專利名稱：中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標(biāo)記四重pcr引物與識別方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)遺傳育種的分子標(biāo)記輔助技術(shù)，是一種中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標(biāo)記四重PCR引物及利用該引物進(jìn)行家系識別的方法。
背景技術(shù)：
中國對蝦(Fenneropenaeus chinensis)又名東方對蝦、對蝦，是原產(chǎn)我國的一種優(yōu)質(zhì)海水養(yǎng)殖品種。利用分子標(biāo)記輔助育種是中國對蝦良種選育重要途徑之一，目前應(yīng)用最為廣泛的分子標(biāo)記為微衛(wèi)星。常規(guī)微衛(wèi)星檢測技術(shù)為單對引物進(jìn)行單個位點的PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測，效率低，周期長。微衛(wèi)星多重PCR是基于常規(guī)PCR技術(shù)，在一個PCR反應(yīng)體系中加入多對特異性的微衛(wèi)星引物，針對特定模板進(jìn)行多個微衛(wèi)星目的片段的PCR技術(shù)。中國對蝦多重PCR檢測技術(shù)的特點是效率高、周期短，可以有效利用少量模板，提高微衛(wèi)星標(biāo)記中國對蝦遺傳多樣性分析、個體系譜識別及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建的效率。目前國內(nèi)外尚未見有中國對蝦微衛(wèi)星四重PCR技術(shù)的發(fā)明及相關(guān)報道。與本發(fā)明類似的專利申請有“中國對蝦微衛(wèi)星三重PCR家系識別技術(shù)”(孔杰，高煥，授權(quán)公告號為CN100510103C)。該專利將開發(fā)的三對中國明對蝦微衛(wèi)星引物納入到一個PCR反應(yīng)體系中，利用片段大小區(qū)分不同產(chǎn)物。其優(yōu)點在于三重PCR提高了 PCR檢測效率；缺點在于個體識別率有限，不同目的片段的PCR產(chǎn)物靠目測難以區(qū)分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供中國對蝦家系識別四重微衛(wèi)星PCR引物，并利用不同中國對蝦微衛(wèi)星位點擴(kuò)增片段的大小差異，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立一個中國對蝦四重微衛(wèi)星PCR反應(yīng)及檢測體系，為中國對蝦分子標(biāo)記輔助育種提供高效、準(zhǔn)確的微衛(wèi)星標(biāo)記檢測技術(shù)。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的中國對蝦家系識別微衛(wèi)星四重PCR引物的序列如下RSllOl 正向序列為5 ‘ -CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘；FCKR005 正向序列為5 ‘ -CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列為5 ‘ -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列為5 ‘ -GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為 5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。一種中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記四重PCR家系識別方法，包括以下步驟提取中國對蝦基因組DNA、加入上述中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記四重PCR引物建立PCR反應(yīng)體系，選擇合適的 PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進(jìn)行中國對蝦四個微衛(wèi)星位點分析，對中國對蝦不同家系進(jìn)行區(qū)分或者進(jìn)行個體間及親子之間的識別和鑒定；所述的PCR反應(yīng)體系，即四對引物可在同一個PCR反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增的參數(shù)，這些參數(shù)是10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1 (內(nèi)含 750mM Tris-HCl (pH 8. 8), 200mM(NH4) 2S04,0. 1% Tween 20), 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP，四對引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. OunitDNA 聚合酶，模板DNAlOOng，補(bǔ)充滅菌雙蒸水使PCR反應(yīng)體系達(dá)到25 μ 1 ；所述的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性^iin，隨后的10個PCR循環(huán)為94°C變性40s、 52°C退火lmin、72°C延伸40s ；緊跟著的4個循環(huán)為941變性408、511退火lmin、隨后每個循環(huán)的退火溫度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10個循環(huán)為94°C變性40s、49°C退火 lmin、72°C延伸 lmin。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果本發(fā)明將需要分別進(jìn)行四次的中國對蝦微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增和檢測，整合為一次的四重PCR反應(yīng)體系和一次的產(chǎn)物檢測，可大大提高中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測效率，四重PCR 技術(shù)的中國對蝦單親排除率為99. 25%，個體識別率99. 87%。由于四對微衛(wèi)星產(chǎn)物片段差異顯著，避免了由于不同位點產(chǎn)物片段大小接近時無法有效區(qū)分的弊病。利用該四重PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記檢測，可以大大節(jié)約包括PCR實驗耗材、PCR試劑、電泳檢測及時間成本等各項內(nèi)容。同時避免了其它以熒光標(biāo)記為基礎(chǔ)的多重PCR技術(shù)檢測體系成本高，對分析儀器要求嚴(yán)格的缺點。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋，但實施例不對本發(fā)明作任何形式上的限制。中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記RSllOl引物是引用已有的參考文獻(xiàn)(專利名稱“中國對蝦微衛(wèi)星三重PCR家系識別技術(shù)”，授權(quán)公告號為CN100510103C)。FCKR005，F(xiàn)CKR007和FCKR009 是我們利用“菌落富集-探針雜交”策略測序獲得的，對重復(fù)序列進(jìn)行引物設(shè)計從而實現(xiàn)對中國對蝦特定微衛(wèi)星位點的PCR擴(kuò)增。利用引物設(shè)計軟件分析排除這四對引物彼此形成引物二聚體、發(fā)莢結(jié)構(gòu)的可能，對于檢測到的嚴(yán)重影響復(fù)合PCR反應(yīng)進(jìn)行的二聚體及發(fā)莢結(jié)構(gòu)的引物進(jìn)行修改，使其完全適合復(fù)合PCR反應(yīng)體系。組合這四對引物于同一個PCR反應(yīng)體系。調(diào)整PCR反應(yīng)體系，建立這四對引物可在同一個PCR反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增的參數(shù)，這些參數(shù)是10 XPCR Buffer 2. 5 μ 1 (內(nèi)含 750mM Tris-HCl (pH 8. 8), 200mM(NH4) 2S04,0. 1% Tween20), 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP，四對引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. Ounit DNA 聚合酶，模板DNAlOOng，補(bǔ)充滅菌雙蒸水使PCR反應(yīng)體系達(dá)到25 μ 1，模板DNA為取中國對蝦肌肉組織采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法獲得。PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性％iin，隨后的10個PCR循環(huán)為94°C變性40s、52°C退火Imin、72°C延伸40s ；緊跟著的4個循環(huán)為94 V變性40s、51 °C退火lmin、隨后每個循環(huán)的退火溫度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10個循環(huán)為94°C變性40s、49°C退火lmin、72°C 延伸lmin;循環(huán)完成后72°C延伸5min。PCR反應(yīng)過程在常規(guī)PCR儀上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色。四對微衛(wèi)星引物的序列如下
RSllOl正向序列為5 5 ‘ -TATTCCCACGCTCTTGTC-3 ‘；FCKR005 正向序列為5 ‘ 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列為5 ‘ 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列為5 ‘ 5' -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。
-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3
反向序列為
-CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 -GC ACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為技術(shù)指標(biāo)RS1101，F(xiàn)CKR005，F(xiàn)CKR005, FCKR007和FCKR009位點的目的片段大小分別為330bp, 283bp, 241bp和196bp,具有的等位基因數(shù)分別為12，9，8和14個，由此組合的四重PCR技術(shù)的中國對蝦單親排除率為99. 25%,個體識別率99. 87%。應(yīng)用范圍可以通過此四重PCR技術(shù)，經(jīng)過常規(guī)方式PCR擴(kuò)增和銀染檢測，可一次性獲得四個微衛(wèi)星位點上的中國對蝦個體的遺傳信息，通過這些不同個體間顯示的遺傳信息差異來進(jìn)行個體和家系系譜識別。育種中的應(yīng)用1)獲得了家系個體四個微衛(wèi)星位點的遺傳信息，可以推測缺失的父本或母本的基因型或父母本的基因型組合；幻獲得群體四個微衛(wèi)星位點的遺傳信息，可以對該群體按照家系組成進(jìn)行歸類；幻獲得親本之一或父母本四個微衛(wèi)星位點的遺傳信息，可以對混養(yǎng)的后代進(jìn)行遺傳分析，確定或排除后代是否為檢測親本的子代個體。
權(quán)利要求
1.中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標(biāo)記四重PCR引物，其特征在于所述引物序列如下RSllOl正向序列為5 -TATTCCCACGCTCTTGTC-3‘；-CGAGTGGCAGCGAGTCCT-3反向序列為FCKR005 正向序列為5 ‘ -CATCGAATCTAAGAGCTGGAAT-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -TTTGTTTGTGAATAATGTGTGT-3‘；FCKR007 正向序列為5 ‘ -CGAAATAAGTTAAATGAAAAAA-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -CAACATAAGACTCACGAGACAG-3‘；FCKR009 正向序列為5 ‘ -GCACGAAAACACATTAGTAGGA-3 ‘，反向序列為 5 ‘ -ATATCTGGAATGGCAAAGAGTC-3‘。
2. 一種中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記四重PCR家系識別方法，其特征在于包括以下步驟提取中國對蝦基因組DNA、加入權(quán)利要求1所述的引物，建立PCR反應(yīng)體系，選擇合適的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進(jìn)行中國對蝦四個微衛(wèi)星位點分析，對中國對蝦不同家系進(jìn)行區(qū)分或者進(jìn)行個體間及親子之間的識別和鑒定； 所述的PCR反應(yīng)體系，即四對引物可在同一個PCR反應(yīng)體系中同時擴(kuò)增的參數(shù)， 這些參數(shù)是10XPCR Buffer 2. 5 μ 1，Buffer 內(nèi)含 pH8. 8 濃度為 750mM Tris-HCl, 200mM (NH4) 2S04、0. 1% Tween20，另有 2. OmM Mg2+, 0. 2mM dNTP,四對引物正向及反向序列各 0. 2 μ M，1. Ounit DNA聚合酶，模板DNAlOOng,補(bǔ)充滅菌雙蒸水使PCR反應(yīng)體系達(dá)到25 μ 1 ； 所述的PCR反應(yīng)程序為95°C預(yù)變性％iin，隨后的10個PCR循環(huán)為94°C變性40s、52°C 退火lmin、72°C延伸40s ；緊跟著的4個循環(huán)為94°C變性40s、51°C退火lmin、隨后每個循環(huán)的退火溫度降低0. 5°C、72°C延伸Imin ；最后10個循環(huán)為94°C變性40s、49°C退火lmin、 72°C延伸 lmin。
全文摘要
中國對蝦家系識別微衛(wèi)星標(biāo)記四重PCR引物與識別方法，利用現(xiàn)有中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記RS1101引物和“菌落富集-探針雜交”策略測序獲得的FCKR005、FCKR007和FCKR009共四個引物，建立PCR反應(yīng)體系，選擇合適的PCR反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染檢測方法進(jìn)行中國對蝦四個微衛(wèi)星位點分析，對中國對蝦不同家系進(jìn)行區(qū)分或者進(jìn)行個體間及親子之間的識別和鑒定；本發(fā)明通過一次的四重PCR反應(yīng)體系和一次的產(chǎn)物檢測，可大大提高中國對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記的檢測效率，組合的四重PCR技術(shù)的中國對蝦單親排除率為99.25％，個體識別率99.87％；同時大大節(jié)約了實驗耗材，降低成本。
文檔編號C12Q1/68GK102399776SQ201110258128
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者李偉亞, 王偉繼, 阮曉紅 申請人:中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所