專利名稱：一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZH1及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物應(yīng)用和飼料調(diào)制加工領(lǐng)域，具體涉及一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZHl及其在青忙飼料調(diào)制中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青貯飼料顏色黃綠、氣味酸香、柔軟多汁、適口性好，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用，尤其在反芻動物飼養(yǎng)中，它已成為不可缺少的基礎(chǔ)飼料。但青貯容器開封后，厭氧環(huán)境立即變成了有氧環(huán)境，好氧微生物開始增殖，從而使青貯飼料發(fā)生一系列的生物化學(xué)變化，常常導(dǎo)致青貯飼料發(fā)熱、變質(zhì)，即青貯飼料的好氧變質(zhì)現(xiàn)象。通常情況下，好氧變質(zhì)主要表現(xiàn)為溫度上升和真菌菌斑的出現(xiàn)。對于不同的青貯飼料而言，好氧變質(zhì)的速率不同。有的青貯飼料在開封后的數(shù)小時內(nèi)則溫度驟升，真菌菌斑產(chǎn)生；有的青貯飼料則能較長時間(I周或數(shù) 周)保持不變。青貯飼料一旦發(fā)生好氧變質(zhì)，飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)被氧化分解，干物質(zhì)損失嚴(yán)重甚至全部不得不廢棄；另外，一些有害微生物的活動會產(chǎn)生大量的有毒物質(zhì)，輕則影響家畜健康、降低生產(chǎn)能力，重則造成中毒死亡，對畜牧業(yè)生產(chǎn)危害重大。乳酸菌為革蘭氏陽性菌，抗過氧化氫酶、厭氧、無孢子，無運(yùn)動性，被認(rèn)為是益生菌而廣泛應(yīng)用于青貯飼料生產(chǎn)當(dāng)中。乳酸菌按發(fā)酵類型分為同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌。同型發(fā)酵乳酸菌利用水溶性碳水化合物(Water-soluble carbohydrates, WSC)產(chǎn)生較多的乳酸，改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，但抑制好氧變質(zhì)的能力普遍較差。異型發(fā)酵乳酸菌利用WSC產(chǎn)生較多的乙酸，抑制了好氧性細(xì)菌、酵母和霉菌及青貯飼料好氧變質(zhì)。目前，應(yīng)用較廣泛的商品菌劑是布氏乳桿菌buchneri ) 但其在某些條件下抑制青忙飼料的效果卻不明顯，如低溫和短時間貯藏。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，提供一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZHl 本發(fā)明另一目的在于提供上述乳酸菌parafarraginis ZHl的應(yīng)用。本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一株類谷糠乳桿菌parafarraginis (ZHl),保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO. 6079，保藏日期為2012年5月3日。本發(fā)明乳酸菌parafarraginis ZHl的生物學(xué)特性為革蘭氏染色陽性桿菌，葡萄糖異型發(fā)酵，耐酸性強(qiáng)(在PH4. O可以正常生長)，生長速度快(MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時pH可降到4. 5以下)，生育溫域?qū)?15-45°C可正常生長)，在純培養(yǎng)和青貯條件下高產(chǎn)苯甲酸和十六烷酸。本發(fā)明乳酸菌parafarraginis ZHl的獲得方法是富集培養(yǎng)該菌，稀釋平板法篩選獲得將裝有500 mL蒸餾水的錐形瓶、裝有9 mL蒸餾水的試管、MRS固體培養(yǎng)基及平板滅菌，滅菌后再將MRS培養(yǎng)基倒入平板內(nèi)。無菌條件下，取10 g青貯蘇丹草樣品于塑料袋內(nèi)，再加入90 mL滅菌蒸餾水振蕩均勻，使其終濃度為100 g·!/1，然后再取稀釋后樣品I mL加入含有9 mL滅菌蒸餾水的試管振蕩均勻，使其終濃度為10 g · L—1，此時取該液體O. 03 mL反復(fù)進(jìn)行平板劃線分離，直至得到單菌落，將單菌落用接種針插入含有MRS固體培養(yǎng)基的試管中心，于4°C冰箱內(nèi)保存。其中MRS培養(yǎng)基為蛋白胨(Proteosepeptone NO. 3) 10. O g;牛肉膏(Beef extract) 10. O g ;酵母提取物(Yeast extract) 5. Og ;葡萄糖(Dextrose)20. O g ;吐溫(Polysorbate 80)1 mL ;朽1 樣酸銨(Ammonium citrate)
2.O g ;醋酸鈉(NaAc) 5. O g ;硫酸鎂(MgSO4 · 7H20) O. I g ;硫酸錳(MnSO4 · 4H20) O. 05 g ；磷酸氫二鉀(K2HPO4) 2.0 g ;蒸餾水(H2O) 1000 mL,固體培養(yǎng)基再加15 g/L瓊脂(Agar)，121°C，滅菌 20 min。本發(fā)明用生理生化方法篩選出高產(chǎn)苯甲酸和十六烷酸、耐酸及生長速度快的乳酸|if Lactobacillus parafarraginis ZHl。 1 . lif Lactobacillus parafarraginis ^ 長基因，然后運(yùn)用PCR擴(kuò)增引物25f (SEQ ID NO: I)和1492r (SEQ ID勵:2)，擴(kuò)增出163rDNA基因，在NCBI上對比相關(guān)序列，確定其相似菌種。最后，將篩選出的菌株及對照菌(在國內(nèi)使用最多的商品菌劑)分別添加到不同飼草中，開封后分析青貯產(chǎn)物和有氧穩(wěn)定性并與對照菌進(jìn)行對比，確認(rèn)parafarraginis ZHl可以顯著提高青忙飼料的有氧穩(wěn)定性。本發(fā)明乳酸菌parafarraginis ZHl可以用于調(diào)制青忙飼料。具體方法為
(1)將待發(fā)酵飼料切斷混合均勻；
(2)每千克待發(fā)酵飼料加入乳酸菌parafarraginisZHl 1.0X IO8個以上；
(3)將飼料真空密封后貯藏。作為一種優(yōu)選方案，步驟(I)所述待發(fā)酵飼料切斷至f 2cm。作為一種優(yōu)選方案，步驟(3)所述的貯藏溫度為15 45°C，pH值為4. (Γ8. 5。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(I)本發(fā)明利用微生物乳酸菌parafarraginis ZHl抑制青忙飼料好氧變質(zhì)，成本低，安全，可靠，易于利用。(2)本發(fā)明菌株可在我國各地使用，特別是低溫貯藏條件下效果獨(dú)特，克服了發(fā)酵品質(zhì)好的青貯飼料易好氧變質(zhì)的問題。(3)本發(fā)明使用的乳酸菌parafarraginis ZHl在低溫環(huán)境下比市售乳酸菌添加劑效果更佳。


圖I為不同乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的十六烷酸產(chǎn)量示意圖，其中柱間小寫字母不同者為差異顯著，/^〈0. 05 ;ZH1,Z. parafarraginis ZHl ;ZH2,短乳桿菌(Z.);LP,植物乳桿菌(Z. 應(yīng))；LB,布氏乳桿菌(Z. buchneri )；
圖2為不同乳酸菌在MRS培養(yǎng)基中的苯甲酸產(chǎn)量示意圖，其中柱間小寫字母不同者為差異顯著，P〈0. 05 ;ZH1,Z. parafarraginis ZHl ;ZH2,短乳桿菌(Z. /wi50;LP,植物乳桿菌(Z. plantarum') ；LB,布氏乳桿菌(Z. buchneri )；
圖3為不同乳酸菌在晾曬黃燕麥青貯中苯甲酸和十六烷酸等的產(chǎn)量，其中柱間小寫字母不同者為差異顯著，/X0. 05 ;CK,對照；ZHl,Z. parafarraginis ZHl ； LB,商品菌劑；BA,苯甲酸；TA，十四烷酸；PA，十六烷酸；OA，十八烷酸。
具體實施例方式以下結(jié)合實施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。實施例I篩選高產(chǎn)苯甲酸和十六烷酸的優(yōu)良乳酸菌 從蘇丹草青貯飼料上分離的乳酸菌菌株ZH1，進(jìn)行革蘭氏染色和細(xì)胞形狀觀察，并根據(jù)生育溫度(10、15、20、25、30、35、40、45、50°0和生育 pH (3. 5、3· 75,4. 0、4· 5、5· 0、5· 5、6· O、6. 5、7. 0、7. 5、8. 0、8. 5、9. O),MRS中產(chǎn)生苯甲酸和十六烷酸等生理生化實驗。結(jié)果表明，ZHl菌株為革蘭氏陽性，異型發(fā)酵的桿菌，在15-45°C和pH4. 0-8. 5條件下皆可生長，具有較強(qiáng)耐酸性(表I);可發(fā)酵大多數(shù)糖類(表2);在MRS中能夠產(chǎn)生較多的苯甲酸和十六烷酸(圖I和圖2)。表I菌株ZHl的特性
ww pg
革蘭氏染色檢測陽性 過氧化氫酶活性陰性
形狀_桿狀
發(fā)酵葡萄糖形式異型 MRS中的生長pH__
3.80—-
4.PO— +
4. 50— +
8. 50— +
MRS中的生育溫度 15。。~ +
40 °C~ +
45 °C|±~
注-，不生長；±，生長較弱；+，正常生長。表2菌株ZHl對不同糖的利用能力
糖類I利用性I糖類I利用性
對照_-_七葉靈_;_
甘油_-_Wg_+_
赤癬醇7纖維二糖+ —
D—阿拉{白糖_^_麥牙糖_+_
L-阿拉伯糖_+_乳糖_+_
核糖一+ 蛋二糖^
D-木糖_-_鹿糖_+_
L-木糖_-_海藻糖_+_
阿東醇_+
β-甲基-D-木糖甙-_松三糖_+_
半乳糖_+_棉子糖_+_
葡萄糖I+ I淀粉I- —
權(quán)利要求
1.一株乳酸菌L3cioAaci77w5· parafarraginis ZHl,其特征在于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO. 6079，保藏日期為2012年5月3日。
2.權(quán)利要求I所述乳酸菌parafarraginisZHl在調(diào)制青忙飼料中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述應(yīng)用，其特征在于包括如下步驟 (1)將待發(fā)酵飼料切斷混合均勻； (2)每千克待發(fā)酵飼料加入乳酸菌parafarraginisZHl 1.0X IO8個以上； (3)將飼料真空密封后貯藏。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于步驟(I)所述待發(fā)酵飼料切斷至f2cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)所述的貯藏溫度為15 45°C，pH值為 4. 0 8· 5。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株乳酸菌Lactobacillus parafarraginis ZH1及其應(yīng)用。本發(fā)明所述乳酸菌保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地點為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號為CGMCC NO.6079，保藏日期為2012年5月3日。本發(fā)明所述乳酸菌為格蘭氏染色陽性桿菌，為葡萄糖異型發(fā)酵，耐酸，生長速度快，生育溫域?qū)?，高產(chǎn)苯甲酸和十六烷酸，可顯著抑制青貯飼料的好氧變質(zhì)。
文檔編號A23K1/14GK102851232SQ20121019226
公開日2013年1月2日 申請日期2012年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月12日
發(fā)明者張建國, 劉秦華 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)