本發(fā)明屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種柵藻水提取物及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

微藻是指在顯微鏡下才能辨別其形態(tài)的微小的藻群，是水體生態(tài)系統(tǒng)中主要的初級(jí)生產(chǎn)者。微藻具有極大的生物多樣性和遺傳多樣性，可以適應(yīng)各種類型的環(huán)境條件，通常以單細(xì)胞、多細(xì)胞群體或細(xì)長(zhǎng)的絲狀形式存在，在生物圈內(nèi)分布廣泛。地球上大約存在200000～800000種不同門類的微藻，其中約35000種已有描述，但目前僅有一小部分微藻在科學(xué)研究中有涉及，而在生產(chǎn)實(shí)踐中得到開發(fā)和應(yīng)用則更少。

微藻具有營(yíng)養(yǎng)豐富，具有極大的生物多樣性和遺傳多樣性，不占用耕地，生物量大，環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，生長(zhǎng)周期短，能夠利用太陽(yáng)能、二氧化碳和水進(jìn)行光合自養(yǎng)，光合效率高等特點(diǎn)。隨著社會(huì)和科技的進(jìn)步，全球性食品、資源和能源短缺壓力日益增加，微藻資源的研究成為了研究熱點(diǎn)。但目前大部分微藻的應(yīng)用研究都集中在高效產(chǎn)油方面，在醫(yī)藥、保健食品方面的應(yīng)用研究較少，且主要集中在螺旋藻、小球藻、鹽生杜氏藻和紫球藻等幾種常見的微藻，其他微藻在醫(yī)藥、保健食品方面的應(yīng)用研究則相對(duì)較少報(bào)道。

柵藻，又稱柵列藻，是綠藻門綠球藻目柵藻科的一屬，通常由4～8個(gè)細(xì)胞或16～32個(gè)細(xì)胞組成定型群體，極少為單細(xì)胞。細(xì)胞常為橢圓形或紡錘形，以長(zhǎng)軸排成1～2列或多列。柵藻是淡水中常見的浮游藻類，極喜在營(yíng)養(yǎng)豐富的靜水中繁殖，繁殖迅速，適應(yīng)性強(qiáng)，自身合成油脂能力強(qiáng)，許多種類對(duì)有機(jī)污染物具有較強(qiáng)的耐性，柵藻細(xì)胞內(nèi)含有豐富的蛋白質(zhì)和維生素，是魚類很好的飼料，如利用有機(jī)污水氧化塘養(yǎng)魚，可獲高產(chǎn)，大量繁殖的藻體也可作家禽的飼料。但是目前對(duì)柵藻的研究及應(yīng)用主要集中在污水處理，生物能源和家禽飼料等方面，對(duì)其抗氧化方面的生物活性研究則鮮有報(bào)道。因此，開發(fā)柵藻作為保健食品具有很大的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種柵藻水提取物。本發(fā)明提供的柵藻水提取物是通過(guò)將新鮮的柵藻濕藻反復(fù)凍融，離心去上清；取沉淀加乙醇進(jìn)行超聲提取，離心去上清；取沉淀，用水洗滌后加水進(jìn)行加熱提取制得，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明的技術(shù)方案將通過(guò)下面的詳細(xì)描述來(lái)進(jìn)一步體現(xiàn)和說(shuō)明。

一種柵藻水提取物，其制備方法包括如下步驟：

s1、取新鮮的柵藻濕藻，在溫度為-20℃～-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融3～5次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；上清液即為柵藻胞內(nèi)液；

s2、向步驟s1所述的沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)為70％～99％的乙醇超聲提取2～4次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

取上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，即得柵藻乙醇提取物；

s3、用一級(jí)水洗滌步驟s2所述的沉淀1～3次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中加入一級(jí)水在溫度為70℃～100℃的條件下提取3～5次，每次30～60min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min～10000r/min的條件下離心5～15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，即得柵藻水提取物。

優(yōu)選地，步驟s2中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入乙醇進(jìn)行超聲提取。

優(yōu)選地，步驟s2中超聲提取的頻率為35～40khz，溫度為4℃。

優(yōu)選地，步驟s2中每次超聲提取的時(shí)間為10～30min。

優(yōu)選地，步驟s3中按濕藻與一級(jí)水的固液比1g/ml加入一級(jí)水進(jìn)行加熱提取。

本發(fā)明所述柵藻(scenedesmussp.)由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供，其在中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)中的編號(hào)為fachb-16。

本發(fā)明發(fā)明人在對(duì)微藻進(jìn)行研究的過(guò)程中，進(jìn)行了大量的試驗(yàn)，意外發(fā)現(xiàn)不僅柵藻胞內(nèi)液和柵藻乙醇提取物具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，提取了柵藻胞內(nèi)液和柵藻乙醇提取物后的殘?jiān)铀M(jìn)行加熱提取得到的柵藻水提取物同樣具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，且效果更為顯著。

在整體動(dòng)物水平上以氧化應(yīng)激模型及衰老相關(guān)模型進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的柵藻水提取物能夠顯著延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率，且柵藻水提取物的終濃度為80mga/ml時(shí)的效果顯著優(yōu)于終濃度為40mga/ml、120mga/ml時(shí)的效果。柵藻水提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響試驗(yàn)的試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的柵藻水提取物能促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)的水平。本發(fā)明提供的柵藻水提取物具有顯著的抗氧化和抗衰老作用，可應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品。

本發(fā)明柵藻水提取物可單獨(dú)或與其他活性成分合用，作為唯一或主要活性成分應(yīng)用于制備具有抗氧化和/或抗衰老功能的保健食品和藥品，所述保健食品和藥品的劑型優(yōu)選為片劑、膠囊劑、注射液、口服液、顆粒劑、丸劑、散劑和滴丸劑等。

本發(fā)明所述的抗氧化、抗衰老作用是指對(duì)以病理或生理?xiàng)l件下因發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)所產(chǎn)生的變化為主要特征的衰老及衰老相關(guān)疾病的防治作用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明提供的柵藻水提取物可以促進(jìn)體內(nèi)活性氧自由基(ros)的清除，顯著降低體內(nèi)活性氧自由基(ros)水平，具有顯著的抗氧化作用。

(2)本發(fā)明提供的柵藻水提取物可以延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率，具有顯著的抗衰老和抗氧化作用。

(3)本發(fā)明提供的柵藻水提取物的制備方法具有周期短，有機(jī)溶劑消耗少，工藝簡(jiǎn)單，安全無(wú)毒，穩(wěn)定高效等特點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說(shuō)明

圖1柵藻水提取物對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖2柵藻水提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響。

圖3柵藻胞內(nèi)液對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響。

圖4柵藻乙醇提取物對(duì)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所使用的材料、試劑，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

本發(fā)明實(shí)施例中，柵藻由中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所提供，其在中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)中的編號(hào)為fachb-16。

sbasal溶液：稱取5.8gnacl，1.3gk2hpo4·3h2o和6.0gkh2po4置于試劑瓶中，加入750ml去離子水，完全溶解后定容至1l，滅菌30min，冷卻至40-50℃?zhèn)溆谩?/p>

smedium溶液：取1l滅菌后的sbasal溶液，逐滴加入1ml5.0mg/ml膽固醇乙醇溶液，邊加變振搖，使其充分溶解(溶液由無(wú)色透明轉(zhuǎn)為微乳白透明，無(wú)明顯沉淀)，然后依次加入3ml1mcacl2溶液，3ml1mmgso4，10ml1m檸檬酸鉀溶液(ph＝6.0)和10ml微量元素溶液，常溫放置備用。

實(shí)施例1柵藻水提取物的制備

s1、取新鮮的柵藻濕藻，在溫度為-20℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融5次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為80％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為30min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級(jí)水洗滌步驟s2所述的沉淀2次，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級(jí)水的固液比1g/ml加入一級(jí)水在溫度為100℃的條件下提取4次，每次45min，在轉(zhuǎn)速為8000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于柵藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示柵藻濕藻)，即得柵藻水提取物。

此外，取步驟s1離心后分離得到的上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于柵藻(濕藻)重量的濃度為2ga/ml(a表示柵藻濕藻)，即得柵藻胞內(nèi)液。

取步驟s2離心后分離得到的上清液進(jìn)行真空干燥，將真空干燥后的產(chǎn)物用一級(jí)水溶解，調(diào)節(jié)其相對(duì)于柵藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示柵藻濕藻)，即得柵藻乙醇提取物。

實(shí)施例2柵藻水提取物的制備

s1、取新鮮的柵藻濕藻，在溫度為-30℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融4次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心5min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為90％的乙醇超聲提取3次，超聲提取的頻率為35khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為20min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級(jí)水洗滌步驟s2所述的沉淀3次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級(jí)水的固液比1g/ml加入一級(jí)水在溫度為90℃的條件下提取3次，每次30min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于柵藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示柵藻濕藻)，即得柵藻水提取物。

實(shí)施例3柵藻水提取物的制備

s1、取新鮮的柵藻濕藻，在溫度為-40℃的條件下冷凍12小時(shí)，室溫融化12小時(shí)，反復(fù)凍融3次，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s2、向步驟s1所述的沉淀中按濕藻與乙醇的固液比1g/ml加入體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇超聲提取4次，超聲提取的頻率為40khz，溫度為4℃，每次超聲的時(shí)間為20min，在轉(zhuǎn)速為5000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，取沉淀備用；

s3、用一級(jí)水洗滌步驟s2所述的沉淀2次，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心15min，將上清液和沉淀分離，去上清液，向沉淀中按濕藻與一級(jí)水的固液比1g/ml加入一級(jí)水在溫度為70℃的條件下提取5次，每次60min，在轉(zhuǎn)速為10000r/min的條件下離心10min，將上清液和沉淀分離，取上清液，加一級(jí)水調(diào)節(jié)其相對(duì)于柵藻(濕藻)重量的濃度為1ga/ml(a表示柵藻濕藻)，即得柵藻水提取物。

實(shí)施例4柵藻水提取物對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

百草枯，學(xué)名甲基紫精，是一種強(qiáng)氧化劑，可誘導(dǎo)體內(nèi)大量產(chǎn)生活性氧自由基(ros)，使機(jī)體處于氧化脅迫環(huán)境，進(jìn)而出現(xiàn)早衰現(xiàn)象。

取實(shí)施例1制得的柵藻水提取物，按終濃度40mga/ml、80mga/ml、120mga/ml分別加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)(由美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)秀麗隱桿線蟲遺傳信息保藏中心提供)中，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖1所示。

圖1結(jié)果顯示，柵藻水提取物能夠延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率，且當(dāng)柵藻水提取物終濃度為80mga/ml，效果最為顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的柵藻水提取物能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實(shí)施例5柵藻水提取物對(duì)秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平的影響

取24孔培養(yǎng)板，設(shè)試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)兩個(gè)孔，每孔終體積為1ml，試驗(yàn)組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和實(shí)施例1制得的柵藻水提取物，柵藻水提取物的終濃度100mga/ml，對(duì)照組加同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)和與試驗(yàn)組柵藻水提取物等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，每孔加入百草枯至終濃度為2mm，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集各組秀麗隱桿線蟲，將其分別在冰浴條件下勻漿，將勻漿液在4℃、10000g條件下離心5min，收集上清液，向上清液中加入終濃度為50μm的dcfh-da探針(購(gòu)于sigma公司，cas號(hào)：2044-85-1)溶液，利用熒光酶標(biāo)儀在485nm激發(fā)波長(zhǎng)和538nm發(fā)射波長(zhǎng)下檢測(cè)熒光強(qiáng)度，室溫檢測(cè)2h，每10min測(cè)一次。結(jié)果用f檢驗(yàn)分析，結(jié)果如圖2所示。

圖2結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，經(jīng)柵藻水提取物飼喂后，秀麗隱桿線蟲體內(nèi)ros水平顯著下降。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的柵藻水提取物能夠促進(jìn)體內(nèi)ros的清除，降低體內(nèi)ros水平，具有顯著的抗氧化能力。

實(shí)施例6柵藻胞內(nèi)液對(duì)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲存活率的影響

取實(shí)施例1制得的柵藻胞內(nèi)液，按終濃度200mga/ml、600mga/ml分別加入到成蟲初期的野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)24h后，加入終濃度為50mm的百草枯進(jìn)行氧化脅迫造模，然后每隔12h統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲存活的比例，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的存活率以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖3所示。

圖3結(jié)果顯示，柵藻胞內(nèi)液能夠延長(zhǎng)氧化脅迫條件下秀麗隱桿線蟲的生存時(shí)間，提高其存活率，且當(dāng)柵藻胞內(nèi)液終濃度為600mga/ml，效果最為顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的柵藻胞內(nèi)液能夠緩解由氧化脅迫引起的早衰現(xiàn)象，具有顯著的抗氧化和抗衰老作用。

實(shí)施例7柵藻乙醇提取物對(duì)自然條件下秀麗隱桿線蟲平均壽命的影響

向同步化后的l4期野生型秀麗隱桿線蟲(n2)中加入終濃度為100mga/ml的實(shí)施例1制得的柵藻乙醇提取物，對(duì)照組加入等體積的smedium溶液，置于20℃培養(yǎng)，然后每隔1天統(tǒng)計(jì)秀麗隱桿線蟲的存活情況，直至其全部死亡。秀麗隱桿線蟲的壽命以生存曲線表示，結(jié)果用kaplan-meier法進(jìn)行分析。結(jié)果如圖4所示。

圖4結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，柵藻乙醇提取物相能夠延長(zhǎng)自然條件下秀麗隱桿線蟲的平均壽命。試驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明提供的柵藻乙醇提取物具有延緩衰老進(jìn)程的作用，即，具有顯著的抗衰老作用。

以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換，都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。