口蹄疫病毒通用、a型二重實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)引物及探針的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供口蹄疫病毒通用、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及探針，所述引物包括P0、P1、P2、P3和P4，所述探針包括P5和P6。本發(fā)明基于所述引物和探針建立的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)同時(shí)對(duì)口蹄疫病毒O、A、AsiaⅠ3個(gè)亞型的通用型和口蹄疫病毒A型進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)，可在1-2h內(nèi)完成檢測(cè)，具有快速、特異、敏感、高通量等優(yōu)點(diǎn)，能滿(mǎn)足大批量、快速鑒別檢測(cè)口蹄疫病毒、A型口蹄疫病毒的要求。
【專(zhuān)利說(shuō)明】口蹄疫病毒通用、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及探 針

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物疫病檢疫檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說(shuō)，涉及口蹄疫病毒通用型、A型 二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及探針。

【背景技術(shù)】
[0002] 口蹄疫（FMD)是由口蹄疫病毒（Footand Mouth Disease Virus，F(xiàn)MDV)引起的豬、 牛、羊等主要家畜和其它家養(yǎng)、野生偶蹄動(dòng)物共患的一種急性、惡性、高度接觸性傳染病，易 感動(dòng)物達(dá)70多種。該病傳播途徑多、速度快，曾多次在世界范圍內(nèi)暴發(fā)流行，造成巨大政 治、經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)將其列為A類(lèi)傳染病之首。目前，有三分之二的 OIE成員國(guó)流行FMD，時(shí)刻威脅著無(wú) FMD國(guó)家和地區(qū)的家畜安全和畜產(chǎn)品貿(mào)易?？谔阋甙?7個(gè)血清型，中國(guó)流行的和受鄰國(guó)威脅的主要有0、A、Asia I 3個(gè)血清型，而各血清型之間的 交叉保護(hù)力很差。因此，利用簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢查方法盡早對(duì)口蹄疫作出型的鑒別診斷 對(duì)控制口蹄疫疫情至關(guān)重要。實(shí)時(shí)熒光定量PCR (fluorescent quantitative PCR，簡(jiǎn)稱(chēng)為 FQ-PCR)是一種新型診斷工具，具有敏感、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，并且在核酸快速擴(kuò)增的同時(shí)實(shí) 現(xiàn)模板的定量測(cè)定。目前發(fā)展起來(lái)的多聯(lián)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)可以在同一個(gè)PCR反應(yīng)中，通 過(guò)Tm值分析來(lái)區(qū)分不同的核酸片段，這為同時(shí)檢測(cè)多種病原提供了技術(shù)基礎(chǔ)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種可快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)0、A、Asia I 3個(gè)血清型口蹄疫病毒 通用型和鑒別A型口蹄疫病毒的口蹄疫病毒通用型、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物 及探針。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供上述引物及探針在檢測(cè)口蹄疫病毒和鑒別A型口蹄疫 病毒中的應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的口蹄疫病毒通用、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (二重FQ-PCR)檢測(cè)引物及探針，所述引物包括：
[0006] PO :5，-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3，（SEQ ID N0:3 所示序列）；
[0007] Pl :5' -CGGCCTCTCATCCAACAGA-3，（SEQ ID N0:4 所示序列）；
[0008] P2 :5，-ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3，（SEQ ID N0:5 所示序列）；
[0009] P3 :5，-AACCCCACCGCCTACCA-3，（SEQ ID N0:6 所示序列）；
[0010] P4 :5，-GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3，（SEQ ID N0:7 所示序列）；
[0011] 所述探針包括：
[0012] Probe-P5 :5'-F1-TCATTTGTGAAACGCG-Q1-3'（SEQ ID N0:8 所示的序列 5' 端連接 Fl，3'端連接Ql);
[0013] Probe-P6 :5'-F2-AAGCAGCCGTTTACG-Q2-3'（SEQ ID N0:9 所示的序列 5' 端連接 F2,3'端連接Q2);
[0014] 其中，F(xiàn)1、F2為熒光基團(tuán)，Q1、Q2為非熒光淬滅基團(tuán)，F(xiàn)l為FAM，F(xiàn)2為VIC，Q1和Q2 為 MGB。
[0015] 其中，PO為反轉(zhuǎn)錄引物，用于對(duì)待測(cè)病毒樣品的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ;P1、 P2、P3、P4和Probe-P5和Probe-P6為實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物及探針。
[0016] 本發(fā)明還提供含有上述引物及探針的用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)口蹄疫病毒通 用型和A型口蹄疫病毒的試劑盒。
[0017] 其中，在本發(fā)明所提供的試劑盒中還可以含有陽(yáng)性對(duì)照品和陰性對(duì)照品，陽(yáng)性對(duì) 照品可以為〇型、A型和Asia I型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)株，陰性對(duì)照可以為水或其它病毒標(biāo)準(zhǔn) 株。
[0018] 本發(fā)明進(jìn)一步提供上述引物及探針、或試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)口蹄疫病 毒和A型口蹄疫病毒中的應(yīng)用。所述應(yīng)用包括以下步驟：
[0019] 1)提取待測(cè)病毒樣品的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得CDNA ;其中，反轉(zhuǎn)錄體系為： 5XM-MLV 緩沖液 4 μ L，2. 5mmol/L dNTP 4 μ L，弓丨物 POl μ L，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0· 5 μ L，RNase 抑制劑0. 5yL，RNA IOyL;反轉(zhuǎn)錄條件為：37°C，lh ;
[0020] 2)將cDNA克隆入pGEM-T Easy載體中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
[0021] 3)分析PCR產(chǎn)物。
[0022] 其中，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的反應(yīng)體系以25 μ 1計(jì)為：Pl、P2、P3、P4終濃度各 為 0· 4 μ mol/L，Probe_P5 終濃度為 0· 6 μ mol/L，Probe_P6 終濃度為 0· 7 μ mol/L，2. 5mmol/ L dNTPs 2 μ L，10 X Ex Taq 酶緩沖液 2.5 μ L，5U/μ L Ex Taq DNA 酶 0.25 μ L，I. OX IO5 拷 貝/ μ L的質(zhì)粒模板2 μ L，補(bǔ)足去離子水至終體積25 μ L。
[0023] PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C 5分鐘；94°C 15秒，60°C 30秒，共40個(gè)循環(huán)。
[0024] 本反應(yīng)中，需同時(shí)做陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，分別設(shè)置通用型檢測(cè)體系和A型檢測(cè) 體系為FAM和VIC熒光通道。
[0025] 在本發(fā)明中，檢測(cè)結(jié)果的判定方式可以為：閾值設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)正常陰性 對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)，不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。陰性對(duì)照的檢測(cè) 結(jié)果應(yīng)無(wú)特定的擴(kuò)增曲線，且Ct值> 30. 0或無(wú)，陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)< 27. 0,且出現(xiàn)特定 的擴(kuò)增曲線，判定檢測(cè)結(jié)果成立。如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果不滿(mǎn)足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視 為無(wú)效。在檢測(cè)結(jié)果成立的前提下，若樣品檢測(cè)結(jié)果Ct值< 27. 0,而且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲 線，判定為陽(yáng)性；Ct值> 30.0或無(wú)，并且無(wú)特定的擴(kuò)增曲線，則判定為陰性；30.0 > Ct值 > 27. 0且有特定擴(kuò)增曲線的樣品判定為可疑，對(duì)可疑樣品重新試驗(yàn)，結(jié)果為陽(yáng)性者判定為 陽(yáng)性，結(jié)果為陰性者判定為陰性；對(duì)可疑樣品重新試驗(yàn)，結(jié)果再次為可疑者應(yīng)重新采集該動(dòng) 物樣品重新試驗(yàn)。同一份樣品判定：通用型檢測(cè)體系FAM熒光通道和A型VIC熒光通道均 為陽(yáng)性者判定為本樣品為T(mén)/A型雙陽(yáng)性樣品，即該樣品為A型口蹄疫感染樣品；通用型檢測(cè) 體系FAM熒光通道陽(yáng)性，A型檢測(cè)體系VIC熒光通道陰性者判定為本樣品為通用型陽(yáng)性樣 品，即該樣品為其他型口蹄疫感染樣品，而非A型口蹄疫感染樣品。
[0026] 本發(fā)明提供的口蹄疫病毒通用型、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及探針， 以及基于所述引物和探針建立的二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)一個(gè)反應(yīng)同時(shí)對(duì)0、A、 Asia I 3個(gè)血清型口蹄疫病毒FMDV-T和A型口蹄疫病毒FMDV-A進(jìn)行快速鑒別檢測(cè)，可 在l-2h內(nèi)完成檢測(cè)，具有快速、特異、敏感、高通量等優(yōu)點(diǎn)，能滿(mǎn)足大批量、快速鑒別檢測(cè) FMDV-T、FMDV-A 的要求。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0027] 圖1 :通用FMDV重組質(zhì)粒的鑒定；其中，M為DL2000Marker，1為通用FMDV重組質(zhì) 粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp。
[0028] 圖2 :A型FMDV重組質(zhì)粒的鑒定；其中，M為IOObp Marker，1為A型FMDV重組質(zhì) 粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物為326bp。
[0029] 圖3 : 口蹄疫二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR診斷方法的建立；其中，1為FAM探針FMDV-T 擴(kuò)增曲線，2為VIC探針FMDV-A擴(kuò)增曲線，3、4為陰性對(duì)照。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明， 實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning: a laboratory manual, 2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。
[0031] 實(shí)施例1 口蹄疫病毒通用、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立
[0032] 1.材料與方法
[0033] I. 1 材料
[0034] I. I. 1 毒株
[0035] 0型、A型和Asia I型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)株，均購(gòu)自農(nóng)業(yè)部蘭州獸醫(yī)研究所；其他對(duì) 照病毒或質(zhì)粒由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心保存。
[0036] I. L 2儀器和試劑
[0037] 熒光PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，型號(hào)ABI7000 ;PCR擴(kuò)增儀，德國(guó)Biometra公司 產(chǎn)品；凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Alpha Innotech公司產(chǎn)品；恒溫水浴震蕩器（HZQ-Q)，哈爾 濱東聯(lián)電子技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司產(chǎn)品；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)Heraeus公司產(chǎn)品；Ex Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA回收試劑盒等均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，pGEM-T Easy 載體、JM109感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自Promega公司。
[0038] 1. 2 方法
[0039] 1. 2. 1引物設(shè)計(jì)和合成
[0040] 經(jīng)大量比對(duì)GenBank中FMDV 7個(gè)血清型的基因和FMDV-A基因序列，選取FMDV 的0、A、Asia I 3個(gè)血清型基因高度保守基因序列（SEQ ID NO: 1)和FMDV-A基因高度 保守且具有型特異性基因序列（SEQ ID N0:2)為模板設(shè)計(jì)FMDV-T/FMDV-A的特異性引物 對(duì)和 TaqMan MGB 探針，分別命名為 FMDVR (PO)、FMDV-T (Pl)、FMDV-T (P2)、FMDV-A (P3)、 FMDV-A (P4)、FMDV-T-MGB-FAM-Probe (Probe-P5)、FMDV-A-MGB-VIC-Probe (Probe-P6)，由寶 生物工程（大連）有限公司合成，用于FMDV-T/FMDV-A二重TaqMan MGB FQ-PCR擴(kuò)增的引 物和探針序列如下：
[0041] PO : 5，-CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3，
[0042] Pl=Si -CGGCCTCTCATCCAACAGA-3;
[0043] P2 ： 5; -ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3;
[0044] P3:5，-AACCCCACCGCCTACCA-3,
[0045] Ρ4:5' -GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3'
[0046] Probe-P5 :5'-FAM-TCATTTGTGAAACGCG-MGB-3'
[0047] Probe-P6 :5'-VIC-AAGCAGCCGTTTACG-MGB-3'
[0048] I. 2. 2 總 RNA 的制備
[0049] 模板RNA的制備：以FMDV-T/FMDV - A陽(yáng)性質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照，水為陰性對(duì)照，與0 型、A型和Asia I型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)株同時(shí)采用Trizol法提取總RNA。具體操作如下：分 別取0型、A型和Asia I型口蹄疫病毒標(biāo)準(zhǔn)株、陰性對(duì)照及待檢樣品各200 μ L于I. 5ml離 心管中，再加入600 μ L的Trizol于渦旋器震蕩2-3min，加入200 μ L氯仿，離心后，取上 清轉(zhuǎn)入另I. 5ml離心管中，加200 μ L異丙醇沉淀，75 %乙醇洗滌沉淀，干燥，最后用20 μ L DEPC(焦磷酸二乙酯）水溶解沉淀，取10 μ L用于反轉(zhuǎn)錄，其余-20°C保存。
[0050] 1. 2. 3 反轉(zhuǎn)錄
[0051] 每管FMDV反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系含如下成份：5XM-MLV緩沖液4 μ L ;2. 5mmol/L dNTPs (三磷酸脫氧核苷酸）4μ L ;M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶0. 5yL ;RNase抑制劑0. 5μ L ;引物 POl μ L ;總體積10 μ L。向每管反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入步驟1. 2. 2中制得的RNA 10 μ L，37°C 水浴Ih或置于PCR儀中37°C反應(yīng)lh，反應(yīng)結(jié)束后，70°C，15min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，直接用于后 續(xù)PCR擴(kuò)增或-20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0052] I. 2. 4FMDV-T/FMDV-A 標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0053] 將FMDV-T/FMDV-A的陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物分別克隆入pGEM-T Easy載體中，篩選陽(yáng)性重 組質(zhì)粒送寶生物工程（大連）有限公司采用T7和SP6引物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序正確的FMDV-T/ FMDV-A重組陽(yáng)性質(zhì)粒應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定其OD26tl和OD28tl值及OD26tZOD 28tl值，共重復(fù)5次； 參考質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)計(jì)算方法，計(jì)算pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A質(zhì)粒DNA溶液的濃度 分別為9. 12X 101°拷貝/ μ L和9. IlX 101°拷貝/ μ L，定量并稀釋至1.0X 10°?LOXIOiq 拷貝/ μ L，-20°C保存?zhèn)溆谩?duì)通用FMDV重組質(zhì)粒（pGEM-T/FMDV-T)和A型FMDV重組質(zhì) 粒（pGEM-T/FMDV-A)進(jìn)行鑒定。（如圖1和2,通用FMDV重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物為633bp，A 型FMDV重組質(zhì)粒的擴(kuò)增產(chǎn)物為326bp。）
[0054] I. 2. 5FMDV-T/FMDV-A 二重 FQ-PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化
[0055] 將步驟1. 2. 4中獲得的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組質(zhì)粒分別稀釋至終 濃度I. OX IO5拷貝/ y L作為檢測(cè)模板，P1/P2、P3/P4引物對(duì)分別稀釋為終濃度0. 05、0. 1、 0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8 和 I. 0 μ mol/L，Probe-P5、Probe-P6 探針?lè)謩e稀釋到終濃 度為 0· 05、0· 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8 和 I. Oymol/L，應(yīng)用熒光 PCR 儀（美國(guó) ABI 公司，型號(hào)：ΑΒΙ7000)采用矩陣法篩選不同濃度的FMDV-T/FMDV-A引物和探針組合，篩選針 對(duì)FMDV-T/FMDV-A的二重FQ-PCR最佳引物濃度、探針濃度和最佳反應(yīng)條件。
[0056] 優(yōu)化的25 μ L PCR反應(yīng)體系，F(xiàn)MDV-T/FMDV-A上、下游引物P1/P2、P3/P4終濃度 各 0· 4 μ mol/L，Probe_P5 終濃度為 0· 6 μ mol/L，Probe_P6 終濃度為 0· 7 μ mol/L，2. 5mmol/ L dNTPs 2 μ L，10 X Ex Taq 酶緩沖液 2.5 μ L，5U/μ L Ex Taq DNA 酶 0.25 μ L，I. OX IO5 拷 貝/ μ L的質(zhì)粒模板各2 μ L，補(bǔ)足去離子水至終體積25 μ L。優(yōu)化的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C, 511^11;941：158,601：308,40個(gè)循環(huán)（如圖3，1為？41探針？]\?￥-1'擴(kuò)增曲線，2為￥1(：探針 FMDV-A擴(kuò)增曲線，3、4為陰性對(duì)照）。
[0057] 結(jié)果判定：閾值設(shè)定以閾值線剛好超過(guò)正常陰性對(duì)照品擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)為準(zhǔn)， 不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)無(wú)特定的擴(kuò)增曲線，且Ct 值> 30. 0或無(wú)，陽(yáng)性對(duì)照的Ct值應(yīng)< 27. 0,且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，判定檢測(cè)結(jié)果成立。 如陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果不滿(mǎn)足以上條件，此次實(shí)驗(yàn)視為無(wú)效。在檢測(cè)結(jié)果成立的前提 下，若樣品檢測(cè)結(jié)果Ct值< 27.0,而且出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲線，判定為陽(yáng)性；Ct值> 30.0或 無(wú)，并且無(wú)特定的擴(kuò)增曲線，則判定為陰性；30. 0 > Ct值> 27. 0且有特定擴(kuò)增曲線的樣品 判定為可疑，對(duì)可疑樣品重新試驗(yàn)，結(jié)果為陽(yáng)性者判定為陽(yáng)性，結(jié)果為陰性者判定為陰性； 對(duì)可疑樣品重新試驗(yàn)，結(jié)果再次為可疑者應(yīng)重新采集該動(dòng)物樣品重新試驗(yàn)。通用型檢測(cè)體 系FAM熒光通道和A型VIC熒光通道均為陽(yáng)性者判定為本樣品為T(mén)/A型雙陽(yáng)性樣品，即該 樣品為A型口蹄疫感染樣品；通用型檢測(cè)體系FAM熒光通道陽(yáng)性，A型檢測(cè)體系VIC熒光通 道陰性者判定為本樣品為通用型陽(yáng)性樣品，即該樣品為其他型口蹄疫感染樣品，而非A型 口蹄疫感染樣品。
[0058] 1. 2. 6敏感性試驗(yàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0059] 將步驟1. 2. 4中獲得的pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組質(zhì)粒分別作10倍系 列稀釋?zhuān)瑑煞N質(zhì)粒1:1比例混合，每種質(zhì)粒終濃度調(diào)整為1. 〇XIO7?1. 〇X10°拷貝/ μ L，共 8個(gè)稀釋度，以純水為陰性對(duì)照，按步驟1. 2. 5優(yōu)化的FQ-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行FMDV-T/FMDV-A 二重FQ-PCR敏感性試驗(yàn)。分別以pGEM-T/FMDV-T和pGEM-T/FMDV-A重組質(zhì)粒起始模板數(shù) 的對(duì)數(shù)為X軸，以FQ-PCR循環(huán)次數(shù)C t值為Y軸作回歸曲線，建立二重FQ-PCR方法的標(biāo)準(zhǔn) 曲線。二重FQ-PCR檢測(cè)FMDV-T和FMDV-A最低檢出限均為1.0X10 1拷貝/ μ L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。
[0060] 表 1
[0061]

【權(quán)利要求】
1. 口蹄疫病毒通用、A型二重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)引物及探針，其特征在于，所述引 物包括： P0 :5' -CGGGAAACGCATGAGCAGTA-3' P1 :5，-CGGCCTCTCATCCAACAGA-3, P2 ： 5' -ATTTTCCTTCAGGCGCTTGA-3' P3 ： 5' -AACCCCACCGCCTACCA-3' P4 :5, -GGTGTAAGGGAGCGCAAGTC-3, 所述探針包括： Probe-P5 :5'-F1-TCATTTGTGAAACGCG-Q1-3' Probe-P6 :5'-F2-AAGCAGCCGTTTACG-Q2-3' 其中，F(xiàn)1、F2為熒光基團(tuán)，Q1、Q2為非熒光淬滅基團(tuán)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物及探針，其特征在于，F(xiàn)1為FAM，F(xiàn)2為VIC，Q1和Q2為 MGB。
3. 含有權(quán)利要求1或2所述引物及探針的用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)口蹄疫病毒和A 型口蹄疫病毒的試劑盒。
4. 權(quán)利要求1或2所述引物及探針，或權(quán)利要求3所述試劑盒在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢 測(cè)口蹄疫病毒和A型口蹄疫病毒中的應(yīng)用。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，包括以下步驟： 1) 提取待測(cè)病毒樣品的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA ;其中，反轉(zhuǎn)錄體系為：5XM-MLV 緩沖液 4 ii L，2. 5mmol/L dNTP 4 ii L，引物 P01 ii L，M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 0? 5 ii L，RNase 抑制劑 0. 5iiL，RNA lOiiL;反轉(zhuǎn)錄條件為：37°C，lh; 2) 將cDNA克隆入pGEM-T Easy載體中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò) 增反應(yīng)； 3) 分析PCR產(chǎn)物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用的反應(yīng)體系 以 25iil 計(jì)為：PI、P2、P3、P4 終濃度各為 0? 4iimol/L，Probe-P5 終濃度為 0? 6iimol/L， ?1~(*6-?6終濃度為0.711111〇1/1，2.5臟〇1/1(1階？8 2111，10\￡叉139酶緩沖液2.5111，5。/ ii L Ex Taq DNA酶0. 25 ii L，1. 0 X 105拷貝/ ii L的質(zhì)粒模板2 ii L，補(bǔ)足去離子水至終體積 25 u L〇
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94°C 5分鐘；94°C 15 秒，60°C 30秒，共40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404170SQ201410750833
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】吳志明, 閆若潛, 謝彩華, 趙雪麗, 陳濤, 趙明軍, 鄭巖, 嚴(yán)平, 王淑娟, 劉琨, 曹偉偉, 張代寶, 王翠, 韓慶斌, 朱鳳霞, 王永強(qiáng) 申請(qǐng)人:河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心