豬細(xì)小病毒2型和3型雙重實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3）雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及方法，其中，豬細(xì)小病毒2型引物序列如下：上游引物P1：GAAGCGGGGAAGATACTC，下游引物P2：GTCCTTAGCTCTCCACAG；豬細(xì)小病毒3型引物序列如下：上游引物P3：GAGGGAATTTAGCAACTG，下游引物P4：TCTGGTCTTCCTGATATC。目前，還沒(méi)有基于SYBRⅠ雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)豬細(xì)小病毒2型（PPV2）和3型（PPV3）的相關(guān)研究報(bào)道，本發(fā)明的建立可填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域空白。
【專利說(shuō)明】豬細(xì)小病毒2型和3型雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引 物及方法，具體涉及用于PPV2和PPV3多重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的引物及 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著病毒宏基因組學(xué)的研究的不斷深入，新發(fā)病毒的發(fā)現(xiàn)的報(bào)道越來(lái)越多。近 年來(lái)，豬群中DNA病毒的報(bào)道越來(lái)越多，除去經(jīng)典的豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus, PPV)和豬圓環(huán)病毒（porcine circovirus type I and II ,PCVl 和 PCV2)，還見(jiàn)有豬細(xì)小 病毒 2 型（porcine parvovirus type 2，PPV2)、豬細(xì)小病毒 3 型（porcine parvovirus type 3，PPV3)、豬細(xì)小病毒4型（porcine parvovirus type 4，PPV4)以及多種亞型的豬 博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV)。【參考文獻(xiàn)：Xiao CT, Gim6nez-Lirola LG, Jiang YH, Halbur PG, Opriessnig T. Characterization of a novel porcine parvovirus tentatively designated PPV5. PLoS One. 2013 Jun 7;8 (6):e65312. ]〇
[0003] 豬細(xì)小病毒2型（PPV2)最早于2001年在緬甸聯(lián)邦共和國(guó)一例患有E型肝炎的豬 只中檢測(cè)到。此后在2006-2007我國(guó)（中國(guó)）患有高熱病的豬群中檢測(cè)到，之后再歐洲的匈 牙利和美洲的美國(guó)均見(jiàn)有感染的報(bào)道。目前，關(guān)于PPV2的致病性的研究較小，致病機(jī)理還 未見(jiàn)明確。【參考文獻(xiàn)：Xiao C, Gerber P, Gim6nez_Lirola L, Halbur P, Opriessnig T. Characterization of porcine parvovirus type 2 (PPV2) which is highly prevalent in the USA. VetMicrobiol. 2013,161 (3-4):325-30. ]〇
[0004] 豬細(xì)小病毒3型（PPV3)是近年來(lái)在豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的新型DNA病毒，目前在德國(guó)、中 國(guó)、羅馬利亞、美國(guó)等國(guó)報(bào)道?！緟⒖嘉墨I(xiàn)：Adlhoch C, Kaiser M, Ellerbrok H, Pauli G. High prevalence of porcine Hokovirus in German wild boar populations. Virol J. 2010,7:171.]〇
[0005] SYBR I實(shí)時(shí)熒光PCR是在普通PCR的基礎(chǔ)上，在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入一對(duì)特異性 引物，使用實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的熒光PCR檢測(cè)儀來(lái)檢測(cè)靶核苷酸序列的技術(shù)，具有特異性強(qiáng)、靈敏度 高、定量準(zhǔn)確、適用性廣等優(yōu)點(diǎn)。雙重SYBR I實(shí)時(shí)熒光PCR是在單重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的 基礎(chǔ)上，利用2組引物擴(kuò)增目的片段的GC含量差異導(dǎo)致Tm值差異，可在SYBR I實(shí)時(shí)熒光 PCR反應(yīng)完成后結(jié)合熔解溫度的差異來(lái)對(duì)豬細(xì)小病毒2型（PPV2)和3型（PPV3)進(jìn)行快速 鑒別診斷和感染程度分析。
[0006] 目前，還沒(méi)有基于SYBR I雙重實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和 PPV3)的相關(guān)研究報(bào)道，本發(fā)明的建立可填補(bǔ)相關(guān)領(lǐng)域空白。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供豬細(xì)小病毒2型和3型雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及 方法，利用2組引物擴(kuò)增目的片段的GC含量差異導(dǎo)致Tm值差異，可在SYBR I實(shí)時(shí)熒光PCR 反應(yīng)完成后結(jié)合熔解溫度的差異來(lái)對(duì)豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3)進(jìn)行快速鑒別 診斷和感染程度分析。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3)雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，所述多重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，其中，豬細(xì)小病毒2型引物序列如下：上游引物Pl : GAAGCGGGGAAGATACTC，下游引物P2 :GTCCTTAGCTCTCCACAG ;豬細(xì)小病毒3型引物序列如下： 上游引物 P3 :GAGGGAATTTAGCAACTG，下游引物 P4 :TCTGGTCTTCCTGATATC。
[0009] 所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：SYBR? Primemix Ex Taq ? II 10 μ L、 ?卩￥2上/下游引物10以1各0.6以1^?￥3上/下游引物10以1各0.2以1^、模板分別為 2 μ U補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積20 μ L ;反應(yīng)條件為：95 °C，2 min預(yù)變性；95 °C 15 s、 56 °C 18 s、72 °C 20 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，做出熔解曲線。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：本發(fā)明根據(jù)NCBI中的豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3) 基因組序列，建立檢測(cè)豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3)的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方 法，該方法特異性強(qiáng)、敏感性高，可同時(shí)用于對(duì)豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3)的感 染性的研究，為研究豬細(xì)小病毒2型和3型（PPV2和PPV3)共感染奠定檢測(cè)手段。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011] 圖I PPV2標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。
[0012] 圖2 PPV3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。
[0013] 圖3熔解曲線的建立。
[0014] 圖4實(shí)時(shí)熒光定量PCR特異性實(shí)驗(yàn)。

【具體實(shí)施方式】
[0015] I. 1 材料 1. 1. 1毒株與菌株 PPV2和PPV3陽(yáng)性DNA由本院鑒定并保存。
[0016] 1.1. 2主要儀器和試劑 SYBR? Primemix Ex Taq TM II (Tli RNaseH Plus)、pMD18-T載體、DL500 DNA Marker、 EASY Dilution均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；快速DNA提取檢測(cè)試劑盒（KG203)、膠 回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒、Taq PCR Mastermix(KT201)購(gòu)自天根生化科技(北京） 有限公司；熒光定量PCR管購(gòu)自Axygen。
[0017] 1.2 方法 1.2. 1引物設(shè)計(jì)及合成 參考GenBank中登陸的PPV2和PPV3基因組特征，利用DNAStar軟件進(jìn)行同源性分析比 較，選出保守且特異的核苷酸區(qū)域，利用引物設(shè)計(jì)軟件01ig〇7.0軟件，設(shè)計(jì)引物(見(jiàn)表1)， 采用BLAST工具進(jìn)行檢索，驗(yàn)證其特異性，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合 成。
[0018] 表I PPV2和PPV3實(shí)時(shí)熒光定量引物

【權(quán)利要求】
1. 豬細(xì)小病毒2型和3型雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，其特征在于：所述多重SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物，其中，豬細(xì)小病毒2型引物序列如下：上游引物P1 :GAAGCGGGGAAGATACTC，下游引物P2 :GTCCTTAGCTCTCCACAG ;豬細(xì)小病毒3型引物序列如下： 上游引物 P3 :GAGGGAAITTAGCAACTG，下游引物 P4 :TCTGGTCTTCCTGATATC。
2. 如權(quán)利要求1所述的引物用于豬細(xì)小病毒2型和3型實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，其特征 在于：所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增條件為：SYBR? Primemix Ex Taq ? II 10 iiL、PPV2上 /下游引物10 UM各0. 6 iiL、PPV3上/下游引物10 iiM各0. 2 iiL、模板分別為2 iiL、 補(bǔ)充滅菌去離子水至終體積20 iiL;反應(yīng)條件為：95 °C，2 min預(yù)變性；95 °C 15 s、56 °C 18 s、72 °C 20 s，共40個(gè)循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后，做出熔解曲線。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104480223SQ201410803202
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】李家玉, 張奇, 楊曉燕 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)