本發(fā)明涉及毒素降解技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法。

背景技術(shù)：

黃曲霉毒素是一類化學結(jié)構(gòu)相似的化合物的統(tǒng)稱，為二氫呋喃香豆素的衍生物。黃曲霉毒素主要是由黃曲霉（A.flavus）和寄生曲霉（A.parasiticus）產(chǎn)生的次生代謝化合物，是世界公認的天然致癌性最強的毒素，1993年被世界衛(wèi)生組織（WHO）的癌癥研究機構(gòu)劃定為I類致癌物。我國霉菌毒素污染率高達90%，霉菌污染在我國氣候溫暖且濕潤的南方地區(qū)尤為嚴重。黃曲霉毒素廣泛存在于食品、農(nóng)產(chǎn)品和動物飼料中，嚴重污染小麥、玉米等糧油制品，在一些發(fā)酵腌制產(chǎn)品中也有黃曲霉毒素的檢出。黃曲霉毒素不僅致癌性、致畸性居首位，而且結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在食品的熱加工環(huán)節(jié)難以被破壞。

目前已經(jīng)被人類發(fā)現(xiàn)且分離出的黃曲霉毒素及其衍生物有20多種，其中黃曲霉毒素B₁致癌性與致畸性高居首位，黃曲霉毒素B₁（AFB₁）無色、無嗅、無味，在糧食作物中經(jīng)常能被檢測到。

T-2毒素是單端孢霉烯族真菌毒素中毒性最強的一種，主要危害動物體內(nèi)細胞分裂旺盛的器官，如胸腺、骨髓、淋巴、肝臟等，引起動物造血組織和免疫器官的出血性綜合癥，抑制DNA的合成、轉(zhuǎn)錄與蛋白質(zhì)的翻譯表達，T-2毒素可以使細胞內(nèi)細胞色素氧化酶活力降低，心肌組織中ATP含量下降，導致心肌細胞不可逆損傷，引起心肌功能紊亂；T-2毒素經(jīng)口、皮膚、呼吸道暴露，可引起機體器官和組織損傷；其具有較高的穩(wěn)定性，不易揮發(fā)，且具有很強的耐熱性和紫外線耐受性。在室溫下放置6～7年毒性不減，是食品生產(chǎn)和加工中影響危害很大的一類真菌毒素。

近些年國內(nèi)外的研究中可以見到利用特定菌株與真菌毒素相結(jié)合從而達到降解液體基質(zhì)中AFB₁與T-2毒素，酸奶中的乳酸菌對AFB1以及T-2毒素是否有降解作用，目前尚未有人作出相關(guān)研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，提供一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)的：

乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的應(yīng)用，所述乳酸菌為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，所述真菌毒素為AFB₁和/或T-2毒素。

本發(fā)明還提供一種利用乳酸菌降解食品中真菌毒素的方法，是將保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌同時加入食品中，培養(yǎng)68～72 h，所述真菌毒素為AFB₁和/或T-2毒素。

研究發(fā)現(xiàn)將三種乳酸菌加入到食品中，三種菌能夠聯(lián)合降解食品中的毒素，另外還發(fā)現(xiàn)三種菌對AFB₁的降解能力并不受初始毒素濃度的影響，但三種菌的聯(lián)合作用對T-2毒素的降解作用中可以看出隨著初始濃度的升高，三株菌的聯(lián)合解毒能力下降，因此，優(yōu)選地，當真菌毒素為T-2毒素時，其食品中的T-2毒素含量為20～250 ng/mL或40 ng～500 ng/g時，降解效果好。當真菌毒素為AFB₁毒素時，其食品中的AFB₁毒素含量為5～100ng/mL或者10～200 ng/g時，降解效果好。

優(yōu)選地，所述食品選自魚露和腌制魚肉中的一種或兩種。

更優(yōu)選地，所述腌制魚肉為腌制羅非魚。

優(yōu)選地，上述方法中，保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的添加量為10⁹ cfu/mL，所述保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的添加比例為1:1:1。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明通過提供了乳酸菌在降解食品中真菌毒素中的應(yīng)用，所述乳酸菌為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌，所述真菌毒素為AFB₁和/或T-2毒素，通過共培養(yǎng)，研究保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌以及干酪乳桿菌對AFB₁以及T-2毒素的降解作用的異同。該研究可以有效的應(yīng)用于實際生活生產(chǎn)當中，將有效地降低AFB₁以及T-2毒素對食品的污染，對食品的現(xiàn)代化生產(chǎn)中降解黃曲霉毒素與T-2毒素具有理論指導意義和實際價值。

附圖說明

圖1為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的菌落特征，其中圖1A為保加利亞乳桿菌，圖1B為嗜酸乳桿菌，圖1C為干酪乳桿菌。

圖2為保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌的細胞形態(tài)特征，其中圖1A為保加利亞乳桿菌，圖1B為嗜酸乳桿菌，圖1C為干酪乳桿菌。

圖3為MRS培養(yǎng)基中三種菌的生長曲線。

圖4為魚露中三種菌的生長曲線。

圖5為模擬腌制魚肉中三種菌的生長曲線。

圖6為AFB₁的標準曲線。

圖7為T-2毒素的標準曲線。

具體實施方式

下面將結(jié)合說明書附圖和具體實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟、條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若無特別說明，實施例中所用的實驗方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)方法和技術(shù)，所使用的試劑或材料均為通過商業(yè)途徑得到。

具體實施方式中腌制魚肉為新鮮羅非魚肉加高濃度鹽水溶液腌制食品。

實施例1 保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌的分離鑒定

將發(fā)酵乳作濃度梯度稀釋，選取10^-3、10^-4、10^-5三個稀釋度的液體各0.1mL涂布于已經(jīng)配置好的MRS培養(yǎng)基上，37℃ 培養(yǎng)48h，48h后觀察菌落形態(tài)，將保加利亞乳桿菌疑似菌落與嗜酸乳桿菌疑似菌落分別劃線接種于MRS培養(yǎng)基上，37℃ 培養(yǎng)48h，48h后觀察菌落形態(tài)，并拍照。

將乳酸菌乳飲品作濃度梯度稀釋，選取10^-3、10^-4、10^-5三個稀釋度的液體各0.1mL涂布于已經(jīng)配置好的MRS培養(yǎng)基上，37℃ 培養(yǎng)48h，48h后觀察菌落形態(tài)，并拍照。將干酪乳桿菌菌落劃線接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)并拍照。

將上述疑似菌落制成涂片，顯微鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍照。

將保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌分別轉(zhuǎn)接于斜面MRS培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng)24h后，保存至4℃ 冰箱。

1、保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌在菌落形態(tài)方面有一定的區(qū)別，保加利亞乳桿菌菌落較大，嗜酸乳桿菌菌落較小，兩種菌菌落均為乳白色，表面濕潤，光滑，菌落為比較規(guī)則的圓形；干酪乳桿菌菌落為乳白色，表面濕潤、光滑，邊緣整齊的圓形菌落。在添加Ca²⁺的培養(yǎng)基上，菌落周圍能形成明顯的、直徑約4～8mm的溶Ca²⁺圈（圖1）。

2、挑取保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌的疑似菌落進行革蘭氏染色并且在顯微鏡下觀察其形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征；保加利亞乳桿菌為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下菌體較粗且長，兩端圓潤，在顯微鏡下可以明顯的觀察到異染顆粒；嗜酸乳桿菌為革蘭氏陽性菌，在顯微鏡下菌體較小且較細，兩端圓潤；干酪乳桿菌為革蘭氏陽性桿菌，在顯微鏡下，菌體與保加利亞乳桿菌相比較細，較粗于嗜酸乳桿菌，菌體較長（圖2）。

3、經(jīng)過72h的OD₆₀₀測定，繪制得到保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌三種菌株在MRS培養(yǎng)基、魚露、腌制魚肉勻漿中的生長曲線，三株菌株在不同生長基質(zhì)中的生長以及相互間的生長趨勢都表現(xiàn)出了差異性。

在MRS肉湯中，三種乳酸菌的長勢良好，均在20h左右結(jié)束對數(shù)期并達到最大值，在50h～60h左右結(jié)束穩(wěn)定期，開始有下降的趨勢，OD值逐漸下降（圖3）。

在魚露中，三種乳酸菌的長勢相比在MRS肉湯中較弱，推測原因可能是由于鹽濃度過高，生長緩慢且平穩(wěn)，生長曲線中并未表現(xiàn)出明顯的對數(shù)期，在40h左右結(jié)束穩(wěn)定期，開始有下降的趨勢，之后OD值有明顯的下降（圖4）。

在模擬腌制魚肉過程中，三種乳酸菌的生長趨勢相比在MRS肉湯中較弱，推測原因可能是由于鹽濃度過高，導致乳酸菌生長遲緩，但由于魚肉中營養(yǎng)物質(zhì)豐富，導致其生長情況優(yōu)于魚露中乳酸菌的生長情況。由圖可知，保加利亞乳桿菌耐鹽性較差，在最初的40h生長情況較差，但在40h后，生長趨勢與嗜酸乳桿菌及干酪乳桿菌基本相同。在72h生長曲線中并未表現(xiàn)出明顯的對數(shù)期與衰退期，推測可能由于鹽濃度過高，導致乳酸菌的生長趨勢有著明顯的延滯性（圖5）。

實施例2 乳酸菌聯(lián)合作用對AFB₁與T-2毒素混合毒素的降解實驗

將1.0mg AFB₁毒素標準品用乙腈溶解，置于10mL容量瓶中乙腈定容。配制成濃度均為0.1mg/mL標準儲備液。取1mL儲備液于10mL容量瓶甲醇定容，得濃度均為10μg/mL的AFB₁毒素標準溶液。配得標準溶液均置于-20℃冰箱保存。

根據(jù)需要將AFB₁標準溶液配制濃度為250、500、1000、2500、5000ng/mL的標準使用液；標準使用液現(xiàn)配現(xiàn)用，溶劑為30%甲醇溶液，配得標準使用液均置于-20℃冰箱保存。

根據(jù)T-2毒素的最低檢出量標準，同樣設(shè)置5個濃度梯度。將1.0mg T-2毒素標準品用乙腈溶解，置于10mL容量瓶中乙腈定容。配制成濃度均為0.1mg/mL標準儲備液。取2mL儲備液于10mL容量瓶甲醇定容，得濃度均為20μg/mL的T-2毒素標準溶液。配得標準溶液均置于-20℃冰箱保存。

根據(jù)需要將T-2毒素標準溶液配制濃度為1000、2500、5000、10000、12500 ng/mL的標準使用液；標準使用液現(xiàn)配現(xiàn)用，溶劑為30%甲醇溶液，配得標準使用液均置于-20℃冰箱保存。

為測定乳酸菌之間的相互作用對降解毒素的影響，以及乳酸菌對聯(lián)合毒性的降解作用，設(shè)置將兩種毒素混合，三種乳酸菌菌液混合，共同培養(yǎng)。

將AFB₁與T-2毒素標準使用液回溫至室溫，并根據(jù)下表進行培養(yǎng)管的設(shè)置（如表1，表1中基液為魚露或魚肉與鹽水1:1混合制得的勻漿液）。每個濃度梯度設(shè)置一個平行，每組設(shè)置一個空白對照。

1、AFB₁與T-2毒素的提取和檢測

培養(yǎng)管在37℃培養(yǎng)72小時后，對培養(yǎng)管中的毒素進行提取。配制30%的甲醇溶液，待用。

用移液槍分別吸取0.5mL培養(yǎng)液于已滅菌的1.5mL離心管中，加入1mL乙酸乙酯，使用旋渦混合儀震蕩60s，用離心機離心（7000 rpm，5min），用移液槍提取上層清液于5mL已滅菌的離心管中，反復提取3次，合并提取液。將提取液于60℃的全自動氮吹儀下空氣吹干。用移液槍吸取1mL 30%的甲醇溶液于離心管中，旋渦混合儀上震蕩30s溶解，用一次性無菌注射器吸取，并經(jīng)過濾膜過濾在進樣小瓶中，編號，待測。

AFB1以及T-2毒素的檢測：1、質(zhì)譜條件：噴霧電壓：4500V；鞘氣壓力：35au；輔助氣壓：15au；毛細管溫度：270°C；碰撞壓：1.5mTorr。采用MRM多反應(yīng)監(jiān)測方式，各參數(shù)見表2。

色譜條件：色譜柱：Hypersil Gold（100mm × 2.1mm，5μL）；流動相：甲醇-5mmol/L乙酸銨溶液（含0.1%甲酸）。進樣量：10μL；針頭到瓶底距離：1.0mm；進樣速度：10.0μL/s；淋洗體積：1500μL；淋洗速度：100.00μL/s；沖洗體積：1500μL；進樣速度：250.0μL/min。梯度洗脫條件見表3。流動相：A、甲醇 B：超純水。

將進樣小瓶按編號排列放置于進樣板上，通過LC-MS/MS檢測，記錄并分析實驗數(shù)據(jù)。

2、魚露與三種乳酸菌共培養(yǎng)對毒素的解毒能力實驗

將分離得到的三種乳酸菌與AFB₁以及T-2毒素共同在魚露中共培養(yǎng)，72h后測定的結(jié)果如下。

由表4可知，在魚露中，三株乳酸菌對T-2毒素的聯(lián)合解毒能力弱于AFB₁。相比較于三株菌的單獨解毒作用，三株菌的聯(lián)合解毒能力更好。

3、模擬腌制魚肉中三種乳酸菌對毒素的解毒能力實驗

將分離得到的三種乳酸菌與AFB₁以及T-2毒素共同在模擬腌制魚肉中共培養(yǎng)，72h后測定的結(jié)果如下。

由表5可知，在模擬腌制魚肉中，低濃度下三株菌對T-2毒素的聯(lián)合解毒能力優(yōu)于對AFB₁的聯(lián)合解毒能力，隨著毒素濃度的增高，三株菌對AFB₁的解毒能力逐漸高于T-2毒素的解毒能力；對比三株菌的單獨解毒作用，三株菌的聯(lián)合解毒能力更好。

經(jīng)過試驗可知，從酸奶中分離得到的保加利亞乳桿菌、嗜酸乳桿菌和干酪乳桿菌對AFB₁以及T-2毒素均有不同程度的降解作用。

三株菌的聯(lián)合作用對T-2毒素的降解作用中可以看出隨著初始濃度的升高，三株菌的降解能力出現(xiàn)下降。但三株菌對AFB₁的降解能力并不受初始毒素濃度的影響。