專利名稱：乳酸菌及其在豬的直接飼喂微生物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可用于農(nóng)業(yè)的生物學(xué)方法和產(chǎn)品。更具體地，本發(fā)明涉及乳酸菌、向諸如豬的動(dòng)物施用乳酸菌的方法和制造乳酸菌的方法，但不限于此。
背景技術(shù)：
為了有效且經(jīng)濟(jì)進(jìn)行豬生產(chǎn)，豬產(chǎn)業(yè)中已采用了早期斷奶操作(Wilson，1995)。 斷奶的明顯結(jié)果是飼料從母豬乳到固體飼料的急劇變化，以及豬所在社會(huì)環(huán)境的變化 (McCracken等，1995)。在第一周中，出現(xiàn)飼料攝取減少，并伴隨著動(dòng)物消化道(gut)解剖學(xué)和生理學(xué)的不良變化，例如絨毛萎縮、隱窩加深，以及未成熟腸上皮細(xì)胞對(duì)絨毛頂端的浸潤(rùn)。絨毛萎縮是指可用于營(yíng)養(yǎng)攝取的吸收面積減少，而隱窩加深則體現(xiàn)了大的組織轉(zhuǎn)化(turnover) (Cera等，1988)。此前的研究報(bào)道了絨毛高度與隱窩深度的比例發(fā)生改變以響應(yīng)不同的斷奶環(huán)境和胃腸固有微生物群的種群(Tang等，1999)。腸微生物區(qū)系 (microflora)的破壞常與突然斷奶一起發(fā)生，不利地影響胃腸道的穩(wěn)定性，并且這種破壞可能是促使飼料攝取和消化道解剖學(xué)發(fā)生變化的推動(dòng)力，其導(dǎo)致在斷奶后的時(shí)期中的生長(zhǎng)不良和健康危害(Dritz等，1996)。綜上所述，這些條件對(duì)仔豬(piglet)的生長(zhǎng)和健康具有顯著的不良影響，對(duì)成熟消化系統(tǒng)的發(fā)育和有效的免疫防護(hù)具有負(fù)面影響，并且通過隨后的生產(chǎn)周期對(duì)豬的生長(zhǎng)性能具有派生影響(ramification)。在現(xiàn)代豬生產(chǎn)中發(fā)展出多個(gè)方法，以用于在解決這些問題的同時(shí)仍獲得早期斷奶 (包括管理和飼料變化)的功效以及經(jīng)濟(jì)利益。在不到21日齡進(jìn)行早期斷奶，隨后將豬轉(zhuǎn)移到第二分離地點(diǎn)，這通常被稱作早期隔離斷奶(SEW)。這種方法減少了病原出現(xiàn)的數(shù)量，從而降低了免疫應(yīng)激，導(dǎo)致生長(zhǎng)改進(jìn)和飼料利用效率較高(Fangman等，1997)。這種方案成功地減少了病原的數(shù)量，但并未成功地消除所有病原。其前提是在豬因母體抗體而獲得的免疫力仍然較高時(shí)，將其與母豬分離。這種源自母體的被動(dòng)免疫將防止固有病原(indigenous pathogen)的垂直傳播。盡管SEW沒有消除由突然斷奶導(dǎo)致的胃腸破壞，但在將豬早期斷奶并轉(zhuǎn)移到農(nóng)場(chǎng)外的分離場(chǎng)地(isolated facility)時(shí)，此問題的流行程度和嚴(yán)重性要低得多。這很可能由于對(duì)斷奶豬(此時(shí)其先天防御受損)的病原攻擊較少的結(jié)果。利用高質(zhì)量的蛋白源和添加劑來(lái)減輕斷奶過渡期不適的飼料配方是保護(hù)仔豬健康的另一種方法。所使用的兩種最常見選擇是包含噴霧干燥的血漿蛋白質(zhì)和飼用 (in-feed)抗生素。向豬飼料補(bǔ)充抗生素的益處已經(jīng)得到充分證明，與后續(xù)生長(zhǎng)階段的豬相比，斷奶仔豬(weanling pig)在響應(yīng)上所發(fā)生的最大改進(jìn)在于對(duì)添加抗生素的響應(yīng) (Cromwell的綜述，2001)。科技文獻(xiàn)中還充分證明了噴霧干燥動(dòng)物血漿(SDAP)的性能增強(qiáng)益處(van Dijk等的綜述，2001a)，并且SDAP被特別高度地視為斷奶仔豬起始飼料的成分。 SDAP的添加一向?qū)е略鲋睾惋暳蠑z取改進(jìn)，以及斷奶后腹瀉減輕，特別是在斷奶后一周至兩周的時(shí)期中(Coffey 和 Cromwell，1995 ;van Di jk 等，2001a ;Bikker 等，2004)。此前在科技文獻(xiàn)報(bào)道中提出的機(jī)制包括飼料適口性改進(jìn)，營(yíng)養(yǎng)消化性改進(jìn)，存在有益生長(zhǎng)因子， 結(jié)合/阻斷病原的糖蛋白，毒素的中和；存在免疫球蛋白，免疫調(diào)節(jié)能力，腸形態(tài)改進(jìn)，和消化道微生物生態(tài)的變化(Bosi 等，2001，2004 ；Hammer 等，2004 ；Mouricout 等，1990 ；Nollet 等，1999 ；Perez-Bosque 等，2004 ；Roche 等，2000 ；TorralIardona 等，2003 ；van Dijk 等， 2001a ；van Dijk 等，2002b)。這些以及其他飼料添加劑的作用支持以下觀點(diǎn)，即腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物和添加劑的作用對(duì)豬的直接影響較小，但其通過介導(dǎo)微生物轉(zhuǎn)變以響應(yīng)外源營(yíng)養(yǎng)利用度來(lái)發(fā)揮作用 (Gaskins，2001)。這使得直接飼喂微生物(DFM)添加劑的應(yīng)用得到極大的關(guān)注，使用DFM 添加劑通過防止胃腸生態(tài)系統(tǒng)的破壞(這為病原入侵鋪平了道路)而有助于斷奶過渡 (weaning transition)，從而促進(jìn)幼豬(young pig)生長(zhǎng)并保持其健康。據(jù)報(bào)道，補(bǔ)充桿菌(Bacillus)培養(yǎng)物通過向豬提供對(duì)抗病原攻擊的保護(hù)而改進(jìn)了斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能 (Yang等，2003 ；Kyriakis等，1999 ；Adami等，1997)。盡管通常飼喂給豬的大多數(shù)DFM添加劑以桿菌為基礎(chǔ)，但是補(bǔ)充乳桿菌(lactcAacilli)也可為幼豬提供性能益處。受到沙門氏菌(Salmonella)攻擊并且補(bǔ)充了 5種乳桿菌菌株組合的豬，與受到沙門氏菌攻擊但沒有進(jìn)行補(bǔ)充的豬相比，增重改進(jìn)、癥狀嚴(yán)重性較低，以及糞便沙門氏菌脫落減少(Casey等， 2007)。此外，向初生仔豬補(bǔ)充短乳桿菌(LactcAacillus brevis)導(dǎo)致小腸中杯狀細(xì)胞成熟以及斷奶后增重明顯改進(jìn)，這似乎是通過toll樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)控制消化道中炎癥信號(hào)的結(jié)果(Davis等，2006，2007)?？紤]到與飼喂給牲畜的抗微生物劑的生長(zhǎng)促進(jìn)水平相關(guān)的抗生素抗性缺點(diǎn)(stigma)，以及如血漿蛋白的動(dòng)物副產(chǎn)品的應(yīng)用與最近對(duì)傳染性海綿狀腦病的關(guān)注，補(bǔ)充益生菌以提供某些相同的益處已經(jīng)在畜牧業(yè)贏得了廣泛應(yīng)用。盡管其功效僅有極少的科技支持并且對(duì)其作用模式的理解有限，但益生菌產(chǎn)品的補(bǔ)充在人和農(nóng)業(yè)部門中已經(jīng)變得越來(lái)越流行。在歷史上，益生菌起源于以下觀念，即食用大量諸如酸奶和奶酪的發(fā)酵乳制品的個(gè)體特別長(zhǎng)壽(Tannock，2004)。大部分益生菌生物被選擇的原因是其易于繁殖，并且易于從食品發(fā)酵過程獲得，但引導(dǎo)其選擇的科技支持很少 (Fuller, 1997)。因此，用于牲畜用DFM產(chǎn)品的細(xì)菌通常未被選擇來(lái)提供理想地適合存在于牲畜生產(chǎn)系統(tǒng)中的攻擊的細(xì)菌生物。所需要的是可用于豬和其他動(dòng)物的細(xì)菌菌株。還需要制備和使用細(xì)菌菌株的方法。此外，還需要用于鑒定這些菌株的DNA序列和利用所述DNA序列鑒定菌株的方法。

發(fā)明內(nèi)容
由本公開末尾處所示的權(quán)利要求書限定的本發(fā)明旨在解決至少部分上述問題。本發(fā)明提供了 DNA序列。所述DNA序列包含乳酸菌16S rRNA基因編碼區(qū)的部分， 其5'末端包含5’ AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3’的序列，其3'末端包括Bfa I、Hae III和 Msp I之一的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Bfa I時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約99個(gè)堿基對(duì)至約103個(gè)堿基對(duì)，約268個(gè)堿基對(duì)至約273個(gè)堿基對(duì)，約260個(gè)堿基對(duì)至約265個(gè)堿基對(duì)，約279個(gè)堿基對(duì)至約284個(gè)堿基對(duì)，約278個(gè)堿基對(duì)至約282個(gè)堿基對(duì)，或約273個(gè)堿基對(duì)至約277個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Hae III時(shí)，所述 DNA序列的長(zhǎng)度為約3 個(gè)堿基對(duì)至約334個(gè)堿基對(duì)，約352個(gè)堿基對(duì)至約357個(gè)堿基對(duì)， 約277個(gè)堿基對(duì)至約282個(gè)堿基對(duì)，或約335個(gè)堿基對(duì)至約339個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Msp I時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約188個(gè)堿基對(duì)至約192個(gè)堿基對(duì)。本發(fā)明還提供了用于鑒定可用作直接飼喂微生物的一種或多種菌株的方法。在所述方法中，從來(lái)自動(dòng)物胃腸道的細(xì)菌分離DNA。擴(kuò)增DNA。使用T-RFLP分析擴(kuò)增的DNA以獲得TRF數(shù)據(jù)。建立所述TRF數(shù)據(jù)與目標(biāo)特征的相關(guān)性。由該相關(guān)性鑒定目標(biāo)菌株。確認(rèn) TRF存在于所述菌株中。本發(fā)明還提供由所述方法鑒定出的一種或多種菌株。本發(fā)明還提供了用于向動(dòng)物施用有效量的一種或多種菌株的方法。此外，本發(fā)明還提供了分離的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)菌株P(guān)lJ e3 (NRRL B-50101)，以及包括分離的乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3 (NRRL B-50101)和分離的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株 o246e 33w(NRRL B—50102)的組合。本發(fā)明還提供了分離菌株，其選自嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w (NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株 o246e 42 (NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株P(guān)l J e3 (NRRL B-50101)中的至少一種。本發(fā)明還提供了具有上文所列菌株之一的所有鑒定特征的分離菌株。本發(fā)明還提供了其他方法。在一種方法中，向動(dòng)物施用有效量的選自嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w (NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株 o246e 42 (NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3 (NRRL B-50101)中的至少一種菌株。另一種方法是用于制備直接飼喂微生物的方法。在該方法中，在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯(broth)中培養(yǎng)選自嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w (NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42 (NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3(NRRL B-50101)中的至少一種菌株。從所述液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離所述菌株以獲得直接飼喂微生物。


參考

本發(fā)明的示例性實(shí)施方式。圖1是顯示在斷奶后的第1、3、10和對(duì)天(或20、22、四和43日齡)，從在常規(guī)室內(nèi)場(chǎng)地分娩的保育豬(nursery pig)的外周血分離出的淋巴細(xì)胞濃度，并與在室外場(chǎng)地分娩的保育豬進(jìn)行比較的圖示(處理X日期相互作用，P < 0. 01 ；a,b 使用不同字母表示每日內(nèi)平均值不同，P < 0. 05)。圖2A-2B是顯示通過RAPD引物1和4指紋確定的9個(gè)候選DFM菌株之間相似性的兩個(gè)樹狀圖部分。還顯示了所述9個(gè)菌株的限制性內(nèi)切酶Bfa I.Hae III和Msp I的TRF帶型。圖3是顯示在哺乳期中向母豬施用益生菌組合而導(dǎo)致的同窩幼仔(litter)內(nèi)的初始和終末體重變異系數(shù)的圖示(處理χ時(shí)間相互關(guān)系，P = 0. 06 ；SE = 1. 22)。PA =乳酸片球菌PlJ e3 ;LA =嗜酸乳桿菌PlB c6 ;LS =唾液乳桿菌o246e 33w。在詳細(xì)解釋本發(fā)明的實(shí)施方式之前，應(yīng)理解本發(fā)明的應(yīng)用并不限于在以下說(shuō)明列出的或在附圖中顯示的組件構(gòu)成和排列細(xì)節(jié)。本發(fā)明能夠以其他實(shí)施方式或通過多種方式實(shí)施或?qū)崿F(xiàn)。此外，還應(yīng)理解本文采用的措詞和術(shù)語(yǔ)是用于說(shuō)明的目的，而不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
具體實(shí)施例方式根據(jù)本發(fā)明，可采用本領(lǐng)域技術(shù)范圍之內(nèi)的常規(guī)分子生物學(xué)和微生物學(xué)技術(shù)。文獻(xiàn)中對(duì)此類技術(shù)進(jìn)行了充分解釋。參見,例如Sambrook，F(xiàn)r i tsch以及Maniat i s，Mo 1 ecu 1 ar Cloning :A Laboratory Manual,第 3 版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y。本文描述了新型的乳酸菌株及其組合。這些菌株可單獨(dú)或組合地施用給諸如豬的動(dòng)物。在飼喂給豬時(shí)，這些菌株提供了很多益處。將所述菌株飼喂給妊娠母豬或小母豬 (gilt)或哺乳期母豬時(shí)，所述益處見于其后代中。在將所述菌株飼喂給其他年齡段，例如保育豬和生長(zhǎng)期/育肥期的豬(finish pig)時(shí)，所述菌株也提供益處。本發(fā)明還描述了用于鑒定可用作直接飼喂微生物(DFM)的一種或多種菌株的方法。在所述方法中，從來(lái)自動(dòng)物胃腸道的細(xì)菌分離DNA。擴(kuò)增DNA。使用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(T-RFLP)分析擴(kuò)增的DNA以產(chǎn)生末端限制性片段(TRF)數(shù)據(jù)。建立所述TRF數(shù)據(jù)與目標(biāo)特征的相關(guān)性。由該相關(guān)性鑒定目標(biāo)菌株。利用菌株的RAPD PCR分析或任何其他適合的方法減少菌株的數(shù)量。確認(rèn)TRF存在于菌株中。末端限制性片段(TRF)本文描述了可用于鑒定目標(biāo)菌株的TRF。這些TRF包括但不限于包含乳酸菌16S rRNA基因編碼區(qū)的部分的DNA序列。所述DNA序列的5 ‘末端包含 5，AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3，的序列，其 3'末端包含 Bfa I、Hae III 和 Msp I 之一的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)。當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Bfa I時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約99個(gè)堿基對(duì)至約103個(gè)堿基對(duì)，約268個(gè)堿基對(duì)至約273個(gè)堿基對(duì)，約260個(gè)堿基對(duì)至約265個(gè)堿基對(duì)，約279個(gè)堿基對(duì)至約284個(gè)堿基對(duì)，約278個(gè)堿基對(duì)至約282個(gè)堿基對(duì)，或約273個(gè)堿基對(duì)至約277個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Hae III時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約3 個(gè)堿基對(duì)至約334個(gè)堿基對(duì)，約352個(gè)堿基對(duì)至約357個(gè)堿基對(duì)，約277個(gè)堿基對(duì)至約282個(gè)堿基對(duì)，或約335個(gè)堿基對(duì)至約339個(gè)堿基對(duì)。當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Msp I時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約188個(gè)堿基對(duì)至約192個(gè)堿基對(duì)。乳酸菌本文還描述了使用末端限制性片段(TRF)鑒定出的乳酸菌菌株嗜酸乳桿菌 PlB c6、唾液乳桿菌o246e 33w、乳酸片球菌o246e 42和乳酸片球菌Pl J e3。如下所述， 這些菌株保藏在美國(guó)農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(NRRL，Agricultural Research Service Culture Collection)，地址為美國(guó)伊利諾斯州皮奧里亞市北大學(xué)街1815號(hào)(1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604) 嗜酸乳桿菌 PlB c6 于 2008 年 1 月 18 日保藏且所得登錄號(hào)為NRRL B-50103 ；唾液乳桿菌o246e 33w于2008年1月18日保藏且所得登錄號(hào)為NRRL B-50102 ；乳酸片球菌o246e 42于2008年8月四日保藏且所得登錄號(hào)為NRRL B-50171 ；乳酸片球菌PlJ e3于2008年1月18日保藏且所得登錄號(hào)為NRRL B-50101。 使用本文所述TRF鑒定的其他菌株也在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。乳酸菌菌株短乳桿菌(LactcAacillus brevis) IEl可與上文列出的一種或多種菌株一起使用。菌株IE-I (也寫作菌株1E1)分離自健康斷奶豬的腸道。菌株IE-I可得自于美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所(American Type Culture Collection)，地址為美國(guó)弗吉尼亞州馬納薩斯市大學(xué)街 10801 號(hào)(10801 University Blvd.，Manassas, Va. 20110)，登錄號(hào)為 PTA-6509，保藏日為2005年1月12日。所有保藏均按照“國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約”的規(guī)定進(jìn)行。具有上文所列菌株的所有鑒定特征(如下文提供)的菌株也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。簡(jiǎn)要而言，使用如下TRF鑒定乳酸菌的菌株，與此有關(guān)的更多細(xì)節(jié)在下文的實(shí)施例部分。將豬分成具有不同條件的兩組，以產(chǎn)生性能和免疫測(cè)量的差別，例如在免疫細(xì)胞的特異免疫亞群方面的差別。本文使用的“性能”是指通過以下參數(shù)測(cè)量的動(dòng)物生長(zhǎng)情況平均每日增重、總增重、飼料轉(zhuǎn)化，其包括飼料增重和增重飼料，飼料功效、死亡率和飼料攝取量。本文使用的“性能的改進(jìn)”是指在性能的定義下，上文列出的至少一個(gè)參數(shù)的改進(jìn)。從來(lái)自性能和免疫特征經(jīng)測(cè)量的豬組的胃腸道的乳酸菌鑒定TRF。這些TRF存在于具有有益測(cè)量值的豬組中，而不存在于缺少有益測(cè)量值的豬組中。使用RAPD PCR分析縮小潛在有用的菌株的數(shù)量。確認(rèn)TRF存在于縮小的菌株組中。因?yàn)檫@些TRF發(fā)現(xiàn)于具有較好測(cè)量值的豬組中，本發(fā)明人相信這些菌株應(yīng)該對(duì)性能和/或免疫調(diào)節(jié)具有積極影響。在飼喂給動(dòng)物時(shí)，發(fā)現(xiàn)4種乳酸菌菌株對(duì)性能具有積極影響。這些菌株可單獨(dú)或組合地飼喂。在一種示例性實(shí)施方式中，將嗜酸乳桿菌PlB c6、 唾液乳桿菌o246e 33w和乳酸片球菌PlJ e3菌株進(jìn)行組合并施用于動(dòng)物，例如哺乳期母豬和/或仔豬。在另一種示例性實(shí)施方式中，將乳酸片球菌PlJ e3和唾液乳桿菌o246e 33w 菌株進(jìn)行組合并施用。在另一種示例性實(shí)施方式中，將乳酸片球菌PlJ e3單獨(dú)施用于動(dòng)物， 例如哺乳期母豬和/或仔豬。直接飼喂微生物在本發(fā)明全文中可與“益生菌”相互替換使用的直接飼喂微生物(DFM)包括上文列出的一種或多種乳酸菌菌株。可向DFM中添加一種或多種載體或其他成分。DFM可表現(xiàn)為多種物理形式，例如作為營(yíng)養(yǎng)加強(qiáng)劑(top dress)，作為水溶性濃縮物以用作液體灌喂劑(liquid drench)，或添加到代乳品、明膠膠囊或凝膠中。在營(yíng)養(yǎng)加強(qiáng)劑形式的一種實(shí)施方式中，將凍干的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物添加到諸如乳清、麥芽糊精、蔗糖、葡萄糖、石灰石(碳酸鈣)、稻殼、酵母培養(yǎng)物、干燥淀粉和硅鋁酸鈉之類的載體中。在用于液體灌喂劑或代乳品補(bǔ)充物的水溶性濃縮物的一種實(shí)施方式中，將凍干的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物添加到諸如乳清、 麥芽糊精、蔗糖、葡萄糖、干燥淀粉和硅鋁酸鈉之類的水溶性載體中，并添加液體以形成灌喂劑，或?qū)⒀a(bǔ)充物添加到乳品或代乳品中。在明膠膠囊形式的一種實(shí)施方式中，將凍干的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物添加到諸如乳清、麥芽糊精、蔗糖、石灰石(碳酸鈣)、稻殼、酵母培養(yǎng)物、 干燥淀粉和/或硅鋁酸鈉之類的載體中。在一種實(shí)施方式中，乳酸菌和載體包封在可降解的明膠膠囊中。在凝膠形式的一種實(shí)施方式中，將凍干的乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物添加到諸如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、聚乙二醇、丁基化羥基茴香醚、檸檬酸、乙氧基喹啉(ethoxyquin)和人工著色劑之類的載體中，以形成凝膠。為了獲得乳酸菌并形成DFM，可將乳酸菌發(fā)酵至適合的水平。在一個(gè)非限定性實(shí)例中，所述水平在約lX109CFU/ml的水平至約lX101(lCFU/ml的水平之間。這些乳酸菌可在 MRS(de Man, Rogosa and Sharpe)肉湯中于37°C培養(yǎng)M小時(shí)?？赏ㄟ^離心并棄去上清來(lái)收集這些細(xì)菌。隨后，可將沉淀的乳酸菌作為DFM飼喂給諸如豬的動(dòng)物。在一些實(shí)施方式中，將 DFM飼喂給母豬、小母豬、斷奶前的仔豬、斷奶后的仔豬，或任意年齡的豬。可將乳酸菌飼喂給哺乳期的母豬，但也可以在不同的時(shí)間以不同的持續(xù)時(shí)間飼喂乳酸菌。在飼喂給小母豬或母豬時(shí)，菌株被轉(zhuǎn)移到所述小母豬或母豬生產(chǎn)的仔豬。通常認(rèn)為，這是通過糞口途徑和/ 或通過其他途徑實(shí)現(xiàn)的。在一種實(shí)施方式中，將沉淀的乳酸菌凍干以直接飼喂給動(dòng)物。在至少一些實(shí)施方式中，將乳酸菌添加到動(dòng)物飼料中。在飼喂給動(dòng)物時(shí)，乳酸菌會(huì)定殖在其胃腸道中?？砂凑占sIX IO8CFU/動(dòng)物/天至約5 X IOltlCFU/動(dòng)物/天飼喂乳酸菌，而無(wú)論總CFU是源自一種生物還是多種生物的組合。 在一種示例性的實(shí)施方式中，按照1 X IO9總CFU/動(dòng)物/天飼喂乳酸菌，而無(wú)論總CFU是源自一種生物還是多種生物的組合。在一種實(shí)施方式中，使用等量的各種菌株。在另一種實(shí)施方式中，使用不同的量。實(shí)施例以下提供的實(shí)施例僅用于說(shuō)明的目的。本文包括的實(shí)施例僅用于輔助更完整地理解本文描述的發(fā)明。這些實(shí)施例不以任何方式限制本文描述或要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1常規(guī)與早期隔離斷奶生長(zhǎng)性能模型比較使用在場(chǎng)外(off-site)早期隔離斷奶管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)的豬，并與在相同農(nóng)場(chǎng)地點(diǎn)(其中出生和飼養(yǎng)通過存在的壩)常規(guī)飼養(yǎng)的豬進(jìn)行比較，從而建立用于提供生長(zhǎng)性能分離的模型。來(lái)自11窩的88只雜交閹豬和小母豬在19日齡時(shí)斷奶。將一組44只豬轉(zhuǎn)移到距離母豬群(sow herd) 12km的隔離保育場(chǎng)地，而將其他豬轉(zhuǎn)移到位于斷奶前地點(diǎn)的保育場(chǎng)地。將豬分配到每個(gè)場(chǎng)地的16個(gè)圈欄(pen)中，并在斷奶后的第11、18和25天測(cè)量體重和飼料減少量，以測(cè)定平均每日增重(ADG)、平均每日飼料攝取(ADFI)和增重飼料。在斷奶后的第1、3、11和25天，從每個(gè)場(chǎng)地選擇4只豬進(jìn)行取樣，其中通過腔靜脈穿刺獲得血液樣品以進(jìn)行細(xì)胞分離，并對(duì)豬處以安樂死以獲得胃腸道組織以用于微生物分析和免疫細(xì)胞分離。下表1說(shuō)明與常規(guī)飼養(yǎng)的豬相比，在早期隔離斷奶管理系統(tǒng)中飼養(yǎng)的豬中觀察到平均每日增重和平均每日飼料攝取反應(yīng)改進(jìn)(P < 0. 10)，并且研究結(jié)束時(shí)(斷奶后25天)， 在早期隔離斷奶豬中觀察到更高的(P < 0. 01)豬體重。表1 與常規(guī)現(xiàn)場(chǎng)飼養(yǎng)(CONV)的豬相比，在場(chǎng)外早期隔離斷奶(SEW)管理系統(tǒng)中飼養(yǎng)的斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能響應(yīng)
權(quán)利要求
1.DNA序列，其包含乳酸菌16S rRNA基因編碼區(qū)的部分，其5 ‘末端包含 5，AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3，的序列，其 3'末端包含 BfaI、Hae III 和 Msp I 之一的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)，當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Bfa I時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約99個(gè)堿基對(duì)至約103 個(gè)堿基對(duì)，約268個(gè)堿基對(duì)至約273個(gè)堿基對(duì)，約260個(gè)堿基對(duì)至約265個(gè)堿基對(duì)，約279個(gè)堿基對(duì)至約284個(gè)堿基對(duì)，約278個(gè)堿基對(duì)至約282個(gè)堿基對(duì)，或約273個(gè)堿基對(duì)至約277 個(gè)堿基對(duì)；當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Hae III時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約3 個(gè)堿基對(duì)至約 334個(gè)堿基對(duì)，約352個(gè)堿基對(duì)至約357個(gè)堿基對(duì)，約277個(gè)堿基對(duì)至約282個(gè)堿基對(duì)，或約 335個(gè)堿基對(duì)至約339個(gè)堿基對(duì)；和當(dāng)所述限制性酶識(shí)別位點(diǎn)為Msp I時(shí)，所述DNA序列的長(zhǎng)度為約188個(gè)堿基對(duì)至約192 個(gè)堿基對(duì)。
2.用于鑒定可用作直接飼喂微生物的一種或多種菌株的方法，所述方法包括從來(lái)自動(dòng)物胃腸道的細(xì)菌分離DNA ；擴(kuò)增所述DNA ；使用T-RFLP分析擴(kuò)增的DNA以獲得TRF數(shù)據(jù)；建立所述TRF數(shù)據(jù)與目標(biāo)特征的相關(guān)性；由所述相關(guān)性鑒定目標(biāo)菌株；和確認(rèn)所述TRF存在于所述菌株中。
3.一種菌株，其通過權(quán)利要求2所述的方法鑒定。
4.如權(quán)利要求3所述的菌株，其中所述菌株是潛在的益生菌。
5.如權(quán)利要求3所述的菌株，其中所述菌株是潛在的病原。
6.一種方法，其包括向動(dòng)物施用有效量的至少一種權(quán)利要求3所述的菌株。
7.分離的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)菌株 PlJ e3 (NRRL B-50101)。
8.一種組合物，其包含權(quán)利要求7所述的菌株；和分離的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)菌株 o246e 33w(NRRL B-50102)。
9.如權(quán)利要求8所述的組合物，其還包含分離的嗜酸乳桿菌(Lactohcillus acidophilus)菌株 PlB c6 (NRRL B-50103)。
10.一種分離的菌株，其選自嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株 o246e 33w (NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42 (NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株 PlJ e3 (NRRL B-50101)中的至少一種。
11.一種分離的菌株，其具有權(quán)利要求10所述菌株之一的所有鑒定特征。
12.如權(quán)利要求10所述的菌株，其還包含載體。
13.一種方法，其包括向動(dòng)物施用有效量的選自嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6(NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株 o246e 33w (NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株 o246e 42 (NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3 (NRRL B-50101)中的至少一種菌株。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3(NRRL B-50101)。
15.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3(NRRL B-50101)和唾液乳桿菌菌株 o246e 33w (NRRL B-50102)。
16.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3(NRRL B-50101)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)和嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)。
17.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述動(dòng)物是豬。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中以約1X IO8總cfu/豬/天至約5 X 101°總cfu/ 豬/天向所述豬施用一種或多種所述菌株。
19.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述動(dòng)物是母豬。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述母豬是哺乳期的母豬。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3(NRRL B-50101)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)和嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)；且所述方法還包括與未施用所述菌株的母豬生育的仔豬相比，使所述施用了菌株的母豬生育的仔豬的體重和平均每日增重得到改進(jìn)。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3(NRRL B-50101)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)和嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6 (NRRL B-50103)；且所述方法還包括與未施用所述菌株的母豬生育的仔豬相比，防止所述已施用菌株的母豬生育的同窩仔豬體重的差異增大。
23.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3(NRRL B-50101)；且所述方法還包括與未施用所述菌株的母豬生育的仔豬相比，防止所述已施用菌株的母豬生育的同窩仔豬的體重差異增大。
24.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3(NRRLB-50101)；且所述方法還包括與未施用所述菌株的母豬生育的仔豬相比，降低了所述已施用菌株的母豬生育的同窩仔豬的體重差異。
25.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述動(dòng)物是處于生產(chǎn)保育期的豬，并且其中所述菌株是乳酸片球菌菌株o246e 42 (NRRL B-50171)。
26.如權(quán)利要求13所述的方法，其還包括使用所述菌株調(diào)節(jié)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)。
27.一種用于制備直接飼喂微生物的方法，所述方法包括(a)在液體營(yíng)養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)選自嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lBc6(NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w (NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42 (NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3 (NRRL B-50101)中的至少一種菌株；和(b)從所述液體營(yíng)養(yǎng)肉湯分離所述菌株以獲得所述直接飼喂微生物。
28.如權(quán)利要求27所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株P(guān)lJe3 B-50101。
全文摘要
本文提供了可用于鑒定目標(biāo)菌株的TRF。本發(fā)明還提供了用于鑒定可用作直接飼喂微生物的一種或多種菌株的方法。本發(fā)明還提供了通過所述方法鑒定的一種或多種菌株。本發(fā)明還提供了用于向動(dòng)物施用有效量的所述一種或多種菌株的方法。此外，本發(fā)明還提供了一種分離的菌株，其選自嗜酸乳桿菌菌株P(guān)lB c6(NRRL B-50103)、唾液乳桿菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株P(guān)lJ e3(NRRL B-50101)中的至少一種。本發(fā)明還提供了一種分離的菌株，其具有上文所列菌株之一的所有鑒定特征。一種或多種菌株可作為直接飼喂微生物施用給動(dòng)物。本發(fā)明還提供了用于制備直接飼喂微生物的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102272332SQ201080004311
公開日2011年12月7日 申請(qǐng)日期2010年1月12日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月12日
發(fā)明者喬舒亞·雷貝格爾, 托馬斯·雷貝格爾, 查爾斯·馬克斯韋爾, 邁克·金, 馬里·埃倫·戴維斯 申請(qǐng)人:丹尼斯科公司, 代表阿肯色州大學(xué)的阿肯色州大學(xué)董事會(huì)