一種驅油微生物的高密度濃縮菌劑發(fā)酵和凍干制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種驅油微生物的高密度濃縮菌劑發(fā)酵和凍干制備方法，屬于微生物驅油高密度濃縮菌劑制備【技術領域】。方法步驟為：a、采用高密度培養(yǎng)技術得到高濃度發(fā)酵液；b、發(fā)酵液經無菌生理鹽水洗滌2～3次離心濃縮；c、加入適量凍干保護劑，混合均勻；d、將菌液均勻分裝到凍存管中；e、經真空冷凍干燥機凍干后即可制備成菌劑。本發(fā)明可以得到較高濃度的濃縮菌劑，同時制備其凍干粉，操作簡單有效，菌種活性高，濃縮菌劑菌濃可以達到109～1010cfu/mL，凍干后菌粉含菌量為1010～1011cfu/g，保藏時間較長，且攜帶比較方便，減少了驅油現(xiàn)場菌劑的運輸成本。
【專利說明】一種驅油微生物的高密度濃縮菌劑發(fā)酵和凍干制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于微生物驅油高密度濃縮菌劑制備【技術領域】，具體涉及一種驅油微生物的高密度濃縮菌劑發(fā)酵和凍干制備方法。

【背景技術】
[0002]目前國內外用常規(guī)采油技術只能采出地下油藏30%?40%的原油，提高石油采收率是目前國內外石油行業(yè)研究的關鍵問題之一。近年以來，利用微生物驅油技術，即利用微生物代謝物表面活性劑、有機酸、微生物調剖、生物氣增油、以及界面效應等，取得了一定的效果，石油開采率有所增高。實驗室條件下人工培育的微生物驅油效果較好，但是現(xiàn)場條件下，由于工藝流程的不嚴密性，潔凈水源的缺乏，加熱保溫設備的不足，導致微生物發(fā)酵過程中易于染菌、死亡，菌體發(fā)酵不能達到需求數量，影響驅油效果。
[0003]目前微生物驅油主要有兩種技術，一種方法為采用篩選的驅油微生物培養(yǎng)后注入油藏，另一種方法為利用注入營養(yǎng)物激活本源微生物。油藏是一種特殊環(huán)境，其中的礦物組成及性質，孔隙度和滲透率，地層壓力，流體的溫度、pH、礦化度，原油性質，殘余油飽和度等，都會對微生物生長產生明顯的影響，同時油藏內本身又含有一些內源微生物，在注入外源微生物或營養(yǎng)后也會發(fā)生一些變化，并與外源微生物相互作用。因此無論是外源注入或者內源激活都需要保證目標菌株的高濃度、高活性，保證驅油微生物占據優(yōu)勢。
[0004]現(xiàn)場工廠生產的高活性發(fā)酵液是影響驅油效果的一個重要因素，而高活性、高濃度的驅油微生物菌種是限制工廠生產的一項重要指標。目前油田采用的常規(guī)技術發(fā)酵，由于各種條件限制，只能將菌體的濃度由原來的13?104Cfu/mL提高到16?107cfu/mL，且易于染菌。由于需要發(fā)酵液多次循環(huán)注入油藏，發(fā)酵液通常采用甘油液封的方法進行保藏，由于保藏條件惡劣，難以達到低溫、缺氧等條件而降低菌體新陳代謝的條件，導致發(fā)酵液中的菌體活性較低，菌體死亡率高，工廠制備發(fā)酵液發(fā)酵周期較長，菌體染菌率高。實驗室條件下，常規(guī)甘油保存驅油菌的菌濃只有17?108cfu/mL、菌粉濃度為18?109cfu/g、菌體存活率只有1.4%?9.8%。
[0005]本發(fā)明通過高密度培養(yǎng)技術，不僅提高了發(fā)酵液濃度，而且提高最終菌體生物量和目標產物的產率，縮小生物反應器體積，降低設備投資，縮短發(fā)酵周期，減少水電使用。同時本發(fā)明將高濃度的發(fā)酵液進行濃縮凍干，不僅操作簡單方便，而且菌劑易于攜帶，降低了現(xiàn)場運輸成本。現(xiàn)場工廠生產時可以快速高效的獲得高濃度的種子液，減少了發(fā)酵周期，同時可以達到抑制其他微生物污染的目的，有利于提高石油采收率。


【發(fā)明內容】

[0006]針對現(xiàn)有微生物驅油生產的缺點和不足，本發(fā)明提供一種能夠長期有效的高濃度、高活性菌劑制備的方法。
[0007]為了達到上述目的，實驗方案如下:
[0008]1.將保存于冰箱的斜面菌種接種到固體LB培養(yǎng)基上活化2?3代。
[0009]2.將固體LB平板上的菌落接種到改良的液體培養(yǎng)基中30?37°C、140?160r/min發(fā)酵培養(yǎng)20?24h。
[0010]3.將發(fā)酵液放入離心管中4000?8000r/min、離心10?15min,棄上清,按比例加入優(yōu)化的凍干保護劑，充分混合均勻。
[0011 ] 4.將混勻的菌劑放入凍存管或凍干機中。
[0012]5.將混勻的菌劑依次在O?4°C、-20°C?30°C、_60°C?80°C冰箱分別預凍20min?40min、lh?2h、4h?6h,使用凍干機凍干后，即可得到濃縮凍干菌劑。
[0013]所述的瓊氏不動桿菌改良的液體培養(yǎng)基組成為:葵花籽油1%?10% (v/v)、糖蜜0.1 %?0.5% (m/v)、氯化鈉3?5g、蛋白胨6?10g、酵母膏3?5g,用自來水定容至1L，pH5.0?5.5 ;銅綠假單胞菌改良液體培養(yǎng)基組成為:葵花籽油2%?8% (v/v)、糖蜜0.5%?3% (m/v)、氯化鈉3?5g、蛋白胨6?10g、牛肉膏3?8g,用自來水定容至1L,ρΗ7.0 ?8.5。
[0014]所述的瓊氏不動桿菌最適凍干保護劑組合為(m/v):脫脂奶粉1%?10%、谷氨酸鈉I %?10 %、鹿糖I %?10%;銅綠假單胞菌最適凍干保護劑為(m/v):乳糖10%?15%。121。。滅菌 15min。
[0015]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
[0016]本發(fā)明通過對不同發(fā)酵培養(yǎng)基組成、凍干保護劑組成進行單因素和正交設計優(yōu)化，得到驅油微生物的最適發(fā)酵培養(yǎng)基組成、凍干保護劑組成，利用真空冷凍干燥設備達到菌種保藏的低氧、低水、低溫等條件，油田現(xiàn)場試驗中，通過菌劑濃縮技術，大大延長了菌種的保藏時間，同時保證了菌種活力的相對穩(wěn)定性，菌種復壯迅速，活性很快恢復，節(jié)約了驅油菌劑發(fā)酵時間。高密度濃縮技術使菌種菌濃達到了 1ltl?10ncfu/mL，菌體凍干粉含菌量達到了 111?1012cfu/g，存活率高達74.1%以上。常規(guī)甘油保存菌濃為17?18Cfu/mL、菌粉凍干粉含菌量18?109cfu/g，菌體存活率只有1.4%?9.8%。凍干菌劑的制備減少了菌液工業(yè)生產的成本，保證了菌劑生物量與活性，同時還可以抑制雜菌污染，提高微生物驅油效果。

【具體實施方式】
[0017]實施例1
[0018]1.配制50mL瓊氏不動桿菌改良液體培養(yǎng)基，121°C滅菌15min，接入活化的瓊氏不動桿菌菌種，30°C、140r/min搖瓶培養(yǎng)24h。
[0019]2.配制凍存保護劑:脫脂奶粉lg、谷氨酸鈉lg、蔗糖lg，用自來水定容到10mL,121°C滅菌15min，備用。
[0020]3.分別取發(fā)酵液ImL菌液，用移液器分別吸取發(fā)酵液10mL，6000r/min離心lOmin，用無菌生理鹽水洗滌后再次相同條件離心，分別加入瓊氏不動桿菌優(yōu)化保護劑lmL，充分混勻，得到菌濃為2.1 X 1010cfu/mL的凍存液。最后每管0.2mL分裝到2mL凍存管中，將凍存管依次在4°C、-20°C、_80°C冰箱分別預凍30min、lh、4h后，使用凍干機凍干20h，得到濃縮凍干菌劑，所得菌濃為1.7X 101(lCfu/mL，凍干粉含菌量為2.3 X 101(lCfu/g，凍干菌體存活率為81.0%。
[0021]實施例2
[0022]1.配制1.5L銅綠假單胞菌改良液體培養(yǎng)基，放入3L發(fā)酵罐中，121°C滅菌15min，接入活化的銅綠假單胞菌菌種，36°C、160r/min發(fā)酵培養(yǎng)24h。
[0023]2.配制凍存保護劑:乳糖15g，用自來水定容到lOOmL，121°C滅菌15min，備用。
[0024]3.分別吸取發(fā)酵液lOOmL，7000r/min離心15min，用無菌生理鹽水洗滌后再次相同條件離心，分別加入銅綠假單胞菌優(yōu)化保護劑lmL，充分混合均勻，得到菌濃為1.8X10nCfu/mL的凍存液.最后每管0.2mL分裝到2mL凍存管中，將凍存管依次在4°C、-20°C、-80°C冰箱分別預凍30min、2h、4h后，使用凍干機凍干22h，得到濃縮凍干菌劑，所得菌濃為1.4X10ncfu/mL,凍干粉含菌量為3.6X 1012cfu/g，凍干菌體存活率為77.8%。
[0025]實施例3
[0026]1.配制50mL瓊氏不動桿菌改良液體培養(yǎng)基，121°C滅菌15min，接入活化的瓊氏不動桿菌菌種，37°C、160r/min搖瓶培養(yǎng)24h。
[0027]2.配制凍存保護劑:脫脂奶粉5g、谷氨酸鈉10g、蔗糖5g，用自來水定容到10mL,121°C滅菌15min，備用。
[0028]3.分別吸取發(fā)酵液10mL,8000r/min離心15min,用無菌生理鹽水洗漆后再次相同條件離心，分別加入優(yōu)化保護劑lmL，充分混合均勻后，得到菌濃為2.1 X 1010cfu/mL的凍存液。最后每管0.2mL分裝到2mL凍存管中，將凍存管依次在4°C、-20°C, _80°C冰箱分別預凍30min、lh、4h后，使用凍干機凍干24h，得到濃縮凍干菌劑所得菌濃為1.5 X 1010cfu/mL,凍干粉含菌量為3.4X10ncfu/g，凍干菌體存活率為71.4%。
【權利要求】
1.一種驅油微生物的高密度濃縮菌劑發(fā)酵和凍干制備方法，其特征步驟在于將保存于冰箱的驅油微生物斜面菌種接種到固體18平板培養(yǎng)基上活化2?3代山、將固體18平板上的活化后菌落接種到改良的液體培養(yǎng)基中發(fā)酵20?2411，得到高密度驅油微生物發(fā)酵液將發(fā)酵液離心后，棄上清，得到高密度濃縮菌劑，按比例加入優(yōu)化的凍干保護劑，混合均勻；么將混勻的菌劑均勻分裝到凍存管或凍干機中；6、將菌劑依次在0?41、-201?301^-601^ 80條件下分別預凍20111111?40111111、111?211、411?611后，使用凍干機凍干后，即可得到濃縮菌劑凍干粉。
2.根據權利要求1所述方法，其特征在于:驅油微生物為瓊氏不動桿菌和銅綠假單胞菌。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟6中瓊氏不動桿菌改良的液體培養(yǎng)基組成為:葵花籽油1 %?10%(爪八)、氯化鈉3?5邑、蛋白胨6?108、酵母膏3?58，用自來水定容至1匕邱5.0?5.5 ；銅綠假單胞菌改良液體培養(yǎng)基組成為:葵花籽油2%?8% 0/^)、糖蜜0.5%?3%化八)、氯化鈉3?5邑、蛋白胨6?10邑、牛肉膏3?88，用自來水定容至1匕邱7.0?8.5 ；培養(yǎng)條件為:301?371、140?180x7111111。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟。中離心條件為溫度0?81、轉速4000 ?80001-/111111^ 10 ?15111111。
5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟0中高密度濃縮菌劑菌濃為101°?
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟^中瓊氏不動桿菌最適凍干保護劑組合為化八):脫脂奶粉1%?10%、谷氨酸鈉1%?10%、蔗糖1%?10%；銅綠假單胞菌最適凍干保護劑為(爪八):乳糖10%?15%、121。。滅菌15111111。
7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟^中的凍干保護劑與濃縮菌劑的比例為1: 1?1: 100。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:步驟6中菌劑干粉含水量為:2%?8%，菌劑干粉含菌量為1011?1012#114，存活率達到71.4%以上。
【文檔編號】C12N1/20GK104403982SQ201410802821
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月18日 優(yōu)先權日:2014年12月18日
【發(fā)明者】熊曉輝, 郭漢卿, 陸利霞, 王雪梅, 劉洋 申請人:南京工業(yè)大學