專利名稱：一株耐低溫乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物應用和飼料調(diào)制加工領域，具體涉及一株耐低溫乳酸菌Lactobacillus pi ant arum CCZZl及其在青忙飼料調(diào)制中的應用。
背景技術：
青貯飼料是在厭氧和酸性環(huán)境下長期貯存的新鮮牧草、飼料作物等多水分飼料。近年來，隨著我國奶牛業(yè)的快速發(fā)展，青貯飼料的生產(chǎn)量在迅速增長，2003年全國青貯飼料的生產(chǎn)量就已超過了 2億噸(中國奶業(yè)協(xié)會，2003)。可見青貯飼料的生產(chǎn)、利用對畜牧業(yè)生產(chǎn)，特別是高產(chǎn)奶牛來說具有非常重要的意義。它既能保證奶、肉產(chǎn)品的數(shù)量與品質，又可節(jié)約飼用糧食，另外通過青貯還可使粗糙或帶異味而不易直接飼用的植物材料，以及不易 干燥的高水分飲料、食品加工副產(chǎn)物等得到充分利用，提高生物資源的利用、轉化效率(內(nèi)
H,1999 ;曹致中，2005)。實際操作中，青貯飼料的發(fā)酵品質受多種因素的影響，其中乳酸菌在調(diào)制青貯飼料中起主導作用。乳酸菌為革蘭氏陽性菌，抗過氧化氫酶，厭氧，無孢子，無運動性。在青貯過程中，可促進乳酸發(fā)酵，提高青貯發(fā)酵品質，減少營養(yǎng)損失。當青貯窖密封后，厭氧微生物可以快速繁殖，如果條件適宜，乳酸菌將快速酸化環(huán)境，當pH下降到一定程度時，與其競爭的有害微生物將不能生存，這樣便得到穩(wěn)定的青貯飼料。反之，不良微生物快速生長，導致青貯飼料腐敗或品質下降。乳酸菌是青貯發(fā)酵的關鍵菌，如果材料本身附著的乳酸菌數(shù)量較少，或乳酸菌數(shù)量雖多，但品質不優(yōu)(乳酸菌活力較弱)或不耐特殊環(huán)境(如低溫)，就很難獲得優(yōu)質青忙飼料。青貯時添加甲酸等酸類化學物質，可以直接降低pH，改善青貯料的發(fā)酵品質，但因成本高、腐蝕性強、作業(yè)不安全等因素，在生產(chǎn)中難以利用。改善青貯飼料發(fā)酵品質的乳酸菌添加劑在市場上也比較多，但一股沒有考慮到低溫條件，或在低溫環(huán)境下改善效果不明顯。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術中存在的上述不足，提供一株耐低溫乳酸菌Lactobacillus piantarum CCZZl0本發(fā)明另一目的在于提供上述耐低溫乳酸菌Lactobacillus pi ant arum CCZZl的應用。本發(fā)明上述目的通過以下技術方案予以實現(xiàn)
一株植物乳桿菌plantarum (CCZZ1),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO. 6078，保藏日期為2012年5月3日。本發(fā)明耐低溫乳酸菌Lactobacillus pi an tarum CCZZl的生物學特性為革蘭氏染色陽性桿菌，葡萄糖異型發(fā)酵，耐酸性強(在PH3.8可以正常生長)，生長速度快(MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時pH可降到4. O以下)，生育溫域寬(10-45°C可正常生長)，耐10°C低溫。本發(fā)明耐低溫乳酸菌Lactobacillus pi an tarum CCZZl的獲得方法是富集培養(yǎng)該菌，稀釋平板法篩選獲得將裝有500mL蒸餾水的錐形瓶、裝有9mL蒸餾水的試管、MRS固體培養(yǎng)基及平板滅菌，滅菌后再將MRS培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)。無菌 條件下，取IOg青貯40天的玉米樣于塑料袋內(nèi)，再加入90mL滅菌蒸餾水振蕩均勻，使其終濃度為IOOg噸―1，然后再取稀釋后樣品ImL加入含有9mL滅菌蒸餾水的試管振蕩均勻，使其終濃度為IOg · L—1，此時取該液體O. 03mL反復進行平板劃線分離，直至得到單菌落，將單菌落用接種針插入含有MRS固體培養(yǎng)基的試管中心，于4°C冰箱內(nèi)保存。其中MRS培養(yǎng)基為蛋白胨(Proteose peptoneNO. 3) 10. Og ;牛肉膏(Beef extract) 10. Og ;酵母提取物(Yeast extract) 5. Og ;葡萄糖(Dextrose) 20. Og ;吐溫(Polysorbate 80) ImL;梓樣酸銨(Ammonium citrate) 2. Og ;醋酸鈉(NaAc) 5. Og ;硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. Ig ;硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 0. 05g ;磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2. Og ;蒸餾水(H2O) IOOOmL,固體培養(yǎng)基再加 15g/L 瓊脂(Agar)，121°C，滅菌 20min。本發(fā)明從90株乳酸菌中，用生理生化方法篩選出耐低溫、耐酸及生長速度快的乳酸菌CCZZ1。提取乳酸菌CCZZl全長基因，然后運用PCR擴增引物25f (SEQ ID NO :1)和1492r (SEQ ID NO :2) (Hurek et al，1997)，擴增出 16S rDNA基因，在NCBI 上對比相關序列，確定其相似菌種。最后，將篩選出的菌株及對照菌分別添加到不同飼草中，并將其放于低、常溫環(huán)境中青貯，開封后分析青貯發(fā)酵品質并進行對比，確認CCZZl可以顯著提高低/常溫環(huán)境下青貯飼料的發(fā)酵品質。本發(fā)明耐低溫乳酸菌Lactobacillus pi an tarum CCZZl可以用于調(diào)制青忙飼料。具體方法為
(1)將待發(fā)酵飼料切斷混合均勻；
(2)每千克待發(fā)酵飼料加入Lactobacilluspi an tarum CCZZl I. OX IO8個以上;
(3)將飼料真空密封后貯藏。作為一種優(yōu)選方案，步驟(I)所述待發(fā)酵飼料切斷至I 2cm。作為一種優(yōu)選方案，步驟(3)所述的貯藏溫度為10 45°C，pH值為3. 75 9. O。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(I)本發(fā)明利用微生物改善青貯飼料的發(fā)酵品質，成本低，安全，可靠，易于利用。(2)本發(fā)明菌株可在我國各地使用，特別是低/常溫環(huán)境下效果獨特，克服了因乳酸菌數(shù)量不足或耐低溫乳酸菌較少造成青貯飼料發(fā)酵不佳的問題。(3)本發(fā)明使用的植物乳桿菌菌株Lactobacillus pi an tarum CCZZl在低/常溫環(huán)境下比現(xiàn)有乳酸菌添加劑效果更佳。
具體實施例方式以下結合實施例來進一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例I篩選耐低溫優(yōu)良乳酸菌
從王草、柱花草、玉米、野生稻等材料上分離乳酸菌菌株90株，進行革蘭氏染色和細胞形狀觀察，并根據(jù)生育溫度(10、15、20、25、30、35、40、45、50°C )和生育 pH(3. 5、3· 75,4. O、4.5、5· 0、5· 5、6· 0、6· 5、7· 0、7· 5、8· 0、8· 5、9· O)等實驗篩選出耐低溫、耐酸及生長速度快的
乳酸菌CCZZ1。結果表明，CCZZl菌株為革蘭氏陽性，同型發(fā)酵的桿菌，在10°C和ρΗ3. 75條件下皆可生長，具有較強的耐低溫、耐酸性，可發(fā)酵大多數(shù)糖類(表I)。表I菌株CCZZl的特性
-菌株CCZZl—
來源玉米—
形狀—桿狀
革蘭氏染色__+_
發(fā)酵類型__同型
生育溫度__
IO0C__+_
—15。。++ ~
—45。。+ ~
~50°C- _
生育pH值
3. 50- —
3.75士 —
~ 4. PO++ —
8. 50+ —
9.00+
發(fā)酵糖類—
L-阿拉伯糖__+_
核糖_ +
半乳糖__+_
P-葡萄糖__+_
D-果糖+ —
P-甘露糖__+_
甘露醇__+_
山梨醇__+_
α-甲基-D-甘露糖苷 +
N-乙酰葡萄糖胺__+_
杏仁苷__I_
熊果苷__+_
七葉靈__+_
水楊苷__+_
維二糖I
麥芽糖__+_
乳糖__+_
海藻糖__+_
蜜二糖__+_
松三糖__+_
P-蜜三糖/棉籽糖__+_
P-松二糖+ —
乳酸菌CCZZl的生理生化試驗、培養(yǎng)基及其配制的方法如下所述
I)革蘭氏染色、發(fā)酵類型及形狀觀察參照東秀珠主編的《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》。2)乳酸菌生長pH調(diào)節(jié)使用4mol/L NaOH和4mol/L HCl。3)糖發(fā)酵米用 API 50CHL(bioMerieux, I，Etoile, France)分析。
4)培養(yǎng)基
I.MRS培養(yǎng)基(用于乳酸菌的培養(yǎng)):
蛋白腺(Proteose peptone NO. 3) 10. Og ;牛肉膏(Beef extract) 10. Og ;酵母提取物(Yeast extract) 5. Og ;葡萄糖(Dextrose) 20. Og ;吐溫(Polysorbate 80) ImL;朽1 樣酸銨(Ammonium citrate) 2. Og ;醋酸鈉(NaAc) 5. Og ;硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) 0. Ig ;硫酸猛(MnSO4 ·4Η20)0. 05g ;磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2. Ogo將上述試劑溶解，用蒸餾水定容至IOOOmL,固體培養(yǎng)基再加15g/L瓊脂(Agar)，121°C滅菌20min。2. API 50CHL 培養(yǎng)基
蛋白腺(Proteose peptone NO. 3) 10. Og ;酵母提取物(Yeast extract) 5. Og ;吐溫 (Polysorbate 80) ImL ;醋酸鈉(NaAc) 5. Og ;梓樣酸銨(Ammonium citrate) 2. Og ;硫酸續(xù)(MgSO4 · 7H20) 0. 2g ;磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2. Og ；硫酸錳(MnSO4 · 4H20) 0. 05 g ;溴甲酚紫(Bromcresol purple) 0. 17g。將上述試劑溶解，用蒸懼水定容至IOOOmL,分裝在15mL的試管中，每試管IOmL, 121°C滅菌20min。實施例2乳酸菌的鑒定
菌株在5mL的MRS培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)過夜，菌液移入I. 5mL的離心管中，10000rpm/min離心 3min 5min 收集菌,用 ΤΕ0. I (1 Ommol /T, Tris-HCl, 0. I mmol/L EDTA, pH 8. 0)清洗兩次，再用 TIANamp Bacteria DNA Kit (TIANGEN BIOTECH CO.，LTD，Bei jing，China)試劑盒提取DNA，在0D600nm處檢測其吸光值。然后，進行PCR擴增，16S rDNA的擴增引物為25f (SEQID NO :1)和 1492r(SEQ ID NO :2)，RCR反應為 95°C (5min) -94°C (30s)-55°C (Imin) -72°C (I. 5min) -72°C (IOmin)，其中 94°C (30s)-55。。(Imin)-72。。(I. 5min)反應循環(huán) 30 次。擴增產(chǎn)物送博尚生物科技有限公司(中國)測序，結果在NCBI的基因庫中比對，找出與此菌親緣相近的標準菌株植物乳桿菌 IMAD 80188 (Lactobacillus pi an tarum IMAD 80188)、瑞士乳桿菌IMAU 10104 (L. helveticus IMAU10104)等，用DNAman軟件分析，將篩選菌株的16SrDNA的部分序列(約1400bp 1500bp)與標準菌進行相似度分析，CCZZl與植物乳桿菌(Lactobacillus pi an tarum)相似度超過 99%,應為同一種。實施例3添加到青貯飼料中的效果
以輕度預干(預干是指晾曬，以降低水分含量)和未預干的黑麥草為材料進行了青貯添加試驗。黑麥草切短至Icm 2cm,混合均勻，每kg新鮮材料加入菌株CCZZl約1.0X108個。添加菌株CCZZl后的黑麥草飼料裝入30cm X 20cm的聚乙烯青忙袋，每個處理裝3袋,每袋約 200g,用真空密封機(SINB0 Vacuum Sealer, Hong Tai Home Electrical ApplianceCo. Ltd.)抽氣、密封，置于15°C貯藏30d。水稻切短至I 2cm，混合均勻，每kg新鮮材料加入菌株CCZZl約I. OX 108個。添加菌株CCZZl后的水稻飼料裝入30cmX20cm的聚乙烯青貯袋，每個處理裝3袋，每袋約200g，用真空密封機抽氣、密封，置于常溫(25°C -30°C )貯藏30d。表2青貯前飼草的化學及微生物成分
-項目未預干黑麥草預干黑麥草水稻
干物質(％ )__16. 37__30. 03__50. 73
粗灰分(％DM)" 9.8610.2810.04
可溶性碳水化合物(％ DM) ~3. 7— 12.3911.16
粗蛋白(％ DM)14.3614.876. 19
權利要求
1.一株耐低溫乳酸菌plantarum CCZZ1,其特征在于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO. 6078，保藏日期為2012年5月3日。
2.權利要求I所述耐低溫乳酸菌plantarumCCZZl在調(diào)制青忙飼料中的應用。
3.根據(jù)權利要求2所述應用，其特征在于包括如下步驟 (1)將待發(fā)酵飼料切斷混合均勻； (2)每千克待發(fā)酵飼料加入耐低溫乳酸菌ZacioAaciBw1Splan tarum CCZZl 1.0X108個以上； (3)將飼料真空密封后貯藏。
4.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于步驟(I)所述待發(fā)酵飼料切斷至f2cm。
5.根據(jù)權利要求3所述的應用，其特征在于步驟(3)所述的貯藏溫度為l(T45°C，pH值為 3. 75 9. O。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株耐低溫乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其應用。本發(fā)明所述乳酸菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO.6078，保藏日期為2012年5月3日。本發(fā)明所述乳酸菌為格蘭氏染色陽性桿菌，為葡萄糖同型發(fā)酵，耐酸，生長速度快，生育溫域寬，在低溫或常溫環(huán)境下可顯著改善青貯飼料的發(fā)酵品質。
文檔編號C12R1/25GK102851233SQ20121019228
公開日2013年1月2日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權日2012年6月12日
發(fā)明者張建國, 陳明霞 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學