本發(fā)明涉及食品包埋技術(shù)領(lǐng)域，特指一種以玉米醇溶蛋白為原料、采用多模式超聲處理制備納米顆粒并對白藜蘆醇進行包埋的的方法。

背景技術(shù)：

維生素、不飽和脂肪酸、多酚類化合物或益生菌等生物活性成分，具有調(diào)節(jié)人體生理機能的功能，可以延緩和預防慢性疾病的發(fā)生。然而，上述活性成分對食品加工和儲藏過程中溫度、氧、光、ph和金屬離子等因素敏感，易于發(fā)生氧化、異構(gòu)化、聚集或降解等結(jié)構(gòu)改變，導致生物活性降低或丟失。而且，疏水性和兩親性活性成分在水中溶解度非常低。這些在很大程度上限制了生物活性成分在食品和醫(yī)藥工業(yè)中的應用。對生物活性成分進行包埋是食品加工和儲藏過程中對其保護、消化以及增加生物利用度的一種有效手段。天然的生物大分子(如蛋白質(zhì)、多糖等)不但具有高的營養(yǎng)價值，而且具有多種功能特性，已被廣泛用作包埋技術(shù)中的原料。

玉米醇溶蛋白(zein)舊稱玉米朊，日本學者稱之為“醇溶谷蛋白”，顧名思義屬于醇溶蛋白類，1821年johngorham將之命名為zein。其由很多不同的肽鏈的多肽混合而成，這些多肽的分子大小、溶解性及電荷都不相同，mckinney在1958年首次提出玉米醇溶蛋白(zein)主要包括α-zein和β-zein兩種成分，α-醇溶蛋白(α-zein)是指溶于95％乙醇的蛋白，約占所有醇溶蛋白的80％。β-醇溶蛋白(β-zein)溶于60％乙醇而不溶于95％的乙醇，該蛋白相對來說不穩(wěn)定，易發(fā)生凝沉或膠凝，工業(yè)制備的玉米醇溶蛋白中不存在。與β-醇溶蛋白比較而言，α-醇溶蛋白更缺乏組氨酸、精氨酸、脯氨酸和蛋氨酸。pomes提出β-醇溶蛋白分子量較大可能是由α-醇溶蛋白通過二硫鍵連接組成，因為它水解后，凝膠電泳出現(xiàn)了三個主要帶，分子量分別為：24000、22000、14000da。

玉米醇溶蛋白獨特的結(jié)構(gòu)性質(zhì)和氨基酸組成決定了其營養(yǎng)價值低、很難被生物體利用的特點，很難直接作為食品原料使用，造成了其在食品生產(chǎn)領(lǐng)域中直接應用的局限性。但是玉米醇溶蛋白具有粘結(jié)、光亮、疏水、阻氧和易成膜等功效，所成膜具有一定韌性，而且光滑、耐水、耐油、防腐等特性，在藥物輔料、食品包裝材料、生物降解塑料領(lǐng)域等有著良好的潛在應用前景，具有重大的商業(yè)價值。如beck的研究表明，玉米醇溶蛋白能作為藥物片劑的包衣。其可以在胃中不被消化，這樣它就能用于保護藥效成分在胃里完好無缺，但能在在腸道中溶解并緩慢釋放其包衣物(beckm.i,tomkai,wayseke.physico-chemicalcharac-terizationofzeinasafilmcoatingpolymer-adirectcompari-sonwithwithethylcellulose[j].pharm.1996,14:137-150.)。李秀明等在玉米醇溶蛋白(zein)中添加了聚了聚丙撐碳酸酯(ppc)，通過擠壓法制備得到zein-ppc復合薄膜，ppc的添加增強了復合膜的拉伸強度和耐水性，制備的膜為一種良好的可降解的生物材料(李秀明,陳野,王君予,等.ppc對擠壓成型zein-ppc復合薄膜性質(zhì)的影響[j].食品科學,2012,(23):6-10.)。seungyongcho等人進行了玉米醇溶蛋白和大豆蛋白制成的復合膜包裝橄欖油試驗，研究結(jié)果表明，復合膜能顯著減緩橄欖油的氧化和腐敗，達到了很好的阻氧化作用(chosy,leesy,rheec.edibleoxygenbarrierbilayerfilmpouchesfromcornzeinandsoyproteinisolateforoliveoilpackaging[j].lwt-foodscienceandtechnology.2010,43(8):1234-1239.)。

白藜蘆醇是一種生物性很強的天然的多酚類蒽醌萜化合物，又稱為芪三酚，是腫瘤的化學預防劑，也是對降低血小板聚集，預防和治療動脈粥樣硬化、心腦血管疾病的化學預防劑，具有抗氧化、抗腫瘤、保護肝臟等作用。然而其性質(zhì)不穩(wěn)定、水溶性差、生物利用度低，在強酸強堿、光照及較高溫度下容易發(fā)生氧化，且經(jīng)人體攝入后在胃環(huán)境中容易分解破壞而失去活性，因此研究和發(fā)展一種白藜蘆醇的載體，對其進行包封，以保持其活性及提高其生物利用率尤為必要。

研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)納米顆?？梢詫ι锘钚猿煞制鸬胶芎玫陌窈捅Ｗo作用。因此國內(nèi)外學者進行了大量的蛋白質(zhì)對生物活性成分包埋的研究。乳化法是蛋白質(zhì)納米顆粒包埋生物活性成分的常用方法，此法的不足表現(xiàn)在蛋白質(zhì)納米顆粒包埋生物活性成分的過程中需要添加有機溶劑、表面活性劑、戊二醛交聯(lián)劑等，這些試劑的殘留使蛋白質(zhì)納米顆粒的具有一定毒性；去溶劑法和化學交聯(lián)法也涉及有毒交聯(lián)劑的引入；因此這三種方法不是蛋白質(zhì)納米顆粒包埋生物活性成分的理想方法。離子交聯(lián)法和自組裝法制備蛋白質(zhì)納米顆粒，條件溫和，不需要有毒的交聯(lián)劑，不生成化合鍵，僅依靠非共價鍵進行連接，因而被廣泛使用。特別是自組裝法，對于營養(yǎng)遞送系統(tǒng)設(shè)計而言，安全性等相對更佳。然而蛋白質(zhì)畢竟是具體獨特性質(zhì)的生物大分子，僅僅通過簡單自組裝法包埋生物活性成分，蛋白質(zhì)分子對生物活性成分的包埋效率低。

為了解決這一問題，本發(fā)明引進先進的多模式超聲波技術(shù)，希望超聲波能激發(fā)蛋白質(zhì)與多酚兩種生物大分子溶液產(chǎn)生與其自身固有頻率相匹配的共振頻率，產(chǎn)生交聯(lián)，獲得了一種包埋效率高、ph穩(wěn)定、粒徑均一的蛋白質(zhì)納米顆粒，利用所得的蛋白質(zhì)納米顆粒對生物活性成分進行包埋和保護。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，該發(fā)明主要是通過蛋白質(zhì)納米顆粒包埋生物活性成分和多模式超聲波處理等技術(shù)手段制備玉米醇溶蛋白包埋白藜蘆醇納米顆粒，并研究其對白藜蘆醇的包埋作用。

本發(fā)明包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒，是由以下重量份的原料制備而成：

玉米醇溶蛋白：5-20份；

白藜蘆醇：1份。

優(yōu)選由以下重量份的原料制備而成：

玉米醇溶蛋白：20份；

白藜蘆醇：1份。

其中所述的玉米醇溶蛋白為市售產(chǎn)品。

其中所述的玉米醇溶蛋白或者按照下述步驟進行制備：

(1)玉米黃粉采用粉碎機粉碎后過60篩，按照料液比1:10(mg/ml)加入無水乙醇；

(2)逆流超聲波輔助脫色40min，然后4000r/min離心5min分離收集上清液；濾餅待進一步超聲提取玉米醇溶蛋白；

(3)步驟(2)中的濾餅按照料液比1:8(mg/ml)加入80％乙醇，雙頻掃頻超聲波輔助提取，然后4000r/min離心5min分離收集上清液；

(4)上述上清液倒入2倍體積質(zhì)量濃度為0.6％的氯化鈉溶液，回收玉米醇溶蛋白，4℃靜置24h，然后收集沉淀，反復水洗，40℃熱風干燥4h后，粉碎成玉米醇溶蛋白成品。

其中步驟(2)中逆流脈沖超聲輔助脫色的具體參數(shù)為脈沖寬度1～5s、脈沖間隔1～5s、超聲功率密度50～80w/l；超聲頻率20khz，料液以逆流循環(huán)的方式通過超聲探頭。

其中步驟(3)中所述的雙頻掃頻超聲工作時固定上下板間距為10cm，掃頻周期300s，間歇比1:1.2(超聲10s，間歇12s)，上下每塊振板功率為600w。

其中步驟(3)中所述的雙頻頻率組合為：33khz/68khz、33khz/40khz、33khz/28khz；最優(yōu)選佳頻率組合為33khz/68khz。

其中所述的包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒，按照下述步驟進行制備得到：

(1)將玉米醇溶蛋白溶解到70％乙醇中，得到玉米醇溶蛋白濃度為0.06g/ml溶液，磁力攪拌至完全溶解；8000r/min條件下低溫(4℃)離心10min；取0.75ml上清液，渦旋振蕩條件下逐滴分散到2ml去離子水中；

(2)在避光條件下將白藜蘆醇將入到上述混合溶液中，使得玉米醇溶蛋白和白藜蘆醇的質(zhì)量比例為5-20：1。

(3)在避光條件下同時進行多頻模式超聲處理，其中所述的多頻超聲處理模式為：三頻或者雙頻或者單頻同步超聲處理，超聲功率密度80～120w/l；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間3s，超聲處理時間為40min。

其中三頻或者雙頻或者單頻同步超聲處理的超聲波頻率組合為：20khz、28khz、28/40khz或者20/28/40khz，優(yōu)選20/28/40khz。

(4)超聲結(jié)束后，室溫下靜置6h，即得包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白溶液，噴霧干燥或者冷凍干燥后得包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)本發(fā)明在玉米醇溶蛋白包埋白藜蘆醇的過程中施加了多模式超聲波，改變玉米醇溶蛋白的高級結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)打開，暴露活性基團，蛋白質(zhì)形成小的聚集體，從而促進各聚集體通過疏水相互作用形成納米顆粒為包埋生物活性成分提供基礎(chǔ)。

(2)本發(fā)明中包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒的制備方法，工藝操作簡單，制備過程中未涉及有機試劑，適宜工業(yè)化生產(chǎn)，且玉米醇溶蛋白原料價格便宜，制備工藝簡單。

(3)本發(fā)明的包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒具有穩(wěn)定性好、生物相容性好、緩釋時間長、包載率高等優(yōu)點，可應用于食品、保健品、藥品及化妝品等多個領(lǐng)域。

(4)本發(fā)明以玉米黃粉為原料，分離提取其中的玉米醇溶蛋白并用作制備包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒的原料，有利于玉米加工副產(chǎn)物的綜合利用，同時提高玉米黃粉的附加值。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的多模式超聲波生物處理設(shè)備結(jié)構(gòu)圖，其中1、2、3為超聲振板，4為盛液器，5為水浴鍋，6為溫度探頭，7為循環(huán)泵，8為電腦程序控制器，9、10、11為超聲控制器。

圖2是掃頻雙頻超聲預處理裝置的設(shè)備圖，1-超聲池，2-溫度計，3-恒溫水浴池，4-超聲波上振板，5-超聲波下振板，6-樣品處理區(qū)域，7-電腦控制器，8-超聲波發(fā)生器。

圖3是逆流超聲處理設(shè)備結(jié)構(gòu)示意圖，1為聚能式超聲波探頭，2為超聲波控制器，3為超聲杯型腔，4為進料口，5為循環(huán)泵，6為盛液器，7為出料口。

具體實施方式

在本發(fā)明中所使用的術(shù)語，除非有另外說明，一般具有本領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的含義。下面結(jié)合具體的實施例，并參照數(shù)據(jù)進一步詳細地描述本發(fā)明。應理解，這些實施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

圖1為本發(fā)明的多模式超聲波生物處理設(shè)備，該設(shè)備配有一臺電腦程序控制器8，可設(shè)定超聲工作參數(shù)(超聲功率密度、頻率、脈沖工作時間、間歇時間和處理總時間)分別控制三個超聲控制器9、10、11，分別連接三支不同頻率的超聲振板1、2、3，可實現(xiàn)單一頻率/兩個頻率/三個頻率超聲波處理；將需要處理的溶液投入盛液器4中進行單頻/雙頻/多頻超聲輔助酶解試驗，啟動循環(huán)泵7對溶液進行循環(huán)。通過水浴鍋5和溫度探頭6實現(xiàn)溶液溫度的自動控制。

圖2為本發(fā)明使用的掃頻雙頻超聲預處理裝置的設(shè)備圖，為江蘇大學自主研制。超聲發(fā)生器8能發(fā)出定頻和掃頻兩種模式的超聲波，單臺超聲波發(fā)生器功率為600w。在超聲池1中上下對稱放置超聲波振板上板4和超聲波下板5，通過超聲波發(fā)生器8控制超聲波振板上板4和超聲波下板5；電腦控制器7設(shè)定超聲波各參數(shù)后，控制超聲波發(fā)生器8，發(fā)出符合要求的超聲波；3為本發(fā)明中設(shè)備的恒溫水浴池，通過溫度計2實時監(jiān)控溫度，并根據(jù)工作需要調(diào)節(jié)介質(zhì)溫度；將需要處理的液原料置于樣品袋中置于處理液區(qū)域6中進行超聲波處理。

圖3為本發(fā)明的逆流超聲處理設(shè)備，該設(shè)備配有超聲波控制器2，控制超聲參數(shù)，聚能式超聲波探頭1對進料口4進入超聲杯型腔3的物料進行處理，超聲的同時啟動循環(huán)泵5對料液進行循環(huán)，6為盛液器，7為出料口。

本發(fā)明中的玉米醇溶蛋白為市售產(chǎn)品(蛋白質(zhì)含量大于90％)。

本發(fā)明中的玉米醇溶蛋白或者按照下述步驟進行制備：

(1)玉米黃粉采用粉碎機粉碎后過60篩，按照料液比1:10(mg/ml)加入無水乙醇；

(2)逆流超聲波脫色40min，然后4000r/min離心5min分離收集上清液；濾餅待進一步超聲提取玉米醇溶蛋白；具體參數(shù)為脈沖寬度5s、脈沖間隔5s、超聲功率密度80w/l；超聲頻率20khz，料液以逆流循環(huán)的方式通過超聲探頭。

(3)步驟(2)中的濾餅按照料液比1:8(mg/ml)加入80％乙醇，雙頻掃頻超聲波輔助提取，然后4000r/min離心5min分離收集上清液；雙頻掃頻超聲工作時固定上下板間距為10cm，掃頻周期300s，間歇比1:1.2(超聲10s，間歇12s)，上下每塊振板功率為600w；雙頻頻率組合為：33khz/68khz。

(4)上述上清液倒入2倍體積質(zhì)量濃度為0.6％的氯化鈉溶液，回收玉米醇溶蛋白，4℃靜置24h，然后收集沉淀，反復水洗，40℃熱風干燥4h后，粉碎成玉米醇溶蛋白成品，測得其中蛋白質(zhì)含量為90.5％。

實施例1-4(不加超聲)

(1)將玉米醇溶蛋白溶解到70％乙醇中，得到玉米醇溶蛋白濃度為0.06g/ml溶液，磁力攪拌至完全溶解；8000r/min條件下低溫(4℃)離心10min；取0.75ml上清液，渦旋振蕩條件下逐滴分散到2ml去離子水中；

(2)在避光條件下將白藜蘆醇將入到上述混合溶液中，玉米醇溶蛋白和白藜蘆醇的質(zhì)量比例為5:1。

(3)室溫下靜置6h，即得包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白溶液，按照下述步驟測定白藜蘆醇包封率，游離白藜蘆醇含量測定:取包覆白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白溶液，經(jīng)超濾管(截留分子量10kd)在8000×g下離心20min，取濾液500μl于25ml容量瓶中定容，測定a306處的吸光值，并計算游離白藜蘆醇質(zhì)量。

根據(jù)下式計算白藜蘆醇的包封率和負載率：

白藜蘆醇的包封率(％)＝(白藜蘆醇總質(zhì)量－游離白藜蘆醇質(zhì)量)×100/白藜蘆醇總質(zhì)量；

白藜蘆醇的負載率(％)＝(白藜蘆醇總質(zhì)量－游離白藜蘆醇質(zhì)量)×100/樣品總質(zhì)量。

(4)噴霧干燥或者冷凍干燥后得包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒。

實施例2-4制備過程同實施例1，只是玉米醇溶蛋白/白藜蘆醇質(zhì)量不同，具體見表1不同玉米醇溶蛋白/白藜蘆醇質(zhì)量比對白藜蘆醇包封率和負載率的影響。

通過表1中對比實施例1-4不同玉米醇溶蛋白/白藜蘆醇質(zhì)量比對白藜蘆醇包封率和負載率的影響可以看出，隨著玉米醇溶蛋白的量增加，白藜蘆醇的包封率逐步降低，但是當玉米醇溶蛋白/白藜蘆醇質(zhì)量比為20:1時，白藜蘆醇的包封率又升高了，達到了55.6％。

表1不同玉米醇溶蛋白/白藜蘆醇質(zhì)量比對白藜蘆醇包封率和負載率的影響

實施例5-10(加超聲)

(1)將玉米醇溶蛋白溶解到70％乙醇中，得到玉米醇溶蛋白濃度為0.06g/ml溶液，磁力攪拌至完全溶解；8000r/min條件下低溫(4℃)離心10min；取0.75ml上清液，渦旋振蕩條件下逐滴分散到2ml去離子水中；

(2)在避光條件下將白藜蘆醇將入到上述混合溶液中，玉米醇溶蛋白和白藜蘆醇的質(zhì)量比例為10:1。

(3)在避光條件下同時進行多頻模式超聲處理，其中所述的多頻超聲處理模式為：三頻或者雙頻或者單頻同步超聲處理，超聲功率密度120w/l；超聲脈沖工作時間10s；脈沖間歇時間3s。其中同步超聲處理的超聲波頻率為：28khz。

(4)室溫下靜置6h，即得包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白溶液，按照下述步驟測定白藜蘆醇包封率，游離白藜蘆醇含量測定:取包覆白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白溶液，經(jīng)超濾管(截留分子量10kd)在8000×g下離心20min，取濾液500μl于25ml容量瓶中定容，測定a306處的吸光值，并計算游離白藜蘆醇質(zhì)量。

根據(jù)下式計算白藜蘆醇的包封率和負載率：

白藜蘆醇的包封率(％)＝(白藜蘆醇總質(zhì)量－游離白藜蘆醇質(zhì)量)×100/白藜蘆醇總質(zhì)量；

白藜蘆醇的負載率(％)＝(白藜蘆醇總質(zhì)量－游離白藜蘆醇質(zhì)量)×100/樣品總質(zhì)量。

(5)噴霧干燥或者冷凍干燥后得包埋白藜蘆醇的玉米醇溶蛋白納米顆粒。

實施例6-8制備過程同實施例5，只是超聲參數(shù)略有改變，表2不同超聲波模式對白藜蘆醇包封率和負載率的影響。

表2不同超聲波模式對白藜蘆醇包封率和負載率的影響

通過表2中對比實施例5-8不同超聲波模式對玉米醇溶蛋白納米顆粒包埋白藜蘆醇的包封率和負載率的影響，可以發(fā)現(xiàn)超聲波處理可以顯著提高玉米醇溶蛋白納米顆粒包埋白藜蘆醇的包封率，與對照相比(不超聲)，28khz的單頻超聲波處理即可使白藜蘆醇的包封率提高70.4％，而20/28/40khz的多頻超聲波處理則使白藜蘆醇的包封率提高了88.3％。