30min；

3)滅菌：浸泡之后的豆粕在130℃條件下高壓蒸汽滅菌30min，冷卻后備用；將大豆糖蜜稀釋至可溶性固形物含量為8％后進(jìn)行滅菌，然后將大豆糖蜜稀釋液分為培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c冷卻備用；

4)菌種活化：將枯草芽孢桿菌、酵母菌和乳酸菌分別接種到培養(yǎng)基a，培養(yǎng)基b和培養(yǎng)基c中培養(yǎng)，枯草芽孢桿菌在搖床轉(zhuǎn)速為130rpm，溫度為39℃條件下培養(yǎng)16h，酵母菌在轉(zhuǎn)速為130rpm，溫度30℃條件下培養(yǎng)22h；乳酸菌在溫度為37℃條件下靜置培養(yǎng)19h后備用，培養(yǎng)后的菌液濃度分別為枯草芽孢桿菌7×10¹⁰cfu/ml，酵母菌8×10⁸cfu/ml，乳酸菌7×10⁸cfu/ml；

5)初步發(fā)酵：將枯草芽孢桿菌接種到滅菌的豆粕中，接種量為豆粕質(zhì)量的5％，在溫度為37℃條件下通風(fēng)固態(tài)發(fā)酵29h；

6)二次發(fā)酵：將酵母菌和乳酸菌按照1:1的比例接種到初步發(fā)酵的豆粕中，接種總量為豆粕質(zhì)量的6％，停止通風(fēng)，在29℃條件下厭氧發(fā)酵26h；

7)干燥：發(fā)酵完成后的豆粕在52℃條件下低溫干燥至水分含量8％，得所述的生物活性飼料。

所述的生物活性飼料粗蛋白含量55％，乳酸含量4.01％，活菌含量5×10¹¹cfu/g，尿素酶活性0.005mg/(min·g)。

本發(fā)明中由于高溫豆粕生產(chǎn)線生產(chǎn)的低變性膨化豆粕抗?fàn)I養(yǎng)因子含量本來就低(尿素酶活性＜0.5mg/(min·g)，發(fā)酵以后基本可以消除抗?fàn)I養(yǎng)因子(尿素酶活性≤0.02mg/(min·g))，經(jīng)測(cè)定發(fā)現(xiàn)本發(fā)明方法生產(chǎn)的生物活性飼料抗原蛋白(sds-page法)降解完全，不良寡糖(tlc法)降解＞99％，乳酸含量＞3.9％，現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的活性飼料中的乳酸含量一般在2.5％左右。

本發(fā)明分步發(fā)酵法結(jié)合了好氧發(fā)酵過程和厭氧發(fā)酵過程的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)豆粕中的大豆蛋白降解效果較佳，好氧發(fā)酵過程中產(chǎn)生的大量蛋白酶在其后的厭氧發(fā)酵過程中能夠繼續(xù)降解大分子蛋白，三氯乙酸法(tca法)測(cè)得生物活性飼料中小肽含量＞18％，一般發(fā)酵飼料在9％-10％左右；乳酸菌在厭氧條件下能夠產(chǎn)生乳酸及抑菌活性物質(zhì)，提高消化率，增強(qiáng)動(dòng)物免疫機(jī)能。