本發(fā)明涉及功能性納米生物制品，具體涉及利用谷氨酰胺酶制備大豆分離蛋白‐姜黃素納米顆粒結合物的方法。

背景技術：

近年來，國內對于利用蛋白質包埋一些疏水性生物活性成分的研究越來越多。2015年陳碩等采用pH3.0和pH7.0時的大豆分離蛋白和豌豆分離蛋白為原料，在蛋白濃度為0.5mg/mL時，向其中添加不同姜黃素濃度(0～60μM)乙醇溶液，迅速渦旋振蕩20s形成蛋白質‐姜黃素復合物，經(jīng)測定復合物在pH3.0和pH7.0的粒徑分別為96.2nm和60.3nm，裝載量分別為6.238±0.107和8.582±0.595。(陳碩,陳飛平,唐傳核.植物球蛋白/姜黃素納米復合物的制備及其對O/W型Pickering乳液氧化穩(wěn)定性影響[J].現(xiàn)代食品科技,2015(12):197‐204.)2016年華南理工大學公開了一種可溶性大豆多糖‐大豆蛋白‐姜黃素復合物及制備與應用(專利申請?zhí)?01510598337.1)。主要步驟：將大豆蛋白和大豆多糖分別分散溶解于去離子水中；將姜黃素分散于無水乙醇中充分溶解；然后將姜黃素乙醇溶液加入到大豆蛋白分散液中,得到大豆蛋白‐姜黃素混合液；再將大豆多糖分散液加入到大豆蛋白‐姜黃素混合液中,調節(jié)pH至7.0或4.0,冷凍干燥,得到可溶性大豆多糖‐大豆蛋白‐姜黃素復合物。發(fā)明人聲稱將大豆多糖和大豆蛋白與姜黃素進行連續(xù)復合,顯著提高姜黃素在水溶液中的穩(wěn)定性和緩釋效果,在功能性食品及藥品的開發(fā)中具有良好的應用前景。2014年華南理工大學公開了一種超聲輔助制備大豆蛋白‐姜黃素復合物的方法(專利申請?zhí)?01410521682.)。主要步驟：:將大豆蛋白加入水中,常溫攪拌分散,水化得到大豆蛋白分散液；將所得大豆蛋白分散液進行超聲處理,然后冷卻至常溫；將姜黃素預分散于無水乙醇中,于常溫在攪拌條件下,將含有姜黃素的無水乙醇溶液添加至大豆蛋白分散液中,攪拌混合,室溫靜置,離心,取離心上清液干燥，得到大豆蛋白‐姜黃素復合物。發(fā)明人聲稱利用超聲波處理展開大豆蛋白的空間立體結構,提高其與姜黃素的結合效率,大大提高了姜黃素在水中的溶解性和生物穩(wěn)定性；且生產(chǎn)工藝簡單，所需有機溶劑的量極小,綠色環(huán)保安全。2013年蘇州雷納藥物研發(fā)有限公司公開了一種高包封率姜黃素白蛋白納米藥物組合物(專利申請?zhí)?01210484495)。主要步驟：取處方量人血清白蛋白溶于水相,置于30℃恒溫水浴,在持續(xù)攪拌(480rpm)的同時,向水相中滴加姜黃素無水乙醇溶液至處方量,加入2％戊二醛水溶液,繼續(xù)攪拌固化24小時,于35℃旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑,殘留水相過0.22pm微孔濾膜,凍干,即得固體粉末。發(fā)明人聲稱其制備的納米藥物組合物可以達到55％的包封率，同時該藥物組合物可以用于臨床上抗腫瘤的應用。

上述論文和專利中，未見公開利用谷氨酰胺酶改性之后制備蛋白質‐姜黃素納米顆粒結合物的研究報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供大豆分離蛋白‐姜黃素納米顆粒結合物及其制備方法，具體技術方案如下。

本發(fā)明的大豆分離蛋白‐姜黃素納米顆粒的制備方法，包括如下步驟：

(1)以市售豆粕為原料，通過堿溶酸沉的方法得到自制的大豆分離蛋白；

(2)將大豆分離蛋白加入水中，充分溶解，加入谷氨酰胺酶進行酶改性，得到酶改性大豆分離蛋白；

(3)將酶改性得到的大豆分離蛋白與姜黃素乙醇溶液混合，室溫攪拌充分混合，將混合液離心除去沉淀，得到的上清液進行冷凍干燥，得到的粉末即為大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物。

進一步地，所述堿溶酸沉的具體過程為：將豆粕以1：10-20的質量比例加入蒸餾水，用2M的氫氧化鈉調節(jié)pH為7.0-9.0，之后離心取上清液，再用2M的鹽酸調節(jié)pH為4-5，靜置20-60min，離心得到沉淀，之后再將沉淀復溶，透析凍干，即可得到自制大豆分離蛋白。

進一步地，所述大豆分離蛋白與水的質量比為1：10-100。

進一步地，所述酶改性條件為pH為7.0-9.0，溫度為30℃-60℃，保溫時間為0.5-6h，反應結束之后于80-90℃水浴鍋中保溫10-30min，離心得到上清液，即為酶改性大豆分離蛋白。

進一步地，所述谷氨酰胺酶的添加量為大豆蛋白重量的0.01-0.4％。

進一步地，所述谷氨酰胺酶來源于解淀粉芽孢桿菌或日本田野公司。

進一步地，所述解淀粉芽孢桿菌保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC8425。

進一步地，所述姜黃素乙醇溶液濃度為0.5-5mg/mL。

進一步地，所述姜黃素乙醇溶液與大豆分離蛋白溶液的體積比為1:1-100。

進一步地，所述離心條件為8000g-1000g離心15min。

本發(fā)明還提供了由上述任一項所述制得大豆蛋白-姜黃素納米顆粒結合物。本發(fā)明所制得的大豆分離蛋白‐姜黃素納米顆粒結合物，可以在食品工業(yè)中增加姜黃素的利用率。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術效果：

(1)本發(fā)明首次公開利用谷氨酰胺酶改性得到的大豆分離蛋白包埋姜黃素，得到一種納米顆粒結合物，其粒徑約為300nm以下。

(2)本發(fā)明所得產(chǎn)品裝載量可以達到10‐70mg/g，具有較好的包埋效果。

具體實施方式

以下結合實施例對本發(fā)明的具體實施作進一步說明，但本發(fā)明的實施和保護范圍不限于此。

包封率＝(1‐游離姜黃素含量/總的姜黃素含量)*100％

裝載量(mg/g)＝結合的姜黃素含量/蛋白含量

蛋白利用率＝(上清液的蛋白質含量/總的蛋白質含量)*100％

PDI＝數(shù)均粒徑/重均粒徑，由粒度分布儀直接測定。

實施例1

大豆分離蛋白的制備：稱取200g豆粕打粉，溶于10倍質量的去離子水，用2.0M的NaOH調節(jié)pH至8.0，攪拌2h后4℃離心(8000g，20min)，取上清再用2.0M的HCl調節(jié)pH為4.5,于4℃冰箱靜置30min，之后再離心，倒掉上清液，清洗沉淀3次之后掏出稱重，將沉淀溶于5倍去離子水，復溶之后于4℃透析48h，凍干即可得到大豆分離蛋白。

取出已在申請人其他專利申請中保藏的解淀粉芽孢桿菌SWJS22(Bacillus amyloliquefaciens SWJS22，CGMCC No.8425)試管斜面，在無菌操作臺中，刮取少許菌落，在中性酪蛋白平板上劃線，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，再挑取單菌落轉接到另一平板進行培養(yǎng)，如此重復3次，使菌株完全復壯。挑取一環(huán)已經(jīng)在中性酪蛋白平板上活化三代的SWJS22菌株接入裝液量為10％的LB培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基由胰蛋白胨10％，酵母抽提物0.2％，氯化鈉10％，水78％組成)里面，在150rpm，37℃下培養(yǎng)12h，得種子液。

在麩皮：水＝5:3(w/w)，蔗糖酯SE‐1170的添加量0.5％(w/w)，解淀粉芽孢桿菌SWJS22種子液的接種量2.0％(v/w)，37℃的條件下，固體發(fā)酵48h，得谷氨酰胺酶，谷氨酰胺酶的酶活力為2.72GTU/g。

分別配制1％，2％，4％，8％質量百分比濃度的大豆分離蛋白溶液，添加大豆分離蛋白重量0.4％的谷氨酰胺酶，調節(jié)pH至8.5，在60℃保溫0.5h后，85℃保溫20min滅酶，得到酶改性之后的大豆分離蛋白，與姜黃素混合攪拌，之后測定平均粒徑、PDI、Zeta電位、包封率和裝載量，結果見表1。

表1

由表1可以看出，隨著大豆分離蛋白溶液濃度的增加，大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物的粒徑呈現(xiàn)增長的趨勢，但是可以發(fā)現(xiàn)當大豆分離蛋白的濃度為4％時得到的納米顆粒結合物的PDI最小，表明該體系最穩(wěn)定；另外隨著濃度的增加，姜黃素的包封率呈現(xiàn)增長的趨勢，且都表現(xiàn)出較高的包封率。

對比實施例1

分別配制1％，2％，4％，8％(wt％)濃度的大豆分離蛋白水溶液，調節(jié)pH至8.5，在60℃保溫0.5h后，85℃保溫20min熱處理，得大豆分離蛋白蛋白，與姜黃素混合攪拌，之后測定平均粒徑、PDI、Zeta電位和包封率，結果見表2。

表2

相比較于酶改性之后制備的納米顆粒結合物而言，未經(jīng)過酶改性的大豆分離蛋白-姜黃素的納米顆粒結合物的顆粒較大，裝載量小，且PDI值高，Zeta電位偏低，表明整個體系相對來說比較不穩(wěn)定。

實施例2

配制1wt％濃度的大豆分離蛋白水溶液，添加蛋白質重量0.04％的日本天野公司谷氨酰胺酶，調節(jié)pH至9.0，在30℃保溫6h后，80℃保溫10min滅酶，得到酶改性大豆分離蛋白，分別加入不同比例的姜黃素，姜黃素：大豆分離蛋白的體積比分別為1:1，1:5；1:10；1:50制備納米顆粒結合物，測定平均粒徑、PDI、Zeta電位以及包封率，見表3。

表3

由表3可以看出，隨著姜黃素濃度的降低，蛋白質-姜黃素結合物的粒徑呈現(xiàn)降低的趨勢，而PDI都在基本在0.5以下，體系呈現(xiàn)較好的穩(wěn)定性。而隨著姜黃素濃度的降低，包封率卻呈現(xiàn)增加的趨勢，有可能是因為高濃度的姜黃素會自身發(fā)生聚集，而導致蛋白質無法完全包埋姜黃素。

對比實施例2

配制1wt％濃度的大豆分離蛋白，調節(jié)pH至9.0，在30℃保溫6h后，80℃保溫10min，得到大豆分離蛋白，分別加入不同比例的姜黃素，姜黃素：大豆分離蛋白的體積比分別為1:1，1:5；1:10；1:50制備納米顆粒結合物，測定平均粒徑、PDI、Zeta電位，見表4。

表4

由表4可以看出，隨著姜黃素濃度的降低，蛋白質-姜黃素結合物的粒徑呈現(xiàn)減少的趨勢，而PDI都在基本在0.59以上，體系呈現(xiàn)較差的穩(wěn)定性，說明包埋的效果不太好。而隨著姜黃素濃度的降低，包封率卻呈現(xiàn)增加的趨勢，卻均低于酶改性之后的大豆分離蛋白。說明酶改性對于大豆分離蛋白包埋疏水性生物活性成分有較好的效果。

實施例3

分別配制1％，2％，4％，8％濃度的大豆分離蛋白溶液，添加蛋白質重量0.04％的谷氨酰胺酶(來源于解淀粉芽孢桿菌，谷氨酰胺酶的制備方法同實施例1)，調節(jié)pH至7.1，在55℃保溫2h后，85℃保溫25min滅酶，得到酶改性之后的蛋白質，與姜黃素混合攪拌，之后測定平均粒徑、PDI、Zeta電位和蛋白質利用率，結果見表5。

表5

由表5可以看出，大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物的整體粒徑較小，說明酶改性之后的大豆分離蛋白呈現(xiàn)較好的效果。另外，蛋白質利用率較高，說明大部分的蛋白質都用于包埋姜黃素。

對比實施例3

分別配制1％，2％，4％，8％濃度的大豆蛋白溶液，調節(jié)pH至7.1，在55℃保溫2h后，85℃保溫25min，得到大豆分離蛋白，與姜黃素混合攪拌，之后測定平均粒徑、PDI、Zeta電位和蛋白質利用率，結果見表6。

表6

由表6可以看出，與改性蛋白質相比，未改性的蛋白質-姜黃素結合物的整體粒徑較大，并且蛋白質利用率也呈現(xiàn)較低的結果。

實施例4

配制1wt％濃度的大豆分離蛋白水溶液兩份，均調節(jié)pH為8.0，其中一份加入大豆分離蛋白重量的0.03％的日本田野的谷氨酰胺酶，均置于45℃的水浴鍋中保溫1h，之后置于80℃中保溫20min滅酶，分別得到酶改性大豆分離蛋白和大豆分離蛋白，分別加入與大豆分離蛋白體積比為1:50的姜黃素乙醇溶液(5mg/mL)，在室溫下混合攪拌，得到大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物，將這些樣品離心(9000g，5min)得到上清液，進行貯藏穩(wěn)定性的測定。

分別測定游離姜黃素(CUR)，酶改性大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物(E-SPI-CRU)以及大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物(SPI-CUR)的1％水溶液在0h，1d，2d，3d，4d在426nm處的吸光度值，所有樣品的初始保留率為1。測定結果見表7。

表7

由表7可以看出，隨著時間的延長，游離姜黃素的貯藏穩(wěn)定性下降的很快，而與大豆分離蛋白結合之后，姜黃素的貯藏穩(wěn)定性均呈現(xiàn)較高的水平，總體來看，酶改性之后的大豆分離蛋白-姜黃素納米顆粒結合物的貯藏穩(wěn)定性較好，有利于姜黃素的應用。