管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)及其引物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了14個(gè)管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)及其引物。研究表明，所獲引物的擴(kuò)增結(jié)果具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于管角螺的種群遺傳多樣性檢測(cè)、個(gè)體鑒定或分子輔助育種方面。將本發(fā)明運(yùn)用于對(duì)管角螺的繁育保護(hù)及科研研究之中，將為管角螺的遺傳多樣性研究提供可用的分子標(biāo)記，并提供了利用微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)管角螺進(jìn)行遺傳學(xué)個(gè)體識(shí)別的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有基礎(chǔ)理論的不足。對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分型，利用基因分型結(jié)果對(duì)管角螺野生個(gè)體進(jìn)行分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)管角螺的個(gè)體識(shí)別。
【專利說(shuō)明】管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)及其引物和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)及其引物 和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 管角螺 Hemifusus tuba (Gmelin)屬軟體動(dòng)物門（Mollusca)、腹足綱 (Gastropoda)、新腹足目（Neogastropoda)、盜螺科（Gal eodidae),為暖水種，生活在熱 帶、亞熱帶海區(qū)潮下帶淺海水深ll-42m的軟泥和沙質(zhì)的海底；貝殼較大型，狀似梨形， 殼質(zhì)堅(jiān)厚，殼表被有黃褐色或淡棕色細(xì)密而短的茸毛殼皮；成體殼高110-200mm，殼寬 70-117_1(約150-30(^)，最大殼高超過(guò)300111111(體重>50(^) ;螺層約8.5層，每層的高、寬 度增長(zhǎng)較快，自螺旋部第三層開(kāi)始到體螺層，每層的肩部有一環(huán)列結(jié)節(jié)突起，在體螺層則成 為三角形的棘。管角螺主要分布于我國(guó)浙江以南、福建、廣東、廣西和海南沿海，貝殼大型可 做號(hào)角，故俗稱"角螺"、"響螺"。其軟體部肥大，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美且營(yíng)養(yǎng)豐富，具有極高 的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。目前市場(chǎng)上出售的管角螺均采捕于自然海域，然而，由于近年來(lái)管角螺的過(guò)度 采捕加上環(huán)境污染日益惡化等原因，海區(qū)管角螺自然資源遭受嚴(yán)重破壞。因此，保護(hù)其種質(zhì) 資源及進(jìn)行種群遺傳多樣性評(píng)估已經(jīng)成為我國(guó)海區(qū)管角螺自然資源可持續(xù)發(fā)展急待解決 的重要課題之一。
[0003] 隨著我國(guó)海水貝類養(yǎng)殖業(yè)迅猛發(fā)展，保護(hù)貝類的種質(zhì)資源，是我國(guó)貝類養(yǎng)殖業(yè)健 康持續(xù)發(fā)展的可靠保障，同時(shí)亦日益受到人們的重視。對(duì)某一種資源進(jìn)行保護(hù)之前，需要了 解有關(guān)該物種的遺傳背景和群體遺傳結(jié)構(gòu)，從而建立種質(zhì)資源的遺傳背景檔案。近年來(lái)，迅 速發(fā)展的各種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，使人們從不同角度和不同層次，更加全面的揭示物種的 遺傳信息，也為貝類的種質(zhì)資源提供了重要的基礎(chǔ)資料。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)管角螺的遺傳背景 知之甚少，對(duì)其遺傳多樣性研究十分迫切。然而，選擇一種有效可靠，并且生物信息含量豐 富的分子標(biāo)記為管角螺的大規(guī)模人工繁育、養(yǎng)育提供基礎(chǔ)理論依據(jù)，為我國(guó)管角螺種質(zhì)資 源的開(kāi)發(fā)、種群識(shí)別、增殖流放和合理保護(hù)提供資料，是一個(gè)急需解決的問(wèn)題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)及其引物和應(yīng)用，以便于對(duì)管 角螺的繁育保護(hù)及科研研究。
[0005] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0006] 管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)，具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 14中任一的堿基序 列，它們分別標(biāo)記編號(hào)為 HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT7、HT8、HT9、HT10、HT11、HT12、 HT13、HT14。
[0007] 管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的組合，包括管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、 HT7、HT8、HT9、HT10、HT11、HT12、HT13、HT14。
[0008] 管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT7、 HT8、HT9、HT10、HT11、HT12、HT13、HT14 的引物分別包括具有 SEQ. ID. No. 15/16、17/18、 19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、35/36、37/38、39/40、41/42 中的一 對(duì)堿基序列，它們分別標(biāo)記編號(hào)為 HTlpl/p2、HT2pl/p2、HT3pl/p2、HT4pl/p2、HT5pl/p2、 HT6pl/p2、HT7pl/p2、HT8pl/p2、HT9pl/p2、HT10pl/p2、HTllpl/p2、HT12pl/p2、HT13pl/p2、 HT14pl/p2。
[0009] 管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物組合，包括引物HTlpl/p2、HT2pl/p2、HT3pl/p2、HT4pl/ p2、HT5pl/p2、HT6pl/p2、HT7pl/p2、HT8pl/p2、HT9pl/p2、HT10pl/p2、HTllpl/p2、HT12pl/ p2、HT13pl/p2、HT14pl/p2。
[0010] 上述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)或其組合在管角螺的種群遺傳多樣性檢測(cè)、個(gè)體鑒定或分 子輔助育種方面的應(yīng)用。
[0011] 權(quán)利要求3或4管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物或其組合在管角螺的種群遺傳多樣性檢 測(cè)、個(gè)體鑒定或分子輔助育種方面的應(yīng)用。
[0012] 管角螺的種群遺傳多樣性檢測(cè)按以下步驟進(jìn)行：
[0013] 〈1>基因組DNA的提取：采用CTAB (十六烷基三甲基溴化銨）抽提法提取管角螺 基因組DNA ;
[0014] 〈2>微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：采用三引物檢測(cè)法檢測(cè)篩選管角螺微衛(wèi)星引物，并將篩選出 的微衛(wèi)星引物擴(kuò)增基因組DNA，獲得管角螺個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0015] 〈3>擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果， 掃描儀記錄電泳圖譜，根據(jù)電泳圖譜分析各微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增情況；
[0016] 〈4>遺傳多樣性分析：根據(jù)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，利用 GENEPOP Version 4. 0計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)；
[0017] 〈5>基因分型的結(jié)果分析，去除下列備選位點(diǎn)：無(wú)基因分型結(jié)果的位點(diǎn)；在任一個(gè) 體中等位基因數(shù)在兩個(gè)以上的位點(diǎn)；在30個(gè)管角螺個(gè)體中等位基因在兩個(gè)以下的位點(diǎn)。
[0018] 發(fā)明人通過(guò)磁珠雜富集法從管角螺基因組DNA中篩選出了 14個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并根 據(jù)這些微衛(wèi)星位點(diǎn)兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)出了相應(yīng)的14對(duì)多態(tài)性微衛(wèi)星引物。研究表明，所 獲引物的擴(kuò)增結(jié)果具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于管角螺的種群遺傳多樣性檢測(cè)、個(gè) 體鑒定或分子輔助育種方面。將本發(fā)明運(yùn)用于對(duì)管角螺的繁育保護(hù)及科研研究之中，將為 管角螺的遺傳多樣性研究提供可用的分子標(biāo)記，并提供了利用微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)管角螺進(jìn)行遺 傳學(xué)個(gè)體識(shí)別的方法，彌補(bǔ)了現(xiàn)有基礎(chǔ)理論的不足。對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物進(jìn)行基因分 型，利用基因分型結(jié)果對(duì)管角螺野生個(gè)體進(jìn)行分析，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)管角螺的個(gè)體識(shí)別。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 一、微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選
[0020] 1、基因組DNA的提取
[0021] 1)將_80°C下冷凍的管角螺腹足肌肉，解剖刀切碎，迅速稱100mg左右放入1. 5ml 滅菌離心管中；
[0022] 2)向每個(gè)離心管中加入CTAB裂解緩沖液500iiL，蛋白酶K(20mg/ml)10iiL，在56 度水浴鍋下消化過(guò)夜，每隔幾個(gè)小時(shí)翻轉(zhuǎn)混勻；
[0023] 3)待樣品消化完全后，加CIA(氯仿：異戊醇=24:1)等量，旋轉(zhuǎn)20min，室溫離 心lOOOOrpm lOmin，移液槍吸取上清于另外干凈離心管中（中間層不能吸出）重復(fù)CIA抽 提一次；4)加PCI (酚：氯仿：異戊醇=25:24:1)，與所取上清等量，旋轉(zhuǎn)lOmin，室溫離心 lOOOOrpm lOmin，取上清于另外干凈滅菌離心管中；
[0024] 5)加等量CIA，旋轉(zhuǎn)lOmin，室溫離心lOOOOrpm lOmin，取上清；
[0025] 6)加入0? 6倍體積異丙醇，上下顛倒至出現(xiàn)沉淀；室溫12000rpm離心15min ;手動(dòng) 倒去上清液；
[0026] 7)加入100%酒精11111(41：預(yù)冷），用手顛倒攪拌幾次，12000印111離心1111111，手動(dòng) 倒去上清液；加入100%酒精，lml置換；12000rpm離心lmin，手動(dòng)倒去上清液；
[0027] 8)離心管開(kāi)口，倒放與干凈紙巾上，干燥15min左右，直到干燥；
[0028] 9)力卩 TE (10mM Tris-HC，ImM EDTA，PH8. 0) 500 ii L，4°C溶解過(guò)夜；
[0029] 10)力卩 Rnase (lOmg/ml) 1 u L，37°C處理 lh ;
[0030] 11)力卩PCI抽提緩沖液純化DNA (重復(fù)以上步驟）；
[0031] 12)加適量 TE，4°C 溶解過(guò)夜（50iiL);
[0032] 13)分光光度計(jì)定量，調(diào)整DNA溶度1 ii g/ ii L ;
[0033] 14)取5 y L瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，0? 15g瓊脂糖加15ml TBE ;4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034] 2、酶切、接頭連接和回收
[0035] 1)DNA 的酶切
[0036] 20 U L反應(yīng)體系：

【權(quán)利要求】
1. 管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)，其特征在于具有序列表SEQ. ID. No. 1至SEQ. ID. No. 14中任一 的堿基序列，它們分別標(biāo)記編號(hào)為 HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT7、HT8、HT9、HT10、HT11、 HT12、HT13、HT14。
2. 權(quán)利要求1所述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的組合，其特征在于包括管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)HT1、 HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT7、HT8、HT9、HT10、HT11、HT12、HT13、HT14。
3. 權(quán)利要求1所述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，其特征在于：所述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn) HT1、HT2、HT3、HT4、HT5、HT6、HT7、HT8、HT9、HT10、HT11、HT12、HT13、HT14 的引物分別包 括具有 SEQ. ID. No. 15/16、17/18、19/20、21/22、23/24、25/26、27/28、29/30、31/32、33/34、 35/36、37/38、39/40、41/42中的一對(duì)堿基序列，它們分別標(biāo)記編號(hào)為HTlpl/p2、HT2pl/p2、 HT3pl/p2、HT4pl/p2、HT5pl/p2、HT6pl/p2、HT7pl/p2、HT8pl/p2、HT9pl/p2、HT10pl/p2、 HTllpl/p2、HT12pl/p2、HT13pl/p2、HT14pl/p2。
4. 權(quán)利要求3所述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物組合，其特征在于包括引物HTlpl/p2、 HT2pl/p2、HT3pl/p2、HT4pl/p2、HT5pl/p2、HT6pl/p2、HT7pl/p2、HT8pl/p2、HT9pl/p2、 HT10pl/p2、HTllpl/p2、HT12pl/p2、HT13pl/p2、HT14pl/p2。
5. 權(quán)利要求1或2所述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)或其組合在管角螺的種群遺傳多樣性檢測(cè)、 個(gè)體鑒定或分子輔助育種方面的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求3或4所述管角螺微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物或其組合在管角螺的種群遺傳多樣性 檢測(cè)、個(gè)體鑒定或分子輔助育種方面的應(yīng)用。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于管角螺的種群遺傳多樣性檢測(cè)按以下 步驟進(jìn)行： 〈1>基因組DNA的提?。翰捎肅TAB抽提法提取管角螺基因組DNA ; 〈2>微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增：采用三引物檢測(cè)法檢測(cè)篩選管角螺微衛(wèi)星引物，并將篩選出的微 衛(wèi)星引物擴(kuò)增基因組DNA，獲得管角螺個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物； 〈3>擴(kuò)增產(chǎn)物電泳：8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果，掃描 儀記錄電泳圖譜，根據(jù)電泳圖譜分析各微衛(wèi)星位點(diǎn)的擴(kuò)增情況； 〈4>遺傳多樣性分析：根據(jù)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，利用 GENEPOP Version 4. 0計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)； 〈5>基因分型的結(jié)果分析，去除下列備選位點(diǎn)：無(wú)基因分型結(jié)果的位點(diǎn)；在任一個(gè)體中 等位基因數(shù)在兩個(gè)以上的位點(diǎn)；在30個(gè)管角螺個(gè)體中等位基因在兩個(gè)以下的位點(diǎn)。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450915SQ201410750857
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月9日
【發(fā)明者】潘英, 吳雪萍, 吳明燦, 周于娜, 蘇翔駒 申請(qǐng)人:廣西大學(xué)